JP5796147B2

JP5796147B2 - ポリペプチド多孔質体及びその製造方法

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Publication number: JP5796147B2
Application number: JP2015513726A
Authority: JP
Inventors: 利昭大澤; 森田　啓介; 啓介森田
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Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2015-10-21
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Description

本発明は、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを原料とするポリペプチド多孔質体及びその製造方法に関する。

ポリペプチドヒドロゲルは人工軟骨などの生体材料等に使用される。特許文献１にはシルクフィブロインをポリエチレングリコール等の吸湿ポリマーに溶解したヒドロゲルや発泡体が提案されている。特許文献２にはスパイダーシルクを原料とし、光架橋させたゲルが開示されている。

特表２００７−５１５３９１号公報特表２００８−５０６４０９号公報

しかし、従来法で提案されている溶媒のウレア水溶液はクモ糸タンパク質を溶解する力が弱く、グアニジン水溶液やヘキサフルオロイソパノール（ＨＦＩＰ）等は高価であり、かつ溶媒が残存すると生体へ適用することが難しかった。また、従来のシルクフィブロインの発泡体に関しては、水分吸収性が不明であった。

本発明は前記従来の問題を解決するため、水分吸収性に優れたポリペプチド多孔質体を提供するものであり、また、生体への適用に優れたポリペプチド多孔質体及びその製造方法を提供する。

本発明のポリペプチド多孔質体は、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド多孔質体であって、前記ポリペプチドは非水溶性ポリペプチドを含み、見掛けの密度が０．１ｇ／ｃｍ³以下であり、前記ポリペプチド多孔質体にはジメチルスルホキシド及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群から選ばれる少なくとも一つが内部に存在していることを特徴とする。

本発明のポリペプチド多孔質体の製造方法は、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの溶解用溶媒に溶解させてポリペプチドの溶液を得る溶液生成工程と、
（Ａ）ジメチルスルホキシド
（Ｂ）ジメチルスルホキシドに無機塩を加えたもの
（Ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに無機塩を加えたもの
前記溶液生成工程で生成した溶液を水溶性溶媒に置換することによりポリペプチドゲルを得る工程と、前記ポリペプチドゲルを乾燥する工程を含むことを特徴とする。なお、ここで言う「ポリペプチドを溶解用溶媒に溶解させる」とは、ポリペプチドを溶解用溶媒に完全に溶解させることと、ポリペプチドの微粒子を溶解用溶媒中に分散させることで、ポリペプチドの微粒子を溶解用溶媒に実質的に溶解させた形態と為すことの両方を含む。以下、同一の意味において使用する。

本発明は、ポリペプチド溶液を作成する際に特定の溶媒を使用し、水溶性溶媒と置換することでポリペプチドゲルを取得し、乾燥することにより、残存溶媒をほとんど含まないか或いは残存溶液が十分に少ないポリペプチド多孔質体を製造することができ、それによって、生体への適用に優れたポリペプチド多孔質体を提供できる。また、本発明に係るポリペプチド多孔質体は、見掛けの密度が十分に小さくされていることにより、内部の空隙量が大きくされ、以って、高い水分吸収性を発揮する。この多孔質体はキセロゲル（ｘｅｒｏｇｅｌ）ともいい、固相の骨格で空隙を有する網目構造体である。加えて、本発明で使用する溶媒はアクリル系繊維やポリイミドの製造に使用されている溶媒であり、コストが安い利点もある。

図１は本発明の一実施例のポリペプチド多孔質体の光学写真である。図２は本発明の一実施例のポリペプチド多孔質体の走査型電子顕微鏡(SEM)の倍率７０の写真である。図３は同、倍率２００の写真である。図４は同、倍率１，０００の写真である。

本発明のタンパク質は、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを使用する。クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドとは、天然型クモ糸タンパク質に由来又は類似するものであればよく、特に限定されない。例えば天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。上記組換えクモ糸タンパク質は、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であることが好ましい。上記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。

