JP2009505668A - 修飾スパイダーシルクタンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
生体内におけるシルクのアセンブリは卓越したプロセスである。クモの牽引糸シルクタンパク質は、いわゆる大瓶状腺(major ampullate gland)の中に最大50%(w/v)の濃度で貯蔵される。「動的な緩いらせん構造」が大瓶状腺内のタンパク質について提案されてきたが、より最近のデータは、大瓶状腺の大部分に相当するいわゆるAゾーンのタンパク質についてランダムコイル構造を示唆している。この高度に濃縮されたタンパク質溶液がシルクのドープ液(紡糸液)を形成し、該ドープ液は液晶の特性を示す。
この点に関し特に関心が高いのは、スパイダーシルクモジュール中の化学特異的なアミ
ノ酸側鎖(本願の場合システインのチオール基またはリジンのアミノ基)を有するアミノ酸の組み込みである。これまで記載してきた上述のいずれのスパイダーシルクタンパク質モジュールも、システインもリジンも含んでおらず、したがって、それぞれの核酸配列の特異的突然変異誘発により、モジュールの配列に所望のアミノ酸を制御された方法で組み込むことが可能となる。このようにして修飾されたモジュールは新しい構築物に組み立てられ、従って、単一のモジュールを組み合わせることにより、1つよりも多くの化学活性作用役または薬物を一つの単一構築物中に組み合わせることが可能となる。
DNA配列によっては離間されない。本願で用いられているクローニング系では、例えば、一定のクローニングカセット(図1)を備えたクローニングベクターpAZL(本願発明者により開発)を使用することができる。このクローニングカセットの最も重要な要素は2つの制限酵素(BseRIおよびBsgI)に対する認識配列であり、それらの制限部位は、それぞれの認識配列からそれぞれ8および14個のヌクレオチドだけ離れた所に位置している。これにより、翻訳開始および停止コドンの配置と、合成遺伝子の直前または直後へのさらなる制限部位の組み込みが可能となる。
モジュールA:GPYGPGASAA AAAAGGYGPG SGQQ(配列番号1)モジュールC:GSSAAAAAAA ASGPGGYGPE NQGPSGPGGY GPGGP(配列番号3)
モジュールQ:GPGQQGPGQQ GPGQQGPGQQ(配列番号2)
モジュールK:GPGGAGGPYG PGGAGGPYGP GGAGGPY(配列番号4)
モジュールsp:GGTTIIEDLD ITIDGADGPI TISEELTI(配列番号5)
モジュールX:GGAGGAGGAG GSGGAGGS(配列番号6)
モジュールY:GPGGAGPGGY GPGGSGPGGY GPGGSGPGGY(配列番号7)
これらのアミノ酸モジュールから、合成スパイダーシルクタンパク質構築物が組み立てられた。かかるモジュールおよびそれから得られたスパイダーシルクタンパク質は、とり
わけスパイダーシルクタンパク質を修飾する本発明の方法の出発物質を形成する。
第1の態様によれば、スパイダーシルクタンパク質を修飾する方法であって、
a)スパイダーシルクタンパク質、またはリジン残基もシステイン残基を含まない同スパイダーシルクタンパク質のフラグメントをコードする核酸を提供する工程と、
b)前記スパイダーシルクタンパク質中の1または複数のアミノ酸をコードする核酸をリジンまたはシステインをコードする核酸配列により置換するか、またはリジンおよびシステインの少なくとも一方をコードする核酸配列を有する核酸配列を前記配列に付加するかの少なくとも一方を行う工程と、
c)工程b)で得られた修飾核酸配列を適切な宿主中で発現する工程と、
d)発現した修飾スパイダーシルクタンパク質を回収する工程と、
から成る方法が提供される。
につながる。
antipodiana)、ベッカリズテントスパイダー(Beccari’s Tent Spider)(Cyrtophora beccarii)、トリノフンダマシ(Bird−dropping Spider)(Celaenia excavata)、ブラックアンドホワイトスピニースパイダー(Black−and−White Spiny Spider)(Gasteracantha kuhlii)、キマダラコガネグモ(Black−and−yellow Garden Spider)(Argiope aurantia)、ナゲナワグモ(Bolas Spider)(Ordgarius furcatus)、ナゲナワグモ〜マグニフィセントスパイダー(Bolas Spiders−Magnificent Spider)(Ordgarius
magnificus)、ブラウンセーラースパイダー(Brown Sailor Spider)(Neoscona nautica)、ブラウンレッグドスパイダー(Brown−Legged Spider)(Neoscona rufofemorata)、キャップトブラックヘッディドスパイダー(Capped Black−Headed Spider)(Zygiella calyptrata)、コモンガーデンスパイダー(Common Garden Spider)(Parawixia dehaani)、コモンオーブウィーバー(Common Orb Weaver)(Neoscona oxancensis)、クラブライクスピニーオーブウィーバー(Crab−like Spiny Orb Weaver)(Gasteracantha
cancriformis(elipsoides)))、カーブドスピニースパイダー(Curved Spiny Spider)(Gasteracantha arcuata)、Cyrtophora moluccensis、Cyrtophora parnasia、Dolophones conifera、Dolophones turrigera、ドリアズスピニースパイダー(Doria’s Spiny Spider)(Gasteracantha doriae)、ダブルスポッテッドスピニースパイダー(Double−Spotted Spiny Spider)(Gasteracantha mammosa)、ダブルテイルドテントスパイダー(Double−Tailed Tent Spider)(Cyrtophora exanthematica)、Aculeperia ceropegia、Eriophora pustulosa、フラットアネプション(Flat Anepsion)(Anepsion depressium)、フォースパインドジュエルスパイダー(Four−spined Jewel Spider)(Gasteracantha quadrispinosa)、ガーデンオーブウェブスパイダー(Garden Orb Web Spider)(Eriophora transmarina)、ジャイアントライケンオーブウィーバー(Giant Lichen Orbweaver)(Araneus
