WO2021187500A1 - 成形材料用の化学修飾人工タンパク質及びその製造方法 - Google Patents

成形材料用の化学修飾人工タンパク質及びその製造方法 Download PDF

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WO2021187500A1
WO2021187500A1 PCT/JP2021/010696 JP2021010696W WO2021187500A1 WO 2021187500 A1 WO2021187500 A1 WO 2021187500A1 JP 2021010696 W JP2021010696 W JP 2021010696W WO 2021187500 A1 WO2021187500 A1 WO 2021187500A1
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WO
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amino acid
seq
artificial
fibroin
protein
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Application number
PCT/JP2021/010696
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English (en)
French (fr)
Inventor
一樹 坂田
奈緒 北原
誠司 白川
オリバ－ セイエッド シャファート
れおな 武藤
Original Assignee
Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans

Definitions

  • the present invention relates to a chemically modified artificial protein for a molding material and a method for producing the same.
  • Patent Document 1 discloses that a molded product obtained by compression molding wool, cashmere fibers, waterfowl blades, or the like has high mechanical properties such as stress-strain characteristics.
  • the materialization of artificial proteins that can be industrially produced has been studied, and in particular, applied research as a molding material for artificial fibroin having the characteristics of spider silk having excellent strength and elongation is being conducted.
  • an object of the present invention is to provide a chemically modified artificial protein capable of imparting various functions.
  • the present invention provides the following [1] to [17].
  • [1] A chemically modified artificial protein for a molding material having a pendant group containing a maleimide group.
  • the artificial protein according to [1] which is a chemically modified hydrophobic artificial protein having a pendant group containing a maleimide group.
  • the artificial protein according to [3] which is a chemically modified artificial fibroin having a pendant group containing a maleimide group.
  • [5] The artificial protein according to [4], which is a chemically modified artificial spider silk fibroin having a pendant group containing a maleimide group.
  • a method for producing a chemically modified artificial protein which comprises a step of obtaining a chemically modified artificial protein represented by the formula (II) by reacting the artificial protein with a compound represented by the formula (I).
  • X represents a leaving group and L represents a linker moiety.
  • L represents a linker moiety
  • Prot represents an artificial protein
  • Y represents a heteroatom in the amino acid residue of the artificial protein
  • n represents an integer of 1-10.
  • L represents a linker moiety
  • Prot represents an artificial protein
  • Y represents a heteroatom in the amino acid residue of the artificial protein
  • n represents an integer of 1-10.
  • the molding material according to [15], wherein the artificial fibroin is a modified spider silk fibroin.
  • the chemically modified artificial protein of the present invention can be bound to various functional substances by a simple operation, and various functions can be imparted according to the functional substances.
  • GPC gel filtration chromatography
  • the first embodiment of the present invention is a chemically modified artificial protein for a molding material having a pendant group containing a maleimide group, and is a compound represented by the formula (II).
  • the chemically modified artificial protein according to the present embodiment can be produced by chemically modifying the artificial protein and introducing a pendant group containing a maleimide group.
  • L represents a linker moiety
  • Prot represents an artificial protein
  • Y represents a heteroatom in the amino acid residue of the artificial protein
  • n represents an integer of 1-10.
  • artificial proteins include arbitrary proteins that can be produced on an industrial scale, and examples thereof include proteins that can be used for industrial purposes, proteins that can be used for medical purposes, and structural proteins. "Available for industrial use” means that it can be used for various general-purpose materials used indoors or outdoors, for example. Specific examples of proteins that can be used for medical purposes include enzymes, regulatory proteins, receptors, peptide hormones, cytokines, membrane or transport proteins, antigens used for vaccination, vaccines, antigen-binding proteins, immunostimulatory proteins, allergens, completeness. Long antibodies or antibody fragments or derivatives can be mentioned. Examples of proteins that can be used industrially include structural proteins.
  • structural proteins include spider silk (spider silk), silk moth silk, keratin, collagen, elastin and resilin, and proteins derived from these.
  • artificial fibroin is preferable, and artificial spider silk fibroin (artificial modified spider silk fibroin) is more preferable.
  • the artificial protein includes a recombinant protein and a synthetic protein. That is, as used herein, the term “artificial protein” means an artificially produced protein.
  • the artificial protein may be a protein whose domain sequence is different from the amino acid sequence of the naturally occurring protein, or may be a protein having the same amino acid sequence as the naturally occurring protein. Further, the “artificial protein” may be one in which the amino acid sequence of the naturally occurring protein is used as it is, or one in which the amino acid sequence is modified based on the amino acid sequence of the naturally occurring protein (for example, cloned natural).
  • the chemically modified artificial protein does not include the introduction of a partial structure not derived from amino acids by chemical modification.
  • the artificial protein unlike the natural protein, can freely design the amino acid sequence. Therefore, when such an artificial protein is used as a chemically modified artificial protein, it is possible to arbitrarily control the functions, properties, physical properties, etc. of the molding material and the molded product by appropriately designing the amino acid sequence of the artificial protein. It will be possible.
  • the artificial protein according to this embodiment may have 50 or more amino acid residues.
  • the number of amino acid residues may be, for example, 100 or more or 150 or more, 200 or more or 250 or more, and preferably 300 or more, 350 or more, 400 or more, 450 or more or 500 or more.
  • a preferred embodiment of the first embodiment of the present invention is a chemically modified artificial fibroin for a molding material having a pendant group containing a maleimide group, which is a compound represented by the formula (II').
  • L represents a linker moiety
  • Fib represents an artificial fibroin
  • Y represents a heteroatom in the amino acid residue of the artificial fibroin
  • n represents an integer of 1 to 10.
  • the artificial protein according to this embodiment is preferably a chemically modified hydrophobic artificial protein.
  • Chemically modified hydrophobic artificial protein is obtained by chemically modifying a hydrophobic artificial protein.
  • Hydrophobic artificial proteins can be determined based on at least one of the hydrophobicity index (mean hydropathy index) of amino acid residues, which will be described later, solubility, contact angle with water, and the presence or absence of decomposition by hot water.
  • Preferred hydrophobic artificial proteins have a hydrophobicity index of, for example, 0 or more, 0.1 or more, 0.2 or more, 0.22 or more, 0.25 or more, 0.3 or more, 0.35 or more, 0.
  • the preferable hydrophobic artificial protein has a maximum concentration (solubility) of, for example, 30% by mass, less than 25% by mass, less than 20% by mass when dissolved in an aqueous solution of lithium bromide (concentration: 9M) at 60 ° C. It may be less than 15% by mass, less than 10% by mass, less than 5% by mass, or less than 1% by mass.
  • the preferable hydrophobic artificial protein may be one that is completely insoluble in an aqueous solution of lithium bromide (concentration: 9M) at 60 ° C.
  • a preferable hydrophobic artificial protein is a contact angle with water (when water is dropped on a membrane formed by using the artificial protein, or after a predetermined time has passed (for example, after 5 seconds have passed). ) Can be 55 ° or higher, 60 ° or higher, 65 ° or higher, or 70 ° or higher.
  • preferred hydrophobic artificial proteins have excellent heat resistance. For example, a dispersion consisting of an artificial protein and water, wherein the content of the artificial protein is 5% by mass is prepared, and the dispersion is heat-treated at 100 ° C. for 5 hours so as not to be decomposed. Artificial protein is judged as the above-mentioned hydrophobic artificial protein.
  • the artificial protein according to the present embodiment is a chemically modified hydrophobic artificial protein obtained by chemically modifying the above-mentioned hydrophobic artificial protein, for example, improvement in water resistance can be expected.
  • a chemically modified hydrophobic artificial protein is used as a molding material, for example, improvement in water resistance may be desired in a molded product produced using such a molding material.
  • a molded product is used as a general-purpose material for industrial use, it can be expected that the service life will be extended based on the water resistance.
  • the chemically modified artificial protein controls the hydrophobicity or hydrophilicity of the functional substance when the functional substance is bound, thereby controlling the hydrophobicity or hydrophilicity of the entire conjugate of the functional substance and the chemically modified artificial protein.
  • the hydrophilicity can be adjusted arbitrarily, but when the artificial protein has hydrophobicity, the entire conjugate can be shifted to the hydrophobic side as compared with the case where the artificial protein has hydrophilicity. This makes it possible to control the hydrophobicity or hydrophilicity of the entire synthetic polymer over a wider range.
  • the artificial protein according to this embodiment may be, for example, a structural protein.
  • the structural protein means a protein related to the structure of a living body, a protein constituting a structure produced by a living body, or a protein derived from them.
  • Structural proteins also refer to proteins that self-aggregate under certain conditions to form structures such as fibers, films, resins, gels, micelles, and nanoparticles. In nature, for example, fibroin, keratin, and collagen. Examples include gen, elastin and resilin.
  • the structural protein may be an artificial structural protein.
  • artificial structural protein means an artificially produced structural protein.
  • the artificial structural protein may be any artificial structural protein in which a pendant group containing a maleimide group can be introduced by chemical modification. It may be a structural protein produced microbially by gene recombination, including an amino acid sequence improved from the viewpoint of moldability and productivity, and is not limited to the sequence of a naturally occurring structural protein.
  • the alanine residue and the glycine residue are non-polar amino acids in the side chain, they are arranged so as to face inward in the folding process in polypeptide production, and easily form an ⁇ -helix structure or a ⁇ -sheet structure. Therefore, it is desirable that the proportion of amino acids such as glycine residue, alanine residue, and serine residue is high.
  • the alanine residue content may be 10-40%, 12-40%, 15-40%, 18-40%, 20-40%. It may be 22-40%.
  • the glycine residue content may be 10 to 55%, 11% to 55%, 13% to 55%, 15% to 55%, 18% to. It may be 55%, 20% to 55%, 22% to 55%, 25% to 55%.
  • alanine residue content is a value represented by the following formula.
  • Alanine residue content (number of alanine residues contained in the polypeptide / number of total amino acid residues in the polypeptide) x 100 (%) Further, the glycine residue content, the serine residue content, the threonine residue content, the proline residue content and the tyrosine residue content are as follows. It is synonymous with what is read as a threonine residue, a proline residue, and a tyrosine residue.
  • amino acids having large side chains or flexible amino acids are homogeneous in the entire sequence to a certain extent. It is desirable that it is contained in, and specifically, a motif containing a tyrosine residue, a threonine residue, and a proline residue may be repeatedly contained in a cycle.
  • the total content of proline residue, threonine residue and tyrosine residue in any consecutive 20 amino acid residue may be 5% or more, 10% or more, or 15% or more, and 50% or less. , 40% or less, 30% or less, or 20% or less.
  • the total of the serine residue content, the threonine residue content and the tyrosine residue content may be 4% or more, 4.5% or more, and 5 % Or more, 5.5% or more, 6% or more, 6.5% or more, 7% or more.
  • the total of serine residue content, threonine residue content and tyrosine residue content may be, for example, 35% or less, 33% or less, 30% or less, 25% or less. It may be 20% or less.
  • the artificial structural protein according to one embodiment may have a repetitive sequence. That is, the polypeptide according to the present embodiment may have a plurality of amino acid sequences (repeated sequence units) having high sequence identity in the polypeptide.
  • the number of amino acid residues in the repetitive sequence unit is preferably 6 to 200.
  • the sequence identity between the repetitive sequence units may be, for example, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more. It may be 98% or more, and may be 99% or more.
  • the hydrophobicity index (mean hydropathy index) of the repeating sequence unit is, for example, -0.8 or more, -0.7 or more, -0.6 or more, -0.5 or more, -0.4 or more, -0.3 or more, -0.2 or more, -0.1 or more, 0 or more, 0.1 or more, 0.2 or more, 0.22 or more, 0.25 or more, 0.30 or more, 0.35 or more , 0.40 or more, 0.45 or more, 0.50 or more, 0.55 or more, 0.60 or more, 0.65 or more, or 0.70 or more.
  • the upper limit of the hydrophobicity of the repetitive sequence unit is not particularly limited, but may be, for example, 1.0 or less, or 0.7 or less.
  • the artificial structural protein according to one embodiment may contain (A) n motif.
  • the (A) n motif means an amino acid sequence mainly composed of an alanine residue.
  • the number of amino acid residues of the n motif may be 2 to 27, and may be an integer of 2 to 20, 2 to 16, or 2 to 12. Further, (A) the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 40% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, It may be 86% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).
  • the artificial structure protein preferably has an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue at a position adjacent to the glycine residue, serine residue, or alanine residue, and the artificial structure protein preferably has an amino acid sequence corresponding to that of the glycine residue. It is more preferable to have an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue at adjacent positions.
  • the mercapto group (-SH) existing in the side chain of the cysteine residue easily forms a disulfide bond within or between the molecules, which further improves the physical properties. It can be further improved.
  • the cysteine residue may be located between the glycine residue, serine residue, or alanine residue and the glycine residue, serine residue, or alanine residue, and the serine residue and the glycine residue. It may be located between.
  • the artificial structure protein has an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue at a position adjacent to the hydrophobic amino acid residue.
  • the hydrophobic amino acid residues are fixed between the molecules by hydrophobic interaction, so that the mercapto group (-SH) at the cysteine residue easily forms a disulfide bond, further improving the physical properties. Can be done.
