JP6051619B2

JP6051619B2 - コラーゲン様ポリペプチドの製造方法

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Publication number: JP6051619B2
Application number: JP2012146685A
Authority: JP
Inventors: 昭博内田; 修治佐々木; 明子島谷; 陽梅林; 和史石田
Original assignee: JNC Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2016-12-27
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: US8969522B2; US20140128573A1; JP2014009194A

Description

本発明は、コラーゲン様ポリペプチドの製造方法に関する。

タンパク質の一種であるコラーゲンは、汎用的な医用材料として幅広く用いられている。天然の一型コラーゲン分子は三アミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ、Ｙは様々なアミノ酸で、ＸはＰｒｏ、ＹはＨｙｐである場合が多い）の繰り返しから成る特徴的な一次構造を有する。このポリペプチドが同じ向きに３本寄り集って形成された三重らせんの三次構造をとり、コラーゲン繊維を形成する。

一方、コラーゲン様ポリペプチド（いわゆる合成コラーゲン）として創出された、三アミノ酸残基Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（Ｙ：プロリンまたはヒドロキシプロリン）の繰り返し構造からなるポリペプチド分子も、三重らせん構造をとることが報告されている（非特許文献１〜２）。
コラーゲン様ポリペプチドは、天然コラーゲンと異なり、感染症の危険性がないこと、工業的合成により得られるため安定な供給が可能であること、三重らせん構造の熱安定性が高いこと、着色やにおいなどがないことなど、諸々の優れた性質を有するため、様々な機能性材料としての研究がなされている（特許文献１等）。

通常、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖は、−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_n−（Ｙ
はＨｙｐまたはＰｒｏ）で示されるフラグメントを含むペプチドオリゴマーの縮合反応により製造される。例えば、特許文献２には、−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_n−（ＹはＨｙｐ
またはＰｒｏ、ｎ＝１〜２０）で示されるペプチドフラグメントを含むペプチドオリゴマーを、ジメチルスルホキシド中やエチレンジアミンを含む水系溶媒等中で縮合反応させる方法が記載されている。

しかしながら、コラーゲン様ポリペプチド複合体を機能性材料として活用する場合、その加工性や物性について難点が存在する場合がある。
例えば、近年ナノファイバーが材料形態として着目されているところ、コラーゲン様ポリペプチドをナノファイバー化するに際して従来のものでは困難があった。すなわち、天然コラーゲン分子とは異なるコラーゲン様ポリペプチドはＰｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙのみからなる単純な繰り返し構造であるため、高分子ペプチドでありながら分子鎖間の相互作用に乏しく、コラーゲン様ポリペプチド単独で紡糸しようとしても途切れたりビーズが形成されたりして繊維状のものが得られなかった。
また、例えば、コラーゲン様ポリペプチドをポリマー材料として用いる場合、従来のものでは力学的強度が不十分であった。

これらの問題点は、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖及びその複合体の分子量の大きさに起因することを本発明者らは初めて見出し、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖及びその複合体をより高分子量化することにより解消しうると考えた。しかしながら、所望の分子量、特に高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を得る製造方法は開発が進んでいなかった。
その理由として、コラーゲン様ポリペプチド複合体は巨大な会合構造を形成するため、正確な分子量を調べることが非常に困難であることが挙げられる。そのような状況では、得られる生成物の分子量を制御しようとしても、分子量の評価がし難いため、所望の分子量のコラーゲン様ポリペプチドを得る方法の開発が進捗しないという問題もあり、その解決方法も望まれている。

国際公開第２００８／０７５５８９号パンフレット特開２００３−３２１５００号公報

S. Sakakibara et al., Biochim. Biophys. Acta, 303, 198(1973). T. Kishimoto et al., Biopolymers, 79, 163-172(2005).

上記の状況に鑑み、本発明は従来よりも高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造する際に、得られる生成物の分子量を所望の大きさに制御する方法を提供することをも課題とする。