また、上記組換えクモ糸タンパク質は、クモの小瓶状線で産生される小吐糸管しおり糸に由来する組換えクモ糸タンパク質であってもよい。上記小吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する小瓶状線スピドロインＭｉＳｐ１やＭｉＳｐ２が挙げられる。

その他にも、上記組換えクモ糸タンパク質は、クモの鞭毛状線（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｇｌａｎｄ）で産生される横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であってもよい。上記横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。

前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは４以上、より好ましくは６以上含むポリペプチドが挙げられる。なお、前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組ポリペプチドにおいて、式（１）：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。前記式（１）において、ＲＥＰ１はポリアラニンを意味している。前記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２残基以上であることが好ましく、より好ましくは３残基以上であり、さらに好ましくは４残基以上であり、特に好ましくは５残基以上である。また、前記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２０残基以下であることが好ましく、より好ましくは１６残基以下であり、さらに好ましくは１４残基以下であり、特に好ましくは１２残基以下である。前記式（１）において、ＲＥＰ２は１０〜２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、前記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン、プロリン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。

大吐糸管しおり糸において、前記ＲＥＰ１は繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、前記ＲＥＰ２は繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、前記［ＲＥＰ１−ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。

前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれかに示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号１に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したアミノ酸配列の１残基目から６３１残基目までのアミノ酸配列に該当する。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号３に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したアミノ酸配列である。配列番号４に示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やしたものである。また、前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するポリペプチドを用いてもよい。

本発明において、「１若しくは複数個」とは、例えば、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、又は１若しくは数個を意味する。また、本発明において、「１若しくは数個」は、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個を意味する。

上記小吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。上記式２において、ＲＥＰ３は（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｚ）ｍ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）ｌ（Ａ）rから構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｚは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｔｙｒ及びＧｌｎからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。またｍは１〜４であることが好ましく、ｌは０〜４であることが好ましく、rは１〜６であることが好ましい。

クモ糸において、小吐糸管しおり糸はクモの巣の中心から螺旋状に巻かれ、巣の補強材として使われたり、捉えた獲物を包む糸として利用されたりする。大吐糸管しおり糸と比べると引っ張り強度は劣るが、伸縮性は高いことが知られている。これは小吐糸管しおり糸において、多くの結晶領域がグリシンとアラニンが交互に連なる領域から形成されているため、アラニンのみで結晶領域が形成されている大吐糸管しおり糸よりも結晶領域の水素結合が弱くなり易いためと考えられている。

上記横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式３：ＲＥＰ４（３）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。前記式３において、ＲＥＰ４は（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ）ｎから構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｘは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。またｎは少なくとも４以上の数字を表し、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上である。

クモ糸において、横糸は結晶領域を持たず、無定形領域からなる繰り返し領域を持つことが大きな特徴である。大吐糸管しおり糸などにおいては結晶領域と無定形領域からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つと推測される。一方、横糸については、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。これは横糸の大部分が無定形領域によって構成されているためだと考えられている。

前記ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅してクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔｐｌｕｓ１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、前記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。前記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。前記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつ自身が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。前記宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。

また、前記ポリペプチドとしては、水溶性溶媒との接触によりゲルを形成可能なものが用いられる。ゲルが形成可能なポリペプチドには、例えば、前記溶液生成工程で生成した溶液を水溶性溶媒に置換した際に凝集し易い特性を有するもの（例えば、分子量が比較的に大きなもの）等がある。なお、そのような易凝集性を有しないポリペプチドであっても、例えば、溶液生成工程で生成した溶液中の濃度が高くされていれば、かかる溶液が水溶性溶媒に置換されることにより、凝集して、ポリペプチドゲルを形成する。凝集は高温状態から低温状態に温度を下げることによっても起こり得る。要するに、ポリペプチド多孔質体は、前記溶液生成工程で生成した溶液を水溶性溶媒に置換した際に凝集して、ゲルを形成するポリペプチドを用いて製造されるのであり、また、そのようなポリペプチドを含んで構成されている。