  • the cysteine residue may be located next to the hydrophobic amino acid residue and may be located between the hydrophobic amino acid residue and an amino acid residue other than the hydrophobic amino acid residue, and is hydrophobic.
  • the hydrophobic amino acid residue may be one selected from the group consisting of isoleucine residue, valine residue, leucine residue, phenylalanine residue, methionine residue, and alanine residue.
  • artificial fibroin As the artificial structural protein, artificial fibroin is preferable.
  • examples of fibroin include naturally occurring fibroin.
  • examples of naturally occurring fibroin include fibroin produced by insects or spiders.
  • fibroins produced by insects include Bombyx mori, Bombyx mandarina, Antheraea yamamai, Anteraea perni, tussah, and tussah.
  • Silk moth (Samia synthia), Chrysanthemum (Caligra japonica), Chusser silk moth (Antheraea mylitta), Muga silk moth (Antheraea assama) Silk protein can be mentioned.
  • fibroin produced by insects include silk moth fibroin L chain (GenBank accession number M76430 (base sequence), AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • fibroins produced by spiders include spiders belonging to the genus Araneus such as spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders,
  • Spiders belonging to (Gasteracantha genus), spiders belonging to the genus Isekigumo (genus Ordgarius) such as Mameitaisekigumo and Mutsutogaysekigumo, spiders belonging to the genus Koganegumo, Kogatakoganegumo and Nagakoganegumo, etc.
  • Spider silk protein can be mentioned.
  • examples of the spider silk protein include traction thread proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2), and the like.
  • fibroin produced by spiders include, for example, fibroin-3 (aff-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession numbers AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin-.
  • fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank can be mentioned.
  • sequence information registered in NCBI GenBank among the sequences containing INV as DIVISION, spidroin, amplifier, fibroin, "silk and protein", or “silk and protein” are described as keywords in DEFINITION. It can be confirmed by extracting a sequence, a character string of a specific protein from CDS, and a sequence in which a specific character string is described in TISSUE TYPE from SOURCE.
  • artificial fibroin means artificially manufactured fibroin (artificial fibroin).
  • the artificial fibroin may be a fibroin having a different amino acid sequence from the naturally occurring fibroin, or may be a fibroin having the same amino acid sequence as the naturally occurring fibroin.
  • the artificial fibroin may be a fibrous protein having a structure similar to that of naturally-derived fibroin, or may be fibroin having a sequence similar to the repetitive sequence of naturally-derived fibroin.
  • the "sequence similar to the repetitive sequence possessed by fibroin" may be a sequence actually possessed by naturally occurring fibroin, or may be a sequence similar thereto.
  • the "artificial fibroin”, if it has the amino acid sequence specified in the present disclosure, is one in which the amino acid sequence is modified by relying on the naturally occurring fibroin (for example, the gene sequence of the cloned naturally occurring fibroin is modified).
  • the amino acid sequence may be modified by the above (for example, by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence) by artificially designing the amino acid sequence regardless of naturally occurring fibroin. It may have a desired amino acid sequence).
  • An artificial fibroin having a modified amino acid sequence is also included in the artificial fibroin if the amino acid sequence is different from that of the naturally occurring fibroin.
  • artificial fibroin examples include artificial silk fibroin (modified amino acid sequence of silk protein produced by silkworm) and artificial spider silk fibroin (modified amino acid sequence of spider silk protein produced by spiders). ) And so on. Since artificial fibroin is relatively easy to fibrillate and has high fiber forming ability, it preferably contains artificial spider silk fibroin as a molding material, and more preferably consists of artificial spider silk fibroin.
  • the artificial fibroin according to the present embodiment has a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It may be a protein contained.
  • the artificial fibroin may further have an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) added to either or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence.
  • the N-terminal sequence and the C-terminal sequence are not limited to this, but are typically regions that do not have the repetition of the amino acid motif characteristic of fibroin, and consist of about 100 residues of amino acids.
  • the chemically modified artificial fibroin does not include the introduction of a partial structure not derived from amino acids by chemical modification.
  • domain sequence refers to a fibroin-specific crystalline region (typically corresponding to (A) n motif of amino acid sequence) and an amorphous region (typically, REP of amino acid sequence).
  • An amino acid sequence that produces (corresponding to.)) which is represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif.
  • the (A) n motif shows an amino acid sequence mainly composed of alanine residues, and the number of amino acid residues is 2 to 27.
  • the number of amino acid residues of the n motif may be an integer of 2 to 20, 4 to 27, 4 to 20, 8 to 20, 10 to 20, 4 to 16, 8 to 16, or 10 to 16. .
  • the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 40% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, It may be 86% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).
  • a plurality of (A) n motifs present in the domain sequence may be composed of at least seven alanine residues only.
  • REP shows an amino acid sequence consisting of 2-200 amino acid residues.
  • REP may be an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 2 to 300 and may be an integer of 10 to 300.
  • the plurality of (A) n motifs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • the plurality of REPs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • artificial fibroin examples include artificial fibroin (first artificial fibroin) derived from the large spitting tube bookmark thread protein produced in the large bottle-shaped gland of spiders, and a domain sequence with a reduced content of glycine residues.
  • An artificial fibroin having a reduced domain sequence can be mentioned.
  • the first artificial fibroin examples include proteins containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the number of amino acid residues of the (A) n motif is preferably an integer of 3 to 20, more preferably an integer of 4 to 20, even more preferably an integer of 8 to 20, and an integer of 10 to 20. Is even more preferable, an integer of 4 to 16 is even more preferable, an integer of 8 to 16 is particularly preferable, and an integer of 10 to 16 is most preferable.
  • the number of amino acid residues constituting REP in the formula 1 is preferably 10 to 200 residues, more preferably 10 to 150 residues, and 20 to 100 residues.
  • the total number of residues of glycine residue, serine residue and alanine residue contained in the amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m is the amino acid residue. It is preferably 40% or more, more preferably 60% or more, and further preferably 70% or more with respect to the total number.
  • the first artificial fibroin contains the unit of the amino acid sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and the C-terminal sequence is the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3 or It may be a polypeptide having an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the same as the amino acid sequence consisting of 50 residues at the C-terminal of the amino acid sequence of ADF3 (GI: 1263287, NCBI), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a sequence. It is the same as the amino acid sequence in which 20 residues were removed from the C end of the amino acid sequence shown in No. 1, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained by removing 29 residues from the C end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It has the same amino acid sequence.
  • the amino acid sequence shown in (1-i) SEQ ID NO: 4 (recombinant spider silk protein ADF3 KaiLargeNRSH1), or the amino acid sequence shown in (1-ii) SEQ ID NO: 4 and 90
  • An artificial fibroin containing an amino acid sequence having a sequence identity of% or more can be mentioned.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 is the first to the amino acid sequence of ADF3 in which the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) consisting of the starting codon, His10 tag and the HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminal.
  • the 13th repeat region is increased approximately twice and mutated so that the translation terminates at the 1154th amino acid residue.
  • the amino acid sequence at the C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the artificial fibroin of (1-i) may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the second artificial fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of glycine residues as compared with naturally occurring fibroin. It can be said that the second artificial fibroin has an amino acid sequence corresponding to at least one or more glycine residues in REP replaced with another amino acid residue as compared with naturally occurring fibroin. ..
  • the second artificial fibroin has a domain sequence of GGX and GPGXX in REP (where G is a glycine residue, P is a proline residue, and X is an amino acid residue other than glycine) as compared with naturally occurring fibroin.
  • G is a glycine residue
  • P is a proline residue
  • X is an amino acid residue other than glycine
  • it has an amino acid sequence corresponding to at least one or a plurality of glycine residues in the motif sequence being replaced with another amino acid residue. You may.
  • the ratio of the motif sequence in which the above-mentioned glycine residue is replaced with another amino acid residue may be 10% or more of the total motif sequence.
  • the second artificial fibroin contains the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and the domain sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side from the above domain sequence.
  • the total number of amino acid residues in the amino acid sequence consisting of XGX (where X indicates amino acid residues other than glycine) contained in all REPs in the sequence excluding the sequence up to the C-terminal of is z, and the above domain sequence.
  • the number of alanine residues with respect to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. It is even more preferably 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).
  • the second artificial fibroin is preferably one in which the content ratio of the amino acid sequence consisting of XGX is increased by substituting one glycine residue of the GGX motif with another amino acid residue.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, further preferably 10% or less, 6 % Or less is even more preferable, 4% or less is even more preferable, and 2% or less is particularly preferable.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence can be calculated by the same method as the method for calculating the content ratio (z / w) of the amino acid sequence consisting of XGX below.
  • fibroin artificial fibroin or naturally-derived fibroin
  • domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m it is located most on the C-terminal side from the domain sequence (A) n.
  • the amino acid sequence consisting of XGX is extracted from all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the motif to the C end of the domain sequence.
  • z / w (%) can be calculated by dividing z by w.
  • z / w in naturally derived fibroin will be described.
  • 663 types of fibroin (of which 415 types of spider-derived fibroin were extracted) were extracted.
  • Naturally-derived fibroin containing the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m among all the extracted fibroins and having an amino acid sequence consisting of GGX in the fibroin of 6% or less.
  • z / w was calculated by the above-mentioned calculation method. The result is shown in FIG.
  • the horizontal axis of FIG. 2 indicates z / w (%), and the vertical axis indicates frequency.
  • the z / w in naturally-derived fibroin is less than 50.9% (the highest is 50.86%).
  • z / w is preferably 50.9% or more, more preferably 56.1% or more, further preferably 58.7% or more, and 70% or more. Is even more preferable, and 80% or more is even more preferable.
  • the upper limit of z / w is not particularly limited, but may be, for example, 95% or less.
  • the second artificial fibroin is, for example, modified from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence by substituting at least a part of the base sequence encoding the glycine residue to encode another amino acid residue.
  • one glycine residue in the GGX motif and the GPGXX motif may be selected as the glycine residue to be modified, or may be replaced so that z / w is 50.9% or more. It can also be obtained, for example, by designing an amino acid sequence satisfying the above embodiment from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • one or more amino acid residues are further substituted or deleted.
  • Insertion and / or modification of the amino acid sequence corresponding to the addition may be performed.
  • the other amino acid residue described above is not particularly limited as long as it is an amino acid residue other than the glycine residue, but is a valine (V) residue, a leucine (L) residue, an isoleucine (I) residue, and methionine ( Hydrophobic amino acid residues such as M) residue, proline (P) residue, phenylalanine (F) residue and tryptophan (W) residue, glutamine (Q) residue, asparagine (N) residue, serine (S) ) Residues, hydrophilic amino acid residues such as lysine (K) residue and glutamate (E) residue are preferred, valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue, phenylalanine ( F) residues and glutamine (Q) residues are more preferred, and glutamine (Q) residues are even more preferred.
  • (2-i) SEQ ID NO: 6 (Met-PRT380), SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 9 (Met) - contains an amino acid sequence represented by PRT799) or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by (2-ii) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • Artificial fibroin can be mentioned.
  • the artificial fibroin of (2-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is obtained by substituting GQX for all GGX in the REP of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (Met-PRT313) corresponding to naturally occurring fibroin.
  • every two (A) n motifs are deleted from the N-terminal side to the C-terminal side from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence is further before the C-terminal sequence.
  • One [(A) n motif-REP] is inserted in.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 two alanine residues are inserted on the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and some glutamine (Q) residues are further added. It is substituted with a serine (S) residue and a part of the amino acid on the C-terminal side is deleted so as to have substantially the same molecular weight as that of SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is a region of 20 domain sequences existing in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). A predetermined hinge sequence and His tag sequence are added to the C-terminal of the sequence obtained by repeating the above four times.
  • the value of z / w in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (corresponding to naturally occurring fibroin) is 46.8%.
  • the z / w values in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 are 58.7%, respectively. It is 70.1%, 66.1% and 70.0%.
  • x / y in the jagged ratio (described later) of 1: 1.8 to 11.3 of the amino acid sequences shown by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 is They are 15.0%, 15.0%, 93.4%, 92.7% and 89.8%, respectively.
  • the artificial fibroin of (2-i) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the artificial fibroin of (2-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the artificial fibroin of (2-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the artificial fibroin (2-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and is contained in REP.
  • X indicates an amino acid residue other than glycine.
  • the second artificial fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminal and the C-terminal. This enables isolation, immobilization, detection, visualization, and the like of artificial fibroin.
  • an affinity tag using specific affinity (binding, affinity) with other molecules can be mentioned.
  • a histidine tag (His tag) can be mentioned.
  • the His tag is a short peptide in which about 4 to 10 histidine residues are lined up, and has the property of specifically binding to metal ions such as nickel. Therefore, isolation of artificial fibroin by metal chelating chromatography (chromatography). Can be used for.
  • Specific examples of the tag sequence include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (amino acid sequence including His tag sequence and hinge sequence).
  • tag sequences such as glutathione-S-transferase (GST) that specifically binds to glutathione and maltose-binding protein (MBP) that specifically binds to maltose.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose-binding protein
  • an "epitope tag” that utilizes an antigen-antibody reaction can also be used.
  • an antigenic peptide epitope
  • an antibody against the epitope can be bound.
  • the epitope tag include HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like.
  • a tag sequence that can be separated by a specific protease can also be used.