本願発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、コラーゲン様ポリペプチドをオリゴマーの縮合反応により製造する際に、該反応を水系溶媒中で行い、該溶媒中のリン酸イオン濃度を調節することによってより高分子量のコラーゲン様ポリペプチドを製造できることを見出した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］下記式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合反応させる工程を含むポリペプチドの製造方法であって、前記縮合反応を０Ｍ以上０．０１Ｍ未満のリン酸イオンを含む水系溶媒中で、縮合剤又は縮合剤及び縮合助剤の存在下で行うことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_n−ＯＨ（１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）_n−ＯＨ（２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）_n−ＯＨ（３）
（式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは１〜１０整数である。）
［２］リン酸イオンを含む水系溶媒中で、下記式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合させる反応において、前記リン酸イオンの濃度を０〜０．２Ｍの範囲で調節することにより前記縮合反応の生成物の分子量を制御する方法。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_n−ＯＨ（１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）_n−ＯＨ（２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）_n−ＯＨ（３）
（式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは１〜１０の整数である。）
［３］下記式（４）で表されるペプチドフラグメントを有するポリペプチド。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_m― （４）
（式（４）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｍは１００〜１７１の整数である。）
［４］単分子鎖の重量平均分子量が２６，７００〜４５，６００である、［３］に記載のポリペプチド。
［５］［３］または［４］に記載のポリペプチドを含有するナノファイバー。

本発明によれば、簡便かつ安価な手段によって、生成するコラーゲン様ポリペプチドの分子量を所望の大きさに制御することができ、従来よりも高分子量のコラーゲン様ポリペプチドを得る手段が提供される。種々の分子量、特に高分子量のコラーゲン様ポリペプチドを得られることにより、その加工性が飛躍的に向上し、機能性材料としての用途の幅が広がる。

コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖のＨＦＩＰ系ＧＰＣ測定チャート。コラーゲン様ポリペプチド複合体のＧＰＣ測定チャート（ａ：グアニジン塩酸塩処理なし、ｂ：グアニジン塩酸塩処理有）。本発明のコラーゲン様ポリペプチドナノファイバーのＳＥＭ画像写真である。本発明のコラーゲン様ポリペプチドナノファイバーのＳＥＭ画像写真である。

本明細書においては、「コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖」とは、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン）の繰り返し配列を有するポリペプチドであって、三重らせん等の分子鎖間相互作用による構造を取らずに１本鎖として存在する状態をいう。また、「コラーゲン様ポリペプチド複合体」とは、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が三重らせん構造をとった状態を示す。多くの場合において、コラーゲン様ポリペプチド複合体はさらに、三重らせんが分岐構造をとったり、三重らせん分子間で会合したりする高次構造を形成する。なお、三重らせん構造をとっているか否かは後述するように円二色性スペクトルを測定することにより確認することができる。

本明細書においては各種アミノ酸残基を次の略語で記述する。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｈｙｐ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓａｒ：サルコシン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−トレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
なお、本明細書におけるペプチド鎖のアミノ酸配列は、定法に従い、Ｎ末端のアミノ酸残基を左側に、Ｃ末端のアミノ酸残基を右側に位置させて記載する。

＜１＞本発明のポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドの製造方法は、下記式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合反応させる工程を含む。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_n−ＯＨ（１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）_n−ＯＨ（２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）_n−ＯＨ（３）
式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリンであり、好ましくはヒドロキシプロリンである。ヒドロキシプロリンは、例えば４Ｈｙｐであり、trans−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリンが好ましい。また、ｎは１〜１０の整数であり、１〜５の整数であることが、ハンドリングの容易さ、縮合反応の効率、ペプチドオリゴマーの入手の容易さや経済性の観点から好ましい。
本発明において、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーはいずれか１種を用いてもよいし、混合物であってもよい。また、ｎは単一の整数であってもよいし、種々の繰り返し数のオリゴマーの混合物であってもよい。
これらのペプチドオリゴマーは、既知の固相合成法または液相合成法により取得することができる。
式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーの他のペプチドオリゴマーを用いてもよい。ただし、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーと他のペプチドオリゴマーとの使用量が重量比において１００：０〜５０：５０の範囲であることが好ましい。他のペプチドオリゴマーの使用量が前記範囲にあることにより、製造されるコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が三重らせん構造を形成しやすくなる。