ポリペプチド多孔質体は連続孔を有している。この連続孔は真空凍結乾燥工程において、脱離する水分の透過孔によって形成されると推定される。この結果、キセロゲル(ｘｅｒｏｇｅｌ)が形成され、固相の骨格で空隙を有する網目構造体になっていると思われる。このようなポリペプチド多孔質体は、見掛けの密度が０．１ｇ／ｃｍ³以下とされ、好適には、見掛けの密度が０．０１〜０．０８ｇ／ｃｍ³の範囲内の値とされる。なお、見掛けの密度が０．０１ｇ／ｃｍ³未満である場合には、見掛け密度が余りに小さいために、空隙量が過大となって、ポリペプチド多孔質体の強度が低下するといった不具合が生じる可能性がある。

前記多孔質体の水分最大吸収倍率は重量換算で２倍以上が好ましく、さらに好ましくは３倍以上である。好ましい上限は２０倍以下、さらに好ましくは１８倍以下である。前記水分最大吸収倍率は、水分を最大吸収させ、傾けても水が濡れてこない点である。

本発明のポリペプチド多孔質体は、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの溶解用溶媒に溶解させてポリペプチドの溶液を得る溶液生成工程と、
（Ａ）ジメチルスルホキシド
（Ｂ）ジメチルスルホキシドに無機塩を加えたもの
（Ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに無機塩を加えたもの
前記溶液生成工程で生成した溶液を水溶性溶媒に置換することによりポリペプチドゲルを得る工程と、前記ポリペプチドゲルを乾燥する工程により得られる。前記溶液生成工程と前記溶媒を水溶性溶媒に置換する工程の間に、型枠に流し込み所定の形状に成形する工程を入れるか、あるいは前記溶媒を水溶性溶媒に置換する工程の後にカットすることにより所定の形状とすることができる。得られたポリペプチド多孔質の内部にはジメチルスルホキシド及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群から選ばれる少なくとも一つが存在していてもよい。前記溶解用溶媒の存在量は、特に限定されるものではなく、前記溶液生成工程で生成される溶液を前記水溶性溶媒に置換した後において意図せずに残存する程度の量である。

溶解用溶媒は、前記（Ａ）〜（Ｃ）に示す物質に加えて、アルコール及び／又は水を含んでもよい。前記溶解用溶媒は極性溶媒であり、空気中の水分を吸収しやすい性質があるため、通常販売されている溶媒は数％水を含む場合もある。この程度の水やアルコールは含んでいても良い。但し、溶解用溶媒として機能するのは前記（Ａ）〜（Ｃ）に示す物質である。

前記水溶性溶媒は、水を含む溶媒をいい、例えば、水、水溶性緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。前記水溶性溶媒は、人体への適応性が高いという観点から水であることが好ましい。前記水としては、特に限定されないが、純水、蒸留水、超純水等を用いることができる。

溶液生成工程後の溶液粘度は５〜８０ｃＰ（センチポアズ）が好ましく、さらに好ましくは１０〜５０ｃＰである。前記の範囲であれば取扱い性が良く便利である。

本発明は、溶媒として、極性溶媒であるＤＭＳＯ及び／又はＤＭＦを含む溶媒を使用する。ＤＭＳＯは融点１８．４℃、沸点１８９℃、ＤＭＦは融点−６１℃、沸点１５３℃であり、従来法で使用されているヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）の沸点５９℃、ヘキサフルロアセトン（ＨＦＡｃ）の沸点−２６．５℃に比べると、沸点ははるかに高く、その分溶解性も良い。また、ＤＭＳＯ及びＤＭＦは、一般産業分野においてもアクリル繊維の重合、紡糸液として使用され、ポリイミドの重合溶媒としても使用されていることから、コストも安く安全性も確認されている物質である。