bicentenarius)、ジョロウグモ(Golden Web Spider)(Nephila maculata)、ハッセルツスピニースパイダー(Hasselt’s Spiny Spider)(Gasteracantha hasseltii)、Tegenaria atrica、Heurodes turrita、アイランドサイクローサスパイダー(Island Cyclosa Spider)(Cyclosa insulana)、ジュエルスパイダーもしくはスピニースパイダー(Jewel or Spiny Spider)(Astracantha minax)、キドニーガーデンスパイダー(Kidney Garden Spider)(Araneus mitificus)、ラグライジズガーデンスパイダー(Laglaise’s Garden Spider)(Eriovixia laglaisei)、ロングベリードサイクローサスパイダー(Long−Bellied Cyclosa Spider)(Cyclosa bifida)、マラバルスパイダー(Malabar
Spider)(Nephilengys malabarensis)、マルチカラードセントアンドリューズクロススパイダー(Multi−Coloured St Andrew’s Cross Spider)(Argiope versicolor)、オーナメンタルツリートランクスパイダー(Ornamental Tree−Trunk Spider)(Herennia ornatissima)、オーバルセントアンドリューズクロススパイダー(Oval St. Andrew’s Cross
Spider)(Argiope aemula)、レッドテントスパイダー(Red
Tent Spider)(Cyrtophora unicolor)、ロシアンテントスパイダー(Russian Tent Spider)(Cyrtophora hirta)、セントアンドリューズクロススパイダー(Saint Andrew’s
Cross Spider)(Argiope keyserlingi)、スカーレットアクシラス(Scarlet Acusilas(Acusilas coccineus)、ギンコガネグモ(Silver Argiope)(Argiope argentata)、スピニーバックトオーブウィーバー(Spinybacked Orbweaver)(Gasteracantha cancriformis)、スポッテッドオーブウィーバー(Spotted Orbweaver)(Neoscona domiciliorum)、セントアンドリューズクロス(St. Andrews Cross)(Argiope aetheria)、セントアンドリューズクロススパイダー(St. Andrews Cross Spider)(Argiope Keyserlingi)、ツリースタンプスパイダー(Tree−Stump Spider)(Poltys illepidus)、トライアングルスパイダー(Triangular Spider)(Arkys clavatus)、トライアングルスパイダー
(Triangular Spider)(Arkys lancearius)、ツースパインドスパイダー(Two−spined Spider)(Poecilopachys australasia)、ジョロウグモ(Nephila)種、例えば、アメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)、Nephila senegalensis、Nephila madagascariensisなど、ならびにさらに多くのクモ(さらなるクモ類に関しては、以下も参照のこと)。
以下の新たなモジュールが、発明の方法により生成された。また、かかるモジュールが特定の好ましい実施形態で生成される。
牽引糸スパイダーシルク用モジュール
モジュールAC:GPYGPGASAA AAAAGGYGPG CGQQ(配列番号8
)
ggt ccg tac ggc cca ggt gct agc gcc gca gcg gca gcg gct ggt ggc tac ggt ccg ggc tgc ggc cag cag
モジュールAK:GPYGPGASAA AAAAGGYGPG KGQQ(配列番号9
)
ggt ccg tac ggc cca ggt gct agc gcc gca gcg gca gcg gct ggt ggc tac ggt ccg ggc aaa ggc cag cag
モジュールCC:GSSAAAAAAA ASGPGGYGPE NQGPCGPGGY
GPGGP(配列番号10)
cgt tct agc gcg gct gca gcc gcg gca gct gcg tcc ggc ccg ggt ggc tac ggt ccg gaa aac cag ggt cct tgc ggc ccg ggc ggc tac ggt cca ggt ggt cca
モジュールCK1:GSSAAAAAAA ASGPGGYGPE NQGPKGPGG Y GPGGP(配列番号11)
cgt tct agc gcg gct gca gcc gcg gca gct gcg tcc ggc ccg ggt ggc tac ggt ccg gaa aac cag ggt cca aaa ggc ccg ggt ggc tac ggt cct ggc ggt ccg
モジュールCK2:GSSAAAAAAA ASGPGGYGPK NQGPSGPGGY
GPGGP(配列番号12)
cgt tct agc gcg gct gca gcc gcg gca gct gcg tcc ggc ccg ggt ggc tac ggt ccg aaa aac cag ggt cca tct ggc ccg ggt ggc tac ggt cct ggc ggt ccg
モジュールCKC:GSSAAAAAAA ASGPGGYGPK NQGPCGPGGY
GPGGP(配列番号13)
cgt tct agc gcg gct gca gcc gcg gca gct gcg tcc ggc ccg ggt ggc tac ggt ccg aaa aac cag ggt cca tgc ggc ccg ggt ggc tac ggt cct ggc ggt ccg
鞭毛状スパイダーシルク用モジュール
モジュールspC:GGTTIIEDLD ITIDGADGPI TICEELTI(
配列番号14)