他のペプチドオリゴマーとしては、例えば下記式（５）〜（６８）で表されるペプチドオリゴマーが挙げられる。
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_o （５）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_o （６）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_o （７）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_o （８）
（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （９）
（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （１０）
（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （１１）
（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （１２）
（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （１３）
（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （１４）
（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （１５）
（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （１６）
（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （１７）
（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （１８）
（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （１９）
（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_o （２０）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（２１）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（２２）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（２３）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（２４）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（２５）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（２６）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（２７）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（２８）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（２９）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（３０）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（３１）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（３２）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（３３）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（３４）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（３５）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（３６）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（３７）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（３８）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（３９）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（４０）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（４１）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（４２）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（４３）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（４４）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（４５）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（４６）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（４７）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（４８）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（４９）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（５０）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（５１）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（５２）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（５３）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（５４）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（５５）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（５６）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（５７）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（５８）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（５９）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（６０）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（６１）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（６２）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（６３）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（６４）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（６５）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（６６）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（６７）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）_p−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）_q
（６８）
式（５）〜（２０）中ｏは１〜１０の整数であり、式（２１）〜（６８）中ｐは１〜１０の整数であり、ｑは１〜１０の整数である。ただし、縮合反応の効率及びペプチドオリゴマーの入手の容易さから、ｏ、ｐ、およびｑは独立して１〜５の整数であることが好ましく、特に好ましくは１である。

本発明の製造方法における縮合反応は、リン酸イオンを含む水系溶媒中で行う。
本発明において水系溶媒とは、水を含む溶媒であり、有機溶媒が水系溶媒に混入していてもよい。ここで、有機溶媒とは、アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミド等）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシド等）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン等）、ニトリル類（アセトニトリル等）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフラン等）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール等）をいう。また、混入してもよいとは、含有量が好ましくは５０重量％未満、より好ましくは１０重量％未満、さらに好ましく
は全く含まないことをいう。

本発明において、リン酸イオンとは、リン酸二水素イオン（Ｈ₂ＰＯ₄ ^-）、リン酸水素
イオン（ＨＰＯ₄ ²-）、及びリン酸イオン（ＰＯ₄ ³-）の総称であり、水系溶媒中のリン酸イオン濃度は、リン酸二水素イオン（Ｈ₂ＰＯ₄ ^-）、リン酸水素イオン（ＨＰＯ₄ ²-）、及びリン酸イオン（ＰＯ₄ ³-）の合計濃度である。
水系溶媒中のリン酸イオン濃度を低くすると高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造することができ、該濃度を高くすると低分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造することができ、リン酸イオン濃度を調節することによって製造されるコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の分子量を制御することができる。
具体的には、例えば水系溶媒中のペプチドオリゴマーの濃度が５重量％であるときを例に説明すると、リン酸イオン濃度が０〜０．００２５Ｍの場合は重量平均分子量４５，６００〜２６，７００のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が得られ、０．００５Ｍ以上０．０１Ｍ未満の場合は、２０，３００〜１６，０００のコラーゲン様（単分子）鎖が得られ、従来得難かった高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造できる。また、０．０１２〜０．０６Ｍの場合は重量平均分子量１３，５００〜７，１００のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が得られる。
リン酸イオン濃度は、水系溶媒にリン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム等のリン酸塩を添加することにより調節できる。これらのリン酸塩は簡便かつ安価に入手でき、またその濃度の調節も簡便であるため、本発明は容易に実施することが可能である。

本発明にかかる縮合反応において、水系溶媒中のペプチドオリゴマーの濃度は、反応効率の観点から０．１〜５０重量％であることが好ましく、反応のハンドリングの観点からは４〜２５重量％であることがより好ましい。なお、ペプチドオリゴマーの濃度を小さくすることにより、生成するコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の分子量が小さくなるように制御することもできる。
また、縮合反応を行う温度は、反応効率の観点から０〜６０℃であることが好ましく、４〜２０℃であることがより好ましい。
また、反応時間は１〜９６時間であることが好ましく、２〜４８時間であることがより好ましい。
また、縮合反応を行う水系溶媒のｐＨは特に限定されないが、通常、中性付近（ｐＨ＝６〜８程度）に調整される。ｐＨの調節は、通常、無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど）、有機塩基、無機酸（塩酸など）や有機酸を用いて行うことができる。
また、反応効率を上げるため水系溶媒を攪拌してもよいが、特に限定されない。

また、本発明の製造方法における縮合反応は、脱水剤（脱水縮合剤、縮合助剤）の存在下で行う。脱水剤の存在下で反応させることにより、脱保護とアミノ酸結合とを繰返す煩雑な処理を経ることなく、二量化や環化を抑制しつつ円滑に縮合反応が進行する。

脱水縮合剤は、前記溶媒中で脱水縮合を効率よく行える限り特に限定されるものではなく、例えば、カルボジイミド系縮合剤（ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ＝ＷＳＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(ＷＳＣＩ
・ＨＣｌ)、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等）、フルオロホスフェート系
縮合剤（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロ
リン化物塩（ＢＯＰ））等）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）が例示できる。
これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）である。