ＤＭＳＯまたはＤＭＦに無機塩を加えると、さらに媒質の溶解度は上がる。無機塩としては、アルカリ金属ハロゲン化物（例えばＬｉＣｌ，ＬｉＢｒなど）、アルカリ土類金属ハロゲン化物（例えばＣａＣｌ₂）、アルカリ土類金属硝酸塩（例えばＣａ（ＮＯ₃）₂など）、チオシアン酸ナトリウム（例えばＮａＳＣＮなど）から選ばれる少なくとも一つである。溶解成分を１００質量％としたとき、無機塩の割合は０．１〜２０質量％の範囲が好ましい。

前記ポリペプチドゲルは、溶媒を水溶性溶媒に置換して生成される。このとき、前記ポリペプチドゲルは水には溶解しない。水溶性溶媒に置換する工程は、溶媒に溶解させたポリペプチド溶液を透析膜内に入れ、水溶性溶媒中に浸漬し、水溶性溶媒を１回以上入れ替える方法が好ましい。具体的には、溶媒を水溶性溶媒に置換する工程は、溶液生成工程後の溶液を透析膜に入れ、前記溶液の１００倍以上の水溶性溶媒（１回分）の中に３時間静置し、この水溶性溶媒入れ替えを計３回以上繰り返すことが好ましい。透析膜については、溶液中のポリペプチドが透過しないサイズであればよく、例えばセルロース透析膜等を用いることができる。水溶性溶媒置換を繰り返せば溶媒をゼロに近づけることができる。脱溶媒工程の後半では透析膜は使用しなくても良い。

水溶性溶媒置換工程後のポリペプチド中の溶媒：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の残量は核磁気共鳴分光装置（ＮＭＲ）で測定できる。内部標準としては１、２ジクロロエタンーギ酸溶液を用いることができる。

乾燥工程では真空凍結乾燥を用いることが好ましい。真空凍結乾燥時の真空度は２００パスカル(Pa)以下が好ましく、さらに好ましくは１５０パスカル以下であり、より好ましくは１００パスカル以下である。真空乾燥によりポリペプチドから水分が蒸発し、この蒸発潜熱により温度が下がり凍結状態となる。真空凍結乾燥時のポリペプチドの温度は７０℃以下が好ましく、さらに好ましくは６０℃以下であり、より好ましくは５０℃以下である。なお、真空凍結乾燥に先立って、−１０〜−４５℃の温度で１０〜３６時間程度予備凍結をしてもよい。凍結乾燥後の水分率は５．０％以下が好ましく、さらに好ましくは３．０％以下である。

以下実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。水溶性溶媒として水を用いた例を説明する。

＜各測定方法＞
（１）溶媒残量測定
内部標準として１，２−ジクロロエタン−ギ酸溶液濃度３，１００ｐｐｍ（０．００３１０ｍｇ／ｍｌ）を準備した。タンパク質溶液（１０ｍｌのギ酸に０．１ｇのポリペプチド多孔質体を溶解したもの）５００μｌと内部標準溶液５００μｌを混合した。さらに、Ｈ−ＮＭＲ測定のためアセトニトリル重溶媒を同量程度加え約２倍に希釈し、Ｈ−ＮＭＲ測定を行った（ＮＭＲの機種：ＪＥＯＬ社ＪＮＭ−ＥＣＸ１００）。内部標準試料１，２−ジクロロエタンのＨ−ＮＭＲ積分強度とＤＭＳＯのＨ−ＮＭＲ積分強度を比較した。検量線の作成は３ｐｐｍ〜３０００ｐｐｍのＤＭＳＯ−ギ酸溶液を作成し、上記プロトコルにしたがって、検量線を作成した。検量線との比較から、タンパク質溶液中のＤＭＳＯ濃度を求めた。ＤＭＳＯ濃度測定は、ＪＥＯＬ社製、核磁気共鳴装置(ＮＭＲ)を用いた。
（２）粘度
ＫＥＭ社製、ＥＭＳ装置を使用した。