ggt ggc acc acc atc att gaa gat ctg gac atc act att gat ggt gcg gac ggc ccg atc acg atc tgc gaa gag ctg acc atc
モジュールspK:GGTTIIEDLD ITIDGADGPI TIKEELTI(
配列番号15)
ggt ggc acc acc atc att gaa gat ctg gac atc act att gat ggt gcg gac ggc ccg atc acg atc aaa gaa gag ctg acc atc
モジュールXC:GGAGGAGGAG GCGGAGGS(配列番号16)
ggt ggc gct ggt ggc gcc ggt ggc gca ggt ggc tgc ggc ggt gcg ggc ggt tcc
モジュールXK:GGAGGAGGAG GKGGAGGS(配列番号17)
ggt ggc gct ggt ggc gcc ggt ggc gca ggt ggc aaa ggc ggt gcg ggc ggt tcc
モジュールYC:GPGGAGPGGY GPGGSGPGGY GPGGCGPGGY
(配列番号18)
ggt ccg ggc ggt gcg ggc cca ggt ggc tat ggt ccg ggc ggt tct ggg ccg ggt ggc tac ggt cct ggc ggt tgc ggc ccg ggt ggc tac
モジュールYK:GPGGAGPGGY GPGGSGPGGY GPGGKGPGGY
(配列番号19)
ggt ccg ggc ggt gcg ggc cca ggt ggc tat ggt ccg ggc ggt tct ggg ccg ggt ggc tac ggt cct ggc ggt aaa ggc ccg ggt ggc tac
これらのモジュールは、特定の修飾を達成するために他のモジュール/スパイダーシルクタンパク質と意図的に組み合わせることができる。組み合わせの可能性の例として、構築物C16が使用される。これに関し、モジュールCCの使用による可能な構築物は以下の
ものである:
C16CC、CCC16、C8CCC8、C16 C、C8CC 8、CC 8C8、CC 4C8CC 4等。
により、システインのチオール基およびリジン側鎖のアミノ基に適切な物質を結合する可能性が存在する。
以下のTAGが、スパイダーシルク構築物における好ましい使用のために開発された。アミノ末端TAG
NHCYS1:GCGGGGGGSG GGG(配列番号20)
ggt tgc ggc ggt ggc ggt ggc ggt tct ggt ggc ggt ggc
NHCYS2:GCCGGGGG(配列番号21)
ggt tgc ggt ggc ggt ggc ggt ggc
NHCYS3:GCGGS GGGGS GGGG(配列番号22)
ggt tgc ggt ggc tct ggt ggt ggc ggg tcc gga ggc ggt ggc
NHLYS1:GKGGGGGGSG GGG (配列番号23)
ggt aaa ggc ggt ggc ggt ggc ggt tct ggt ggc ggt ggc
NHLYS2:GKGGGGGG (配列番号24)
ggt aaa ggt ggc ggt ggc ggt ggc
カルボキシル末端TAG
CHCYS1:。GGGGSGGGG GGCG (配列番号25)
ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt tgc ggc
CHCYS2:GGGGSGGCG(配列番号26)
ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt tgc ggc
CHLYS1:GGGGSGGGGS GGKG(配列番号27)
ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt aaa ggc
CHLYS2:GGGGSGGKG(配列番号28)
ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt aaa ggc
上述したように、例えば、以下の種々の異なるバリアントを使用することができる:
NHCYS1C16、C16CHCYS1、NHCYS1C16CHLYS1、C16NHLYS1等。
るべきである。したがって、リジンまたはシステインにより置換されるためにはセリン、アラニン、グリシン、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩またはスレオニンを使用することが特に好まれる。
この目的のために、当該技術分野で周知の紡糸方法を使用可能である。例えば、スパイダーシルクタンパク質のドープ溶液を出糸突起(spinneret)から押し出させてバイオフィラメントを形成する。得られたバイオフィラメントは牽引または伸長させてもよい。分子の結晶構造およびアモルファス(不定形)構造がいずれもバイオフィラメント中に存在する場合は常に、牽引または伸長により、分子を配向させるのに十分なせん断応力が分子に加わり、分子をフィラメントの壁に対して一層平行にし、かつバイオフィラメントの引張強さおよび靭性を高めることになる。
ク質を含んでいる。好ましい実施形態では、ドープ液のpHは約6.9である。
第2の態様によれば、上述の方法によって得られる修飾スパイダーシルクタンパク質が、本発明により提供される。
第3の態様によれば、工程d)で得られる修飾スパイダーシルクタンパク質または上述の修飾スパイダーシルクタンパク質をコードする核酸配列が提供される。
容易に変えることが可能である。
するための、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはベクターを指す。発現ベクターは、(1)遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝因子、例えばプロモータまたはエンハンサー、(2)mRNAへ転写され、タンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、ならびに(3)適切な転写開始配列および終結配列、のアセンブリを含む転写単位を含むことが可能である。酵母または真核生物の発現系で用いるための構造単位は、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含んでいることが好ましい。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列なしで発現される場合、該タンパク質はアミノ末端にメチオニン残基を含みうる。この残基は、最終生産物を提供するために、発現された組換えタンパク質から後で切断される場合もあれば切断されない場合もある。