  • synthetic fibroin from which the tag sequence has been separated can also be recovered.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 16 are SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and sequence, respectively.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is added to the N-terminal of the amino acid sequences shown in No. 8 and SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 47.
  • the artificial fibroin of (2-iii) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the artificial fibroin (2-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the artificial fibroin of (2-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the artificial fibroin (2-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 and is contained in REP.
  • X indicates an amino acid residue other than glycine.
  • the second artificial fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the artificial protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the third artificial fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of (A) n motif as compared with naturally occurring fibroin. It can be said that the domain sequence of the third artificial fibroin has an amino acid sequence corresponding to the deletion of at least one or more (A) n motifs as compared with naturally occurring fibroin.
  • the third artificial fibroin may have an amino acid sequence corresponding to a 10-40% deletion of the (A) n motif from naturally occurring fibroin.
  • a third artificial fibroin its domain sequence, compared to the naturally occurring fibroin, at least from the N-terminal side toward the C-terminal one to three (A) n motif every one (A) n motif It may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of.
  • the third artificial fibroin has a domain sequence of at least two consecutive (A) n- motif deletions and one (A) from the N-terminal side to the C-terminal side as compared to naturally occurring fibroin. ) It may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of the n-motif being repeated in this order.
  • the third artificial fibroin may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of the (A) n motif at least every other two domain sequences from the N-terminal side to the C-terminal side. ..
  • the third artificial fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and two adjacent [(A) n motifs from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • -REP The number of amino acid residues in the REP of the unit is sequentially compared, and when the number of amino acid residues in the REP having a small number of amino acid residues is 1, the ratio of the number of amino acid residues in the other REP is 1.8 to When x is the maximum value of the sum of the number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units, which is 11.3, and y is the total number of amino acid residues in the domain sequence.
  • the number of alanine residues with respect to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. It is even more preferably 100% (meaning that it is composed of only alanine residues).
  • FIG. 1 shows a domain sequence obtained by removing the N-terminal sequence and the C-terminal sequence from artificial fibroin. From the N-terminal side (left side), the domain sequence consists of (A) n motif-first REP (50 amino acid residues)-(A) n motif-second REP (100 amino acid residues)-(A) n. Motif-Third REP (10 amino acid residues)-(A) n Motif-Fourth REP (20 amino acid residues)-(A) n Motif-Fifth REP (30 amino acid residues)-(A) It has an arrangement called n motifs.
  • Two adjacent [(A) n motif-REP] units are sequentially selected from the N-terminal side toward the C-terminal side so as not to overlap. At this time, there may be a [(A) n motif-REP] unit that is not selected.
  • pattern 1 (comparison between the first REP and the second REP and comparison between the third REP and the fourth REP)
  • pattern 2 (comparison between the first REP and the second REP, and a comparison).
  • 4th REP and 5th REP comparison Pattern 3 (2nd REP and 3rd REP comparison, and 4th REP and 5th REP comparison
  • Pattern 4 (1st REP and (Comparison of the second REP) is shown. There are other selection methods.
  • the number of amino acid residues of each REP in two adjacent [(A) n motif-REP] units selected is compared.
  • each pattern add up the total number of amino acid residues of the two adjacent [(A) n motif-REP] units shown by the solid line (not only REP, but also the number of amino acid residues of (A) n motif. be.). Then, the total values added are compared, and the total value (maximum value of the total value) of the pattern in which the total value is maximized is defined as x. In the example shown in FIG. 1, the total value of pattern 1 is the maximum.
  • x / y (%) can be calculated by dividing x by the total number of amino acid residues y in the domain sequence.
  • x / y is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 65% or more, still more preferably 70% or more. It is preferably 75% or more, even more preferably 80% or more, and particularly preferably 80% or more.
  • the upper limit of x / y is not particularly limited and may be, for example, 100% or less.
  • x / y is preferably 89.6% or more, and when the jagged ratio is 1: 1.8 to 3.4, x.
  • / Y is preferably 77.1% or more, and when the jagged ratio is 1: 1.9 to 8.4, x / y is preferably 75.9% or more, and the jagged ratio is 1. In the case of 1.9 to 4.1, x / y is preferably 64.2% or more.
  • x / y is 46.4% or more. Is more preferable, 50% or more is more preferable, 55% or more is further preferable, 60% or more is further more preferable, 70% or more is even more preferable, and 80% or more. It is particularly preferable to have.
  • the upper limit of x / y is not particularly limited and may be 100% or less.
  • the horizontal axis of FIG. 3 indicates x / y (%), and the vertical axis indicates frequency.
  • the x / y of naturally occurring fibroin is less than 64.2% (the highest is 64.14%).
  • the third artificial fibroin deletes one or more of the sequences encoding the (A) n motif from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence so that x / y is 64.2% or more.
  • an amino acid sequence corresponding to the deletion of one or more (A) n motifs so that x / y is 64.2% or more is designed and designed from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin. It can also be obtained by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the amino acid sequence.
  • amino acid residues are further substituted, deleted, inserted and / or added.
  • the amino acid sequence corresponding to the above may be modified.
  • (3-i) SEQ ID NO: 17 (Met-PRT399), SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 9 (Met) contains an amino acid sequence represented by PRT799) or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by (3-ii) SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • Artificial fibroin can be mentioned.
  • the artificial fibroin of (3-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17 is from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 (Met-PRT313) corresponding to naturally occurring fibroin, every other (A) n from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • the motif is deleted, and one [(A) n motif-REP] is inserted in front of the C-terminal sequence.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 is as described in the second artificial fibroin.
  • the value of x / y in the jagged ratio of 1: 1.8 to 11.3 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is 15.0%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is 93.4%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is 92.7%.
  • the value of x / y in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is 89.8%.
  • the artificial fibroin of (3-i) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the artificial fibroin of (3-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the artificial fibroin of (3-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the artificial fibroin (3-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and is N-terminal to C-terminal.
  • the number of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units is sequentially compared and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, the other
  • x / y is preferably 64.2% or more.
  • the third artificial fibroin may contain the above-mentioned tag sequence at either or both of the N-terminal and the C-terminal.
  • the amino acids represented by (3-iii) SEQ ID NO: 18 (PRT399), SEQ ID NO: 13 (PRT410), SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799) examples include artificial fibroins comprising a sequence or an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in (3-iv) SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. ..
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are the N-terminals of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively.
  • the amino acid sequence shown by (including His tag sequence and hinge sequence) is added.
  • the artificial fibroin of (3-iii) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the artificial fibroin (3-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the artificial fibroin of (3-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the artificial fibroin (3-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and is N-terminal to C-terminal.
  • the number of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units is sequentially compared and the number of amino acid residues of REP having a small number of amino acid residues is 1, the other Let x be the maximum value of the total value of the sum of the number of amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units in which the ratio of the number of amino acid residues in REP is 1.8 to 11.3.
  • x / y is preferably 64.2% or more.
  • the third artificial fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the artificial protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the fourth artificial fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of (A) n motifs and a reduced content of glycine residues as compared with naturally occurring fibroin. Have.
  • the domain sequence of the fourth artificial fibroin lacked at least one or more (A) n motifs as compared to naturally occurring fibroin, plus at least one or more glycine residues in the REP. It can be said that it has an amino acid sequence corresponding to being substituted with another amino acid residue. That is, the fourth artificial fibroin is an artificial fibroin having the characteristics of the above-mentioned second artificial fibroin and the third artificial fibroin. Specific aspects and the like are as described in the second artificial fibroin and the third artificial fibroin.
  • the fourth artificial fibroin (4-i) SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525), SEQ ID NO: 9 (Met-PRT799), SEQ ID NO: 13 (PRT410) ), The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799), or (4-ii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15
  • Examples thereof include artificial fibroins containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by.
  • Specific embodiments of the artificial fibroin comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 are as described above.
  • the fifth artificial fibroin had one or more amino acid residues in the REP replaced with amino acid residues having a higher hydrophobicity index than the naturally occurring fibroin in its domain sequence, and / or REP. It may have an amino acid sequence containing a region having a large hydrophobic index locally, which corresponds to the insertion of one or a plurality of amino acid residues having a large hydrophobic index.
  • the region having a locally large hydrophobicity index is composed of consecutive 2 to 4 amino acid residues.
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is an amino acid selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). It is more preferably a residue.
  • one or more amino acid residues in REP were replaced with amino acid residues having a higher hydrophobicity index as compared with naturally occurring fibroin, and / or one or more amino acid residues in REP.
  • one or more amino acid residues were substituted, deleted, inserted and / or added as compared with naturally occurring fibroin. There may be a modification of the amino acid sequence corresponding to the above.
  • the fifth artificial fibroin leaves one or more hydrophilic amino acid residues (for example, amino acid residues having a negative hydrophobicity index) in the REP from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence. It can be obtained by substituting for a group (eg, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index) and / or inserting one or more hydrophobic amino acid residues in the REP. Also, for example, one or more hydrophilic amino acid residues in the REP have been replaced with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more hydrophobic amino acid residues in the REP.
  • an amino acid sequence corresponding to the insertion of and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence In each case, one or more hydrophilic amino acid residues in the REP were replaced with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more hydrophobic amino acids in the REP.
  • the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be further modified.
  • the fifth artificial fibroin contains a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , and extends from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the above domain sequence.
  • the total number of amino acid residues contained in the region where the average value of the hydrophobicity index of consecutive 4 amino acid residues is 2.6 or more is defined as p.
  • hydrophobicity index of amino acid residues
  • HI hydrophobicity index
  • sequence A [(A) n motif-REP] m.
  • the average value of the hydrophobicity index is obtained for all consecutive 4 amino acid residues (each amino acid residue is used to calculate the average value 1 to 4 times).
  • a region in which the average value of the hydrophobicity index of consecutive four amino acid residues is 2.6 or more is specified. Even if a certain amino acid residue corresponds to a plurality of "consecutive four amino acid residues having an average value of 2.6 or more of the hydrophobicity index", it should be included as one amino acid residue in the region. become.
  • the total number of amino acid residues contained in the region is p. Further, the total number of amino acid residues contained in the sequence A is q.
  • the average value of the hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.
  • the hydrophobicity index of the consecutive four amino acid residues is present.
  • p / q is preferably 6.2% or more, more preferably 7% or more, further preferably 10% or more, and more preferably 20% or more. Even more preferably, it is even more preferably 30% or more.
  • the upper limit of p / q is not particularly limited, but may be, for example, 45% or less.
  • the fifth artificial fibroin is, for example, one or more hydrophilic amino acid residues (eg, a hydrophobic index) in the REP so that the amino acid sequence of the cloned naturally occurring fibroin satisfies the above p / q condition.
  • Amino acid residue with a negative value is replaced with a hydrophobic amino acid residue (for example, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index), and / or one or more hydrophobic amino acid residues are inserted in the REP.
  • a hydrophobic amino acid residue for example, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index
  • an amino acid sequence satisfying the above p / q condition from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • one or more amino acid residues in the REP were replaced with amino acid residues with a higher hydrophobicity index compared to naturally occurring fibroin, and / or one or more amino acid residues in the REP.
  • the modification corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues may be performed. ..
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is not particularly limited, but isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). ) Is preferable, and valine (V), leucine (L) and isoleucine (I) are more preferable.
  • the fifth artificial fibroin (5-i) the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 19 (Met-PRT720), SEQ ID NO: 20 (Met-PRT665) or SEQ ID NO: 21 (Met-PRT666)
  • artificial fibroin (5-ii) containing an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21 can be mentioned.
  • the artificial fibroin of (5-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 consists of 3 amino acid residues in every other REP except for the domain sequence of the terminal on the C-terminal side with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410).
  • the amino acid sequence (VLI) is inserted at two locations, a part of the glutamine (Q) residue is replaced with a serine (S) residue, and a part of the amino acid on the C-terminal side is deleted.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 20 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) with one amino acid sequence (VLI) consisting of 3 amino acid residues inserted every other REP. be.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 with two amino acid sequences (VLI) consisting of three amino acid residues inserted every other REP.
  • the artificial fibroin of (5-i) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • the artificial fibroin of (5-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • the artificial fibroin of (5-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the artificial fibroin of (5-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21, and is located most on the C-terminal side (A) n.
  • P / q is preferably 6.2% or more.
  • the fifth artificial fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminal and the C-terminal.
  • Artificial fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24 can be mentioned.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 are the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 11 (His tag) at the N-terminal of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, respectively. (Including array and hinge array) is added.
  • the artificial fibroin of (5-iii) may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24.
  • the artificial fibroin of (5-iv) comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24.
  • the artificial fibroin of (5-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the artificial fibroin (5-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24, and is located most on the C-terminal side (A) n.
  • P / q is preferably 6.2% or more.
  • the fifth artificial fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the artificial protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the sixth artificial fibroin has an amino acid sequence in which the content of glutamine residues is reduced as compared with naturally occurring fibroin.
  • the sixth artificial fibroin preferably contains at least one motif selected from the GGX motif and the GPGXX motif in the amino acid sequence of REP.
  • the content of the GPGXXX motif is usually 1% or more, may be 5% or more, and is preferably 10% or more.
  • the upper limit of the GPGXX motif content is not particularly limited and may be 50% or less, or 30% or less.