（実施例１）
１．ポリペプチドの準備
＜ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ａの遺伝子の合成＞
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベース（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）より取得し、同配列のＮ末端に開始コドンと、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加し、該配列のＮ末端の１残基目から６３１残基目までのアミノ酸配列（配列番号１）からなるポリペプチド（ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ａ）をコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号６に示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉ−Ａの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅＩサイト、及び５’末端直下流にＸｂａＩサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ａの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。

＜タンパク質の発現＞
前記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ａの遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ₆₀₀が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ₆₀₀が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ₆₀₀が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ₆₀₀が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（約５６．１ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ａ）が発現していることを確認した。

＜精製＞
（１）遠沈管（１０００ｍｌ）にＡＤＦ３Ｋａｉ−Ａのタンパク質を発現している大腸菌の菌体約５０ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３００ｍｌを添加し、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシックウルトラタラックス」、レベル２）で菌体を分散させた後、遠心分離機（クボタ社製の「Ｍｏｄｅｌ７０００」）で遠心分離（１１，０００ｇ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（２）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３００ｍｌと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を３ｍｌ添加し、前記ＩＫＡ社製のミキサー（レベル２）で３分間分散させた。その後、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡＮｉｒｏＳａｏｖｉ社製の「ＰａｎｄａＰｌｕｓ２０００」）を用いて菌体を繰り返し３回破砕した。
（３）破砕された菌体に、３ｗ／ｖ％のＳＤＳを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭＴｒｉｓーＨＣＬ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）３００ｍＬを加え、前記ＩＫＡ社製のミキサー（レベル２）で良く分散させた後、シェイカー（タイテック社製、２００ｒｐｍ、３７℃）で６０分間攪拌した。その後、前記クボタ社製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、上清を捨て、ＳＤＳ洗浄顆粒（沈殿物）を得た。
（４）ＳＤＳ洗浄顆粒を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう１Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ溶液で懸濁し、８０℃で１時間熱処理した。その後、前記クボタ社製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、上清を回収した。
（５）回収した上清に対して３倍量のエタノールを準備し、エタノールに回収した上清を加え、室温で１時間静置した。その後、前記クボタ社製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、凝集タンパク質を回収した。次に純水を用いて凝集タンパク質を洗浄し、遠心分離により凝集タンパク質を回収するという工程を３回繰り返した後、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ａ（約５６．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＣＢＢ染色）の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒｄｙｎａｍｉｃｓｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ａの精製度は約８５％であった。

２．溶液の調整
クモ糸タンパク質(ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ａ)の粉末０．８ｇをＤＭＳＯ（１ＭのＬｉＣｌを含む）２０ｍｌに入れ、８０℃で３０分間溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除いた。溶液の溶液粘度は３０．８ｃＰ（センチポアズ）であった。この溶液を透析チューブ（三光純薬株式会社セルロースチューブ３６／３２）に入れた。

３．水置換
前記透析チューブを３リットルの純水で満たされたビーカに入れた。その後３時間静置させた後、水を入れ替え、計６回この操作を行った。これにより、溶液中のクモ糸タンパク質が凝集して、ほぼ全てのDMSOが水に置換されたヒドロゲルが作成できた。得られたゲルの水分率は９５．３質量％であった。

４．真空凍結乾燥
前記ヒドロゲルを凍結乾燥機（東京理化器械製の「ＦＤＵー１２００」）により、１４Ｐａ、−４５℃の条件で１５時間凍結乾燥した。

５．結果
（１）得られた多孔質体の溶媒残量は多孔質体１００ｇに対して２．６３ｇであった。
（２）得られた多孔質の見掛けの密度は０．０７７ｇ／ｃｍ³であった。なお、見掛けの密度は公知の手法に従って求めた。以下に示す実施例２〜４の密度（見掛けの密度）も同様にして求めた。
（３）得られた多孔質体の水分最大吸収倍率は１５．４倍であった。この水分吸収倍率は、水分を最大吸収させ、傾けても水が濡れてこない点とした。以下も同様である。
（４）得られた多孔質体は図１〜４に示すとおりである。