tgtcgagaag tactagagga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc 60
tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt 120
tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 180
cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 240
atcttatcat gtctggatct gatcactgct tgagcctagg agatccgaac cagataagtg 300
aaatctagtt ccaaactatt ttgtcatttt taattttcgt attagcttac gacgctacac 360
ccagttccca tctattttgt cactcttccc taaataatcc ttaaaaactc catttccacc 420
cctcccagtt cccaactatt ttgtccgccc acagcggggc atttttcttc ctgttatgtt 480
tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc atcttcggct actttttctc 540
tgtcacagaa tgaaaatttt _tctgtcatct_ cttcgttatt aatgtttgta attgactgaa 600
tatcaacgct tatttgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa 660
gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 720
ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 780
ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 840
aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 900
gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 960
cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 1020
attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 1080
cgtttacaat ttcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1140
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 1200
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 1260
tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 1320
atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 1380
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 1440
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 1500
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 1560
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 1620
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 1680
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 1740
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 1800
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 1860
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 1920
ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 1980
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 2040
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 2100
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 2160
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 2220
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 2280
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 2340
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 2400
tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 2460
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 2520
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 2580
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 2640
gtgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 2700
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 2760
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 2820
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 2880
tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 2940
gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg 3000
agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 3060
gcggtatttc acaccgcaga ccagccgcgt aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 3120
taaatggatg ccctgcgtaa gcgggtgtgg gcggacaata aagtcttaaa ctgaacaaaa 3180
tagatcgagg aggatccatg ggacgaattc acggctaatg aaagcttact gcacagct 3238
本発明の第5の態様は、上記ベクターで形質転換された宿主に関する。宿主は好ましくは原核細胞であり、好ましくは大腸菌(E.coli)または枯草菌(Bacillus
subtilis)である。合成遺伝子の発現は例えば大腸菌k12または大腸菌B細胞で行なうことができる。発現の収量は細菌培養物1リットル当たり、約1gの精製タンパク質である。
本明細書に定義されたタンパク質、糸、フィラメント、フィルム、発泡体、球体、ナノフィブリル、ヒドロゲルおよびその等価物は、バイオテクノロジーおよび/または医学の分野で使用可能であり、好ましくは創傷閉鎖または被覆システム、神経外科もしくは眼科手術で使用される縫合材料を製造するために使用可能である。さらに、タンパク質/糸は好ましくは置換材料の製造、好ましくは人工軟骨または腱材料の製造のために使用され得る。
デバイスに例えば使用することができる。修飾スパイダーシルクタンパク質から形成されたフィルムを用いて行った実験は、バッテリーの酸に浸漬した後の酸に対する耐性および安定性を示した。
実験手順
材料
化学薬品はMerck社(ドイツ連邦共和国ダルムシュタット所在)から入手し、そうでない場合には記載してある。DNAの操作および修飾は、以前に記載(1)されているように実施した。制限酵素はNew England Biolabs社(米国マサチューセッツ州ベヴァリー所在)から、リガーゼはPromega Biosciences社(米国カリフォルニア州サンルイスオビスポ所在)から入手した。DNA精製はQiagen社(ドイツ連邦共和国ヒルデン所在)のキットを使用して実施した。合成オリゴヌクレオチドはMWG Biotech社(ドイツ連邦共和国エーバースベルク所在)から入手した。クローニング工程はすべて、Novagen社(米国ウィスコンシン州マディソン所在)の大腸菌株DH10Bで実施した。
鋳型ヌクレオチド配列としてのモジュールC(配列番号3)と、プライマーpAZL−fwd(CACTGAGCGTCAGA CCCCGTAGAAAAGA)(配列番号30)およびpAZLmut−rev(CTCTTAAGCTT TCATTAGCCTGGACCACCTGGACCGTAGCCGCCCGGGCCGCAAGGACCCTGG)(配列番号31)を使用して、モジュールCC(配列番号10)をPCR突然変異誘
発によって作製した。最適なプライマーを得るために、元のモジュールCのいくつかのコドンを変異させた(CCA(Pro24)からCCT(Pro)へ、GGT(Gly28)からGGC(Gly)へ、CCT(Pro32)からCCA(Pro)へ、GGC(Gly33)からGGTへ、CCG(Pro35)からCCA(Pro)へ)。PCR生成物およびpAZLベクター(配列番号29)をAIwNIおよびHindIIIでの消化後にライゲートした。モジュールNHCYS3(GCGG S GGGG S GGGG(ggt tgc ggt ggc tct ggt ggt ggc ggg tec gga ggc ggt ggc)(配列番号22)を、2つ
の合成オリゴヌクレオチドN1(GATCC ATGGGTTGCGGTGGCTCTGGTGGTGGCGGGTCCG GAGGCGGTGGCTAATGAA)(配列番号32)およびN2(AGCTTTCATTAGCCACCGCCTCC GGACCCGCCACCACCAGAGCCACCGCAACCCATG)(配列番号33)をアニーリングすることにより作成した。アニーリングは50pmol/μlの(各)オリゴヌクレオチド溶液の温度を0.1℃/sの増分で95℃から20℃まで減少させることにより行った。誤対合した二本鎖は70℃で変性した後、さらに20℃まで温度を減少させた。20℃−70℃−20℃のサイクルを10回繰り返した後、10回の追加のサイクルを65℃の変性温度で行なった。得られたクローニングカセットをBamHIとHindIIIで消化したベクターpAZL(配列番号29)とライゲートした。
2つの遺伝子断片(例えば単一モジュールまたはモジュール多量体)の接続は、クローニング戦略の基礎的なステップに相当した。この目的のために、指定の5’末端遺伝子断片を含んでいるpAZLベクターをBsaIおよびBsgIで消化し、3’末端遺伝子断片を含む該ベクターをBseRIおよびBsaIでそれぞれ消化した(図1)。この適切
なプラスミド断片のライゲーションにより、2つの遺伝子断片が接続され、その結果正しい構築物の特定を容易にするpAZLベクターのアンピシリン耐性遺伝子(Apr)が再構成された。
号10)またはNHCYS3(配列番号22)を接続した。その後、結合された修飾モジュールをBamHIとHindIIIでpAZLベクターから切り出し、同様に消化した、T7タグ(MASMTGGQQMGR)(配列番号34)コード配列(2)を提供する細菌の発現ベクターpET21a(Novagen社)とライゲートした。すべての構築物の忠実度はDNA塩基配列決定により確認した。
シルクの遺伝子はすべて大腸菌株BLR[DE3](Novagen社)中で発現させた。細胞をLB培地中37℃でOD600=0.5まで増殖させた。1mM IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトシド)で誘導する前に、細胞を、NHCYS3C16およびC16CCの場合は25℃、ならびにCCC16の場合は30℃にそれぞれシフトした。NHCYS3C16を発現する細胞は誘導の3−4時後に採取し、CCC16を発現する細胞は誘導の