  • GPGXX motif content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n- motif-REP] m
  • Formula 2 [(A) n- motif-REP] m-
  • Fibroin containing a domain sequence represented by n- motif (artificial fibroin or naturally derived) In (fibroin), the number of GPGXX motifs contained in the region in all REPs included in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence.
  • s be the number obtained by multiplying the total number by 3 (that is, corresponding to the total number of G and P in the GPGXX motif), and the sequence from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is taken from the domain sequence.
  • the GPGXX motif content is calculated as s / t, where t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding (A) n motifs.
  • the sequence obtained by excluding the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence is targeted at "the most C-terminal side".
  • the sequence from (A) n motif to the C-terminal of the domain sequence located in (A) may contain a sequence having a low correlation with the sequence characteristic of fibroin, and m is small. In this case (that is, when the domain sequence is short), it affects the calculation result of the GPGXX motif content, and this effect is eliminated.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a domain sequence of artificial fibroin.
  • a specific method for calculating the GPGXX motif content will be described with reference to FIG.
  • the domain sequence of artificial fibroin shown in FIG. 5 (“[(A) n motif-REP] m- (A) n motif” type)
  • all REPs are “located closest to the C-terminal side”.
  • A Since it is included in the "sequence obtained by removing the sequence from the n motif to the C-terminal of the domain sequence from the domain sequence" (the sequence shown by "region A” in FIG. 5), s is calculated.
  • the sixth artificial fibroin has a glutamine residue content of preferably 9% or less, more preferably 7% or less, further preferably 4% or less, and particularly preferably 0%. ..
  • glucose residue content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n- motif-REP] m
  • Formula 2 [(A) n- motif-REP] m-
  • all the sequences from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence are excluded from the domain sequence (the sequence corresponding to "region A" in FIG. 5).
  • the total number of glutamine residues contained in the region is u, and the sequence from the (A) n motif located most on the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is removed from the domain sequence, and (A) n.
  • the glutamine residue content is calculated as u / t, where t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding the motif.
  • t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding the motif.
  • the sixth artificial fibroin corresponds to its domain sequence being deleted from one or more glutamine residues in REP or replaced with other amino acid residues as compared to naturally occurring fibroin. It may have an amino acid sequence.
  • the "other amino acid residue” may be an amino acid residue other than the glutamine residue, but is preferably an amino acid residue having a larger hydrophobicity index than the glutamine residue.
  • the hydrophobicity index of amino acid residues is as shown in Table 1.
  • amino acid residues having a larger hydrophobicity index than glutamine residues include isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), and methionine (M).
  • Amino acid residues selected from alanine (A), glycine (G), threonine (T), serine (S), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and histidine (H). can.
  • amino acid residues selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A) are more preferable.
  • Isoleucine (I), valine (V), leucine (L) and phenylalanine (F) are more preferably amino acid residues.
  • the sixth artificial fibroin has REP hydrophobicity (average hydropathy index) of, for example, -0.8 or more, -0.7 or more, -0.6 or more, -0.5 or more, -0. 4 or more, -0.3 or more, -0.2 or more, -0.1 or more, 0 or more, 0.1 or more, 0.2 or more, 0.2 or more, 0.22 or more, 0.25 or more, 0 It may be .3 or more, 0.35 or more, 0.4 or more, 0.45 or more, 0.5 or more, 0.55 or more, 0.6 or more, 0.65 or more, or 0.7 or more.
  • the upper limit of the hydrophobicity of REP is not particularly limited and may be 1.0 or less, or 0.7 or less.
  • hydrophilcity of REP is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n- motif-REP] m
  • Formula 2 [(A) n- motif-REP] m-
  • all the sequences from the (A) n motif located closest to the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence are excluded from the domain sequence (the sequence corresponding to "region A" in FIG. 5).
  • the sum of the hydrophobicity indexes of each amino acid residue in the region is v, and the sequence from the (A) n motif located most on the C-terminal side to the C-terminal of the domain sequence is removed from the domain sequence, and further ( A) The hydrophobicity of REP is calculated as v / t, where t is the total number of amino acid residues of all REPs excluding the n motif.
  • the reason for targeting is the above-mentioned reason. The same is true.
  • the sixth artificial fibroin had its domain sequence deleted of one or more glutamine residues in REP as compared to naturally occurring fibroin, and / or one or more glutamine residues in REP.
  • modification corresponding to the replacement of one or more amino acid residues with other amino acid residues there may be further modification of the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues. ..
  • the sixth artificial fibroin deletes one or more glutamine residues in REP from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence and / or removes one or more glutamine residues in REP. It can be obtained by substituting with the amino acid residue of. Also, for example, one or more glutamine residues in REP were deleted from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and / or one or more glutamine residues in REP were replaced with other amino acid residues. It can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to this and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 25 (Met-PRT888), SEQ ID NO: 26 (Met-PRT965), SEQ ID NO: 27 (Met-PRT889), SEQ ID NO: 28 (Met) -PRT916), SEQ ID NO: 29 (Met-PRT918), SEQ ID NO: 30 (Met-PRT699), SEQ ID NO: 31 (Met-PRT698), SEQ ID NO: 32 (Met-PRT966), SEQ ID NO: 41 (Met-PRT917) or SEQ ID NO: An artificial fibroin containing the amino acid sequence represented by No.
  • the artificial fibroin of (6-i) will be described.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 is obtained by substituting VL for all QQs in the amino acid sequence (Met-PRT410) shown in SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with TS, and the remaining Qs are replaced with A.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with VL, and the remaining Qs are replaced with I.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with VI, and the remaining Qs are replaced with L.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 are replaced with VF, and the remaining Qs are replaced with I.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 is the one in which all the QQs in the amino acid sequence (Met-PRT525) shown in SEQ ID NO: 8 are replaced with VL.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 is one in which all QQs in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 are replaced with VL, and the remaining Qs are replaced with I.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 are all residual glutamine.
  • the group content is 9% or less (Table 2).
  • the artificial fibroin of (6-i) has SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42. It may consist of the indicated amino acid sequence.
  • the artificial fibroin (6-ii) has SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42. It contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the indicated amino acid sequence.
  • the artificial fibroin of (6-ii) is also a domain represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It is a protein containing a sequence. The sequence identity is preferably 95% or more.
  • the artificial fibroin of (6-ii) preferably has a glutamine residue content of 9% or less. Further, the artificial fibroin of (6-ii) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the sixth artificial fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminal and the C-terminal. This enables isolation, immobilization, detection, visualization, and the like of artificial fibroin.
  • SEQ ID NO: 33 (PRT888), SEQ ID NO: 34 (PRT965), SEQ ID NO: 35 (PRT889), SEQ ID NO: 36 (PRT916), SEQ ID NO: 37 (PRT918), an artificial fibroin containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38 (PRT699), SEQ ID NO: 39 (PRT698), SEQ ID NO: 40 (PRT966), SEQ ID NO: 43 (PRT917) or SEQ ID NO: 44 (PRT1028), or ( 6-iv) Amino acid sequences and 90s shown by SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44.
  • amino acid sequences shown by SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 are, respectively, SEQ ID NO: 25. , SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 shown by SEQ ID NO: 11 at the N-terminal of the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence (including His tag sequence and hinge sequence) is added.
  • SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 all have a glutamine residue content of 9% or less (Table 3).
  • the artificial fibroin of (6-iii) has SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44. It may consist of the indicated amino acid sequence.
  • the artificial fibroin (6-iv) is represented by SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44. It contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the indicated amino acid sequence.
  • the artificial fibroin of (6-iv) is also a domain represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m or the formula 2: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. It is a protein containing a sequence. The sequence identity is preferably 95% or more.
  • the artificial fibroin (6-iv) preferably has a glutamine residue content of 9% or less. Further, the artificial fibroin (6-iv) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the sixth artificial fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the artificial protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the artificial fibroin is at least two or more of the characteristics of the first artificial fibroin, the second artificial fibroin, the third artificial fibroin, the fourth artificial fibroin, the fifth artificial fibroin, and the sixth artificial fibroin. It may be an artificial fibroin having the above-mentioned characteristics.
  • the artificial protein used in the present invention is preferably an artificial protein having a large total number of residues of cysteine, lysine, arginine, asparagine, glutamine, serine, threonine and tyrosine, and further, the total residual amount of cysteine, lysine, arginine, asparagine and glutamine.
  • An artificial protein having a large number of groups is preferable, an artificial protein having a large total number of residues of cysteine, lysine and arginine is preferable, an artificial protein having a large total number of residues of cysteine and lysine is preferable, and an artificial protein having a large number of cysteine residues is large. Artificial proteins are most preferred.
  • a heteroatom represented by Y in the formula (II) contained in the above-mentioned artificial protein is a linker compound (for example, a compound represented by the formula (I), in the formula, X indicates a leaving group and L indicates a linker moiety), which can be introduced into artificial fibroin by reacting (chemically modifying).
  • an amino acid residue having the above-mentioned substituent in the side chain that is, cysteine, lysine, arginine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, etc.
  • cysteine, lysine, arginine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, etc. is used as a foothold to form a pendant group.
  • the linker compound may be a compound represented by the formula (I), preferably a compound represented by the formula (Ia), (Ib) or (Ic), and more preferably a compound represented by the formula (Ic). ..
  • the linker compound has at least one maleimide group that is utilized in the reaction with the functional substance.
  • L 1 , L 2 and L 3 are independently C 1-20 alkylene group, C 6-20 arylene group, C 6-20 arylene group-C 1-20 alkylene group and C 6-20 arylene, respectively.
  • the group represents a tetramethylene glycol group
  • X 1 and X 2 each independently represent a elimination group.
  • the C 1-20 alkylene group is an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, and is, for example, a methylene group, an ethylene group, a propylene group, a butylene group, a pentylene group, a hexylene group, a heptylene group, an octylene group, a nonylene group and a decylene. Examples include a group, an undecylene group, and a dodecylene group.
  • the C 6-20 arylene group is an arylene group having 6 to 20 carbon atoms, and examples thereof include a phenylene group, a naphthylene group, a terphenylene group, a pyrenylene group, and a biphenylene group.
  • the C 6-20 arylene group-C 1-20 alkylene group is a divalent group in which an alkylene having 1 to 20 carbon atoms and an arylene group having 6 to 20 carbon atoms are covalently bonded.
  • C 6-20 arylene group-C 1-20 alkylene group-C 6-20 arylene group and C 1-20 alkylene group-C 6-20 arylene group-C 1-20 alkylene group each have carbon atoms. It is a divalent group in which 1 to 20 alkylene and an arylene group having 6 to 20 carbon atoms are covalently bonded. Specific examples thereof include a methylene diphenylene group and a phenylene bis (methylene) group.
  • the desorbing group may be a group having a high degree of electrical negativeness and being reactive to a nucleophilic substitution reaction by a hetero atom (sulfur atom, nitrogen atom, oxygen atom) in the artificial protein.
  • a hetero atom sulfur atom, nitrogen atom, oxygen atom
  • Halogen atom for example, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom
  • methanesulfonyloxy group for example, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom
  • methanesulfonyloxy group for example, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom
  • methanesulfonyloxy group for example, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom
  • methanesulfonyloxy group for example, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, io
  • the method of chemical modification can be performed by a method well known to those skilled in the art.
  • a method is known in which a sulfhydryl group of cysteine chemically modifies an amino acid sequence by 1,4-addition reaction with a carbon-carbon double bond of maleimide.
  • chemical modification can be performed by a method of alkylating a guanidine group, an amide group or a hydroxy group, or a method of acylating a hydroxy group. Since the reaction conditions are relatively mild, it is preferable to introduce a pendant group by reacting a cysteine residue with maleimide.
  • the linker compound has two maleimide groups, one of which is utilized for the introduction of the pendant group and the other of which is utilized for the reaction with the functional substance.
  • the linker compound is a compound represented by the above formula (Ia), (Ib) or (Ic)
  • the chemically modified artificial fibroin according to the present embodiment has the formula (IIa), (IIb) or (IIc), respectively. It can be a compound represented by.
  • L 1 , L 2 and L 3 are the same as the definitions in the formula (Ia), (Ib) or (Ic).
  • Prot represents an artificial protein
  • Y in formulas (IIa) and (IIb) represents a hetero atom (sulfur atom, nitrogen atom, oxygen atom) in an amino acid residue
  • S in formula (IIc) is an amino acid. It is a sulfur atom in the residue.
  • n indicates the number of pendant groups bound to the artificial protein.
  • n is an integer of at least 1 or more, and is equal to or less than the total number of residues of cysteine, arginine, asparagine, glutamine, serine, and threonine contained in the amino acid sequence of the artificial protein. The higher the value of n, the more functional substances can be bound to the artificial protein.
  • n is, for example, an integer of 1 to 10.
  • the chemically modified artificial protein according to this embodiment can also be used as a molding material.
  • the shape of the chemically modified artificial protein can be powdery.
  • the chemically modified artificial protein is not particularly limited, but is molded by various moldings such as extrusion molding and injection molding, and molding by a method well known in the art such as film casting, spinning, and heat and pressure molding. can do.
  • the shape of the molded product of the chemically modified artificial protein is not particularly limited, and may be, for example, plate-like, particle-like, lump-like, film-like, gel-like, sponge-like, or fibrous.