（実施例２）
実施例１と同一のポリペプチドを用い、操作も同様にして次のゲルを作製した。濃度の薄いゲルとして、ポリペプチド粉末０．４ｇを用いて２０ｍｇ／ｍｌのドープ（ＤＭＳＯ＋１ＭのＬｉＣｌ）を準備し、ゲルを作製した。ドープ粘度は１３．９ｃＰであった。得られたゲルの水分率は９８．８質量％であった。このゲルを実施例１と同じ条件で真空凍結乾燥した。得られた多孔質体の密度は０．０２０ｇ／ｃｍ³であった。得られた多孔質体の水分最大吸収倍率は７．２倍であった。

（実施例３）
実施例１と同一のポリペプチドを用い、操作も同様にして次のゲルを作製した。ポリペプチド粉末０．４ｇを用いて２０ｍｇ／ｍｌのドープ（塩なしのＤＭＳＯ）を準備し、ゲルを作製した。得られたゲルの水分率は９７．４質量％であった。このゲルを実施例１と同じ条件で真空凍結乾燥した。得られた多孔質体の密度は０．０３６ｇ／ｃｍ³であった。得られた多孔質体の水分最大吸収倍率は６．１倍であった。

（実施例４）
実施例１と同一のポリペプチドを用い、操作も同様にして次のゲルを作製した。ポリペプチド粉末０．４ｇを用いて２０ｍｇ／ｍｌのドープ（ＤＭＦ＋１ＭのＬｉＣｌ）を準備し、ゲルを作製した。得られたゲルの水分率は９８．２質量％であった。このゲルを実施例１と同じ条件で真空凍結乾燥した。得られた多孔質体の密度は０．０３９ｇ／ｃｍ³であった。得られた多孔質体の水分最大吸収倍率は３．８倍であった。

なお上記実施例１〜４においては置換工程で水を用いたが、他の水溶性溶媒でも同様の効果が得られる。

本発明のポリペプチド多孔質体は薬剤、香料などの徐放性基材、吸収材などして有用である。

配列番号１〜５アミノ酸配列
配列番号６塩基配列

Claims

クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド多孔質体であって、前記ポリペプチドは非水溶性ポリペプチドを含み、見掛けの密度が０．１ｇ／ｃｍ³以下であり、
前記ポリペプチド多孔質体にはジメチルスルホキシド及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群から選ばれる少なくとも一つが内部に存在していることを特徴とするポリペプチド多孔質体。
前記ポリペプチド多孔質体の見掛けの密度が０．０１〜０．０８ｇ／ｃｍ³である請求項１に記載のポリペプチド多孔質体。
前記ポリペプチド多孔質体の水分吸収倍率が２〜２０倍である請求項１又は２に記載のポリペプチド多孔質体。
クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの溶解用溶媒に溶解させてポリペプチドの溶液を得る溶液生成工程と、
（Ａ）ジメチルスルホキシド
（Ｂ）ジメチルスルホキシドに無機塩を加えたもの
（Ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに無機塩を加えたもの
前記溶液生成工程で生成した溶液を水溶性溶媒に置換することによりポリペプチドゲルを得る工程と、
前記ポリペプチドゲルを乾燥する工程を含むことを特徴とするポリペプチド多孔質体の製造方法。
前記ポリペプチド多孔質体は、前記ポリペプチドの溶液を水に置換した水溶液を用いて生成する請求項４に記載のポリペプチド多孔質体の製造方法。
前記水溶性溶媒に置換する工程は、前記溶解用溶媒に溶解させたポリペプチドの溶液を透析膜内に入れ、水溶性溶媒中に浸漬し、水溶性溶媒を１回以上入れ替える請求項４又は５に記載のポリペプチド多孔質体の製造方法。
前記乾燥は真空凍結乾燥である請求項４〜６のいずれかに記載のポリペプチド多孔質体の製造方法。