4時間後に採取し、C16CCを発現する細胞は誘導の5時間後に採取した。
細胞を、20mMのN−(2−(ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−エタンスルホン酸)(HEPES)pH7.5、100mM NaCl、0.2mg/ml リゾチーム(Sigma−Aldrich社、米国ミズーリ州セントルイス所在)を含有する5ml/gのバッファに再懸濁し、40℃で30分間インキュベートした。細胞を、フレンチプレス(Basic Z.モデル、APV Deutschland社、ドイツ国リューベック所在)を用いて高圧で破壊した。細胞溶解物を0.1mg/ml デオキシリボヌクレアーゼI(Roche社、ドイツ連邦共和国マンハイム所在)および3mM MgCl2とともに室温で30分間インキュベートして、ゲノムDNAを消化した。溶解物中の不溶性の大腸菌タンパク質を50,000×g、4℃で30分間沈殿させた。溶解物の可溶性大腸菌タンパク質を、80℃で20分間加熱変性して沈殿させた。沈殿したタンパク質を、50,000×gで30分間沈降させて除去した。加熱変性の間可溶性を維持していたシルクタンパク質を、室温で20%硫酸アンモニウム(800mM)で沈殿させ、10,000×gで10分間遠心分離して採取した。ペレットを8M尿素で洗浄し、6Mのチオシアン酸グアニジン(GdmSCN)に溶解した。全てのタンパク質を10mM NH4HCO3に対して透析した。透析中に形成された沈殿を、50,000×gで30分間沈降させて除去し、残った可溶性シルクタンパク質を凍結乾燥した。分析に先立って、凍結乾燥したタンパク質を6MのGdmSCNに溶解してから適切なバッファに対して透析した。125,000×gで30分間沈降させて凝集物を除去した。タンパク濃度は、光路長1cmのキュベット中で、消光係数計算値(表1)(3)を使用して276nmで測光により決定した。タンパク質の同一性は、硫酸ドデシルナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE;>10%トリス‐グリシンゲル)を実施した後にポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン(Millipore社、米国マサチューセッツ州ビレリカ)にブロッティングし、一次抗体としてマウス抗T7モノクローナル抗体(Novagen社、1:10,000)および二次抗体として抗マウスIgGペルオキシダーゼ共役抗体(Sigma−Aldrich社、1:5,000)を使用して検出することにより確認した。ペルオキシダーゼ活性を、Amersham Biosciences社(米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在)のECLplus(商標)ウエスタンブロット検出キットを使用して視覚化した。
蛍光スペクトルは、FluoroMax(R)分光蛍光計(Jobin Yvon社、米国ニュージャージー州エジソン所在)で記録した。スペクトルは、25℃で10mM NH4HCO3または10mH トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)/HCl(pH8.0)中で測定した。積分時間は1秒、ステップサイズは0.5nm、帯域幅はそれぞれ5nm(励起)および5nm(発光)とした。
遠紫外線円偏光二色性(CD)スペクトルは、温度調節装置を装備したJasco715型分光旋光計(Jasco International Co.Ltd.社)、日本国東京所在)を使用して得られた。スペクトルはすべて、光路長0.1cmの石英キュベットで、10mMトリス/HCl(pH8.0)中でタンパク質濃度150μg/mlとして20℃で測定した。スキャン速度を20nm/分とし、ステップサイズを0.2nmとし、積分時間を1秒にセットし、帯域幅は1nmとした。4回のスキャンを平均してバッファで補正した。
種々のpH値および種々のリン酸塩濃度におけるタンパク質の溶解度を試験するために、凍結乾燥したタンパク質を6M GdmSCNに溶解し、10mM Tris/HCl(pH8.0)に対してpHで透析した。サンプルはすべて種々のバッファ(以下参照)注で室温で2時間インキュベートし、125,000×gで25分間沈降させることによりすべてのサンプルからタンパク質沈殿物を取り除き、残った可溶性タンパク質の量を測光分析により決定した。可溶性タンパク質および凝集タンパク質の合計は最初の可溶性タンパク質の量と等しいはずので、最初に用いたタンパク質の量から可溶性タンパク質の量を差し引くことにより、凝集タンパク質の割合(%)を計算することができた。対照として、タンパク質を10mM Tris/HCl(pH8.0)中でインキュベートした。
タンパク質溶液を種々のpHのバッファ(表2)で1:10に希釈した。最終タンパク
質濃度は、NHCYS3C16およびCCC16の場合は0.2mg/mlであり、C16CCの場合は0.174mg/mlであった。
タンパク質溶液をKXHXPO4(pH8.0)で1:5に希釈した。最終タンパク質濃
度は0.4mg/mlとし、リン酸塩濃度は50mM、100mM、200mM、300mMおよび500mMとした。
修飾スパイダーシルクタンパク質に小分子有機化合物を結合するために、蛍光染料ローダミンをタンパク質NHCYS3C16に結合した。1mM ローダミンRedTMC2マレイミ
ド(Molecular Probes社、オランダ国ライデン所在)のDMSOストック溶液を10mM Tris/HCl(pH7.5)のタンパク質溶液に加え、20の過剰モルを得た。反応は4℃で暗室にて一晩行なった。残りの非結合の蛍光染料を不活性化するために、100mM 2−メルカプトエタノールを反応溶液に加え、サイズ排除クロマトグラフィ(PD10カラム、Sephadex25、Pharmacia Biotech社、スウェーデンウプサラ所在)にかけた。分画を集め、UV分光測定法によりタンパク質の存在について試験し、SDS−PAGEにより最終的に分析した。タンパク質と蛍光色素分子(フルオロフォア)の視覚化は、銀染色法および532nmの励起波長および580nmの発光波長でTyphoon 9200 Variable Mode Imager(Molecular Dynamics、Amersham Pharmacia Biotech社、スウェーデンウプサラ所在)を使用した蛍光イメージングによりそれぞれ行なった。
修飾合成スパイダーシルクの設計、合成および精製