  • a chemically modified artificial protein When a chemically modified artificial protein is heat-press molded, it can have an apparently uniform phase like a cured resin. Such a molded product may have translucency.
  • a second embodiment of the present invention comprises a step of obtaining a chemically modified artificial protein represented by the formula (II) by reacting the artificial protein with a compound represented by the formula (I). It is a manufacturing method.
  • the present embodiment may further include the step of obtaining an artificial protein by a method well known to those skilled in the art (eg, a chemical method, a microbiological method).
  • the step of obtaining a chemically modified artificial protein represented by the formula (II) by reacting the artificial protein with the compound represented by the formula (I) is a method well known to those skilled in the art as a method for chemically modifying the protein. It can be used.
  • the artificial protein and the compound represented by the formula (I) may be mixed in a solvent.
  • a base may be added or heated.
  • the reaction temperature is usually 0 to 60 ° C, preferably 30 to 55 ° C or 35 to 50 ° C.
  • the solvent used may be one that can dissolve the artificial protein and does not inhibit the progress of the desired reaction. Examples of such a solvent include hexafluoroisopropyl alcohol (HFIP), dimethyl sulfoxide, formic acid, dimethylformamide, acetic acid, dimethylacetamide, and N-methylpyrrolidone.
  • HFIP hexafluoroisopropyl alcohol
  • dimethyl sulfoxide formic acid, dimethylformamide, acetic acid, dimethylacetamide, and N-methylpyrrolidone.
  • ethyl acetate may be added to aggregate the product (chemically modified artificial protein).
  • the product can then be purified by washing the aggregated product with ethyl acetate, methanol, or the like.
  • the obtained chemically modified artificial protein can not only impart a desired function by reacting with a functional substance, but can also be crosslinked with itself or another protein, thereby increasing the molecular weight (polymerization). realizable.
  • a method for modifying a protein As a method for modifying a protein, as described in International Publication No. 2016/192528, a method of reacting a cysteine residue (that is, a sulfhydryl group) in a protein with a linker compound having a maleimide group is known. .. Such techniques have been applied, for example, to the production of antibody drug conjugates (ADCs) in which a drug is bound to a specific antibody protein. In such an ADC, it is assumed that the linker part is cleaved in the living body.
  • ADCs antibody drug conjugates
  • a linker compound having a maleimide group at the terminal is introduced into an artificial protein to achieve the reversal of the substitution mode (donor and acceptor) opposite to the conventional one.
  • the functional substance that can bind to the chemically modified artificial protein according to the present embodiment may be any substance that can bind to the maleimide structure located at the end of the pendant group.
  • functions such as increase in molecular weight, improvement in flexibility, and coloring can be imparted.
  • Chemically modified artificial proteins to which functional substances are bound can be used as molding materials.
  • the shape of the chemically modified artificial protein to which the functional substance is bound can be powdery.
  • the chemically modified artificial protein to which a functional substance is bound is not particularly limited, and is, for example, various moldings such as extrusion molding and injection molding, and the arts such as film casting, spinning, and heat and pressure molding. It can be molded by a well-known method.
  • the shape of the molded product of the chemically modified artificial protein to which the functional substance is bound is not particularly limited, and may be, for example, plate-like, particle-like, lump-like, film-like, gel-like, sponge-like, or fibrous.
  • a chemically modified artificial protein to which a functional substance is bound is heat-press molded, it can have an apparently uniform phase like a cured resin. Such a molded product may have translucency.
  • [Manufacturing of artificial fibroin] (1) Preparation of Expression Vector It has an artificial fibroin (PRT966) having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 40, an artificial fibroin having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 46 (PRT1000), and an amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 45.
  • An artificial fibroin (PRT1001) was designed.
  • the average hydropathy index value of the artificial fibroin having the amino acid sequence (PRT966) shown in SEQ ID NO: 40 is 0.44
  • the average hydro of the artificial fibroin having the amino acid sequence (PRT1000) shown in SEQ ID NO: 46 is 0.44.
  • the value of the passy index is 0.45
  • the value of the average hydropathy index of artificial fibroin having the amino acid sequence (PRT1001) shown in SEQ ID NO: 45 is 0.46.
  • the amino acid sequence (PRT1000) shown in SEQ ID NO: 46 is located in the REP located first from the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence with respect to the amino acid sequence (PRT966) shown in SEQ ID NO: 40, respectively. Cysteine residues are inserted one by one. The total number of cysteine residues of artificial fibroin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 is 2.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 45 (PRT1001) is contained in the REP located at the 1st or 2nd position from the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence with respect to the amino acid sequence (PRT966) shown by SEQ ID NO: 40. One cysteine residue is inserted in each. The total number of cysteine residues of artificial fibroin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 is 4.
  • An NdeI site was added to the nucleic acid at the 5'end, and an EcoRI site was added downstream of the stop codon.
  • This nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Then, the nucleic acid was cut out by restriction enzyme treatment with NdeI and EcoRI, and then recombinant into a protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
  • the seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 mL of the production medium (Table 5) was added so that the OD 600 was 0.05.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • the feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and the culture was carried out for 20 hours. Then, 1 M of isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce the expression of artificial fibroin. Twenty hours after the addition of IPTG, the culture solution was centrifuged and the cells were collected. SDS-PAGE was performed using cells prepared from the culture medium before and after the addition of IPTG, and the expression of the target artificial fibroin was confirmed by the appearance of the target artificial fibroin-sized band depending on the IPTG addition. bottom.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopy
  • the washed precipitate was suspended in 8M guanidine buffer (8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL and at 60 ° C. Stir with a stirrer for 30 minutes to dissolve. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.). The white aggregated protein obtained after dialysis was recovered by centrifugation, water was removed by a freeze dryer, and the freeze-dried powder was recovered to obtain three types of artificial fibroin (PRT1000, PRT1001 and PRT966).
  • 8M guanidine buffer 8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0
  • Step 1 In a glass container, artificial fibroin (PRT1001): 200 mg and 4,4'-bismaleimidodiphenylmethane (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.): 15 mg (amount exceeding 4 equivalents with respect to artificial fibroin) are added to HFIP (Central). Glass Co., Ltd.): After dissolving in 5 mL, the obtained solution was stirred at 40 ° C. for 20 hours.
  • PRT1001 artificial fibroin
  • HFIP Central
  • Glass Co., Ltd. After dissolving in 5 mL, the obtained solution was stirred at 40 ° C. for 20 hours.
  • the aggregation operation was performed by adding ethyl acetate (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), and the mixture was filtered using a Kiriyama funnel.
  • the obtained solid was washed with ethyl acetate and methanol (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) in 2 mL each, and the washing operation was repeated 3 times to remove unreacted 4,4'-bismaleimidediphenylmethane. .. Further, it was dried under reduced pressure to obtain maleimide-bound fibroin.
  • Step 2 In a glass container, 20 mg of maleimide-bound fibroin and 1.2 mg of a functional substance were dissolved in DMSO (manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.): 1 mL, and then the obtained mixture was stirred at 80 ° C. for 20 hours.
  • DMSO manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.
  • Example 1 After that, the aggregation operation was performed by adding ethyl acetate (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), and the mixture was filtered using a Kiriyama funnel. The obtained solid was washed with 2 mL each of ethyl acetate and dichloromethane, and this washing operation was repeated 3 times to remove unreacted functional substances. Further, it was dried under reduced pressure to obtain Example 1.
  • ethyl acetate manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.
  • Example 1 The absorbance of Example 1 and Comparative Example 1 was measured under the following conditions.
  • an artificial fibroin having the amino acid sequence (PRT1000) shown in SEQ ID NO: 46 prepared as described above (number average molecular weight:: 50000) and artificial fibroin (number average molecular weight: 100,000) having the amino acid sequence (PRT966) shown in SEQ ID NO: 40 prepared as described above were used.
  • the solubility was evaluated by adding a predetermined amount of silk fibroin and artificial fibroin to a 9M lithium bromide aqueous solution and observing the appearance of the aqueous solution after stirring at 60 ° C. for 30 minutes. It was evaluated by visual observation.
  • Hot water resistance test A hot water resistance test was conducted on artificial fibroin and silk fibroin to evaluate the heat resistance. bottom. Put 50 mg of silk fibroin (silk powder IM KB Salen) or artificial fibroin (PRT966, PRT1000) in a glass container, and add 950 mg of RO water (water filtered through a reverse osmosis membrane) so that the final concentration is 5% by weight. To prepare a protein solution. The resulting solution was heated to 100 ° C. and stirred. After 5 hours, the solution was distilled off by centrifugation and then washed twice with acetone by centrifugation. After washing, it was dried under reduced pressure to obtain a powder. The retention time of the obtained powder and the protein before hot water treatment was measured by GPC, and the degree of protein degradation was evaluated.
  • FIG. 8 is a photograph showing a state of contact angle measurement.

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Abstract

本発明は、マレイミド基を含むペンダント基を有する、成形材料用の化学修飾人工タンパク質を提供する。

Description

成形材料用の化学修飾人工タンパク質及びその製造方法
　本発明は、成形材料用の化学修飾人工タンパク質及びその製造方法に関する。
　近年、環境保全意識の高まりから、石油由来の材料の代替物質の検討が進められており、強度等の点でタンパク質が注目されている。例えば、特許文献１には、ウールやカシミヤ繊維、水鳥の羽根等を圧縮成形した成形物が応力－ひずみ特性等の機械的特性が高いことが開示されている。また、工業的に生産が可能な人工タンパク質の材料化が検討され、中でも、強度や伸度に優れるクモ糸の特徴を備えた人工フィブロインの成形材料としての応用研究が行われている。
特開２０１７－１１０１３２号公報
　しかしながら、特許文献１に記載の人工タンパク質では、その成形体として利用するにあたり、付与できる性質の種類にも限りがあり、より広汎な種類の機能を付与することは困難である。そこで、本発明は、種々の機能を付与し得る化学修飾人工タンパク質を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の［１］～［１７］を提供する。
［１］　マレイミド基を含むペンダント基を有する、成形材料用の化学修飾人工タンパク質。
［２］　マレイミド基を含むペンダント基を有する化学修飾疎水性人工タンパク質である、［１］に記載の人工タンパク質。
［３］　マレイミド基を含むペンダント基を有する化学修飾人工構造タンパク質である、［１］又は［２］に記載の人工タンパク質。
［４］　マレイミド基を含むペンダント基を有する化学修飾人工フィブロインである、［３］に記載の人工タンパク質。
［５］　マレイミド基を含むペンダント基を有する化学修飾人工クモ糸フィブロインである、［４］に記載の人工タンパク質。
［６］　人工タンパク質と、式（Ｉ）で表される化合物との反応により、式（ＩＩ）で表される化学修飾人工タンパク質を得る工程を含む、化学修飾人工タンパク質の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、Ｘは脱離基を示し、Ｌはリンカー部分を示す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、Ｌはリンカー部分を示し、Ｐｒｏｔは人工タンパク質を示し、Ｙは人工タンパク質のアミノ酸残基中のヘテロ原子を示し、ｎは１～１０の整数を示す。］
［７］　式（Ｉ）で表される化合物の使用量が、人工フィブロイン１当量に対して１当量超である、［６］に記載の化学修飾人工タンパク質の製造方法。
［８］　人工タンパク質が疎水性人工タンパク質である、［６］又は［７］に記載の、人工タンパク質の製造方法。
［９］　人工タンパク質が人工構造タンパク質である、［６］～［８］のいずれかに記載の人工タンパク質の製造方法。
［１０］　人工構造タンパク質が人工フィブロインである、［９］に記載の人工タンパク質の製造方法。
［１１］　人工フィブロインが改変クモ糸フィブロインである、［１０］に記載の人工タンパク質の製造方法。
［１２］　式（ＩＩ）で表される化学修飾人工タンパク質を含む成形材料。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、Ｌはリンカー部分を示し、Ｐｒｏｔは人工タンパク質を示し、Ｙは人工タンパク質のアミノ酸残基中のヘテロ原子を示し、ｎは１～１０の整数を示す。］
［１３］　人工タンパク質が疎水性人工タンパク質である、［１２］に記載の成形材料。
［１４］　人工タンパク質が人工構造タンパク質である、［１３］に記載の成形材料。
［１５］　人工構造タンパク質が人工フィブロインである、［１４］に記載の成形材料。
［１６］　人工フィブロインが改変クモ糸フィブロインである、［１５］に記載の成形材料。
［１７］　［１２］～［１６］のいずれかに記載の成形材料を成形して得られる成形体。
　本発明の化学修飾人工タンパク質によれば、種々の機能性物質と簡便な操作で結合することができ、機能性物質に応じた種々の機能を付与し得る。
人工フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 天然由来のフィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。 天然由来のフィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。 人工フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 人工フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 実施例１及び比較例１のフィブロインの吸光度測定の結果を示すグラフである。 タンパク質の疎水性評価の結果を示すゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）のクロマトグラムである。 接触角測定の状態を示す写真である。
　以下に、本発明についてより詳細に述べる。
　本発明の第一実施形態は、マレイミド基を含むペンダント基を有する、成形材料用の化学修飾人工タンパク質であり、式（ＩＩ）で表される化合物である。本実施形態に係る化学修飾人工タンパク質は、人工タンパク質に化学修飾を行うことにより、マレイミド基を含むペンダント基を導入することにより製造され得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、Ｌはリンカー部分を示し、Ｐｒｏｔは人工タンパク質を示し、Ｙは人工タンパク質のアミノ酸残基中のヘテロ原子を示し、ｎは１～１０の整数を示す。］
　人工タンパク質としては、工業規模での製造が可能な任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、構造タンパク質等を挙げることができる。工業用に利用可能とは、例えば、屋内や屋外で使用される様々な汎用材料等に利用し得ることをいう。医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。工業用に利用できるタンパク質としては、構造タンパク質を挙げることができる。また、構造タンパク質の具体例としては、スパイダーシルク（クモ糸）、カイコシルク、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン及びレシリン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。使用するタンパク質としては、人工フィブロインが好ましく、人工クモ糸フィブロイン（人工改変クモ糸フィブロイン）がより好ましい。
　なお、人工タンパク質は、組換え（リコンビナント）タンパク質と合成タンパク質とを含む。つまり、本明細書において「人工タンパク質」とは、人為的に製造されたタンパク質を意味する。人工タンパク質は、そのドメイン配列が、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列とは異なるタンパク質であってもよく、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列と同一であるタンパク質であってもよい。また、「人工タンパク質」は、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のタンパク質の遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のタンパク質に依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。なお、化学修飾人工タンパク質は、化学修飾によりアミノ酸に由来しない部分構造を導入することは含まない。ここで、人工タンパク質は、天然タンパク質とは異なり、アミノ酸配列を自由に設計し得る。それ故、かかる人工タンパク質が化学修飾人工タンパク質として利用される場合には、人工タンパク質のアミノ酸配列を適宜にデザインすることによって成形材料や成形体の機能や特性、物性等を任意にコントロールすることが可能となる。また、常に均一な分子デザインが可能であるため、目的タンパク質との相同性の高い、目的に応じたタンパク質を安定的に得ることができる。以て、目的とする化学修飾人工タンパク質、ひいてはそれを用いて得られる成形材料や成形体の品質の安定化が有利に図られる。
　本実施形態に係る人工タンパク質は、アミノ酸残基数が５０以上であればよい。当該アミノ酸残基数は、例えば、１００以上又は１５０以上であってよく、２００以上又は２５０以上であってよく、好ましくは３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上又は５００以上である。
　本発明の第一実施形態の好ましい態様は、マレイミド基を含むペンダント基を有する、成形材料用の化学修飾人工フィブロインであり、式（ＩＩ’）で表される化合物である。式中、Ｌはリンカー部分を示し、Ｆｉｂは人工フィブロインを示し、Ｙは人工フィブロインのアミノ酸残基中のヘテロ原子を示し、ｎは１～１０の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本実施形態に係る人工タンパク質は、化学修飾疎水性人工タンパク質であることが好ましい。化学修飾疎水性人工タンパク質は、疎水性の人工タンパク質を化学修飾して得られる。疎水性の人工タンパク質は、後述するアミノ酸残基の疎水性指標（平均ハイドロパシー・インデックス）、溶解度、水への接触角、及び熱水による分解の有無の少なくとも１つに基づいて判断され得る。好ましい疎水性の人工タンパク質は、疎水性指標が、例えば、０以上、０．１以上、０．２以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３以上、０．３５以上、０．４以上、０．４５以上、０．５以上、０．５５以上、又は０．６以上、０．６５以上、０．７以上であり得る。なお、疎水性指標の上限値は特に制限されるものではないものの、例えば１．０以下であってもよく、０．７以下であってもよい。また、好ましい疎水性の人工タンパク質は、６０℃の臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に溶解させた際の最大濃度（溶解度）が、例えば３０質量％、２５質量％未満、２０質量％未満、１５質量％未満、１０質量％未満、５質量％未満、又は１質量％未満であってよい。なお、好ましい疎水性の人工タンパク質は、６０℃の臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に対して全く溶解しないものであってもよい。さらに、好ましい疎水性の人工タンパク質は、水への接触角（人工タンパク質を用いて形成された膜に対して水を滴下した際、或いは滴下して所定時間経過後（例えば、5秒経過後））が５５°以上、６０°以上、６５°以上、又は７０°以上であり得る。また、好ましい疎水性の人工タンパク質は、優れた耐熱水性を有する。例えば、人工タンパク質と水とからなる分散液であって、上記人工タンパク質の含有量が５質量％である分散液を調製し、当該分散液を１００℃で５時間加熱処理しても分解しないような人工タンパク質が、上記疎水性人工タンパク質として判断される。
　本実施形態に係る人工タンパク質が、上記のような疎水性の人工タンパク質を化学修飾して得られる化学修飾疎水性人工タンパク質である場合には、例えば、耐水性の向上が期待され得る。また、そのような化学修飾疎水性人工タンパク質が、例えば、成形材料として用いられる場合には、かかる成形材料を使用して製造される成形体において耐水性の向上が望まれ得る。そして、そのような成形体が工業用の汎用材料として使用される場合には、耐水性に基づいて使用寿命の延命化が期待され得る。加えて、化学修飾人工タンパク質は、機能性物質が結合された際に、機能性物質の疎水性乃至親水性をコントロールすることで、機能性物質と化学修飾人工タンパク質の結合体全体の疎水性乃至親水性を任意に調整可能となるが、人工タンパク質が疎水性を有する場合には、人工タンパク質が親水性を有する場合に比して、結合体全体を疎水性側にシフトすることができ、以て合成高分子全体の疎水性乃至親水性をより幅広い範囲にわたってコントロール可能となる。
（人工構造タンパク質）
　本実施形態に係る人工タンパク質は、例えば、構造タンパク質であってよい。構造タンパク質とは、生体の構造に関わるタンパク質、若しくは生体が作り出す構造体を構成するタンパク質、又はそれらに由来するタンパク質を意味する。構造タンパク質は、また、一定の条件下において自己凝集し繊維やフィルム、樹脂、ゲル、ミセル、ナノパーティクル等の構造体を形成するタンパク質のことを言い、天然においては例えば、フィブロイン、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン及びレシリンが挙げられる。
　構造タンパク質は、人工構造タンパク質であってもよい。本明細書において「人工構造タンパク質」とは、人為的に製造された構造タンパク質を意味する。人工構造タンパク質は、マレイミド基を含むペンダント基を、化学修飾により導入できる人工構造タンパクであればよい。遺伝子組換えにより微生物生産した構造タンパク質であってよく、成形性や生産性の観点からアミノ酸の配列を改良したものも含み、天然由来構造タンパク質の配列に限定されない。
　人工構造タンパク質を人工的に成形する際、側鎖の小さいアミノ酸ほど水素結合しやすく、強度の高い成形体を得やすい。また、アラニン残基及びグリシン残基は、側鎖が非極性のアミノ酸であるため、ポリペプチド生成における折りたたみの過程で内側に向くように配置され、αヘリックス構造又はβシート構造を取りやすい。よって、グリシン残基、アラニン残基、セリン残基等のアミノ酸の割合が高いことが望ましい。例えば、アラニン残基含有量が１０～４０％であればよく、１２～４０％であればよく、１５～４０％であってよく、１８～４０％であってよく、２０～４０％であってよく、２２～４０％であってよい。例えば、グリシン残基含有量が１０～５５％であればよく、１１％～５５％であってよく、１３％～５５％であってよく、１５％～５５％であってよく、１８％～５５％であってよく、２０％～５５％であってよく、２２％～５５％であってよく、２５％～５５％であってよい。
　なお、本明細書において、「アラニン残基含有量」とは、下記式で表される値である。
　アラニン残基含有量＝（ポリペプチドに含まれるアラニン残基の数／ポリペプチドの全アミノ酸残基の数）×１００（％）
　また、グリシン残基含有量、セリン残基含有量、スレオニン残基含有量、プロリン残基含有量及びチロシン残基含有量は、上記式において、アラニン残基をそれぞれグリシン残基、セリン残基、スレオニン残基、プロリン残基及びチロシン残基と読み替えたものと同義である。
　加工性を向上させる観点では、加工時点においては分子間の強固な水素結合を阻害することが重要であり、この観点から側鎖の大きいアミノ酸又は屈曲性を有するアミノ酸が一定程度、配列全体に均質に含まれていることが望ましく、具体的にはチロシン残基、スレオニン残基、プロリン残基が含まれるモチーフを繰り返して周期で入っていてもよい。例えば、任意の連続した２０アミノ酸残基の中、プロリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の合計含有量が、５％以上、１０％以上、又は１５％以上であってよく、５０％以下、４０％以下、３０％以下、又は２０％以下であってよい。
　一実施形態に係る人工構造タンパク質は、セリン残基含有量、スレオニン残基含有量及びチロシン残基含有量の合計が、４％以上であってよく、４．５％以上であってよく、５％以上であってよく、５．５％以上であってよく、６％以上であってよく、６．５％以上であってよく、７％以上であってよい。セリン残基含有量、スレオニン残基含有量及びチロシン残基含有量の合計は、例えば、３５％以下であってよく、３３％以下であってよく、３０％以下であってよく、２５％以下であってよく、２０％以下であってよい。
　一実施形態に係る人工構造タンパク質は、反復配列を有するものであってよい。すなわち、本実施形態に係るポリペプチドは、ポリペプチド内に配列同一性が高いアミノ酸配列（反復配列単位）が複数存在するものであってよい。反復配列単位のアミノ酸残基数は６～２００であることが好ましい。また、反復配列単位間の配列同一性は、例えば、８５％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９６％以上であってよく、９７％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。また、反復配列単位の疎水性指標（平均ハイドロパシー・インデックス）は、例えば、－０．８以上、－０．７以上、－０．６以上、－０．５以上、－０．４以上、－０．３以上、－０．２以上、－０．１以上、０以上、０．１以上、０．２以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．７０以上であってよい。なお、反復配列単位の疎水性度の上限値は特に制限されるものではないものの、例えば、１．０以下であってよ、０．７以下であってもよい。
　一実施形態に係る人工構造タンパク質は、（Ａ）ｎモチーフを含むものであってよい。本明細書において、（Ａ）ｎモチーフとは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を意味する。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は２～２７であってよく、２～２０、２～１６、又は２～１２の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。
　人工構造タンパク質には、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましく、グリシン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることがより好ましい。この場合、システイン残基の側鎖の可動範囲が広いため、システイン残基の側鎖に存在するメルカプト基（－ＳＨ）が、分子内又は分子間でジスルフィド結合を形成しやすくなり、物性をより一層向上させることができる。システイン残基は、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、セリン残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。
　人工構造タンパク質には、疎水性アミノ酸残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましい。この場合、分子間で疎水性アミノ酸残基同士が疎水的相互作用により固定されることで、システイン残基におけるメルカプト基（－ＳＨ）がジスルフィド結合を形成しやすくなり、物性をより一層向上させることができる。システイン残基は、疎水性アミノ酸残基の隣に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、疎水性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基との間に、位置していてもよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。疎水性アミノ酸残基は、イソロイシン残基、バリン残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基、及びアラニン残基からなる群より選択される１種であってよい。
（人工フィブロイン）
　人工構造タンパク質としては、人工フィブロインが好ましい。フィブロインとしては、例えば、天然由来のフィブロインが挙げられる。天然由来のフィブロインとしては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｇｕ１１ａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　本明細書において「人工フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。人工フィブロインは、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。
　人工フィブロインは、天然由来フィブロインに準ずる構造を有する繊維状タンパク質であってよく、天然由来フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有するフィブロインであってもよい。「フィブロインが有する反復配列と同様の配列」とは、実際に天然由来フィブロインが有する配列であってもよく、それと類似する配列であってもよい。
　「人工フィブロイン」は、本開示で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインに依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的にアミノ酸配列を設計したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。なお、人工フィブロインのアミノ酸配列を改変したものも、そのアミノ酸配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるものであれば、人工フィブロインに含まれる。人工フィブロインとしては、例えば、人工絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）、及び人工クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）などが挙げられる。人工フィブロインは、比較的にフィブリル化が容易で繊維形成能が高いことから、成形材料として好ましくは人工クモ糸フィブロインを含み、より好ましくは人工クモ糸フィブロインからなる。
　本実施形態に係る人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってよい。人工フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。なお、化学修飾人工フィブロインは化学修飾によりアミノ酸に由来しない部分構造を導入することは含まない。
　本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２～２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２～３００の整数を示し、１０～３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
　人工フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する人工フィブロイン（第１の人工フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する人工フィブロイン（第２の人工フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する人工フィブロイン（第３の人工フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された人工フィブロイン（第４の人工フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する人工フィブロイン（第５の人工フィブロイン）、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する人工フィブロイン（第６の人工フィブロイン）が挙げられる。
　第１の人工フィブロインとしては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の人工フィブロインにおいて、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３～２０の整数が好ましく、４～２０の整数がより好ましく、８～２０の整数が更に好ましく、１０～２０の整数が更により好ましく、４～１６の整数が更によりまた好ましく、８～１６の整数が特に好ましく、１０～１６の整数が最も好ましい。第１の人工フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０～２００残基であることが好ましく、１０～１５０残基であることがより好ましく、２０～１００残基であることが更に好ましく、２０～７５残基であることが更により好ましい。第１の人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