ニワオニグモ(Araneus diadematus)由来の牽引糸シルクタンパク質ADF−4に由来する合成スパイダーシルクモジュールC(配列番号3)に基づく、種々の修飾モジュールを作製した。修飾はTAGまたはモジュールCのいずれかにおける各バリアント注の1つのシステインを含む。ここでは位置25のセリンをシステインに変異させたが、それは両者のアミノ酸のサイズおよび極性が類似しているためである。さらに、この突然変異に対する疎水性の予測がモジュールCとわずかにしか異ならないため、かかる位置はタンパク質特性にあまり影響しないと考えられた。生じたモジュールCC(配
列番号10)をPCR突然変異誘発を使用して取得した(実験手順を参照)。以下の工程で、モジュールCCの核酸を、C16をコードする核酸配列の上流または下流でクローニン
グベクターpAZL(配列番号29)を用いてクローニングし、タンパク質CCC16また
はC16CCを生成した。さらに、グリシン、セリンおよび1つのシステインから成るTA
Gをコードするオリゴヌクレオチド配列(NHCYS3、配列番号22)をC16をコードする
5’−末端ヌクレオチド配列の位置でクローニングし、NHCYS3C16を生成した。
二次構造をCD分光法により調査した。修飾タンパク質はすべて、本質的に構造化していないタンパク質に典型的なスペクトルを示すC16と類似のスペクトルを示した(図4)。
pH、カリウムやリン酸塩のようなイオン、および機械的ストレスは、天然シルクの集合に関与する。本願発明者らは、C16と比較した修飾タンパク質CCC16、C16CC、およびNHCYS3C16の集合挙動に対する種々のリン酸カリウム濃度および種々のpHの影響について調べた。すべての修飾タンパク質は5.0より低いpH値で有意な凝集(>10%)を示した。CCC16は、7.0より低い値でさえ有意な凝集を示し、pH1で70%を
超える凝集を示した。対照的に、C16はかかる条件下では程ほどの凝集しか示さなかった(図5A)。同様に、リン酸カリウムは、C16で観察されるよりも低濃度で修飾タンパク質を凝集させた(図5B)。修飾タンパクの凝集がこのように大きく影響を受けることについては、タンパク質の電荷の違いでは説明できない。なぜなら、それらの修飾タンパク質の理論的等電点はC16の理論的等電点と同じである(NHCYS3C16)か、非常にわずかにしか異ならない(CCC16で3.45、C16で3.48)ためである。したがって、こ
の結果は、システインの存在と、安定した二量体を形成する可能性とによる可能性がある。
スパイダーシルク配列ADF−3およびADF−4に由来する合成スパイダーシルクタンパク質は、球体、ナノフィブリル、発泡体、およびフィルム等の形態学的に異なる形式に組み立てることができる。以下の実験を、修飾スパイダーシルクタンパク質が異なる集合挙動に関して同じ特徴を示すことを実証するために行なった。
1mg/mlのCCC16、C16CC、NHCYS3C16およびC16の10mM Tris−(
ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)(pH8.0)溶液に2.4M 硫酸アンモニウムを加えることにより、0.3から1.5μmの間の範囲の直径を示すタンパク質球体(図6A)が生成された。修飾たんぱく質から形成された球体と、C16から形成された球体との間に有意な違いは見出されなかった。
ナノフィブリルは、C16CCおよびNHCYS3C16の10mM Tris溶液(pH8.
0)を4℃で数週間インキュベートした後、室温で3日間インキュベートすることにより生成された(図6B)。
ニワオニグモ(Araneus diadematus)由来の牽引糸シルクタンパク質ADF−4に由来する合成スパイダーシルクタンパク質から形成されたフィルムは、ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)またはギ酸から(5)から注型成形することが可能である。凍結乾燥されたタンパク質を、HFIPまたはギ酸に直接溶解した。HFIPは修飾タンパク質CCC16、C16CCQ6およびNHCYS3C16の二次構造の増加を引き起こす。10mM Tris(pH8.0)中では、これらのタンパク質のCDスペクトルは、主としてランダムコイル状のタンパク質を示す波長200nm未満での単一の極小値のみを示した(図4)が、対照的に、HFIP中のタンパク質溶液のCDスペクトルは202−203nmにおける最小値と、220nmにおけるさらなる肩とを示し、これはα−へリックス含有量の増加を示す(図7)。
び220nmでの2つの最小値を示した。C16CCタンパク質フィルムは、200nmで
単一の最小値を有するCDスペクトルを示した。
システインまたはリジンによる合成スパイダーシルクの修飾は、薬物、金属、ポリペプチド、量子ドット等の特異的結合を可能にする。有機小分子へのシステインのSH基の結合を実証するために、蛍光色素分子ローダミンをタンパク質NHCYS3C16に結合させた。ローダミンはマレインイミド共役形式の中で使用され、これはpH7.0−7.5でSH基と容易にかつ非常に特異的に反応する。SDS−PAGEと、その後に続く蛍光イメージングおよび銀染色法(図8)により、有効なカップリングが目で観察された。
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Claims (42)
- スパイダーシルクタンパク質を修飾する方法であって、
a)スパイダーシルクタンパク質、またはリジン残基もシステイン残基も含まない同スパイダーシルクタンパク質のフラグメントもしくはバリアントをコードする核酸を提供する工程と、
b)前記スパイダーシルクタンパク質中の1または複数のアミノ酸をコードする核酸をリジンまたはシステインをコードする核酸配列により置換するか、またはリジンおよびシステインの少なくとも一方をコードする核酸配列を有する核酸配列を前記配列に付加する工程と、
c)工程b)で得られた修飾核酸配列を適切な宿主中で発現する工程と、
d)発現した修飾スパイダーシルクタンパク質を回収する工程と、
から成る方法。 - 前記修飾スパイダーシルクタンパク質中の前記リジンおよびシステイン分子の少なくとも一方に他の物質を結合する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 工程b)で置換される1または複数のアミノ酸が、グリシン、アラニン、セリン、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩およびスレオニンから選択される請求項1または2に記載の方法。
- 前記リジンおよびセリンの少なくとも一方に結合される物質は、ポリペプチド、多糖類、マーカー分子、量子ドット、金属、核酸、脂質および低分子薬物から選択される請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記低分子薬物はカルボキシル基、カルボニル基、イミド基、またはチオール基を有する薬物から選択される請求項4に記載の方法。
- 工程a)で提供されるスパイダーシルクタンパク質は牽引糸および鞭毛状タンパク質の少なくとも一方を主成分とする請求項1〜5に記載の方法。
- 工程a)で提供される牽引糸および鞭毛状タンパク質の少なくとも一方のタンパク質は、円網性種(Orb Web Spider)のコガネグモ(Araneidae)およびアラネオイド(Araneoids)の牽引糸または鞭毛状タンパク質から選択される請求項6に記載の方法。
- 工程a)で提供される牽引糸および鞭毛状タンパク質の少なくとも一方のタンパク質は、ニワオニグモ(Araneus diadematus)およびアメリカジョロウグモ(Nephila clavipes)の少なくとも一方に由来する請求項7に記載の方法。
- 前記フラグメントは1または複数のポリアラニン含有コンセンサス配列を有するモジュールである請求項8に記載の方法。
- 前記ポリアラニン含有コンセンサス配列はADF−3に由来し、配列番号1のアミノ酸配列(モジュールA)またはそのバリアントを有する請求項9に記載の方法。
- 前記フラグメントはADF−3に由来するモジュールであり、配列番号2のアミノ酸配列(モジュールQ)またはそのバリアントを有する請求項8に記載の方法。
- 工程a)で提供されるスパイダーシルクタンパク質が1または複数の(AQ)、(QAQ)、または(AQ)と(QAQ)の両方を有する請求項10または11に記載の方法。
- 前記スパイダーシルクタンパク質が(AQ)12、(AQ)24、(QAQ)8、または(Q
AQ)16を有する請求項12に記載の方法。 - 前記フラグメントは、ADF−4に由来するモジュールであり、配列番号3のアミノ酸配列(モジュールC)またはそのバリアントを有する請求項8に記載の方法。
- 工程a)で提供されるスパイダーシルクタンパク質がC16またはC32を有する請求項14に記載の方法。
- 前記フラグメントは鞭毛状タンパク質に由来するモジュールであり、モジュールK(配列番号4)、モジュールsp(配列番号5)、モジュールX(配列番号6)、およびモジュールY(配列番号7)の少なくとも一つ、またはそれらのバリアントである請求項8に記載の方法。
- 前記スパイダーシルクタンパク質がY8、Y16、X8、X16、K8、K16またはY6X2sp1K2Y2を有する請求項16に記載の方法。
- 工程d)で回収される修飾スパイダーシルクタンパク質が配列番号8〜19のモジュールのうちの1または複数を有する請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 工程d)で回収される修飾スパイダーシルクタンパク質に、またはステップa)で提供されるスパイダーシルクタンパク質に、配列番号20〜24のアミノ末端TAGおよび配列番号25〜28のカルボキシル末端TAGの少なくとも一方が付加される請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜19のいずれかに記載の方法により得られる修飾スパイダーシルクタンパク質。
- 配列番号8〜28のモジュールの1または複数を有する修飾スパイダーシルクタンパク質。
- 請求項1の工程d)で得られる修飾スパイダーシルクタンパク質または請求項20または21に記載の修飾スパイダーシルクタンパク質をコードする核酸配列。
- 請求項22に記載の核酸配列と、1または複数の調節配列とを有する発現ベクター。
- プラスミドまたはウイルスベクターであり、好ましくはバキュロウイルス系またはワクシニアウイルスベクター系である請求項23に記載のベクター。
- 請求項22に記載の核酸配列を有し、好ましくは配列番号29またはそのバリアントのクローニングベクターに由来するベクター。
- 請求項23〜25のベクターで形質転換された宿主。
- 原核細胞である請求項26に記載の宿主。
- 大腸菌(E.coli)または枯草菌(Bacillus subtilis)である請
求項27に記載の宿主。 - 真核細胞である請求項26に記載の宿主。
- 哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞または昆虫細胞である請求項29に記載の宿主。
- CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、293T細胞、HEH細胞またはBHK細胞である請求項30に記載の哺乳動物細胞。
- 酵母細胞である請求項31に記載の宿主。
- 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、またはハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)である請求項32に記載の宿主。
- 昆虫細胞が、鱗翅類の昆虫細胞、好ましくはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)由来およびイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)由来の細胞から選択される請求項30に記載の宿主。
- 昆虫細胞はSf9細胞、Sf21細胞またはhighfive細胞である請求項34に記載の宿主。
- 植物細胞は、タバコ、じゃがいも、トウモロコシ、エンドウマメおよびトマトに由来する請求項30に記載の宿主。
- 請求項20または21に記載の修飾スパイダーシルクタンパク質と、医薬として許容される担体とを含有する医薬組成物または化粧組成物。
- 請求項20または21に記載の修飾スパイダーシルクタンパク質から製造された繊維/糸、フィラメント、フィルム、発泡体、球体、ナノフィブリル、ヒドロゲルおよびその等価物。
- 請求項20または21に記載の修飾スパイダーシルクタンパク質を含有する紙製品。
- 請求項20または21に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質を含有する織物または革製品。
- 前記組換えスパイダーシルクタンパク質がコーティングとして存在する請求項39または40に記載の紙製品、織物または革製品。
- 請求項20または21に記載のタンパク質を含有するか、同タンパク質から構成されたゲルまたは発泡体。
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