　第１の人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
　第１の人工フィブロインのより具体的な例として、（１－ｉ）配列番号４（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｐｉｄｅｒ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は（１－ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。
　（１－ｉ）の人工フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　第２の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の人工フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　第２の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第２の人工フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
　第２の人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　第２の人工フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の人工フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
　ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（人工フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。
　ここで、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図２に示す。図２の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図２から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗは、いずれも５０．９％未満である（最も高いもので、５０．８６％）。
　第２の人工フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
　第２の人工フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。
　第２の人工フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉ）配列番号６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３８０）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
　（２－ｉ）の人工フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。
　（２－ｉ）の人工フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｉ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　第２の人工フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、人工フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による人工フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に人工フィブロインを精製することができる。
　さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した人工フィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む人工フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉｉｉ）配列番号１２（ＰＲＴ３８０）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）、配列番号１５（ＰＲＴ７９９）若しくは配列番号４６（ＰＲＴ１０００）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｖ）配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
　配列番号１６（ＰＲＴ３１３）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号４６（ＰＲＴ１０００）で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９及び配列番号４７で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（２－ｉｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｖ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　第２の人工フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第３の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の人工フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　第３の人工フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０～４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１～３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、人工フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ－第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
　隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
　次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。
　図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
　各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
　次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。
　第３の人工フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９～１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８～３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の人工フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される人工フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。
　ここで、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９～４．１の場合の結果を図３に示す。
　図３の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙは、いずれも６４．２％未満である（最も高いもので、６４．１４％）。
　第３の人工フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第３の人工フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉ）配列番号１７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３９９）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｉ）配列番号１７、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
　（３－ｉ）の人工フィブロインについて説明する。配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列は、第２の人工フィブロインで説明したとおりである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号１０、配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
　（３－ｉ）の人工フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｉ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３（ギザ比率が１：１．８～１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の人工フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む人工フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉｉｉ）配列番号１８（ＰＲＴ３９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｖ）配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
　配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（３－ｉｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｖ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の人工フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第４の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の人工フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の人工フィブロインは、上述した第２の人工フィブロインと、第３の人工フィブロインの特徴を併せ持つ人工フィブロインである。具体的な態様等は、第２の人工フィブロイン、及び第３の人工フィブロインで説明したとおりである。
　第４の人工フィブロインのより具体的な例として、（４－ｉ）配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）、配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（４－ｉｉ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む人工フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
　第５の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
　局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２～４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
　上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
　第５の人工フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　第５の人工フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第５の人工フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
　アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ　Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
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　ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値（平均ハイドロパシー・インデックス）を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１～４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
　例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４－１＝７。「－１」は重複分の控除である。）。例えば、図４に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図４に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図４の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。
　第５の人工フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
　第５の人工フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
　疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。
　第５の人工フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉ）配列番号１９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７２０）、配列番号２０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
　（５－ｉ）の人工フィブロインについて説明する。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
　（５－ｉ）の人工フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｉ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　第５の人工フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む人工フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉｉｉ）配列番号２２（ＰＲＴ７２０）、配列番号２３（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２４（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｖ）配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、人工フィブロインを挙げることができる。
　配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（５－ｉｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｖ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　第５の人工フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第６の人工フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
　第６の人工フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。
　第６の人工フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
　本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（人工フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。
　ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
　図５は、人工フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図５を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図５に示した人工フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図５の人工フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
　第６の人工フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。
　本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（人工フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　第６の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
　「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。
　表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
　第６の人工フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度（平均ハイドロパシー・インデックス）が、例えば、－０．８以上、－０．７以上、－０．６以上、－０．５以上、－０．４以上、－０．３以上、－０．２以上、－０．１以上、０以上、０．１以上、０．２以上、０．２以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３以上、０．３５以上、０．４以上、０．４５以上、０．５以上、０．５５以上、０．６以上、０．６５以上、又は０．７以上であってよい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
　本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（人工フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　第６の人工フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　第６の人工フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
　第６の人工フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉ）配列番号２５（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８８）、配列番号２６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６５）、配列番号２７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８９）、配列番号２８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１６）、配列番号２９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１８）、配列番号３０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９８）、配列番号３２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６６）、配列番号４１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む人工フィブロイン、又は（６－ｉｉ）配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１若しくは配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む人工フィブロインを挙げることができる。
　（６－ｉ）の人工フィブロインについて説明する。配列番号２５で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号４１で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１７）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＬＩに置換し、かつ残りのＱをＶに置換したものである。配列番号４２で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ１０２８）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＩＦに置換し、かつ残りのＱをＴに置換したものである。
　配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　（６－ｉ）の人工フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（６－ｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｉ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（６－ｉｉ）の人工フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｉ）の人工フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　第６の人工フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、人工フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列を含む人工フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉｉｉ）配列番号３３（ＰＲＴ８８８）、配列番号３４（ＰＲＴ９６５）、配列番号３５（ＰＲＴ８８９）、配列番号３６（ＰＲＴ９１６）、配列番号３７（ＰＲＴ９１８）、配列番号３８（ＰＲＴ６９９）、配列番号３９（ＰＲＴ６９８）、配列番号４０（ＰＲＴ９６６）、配列番号４３（ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４４（ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む人工フィブロイン、又は（６－ｉｖ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む人工フィブロインを挙げることができる。
　配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　（６－ｉｉｉ）の人工フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（６－ｉｖ）の人工フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｖ）の人工フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（６－ｉｖ）の人工フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｖ）の人工フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　第６の人工フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　人工フィブロインは、第１の人工フィブロイン、第２の人工フィブロイン、第３の人工フィブロイン、第４の人工フィブロイン、第５の人工フィブロイン、及び第６の人工フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ人工フィブロインであってもよい。
　本発明において使用される人工タンパク質は、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンの総残基数が多い人工タンパク質が好ましく、更にシステイン、リジン、アルギニン、アスパラギン及びグルタミンの総残基数が多い人工タンパク質が好ましく、更にシステイン、リジン及びアルギニンの総残基数が多い人工タンパク質が好ましく、更にシステイン及びリジンの総残基数が多い人工タンパク質が好ましく、システイン残基の数が多い人工タンパク質が最も好ましい。
　マレイミド基を含むペンダント基は、上述の人工タンパク質に含まれるヘテロ原子（式（ＩＩ）において、Ｙで表される。）がリンカー化合物（例えば、式（Ｉ）で表される化合物、式中、Ｘは脱離基を示し、Ｌはリンカー部分を示す。）と反応（化学修飾）することにより、人工フィブロインに導入され得る。ヘテロ原子は、スルフヒドリル基（－ＳＨ）、グアニジン基（－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）、アミド基（－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ２）、ヒドロキシ基（－ＯＨ）等の置換基に存在する。例えば、人工タンパク質のアミノ酸配列のうち、上述の置換基を側鎖に有するアミノ酸残基（すなわち、システイン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン等）を足がかりにして、ペンダント基を導入することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　リンカー化合物は、式（Ｉ）で表される化合物であればよく、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）で表される化合物が好ましく、式（Ｉｃ）で表される化合物がより好ましい。リンカー化合物は、機能性物質との反応に利用される少なくとも１つのマレイミド基を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　式中、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、Ｃ１－２０アルキレン基、Ｃ６－２０アリーレン基、Ｃ６－２０アリーレン基－Ｃ１－２０アルキレン基、Ｃ６－２０アリーレン基－Ｃ１－２０アルキレン基－Ｃ６－２０アリーレン基、又はＣ１－２０アルキレン基－Ｃ６－２０アリーレン基－Ｃ１－２０アルキレン基、ポリエチレングリコール基、ポリプロピレングリコール基、ポリエチレン／プロピレングリコール基、テトラメチレングリコール基を示し、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立に、脱離基を示す。
　Ｃ１－２０アルキレン基は、炭素原子数１～２０のアルキレン基であり、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ウンデシレン基、ドデシレン基が挙げられる。
　Ｃ６－２０アリーレン基は、炭素原子数６～２０のアリーレン基であり、例えば、フェニレン基、ナフチレン基、ターフェニレン基、ピレニレン基、ビフェニレン基が挙げられる。
　Ｃ６－２０アリーレン基－Ｃ１－２０アルキレン基は、炭素原子数１～２０のアルキレンと炭素原子数６～２０のアリーレン基が共有結合した２価の基である。Ｃ６－２０アリーレン基－Ｃ１－２０アルキレン基－Ｃ６－２０アリーレン基、及び、Ｃ１－２０アルキレン基－Ｃ６－２０アリーレン基－Ｃ１－２０アルキレン基は、それぞれ、炭素原子数１～２０のアルキレンと炭素原子数６～２０のアリーレン基が共有結合した２価の基である。具体的には、メチレンジフェニレン基、フェニレンビス（メチレン）基が挙げられる。
　脱離基としては、電気陰性度が高く、人工タンパク質中のヘテロ原子（硫黄原子、窒素原子、酸素原子）による求核置換反応に対して反応性を有する基であればよく、具体的には、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、メタンスルホニルオキシ基、ベンゼンスルニルオキシ基、ｐ－トルエンスルホニルオキシ基が挙げられる。
　化学修飾の方法は、当業者に周知の方法で行うことができる。例えば、システインのスルフヒドリル基がマレイミドの炭素－炭素二重結合に対して１，４－付加反応することにより、アミノ酸配列を化学修飾する方法が知られている。また、グアニジン基、アミド基、ヒドロキシ基をアルキル化する方法、ヒドロキシ基をアシル化する方法により、化学修飾を行うこともできる。反応条件が比較的温和であることから、システイン残基とマレイミドとの反応により、ペンダント基を導入することが好ましい。この場合、リンカー化合物は、２つのマレイミド基を有し、そのうちの１つがペンダント基の導入に利用され、もう１つが機能性物質との反応に利用される。
　リンカー化合物が上述の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）で表される化合物である場合、本実施形態に係る化学修飾人工フィブロインは、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩｃ）で表される化合物となり得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　式中、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）における定義と同じである。Ｐｒｏｔは、人工タンパク質を示し、式（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）中のＹは、アミノ酸残基中のヘテロ原子（硫黄原子、窒素原子、酸素原子）を示し、式（ＩＩｃ）中のＳはアミノ酸残基中の硫黄原子である。ｎは、人工タンパク質に結合したペンダント基の数を示す。ｎは、少なくとも１以上の整数であり、人工タンパク質のアミノ酸配列に含まれるシステイン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンの合計残基数以下である。ｎの値が大きいほど、より多くの機能性物質を人工タンパク質に結合させることができる。ｎは、例えば、１～１０の整数である。
　本実施形態に係る化学修飾人工タンパク質は、成形材料としても利用できる。化学修飾人工タンパク質の形状は、粉末状であり得る。また、化学修飾人工タンパク質は、特に限定されないが、例えば、押出成形、射出成形等を始めとした各種のモールド成形や、フィルムキャスティング、紡糸、加熱加圧成形等の当業界で周知の方法で成形することができる。化学修飾人工タンパク質の成形体の形状は特に限定されないが、例えば、板状、粒子状、塊状、フィルム状、ゲル状、スポンジ状、又は繊維状であり得る。化学修飾人工タンパク質を加熱加圧成形すると、硬化した樹脂のような見かけ上均一相になり得る。このような成形体は、透光性を有し得る。
（化学修飾人工タンパク質の製造方法）
　本発明の第二実施形態は、人工タンパク質と、式（Ｉ）で表される化合物との反応により、式（ＩＩ）で表される化学修飾人工タンパク質を得る工程を含む、化学修飾人工タンパク質の製造方法である。本実施形態は、当業者に周知の手法（例えば、化学的手法、微生物学的手法）により人工タンパク質を得る工程をさらに含み得る。
　人工タンパク質と、式（Ｉ）で表される化合物との反応により、式（ＩＩ）で表される化学修飾人工タンパク質を得る工程は、タンパク質を化学修飾する方法として、当業者に周知の方法を利用することができる。
　例えば、溶媒中で、人工タンパク質と式（Ｉ）で表される化合物を混合してもよい。また、反応が進行しにくい場合には、塩基の添加、加温を行ってもよい。反応温度は、通常、０～６０℃であり、好ましくは３０～５５℃又は３５～５０℃である。使用される溶媒は、人工タンパク質を溶解することができ、所望の反応の進行を阻害しないものであればよい。このような溶媒としては、例えば、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）、ジメチルスルホキシド、ギ酸、ジメチルホルムアミド、酢酸、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンが挙げられる。
　反応を終了させるためには、例えば、酢酸エチルを添加し、生成物（化学修飾人工タンパク質）を凝集させてもよい。その後、凝集した生成物を酢酸エチル、メタノール等で洗浄することにより、生成物を精製することができる。
　得られた化学修飾人工タンパク質は、機能性物質との反応により所望の機能を付与し得るだけでなく、自身又は他のタンパク質と架橋させることができ、それによって分子量の増大（高分子化）を実現できる。
　タンパク質の修飾方法としては、国際公開第２０１６／１９２５２８号に記載されるように、タンパク質中のシステイン残基（すなわち、スルフヒドリル基）に、マレイミド基を有するリンカー化合物を反応させる方法が知られている。このような技術は、例えば、特定の抗体タンパクに薬物が結合した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の製造に応用されている。このようなＡＤＣでは、生体内でリンカー部分が切断されることを想定しています。これに対し、本発明では、末端にマレイミド基を有するリンカー化合物を、人工タンパク質に導入することにより、従来とは逆の置換様式（ドナーとアクセプター）の反転を達成したものです。
（機能性物質）
　本実施形態に係る化学修飾人工タンパク質に結合させ得る機能性物質は、ペンダント基の末端に位置するマレイミド構造に結合し得る物質であればよい。結合される機能性物質の種類によって、分子量の増大、柔軟性の向上、着色などの機能を付与することができる。
　機能性物質が結合した化学修飾人工タンパク質は、成形材料として利用できる。機能性物質が結合した化学修飾人工タンパク質の形状は、粉末状であり得る。また、機能性物質が結合した化学修飾人工タンパク質は、特に限定されないが、例えば、押出成形、射出成形等を始めとした各種のモールド成形や、フィルムキャスティング、紡糸、加熱加圧成形等の当業界で周知の方法で成形することができる。機能性物質が結合した化学修飾人工タンパク質の成形体の形状は特に限定されないが、例えば、板状、粒子状、塊状、フィルム状、ゲル状、スポンジ状、又は繊維状であり得る。機能性物質が結合した化学修飾人工タンパク質を加熱加圧成形すると、硬化した樹脂のような見かけ上均一相になり得る。このような成形体は、透光性を有し得る。
〔人工フィブロインの製造〕
（１）発現ベクターの作製
　配列番号４０で示されるアミノ酸配列を有する人工フィブロイン（ＰＲＴ９６６）、配列番号４６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１０００）を有する人工フィブロイン、及び配列番号４５で示されるアミノ酸配列を有する人工フィブロイン（ＰＲＴ１００１）を設計した。なお、配列番号４０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９６６）を有する人工フィブロインの平均ハイドロパシー・インデックスの値は０．４４であり、配列番号４６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１０００）を有する人工フィブロインの平均ハイドロパシー・インデックスの値は０．４５であり、配列番号４５で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１００１）を有する人工フィブロインの平均ハイドロパシー・インデックスの値は０．４６である。
　配列番号４６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１０００）は、配列番号４０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９６６）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のそれぞれから１番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。配列番号４６で示されるアミノ酸配列を有する人工フィブロインのシステイン残基の総数は２である。配列番号４５で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１００１）は、配列番号４０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９６６）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～２番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。配列番号４５で示されるアミノ酸配列を有する人工フィブロインのシステイン残基の総数は４である。
　上記のように設計した、配列番号４０、配列番号４６及び配列番号４５で示されるアミノ酸配列を有する人工フィブロインをコードする核酸をそれぞれ合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。この核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
（２）タンパク質の発現
　得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、人工フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする人工フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とする人工フィブロインの発現を確認した。
（３）タンパク質の精製
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍ　グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ　リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、３種類の人工フィブロイン（ＰＲＴ１０００、ＰＲＴ１００１及びＰＲＴ９６６）を得た。
＜機能性物質の合成＞
　ガラス容器内で、Ｎ－（１－ピレニル）マレイミド（東京化成工業（株）製）：５０ｍｇをＨＦＩＰ（セントラル硝子（株）製）：１ｍＬに溶解させた。次に、別のガラス容器内で、１，３－プロパンジチオール（東京化成工業（株）製）：８４．２μＬをＨＦＩＰ（セントラル硝子（株）製）：１ｍＬに溶解させた後、得られた溶液に上記のＮ－（１－ピレニル）マレイミドの溶液を加えた。その後、得られた混合物にトリエチルアミン（ナカライテスク（株）製）：２３．４μＬを加え、常温で２０時間撹拌した。
　その後、減圧下乾燥し、カラムクロマトグラフィーにて精製し、所望の画分を乾燥することにより、機能性物質を得た。
＜実施例１＞
（工程１）
　ガラス容器内で、人工フィブロイン（ＰＲＴ１００１）：２００ｍｇと、４，４’－ビスマレイミドジフェニルメタン（東京化成工業（株）製）：１５ｍｇ（人工フィブロインに対して４当量超となる量）をＨＦＩＰ（セントラル硝子（株）製）：５ｍＬに溶解させた後、得られた溶液を４０℃で２０時間撹拌した。
　その後、酢酸エチル（関東化学（株）製）の添加による凝集操作を行い、桐山ロートを用いて濾過した。得られた固体を、酢酸エチルとメタノール（ナカライテスク（株）製）：各２ｍＬでそれぞれ洗浄し、この洗浄操作を３回繰り返すことにより、未反応の４，４’－ビスマレイミドジフェニルメタンを除去した。更に、減圧乾燥を行うことにより、マレイミド結合フィブロインを得た。
（工程２）
　ガラス容器内で、マレイミド結合フィブロイン：２０ｍｇ及び機能性物質：１．２ｍｇをＤＭＳＯ（キシダ化学株式会社製）：１ｍＬに溶解させた後、得られた混合物を８０℃で２０時間撹拌した。
　その後、酢酸エチル（関東化学（株）製）の添加による凝集操作を行い、桐山ロートを用いて濾過した。得られた固体を、酢酸エチルとジクロロメタン：各２ｍＬでそれぞれ洗浄し、この洗浄操作を３回繰り返すことにより、未反応の機能性物質を除去した。更に、減圧乾燥を行うことにより、実施例１を得た。
＜比較例１＞
　人工フィブロイン（ＰＲＴ９６６）：２０ｍｇ及び機能性物質：１．２ｍｇをガラス容器内でＤＭＳＯ（キシダ化学（株）製）：１ｍＬに溶解させた後、得られた混合物を８０℃で２０時間撹拌した。
　その後、酢酸エチル（関東化学（株）製）の添加による凝集操作を行い、桐山ロートを用いて濾過した。得られた固体を、酢酸エチルとジクロロメタン（各２ｍＬ）でそれぞれ洗浄し、この洗浄操作を３回繰り返した。更に、減圧乾燥を行うことにより、比較例１を得た。
　以下の条件により、実施例１及び比較例１の吸光度を測定した。
＜吸光度の測定条件＞
　装置名：紫外可視分光光度計ＵＶ－２６００（（株）島津製作所製）
　波長：２７０～７００ｎｍ
　スキャンスピード：中速モード
　サンプルピッチ：１．０ｎｍ
　スリット幅：５ｎｍ
　結果を図６に示す。実施例１のデータでは、波長３３０～３５０ｎｍの範囲で高い吸光ピークが観測された。この結果から、マレイミド結合フィブロインのマレイミド基と機能性物質のチオール基とが結合することで、ピレニル基がタンパク質に結合していると考えられる。一方、比較例１のデータでは、波長３３０～３５０ｎｍの範囲における吸光ピークは、実施例１のものよりも小さかった。これらの結果は、蛍光基がマレイミド基を介して人工フィブロインに結合すること、及びマレイミドが結合していない人工フィブロインでは蛍光基との結合が生じないことを如実に示している。
＜参考例：人工タンパク質の疎水性評価＞
（１）溶解性試験
　疎水性タンパク質としての人工フィブロインと非疎水性タンパク質としてのシルクフィブロイン（平均ハイドロパシー・インデックスの値：０．２１）とについて、９Ｍ臭化リチウム水溶液への溶解性を評価した。シルクフィブロインとしては、ＫＢセーレン社製の「シルクパウダーＩＭ」を用い、人工フィブロインとしては、上述のようにして調製した配列番号４６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１０００）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）、及び上述のようにして調製した配列番号４０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９６６）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：１０００００）を用いた。溶解性の評価は、具体的には、９Ｍ臭化リチウム水溶液にそれぞれシルクフィブロイン、人工フィブロインを所定量添加し、６０℃で３０分間撹拌した後の水溶液の外観を観察することによって、溶解性を目視観察で評価した。
　結果を表６に示す。表６中、「濃度」は、水溶液中のシルクフィブロイン又は人工フィブロインの濃度を示し、「〇」は、添加したフィブロインが完全に溶解し、設定した濃度の溶液を調製できたことを示し、「×」は、フィブロインの解け残りが観察されたことを示す。すなわち、人工フィブロインは６０℃の９Ｍ臭化リチウム水溶液に対しても５質量％相当の量も溶解させることができない、疎水性の高いフィブロインであることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
（２）熱水耐性試験
　人工フィブロイン、シルクフィブロインについて、熱水耐性試験を行い、耐熱水性を評価した。した。シルクフィブロイン（シルクパウダーＩＭ　ＫＢセーレン社製）又は人工フィブロイン（ＰＲＴ９６６、ＰＲＴ１０００）５０ｍｇをガラス容器に入れ、最終濃度が５重量％となるようにＲＯ水（逆浸透膜でろ過した水）９５０ｍｇを加えて、タンパク質溶液を調製した。得られた溶液を１００℃に加熱し、撹拌した。５時間後、溶液を遠心分離により溶液を留去し、さらに遠心分離によりアセトンで２回洗浄した。洗浄後、減圧乾燥を行うことにより、粉末を得た。得られた粉末と熱水処理前のタンパクの保持時間をＧＰＣにより測定し、タンパク質の分解の程度を評価した。
　結果を図７に示す。シルクフィブロインを熱水処理すると、保持時間が処理前の保持時間よりも長くなった。一方、人工フィブロインを熱水処理すると、保持時間が処理前の保持時間よりも短いものが観察された。これらの結果から、シルクフィブロインは熱水処理により分解し、低分子化したと考えられた。これは、人工フィブロインはＲＯ水に対する親水性がシルクフィブロインよりも低かったためと推定される。換言すれば、人工フィブロインは疎水性が高いといえる。
（３）接触角の測定
　人工フィブロイン、シルクフィブロインについて、水に対する接触角の測定及び評価を行った。シルクフィブロイン（シルクパウダーＩＭ　ＫＢセーレン社製）３０ｍｇをガラス容器に入れ、最終濃度が３重量％となるようにＲＯ水９７０ｍｇを加えた後、得られた溶液を５０℃に加熱し、２４時間撹拌してタンパク質溶液を得た。また、人工フィブロイン（ＰＲＴ９６６、ＰＲＴ１０００）３０ｍｇをガラス容器に入れ、最終濃度が３重量％となるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）９７０ｍｇを加えた後、得られた溶液を１００℃に加熱し、１５分間撹拌してタンパク質溶液を得た。これらのタンパク質溶液をスライドガラス上に厚さ１００μｍのマスキングテープをシムにしてガラス棒でキャストした。その後、真空オーブン（商品名：ＶＯＳ－２１０Ｃ、東京理化機器社製）で８０℃で減圧乾燥を行うことによって、タンパク質のフィルムを得た。接触角計（商品名：ＤＭｓ－０６１、共和界面科学社製）を用いて、得られたフィルムにＲＯ水２μＬを滴下して、測定時間５秒の条件で接触角を測定した。合計６回の測定を行い、接触角の平均値を算出した。
　結果を表７に示す。人工フィブロインは、シルクフィブロインよりも接触角が大きく、より疎水性であることを示唆した。図８は、接触角測定の状態を示す写真である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018

Claims (13)

  1. 　マレイミド基を含むペンダント基を有する、成形材料用の化学修飾人工タンパク質。
  2. 　マレイミド基を含むペンダント基を有する化学修飾疎水性人工タンパク質である、請求項１に記載の人工タンパク質。
  3. 　マレイミド基を含むペンダント基を有する化学修飾人工構造タンパク質である、請求項１又は２に記載の人工タンパク質。
  4. 　マレイミド基を含むペンダント基を有する化学修飾人工フィブロインである、請求項３に記載の人工タンパク質。
  5. 　マレイミド基を含むペンダント基を有する化学修飾人工クモ糸フィブロインである、請求項４に記載の人工タンパク質。
  6. 　人工タンパク質と、式（Ｉ）で表される化合物との反応により、式（ＩＩ）で表される化学修飾人工タンパク質を得る工程を含む、化学修飾人工タンパク質の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｘは脱離基を示し、Ｌはリンカー部分を示す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｌはリンカー部分を示し、Ｐｒｏｔは人工タンパク質を示し、Ｙは、人工タンパク質のアミノ酸残基中のヘテロ原子を示し、ｎは１～１０の整数を示す。］
  7. 　式（Ｉ）で表される化合物の使用量が、人工フィブロイン１当量に対して１当量超である、請求項６に記載の化学修飾人工タンパク質の製造方法。
  8. 　式（ＩＩ）で表される化学修飾人工タンパク質を含む成形材料。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｌはリンカー部分を示し、Ｐｒｏｔは人工タンパク質を示し、Ｙは人工タンパク質のアミノ酸残基中のヘテロ原子を示し、ｎは１～１０の整数を示す。］
  9. 　人工タンパク質が疎水性人工タンパク質である、請求項８に記載の成形材料。
  10. 　人工タンパク質が人工構造タンパク質である、請求項９に記載の成形材料。
  11. 　人工構造タンパク質が人工フィブロインである、請求項１０に記載の成形材料。
  12. 　人工フィブロインが人工クモ糸フィブロインである、請求項１１に記載の成形材料。
  13. 　請求項８～１２のいずれか一項に記載の成形材料を成形して得られる成形体。
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