脱水縮合剤の使用量は、ペプチドオリゴマーの総量１モルに対して、通常、水を含まない非水系溶媒を用いる場合０．７〜５モル、好ましくは０．８〜２．５モル、さらに好ましくは０．９〜２．３モル（例えば１〜２モル）の範囲である。水を含む溶媒（水系溶媒）においては、水による脱水縮合剤の失活があるので、脱水縮合剤の使用量は、ペプチドオリゴマーの総量１モルに対して、通常、２〜５００モル、好ましくは５〜２５０モル、さらに好ましくは１０〜１２５モルの範囲である。

縮合助剤は、縮合反応を促進する限り特に制限されず、例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類（例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）等のＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類）、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）等のトリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルが例示できる。
これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、Ｎ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類（ＨＯＮＳｕ等）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン類（ＨＯＢｔ等）である。
縮合助剤の使用量は、溶媒の種類に関係なく、ペプチドオリゴマーの総量１モルに対して、通常、０．５〜５モル、好ましくは０．７〜２モル、さらに好ましくは０．８〜１．５モルの範囲である。

本発明において、脱水縮合剤のみを使用してもよいが、脱水縮合剤と縮合助剤とを適当に組み合わせて使用することが好ましい。脱水縮合剤と縮合助剤との組合せとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔまたはＨＯＯＢｔ）、ＷＳＣＩ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔ又はＨＯＯＢｔ）が挙げられる。

本発明の製造方法により得られたポリペプチドは、凍結乾燥により粉体にする等して、その後の加工へ供するのに取り扱いやすい形態とすることができる。凍結乾燥する場合は、縮合反応後の反応溶液をナス型フラスコ等適切な容器に入れ、凍結乾燥機（例えば、東京理科機械製；ＥＹＥＬＡＦＤＵ−２０００等）を用いて行う。凍結乾燥は、水分が蒸発して乾燥物が得られるまで実施し、通常は一夜から２日間で完了する。得られた乾燥物を任意の溶媒に所望の濃度で溶解させることにより、ファイバー、ナノファイバー、ゲル等の製造に供する原液を調製することができる。
また、本発明の製造方法により得られたポリペプチドには、反応に用いた試薬が残存している。得られたポリペプチドをこの後に加工等に供する場合にこれらの残存試薬が影響する恐れがあるため、除去することが好ましい。残存試薬の除去は、透析法、カラム法、限外ろ過法等の既知の手法を用いることができる。
また、ポリペプチドの安定性および取扱いの容易さから考えると、反応溶媒を保存溶媒に置換することが好ましい。反応溶媒から目的とする保存溶媒への置換は、透析法においては目的とする保存溶媒を透析外液として使用することにより、カラム法においては目的とする保存溶媒を移動相として用いることにより置換することができる。
保存溶媒としては、得られたポリペプチドの物理的性質等の変化を抑えられるものであれば特に限定されない。例えば、水、生理食塩水、弱酸から弱アルカリに緩衝能を有するバッファーを挙げることができる。

＜２＞本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、次式（４）で示されるペプチドフラグメント（以降、ポリＰＹＧと記す）を有するコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖である。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_m― （４）
ここでＹはヒドロキシプロリンまたはプロリンであり、ヒドロキシプロリンは、例えば４Ｈｙｐであり、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが好ましい。
また、式（４）中、繰り返し数ｍは１００〜１７１の整数である。すなわち、従来のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖に比して繰り返し数が大きいものである。
また、本発明のポリペプチドの重量平均分子量は単分子鎖あたり２６，７００〜４５，６００である。すなわち、従来合成されていたコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖に比して高分子量のものを含む。なお、かかる重量平均分子量は後述するＨＦＩＰ系ＧＰＣにより測定された値である。

本発明のポリペプチド単分子鎖は、天然コラーゲンのように三重らせん構造をとりコラーゲン様ポリペプチド複合体を形成することができる。なお、ポリペプチドが三重らせん構造をとっているか否かは、ポリペプチド溶液について円二色性スペクトルを測定することにより確認することができる。具体的には、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果、および波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す場合、そのポリペプチドは三重らせん構造をとっていると考えられる。
本発明のポリペプチドは、直線状または１以上の分岐を有していてもよい。分岐を有する場合、分岐点以降に三重らせん構造が形成されていてもよく、さらにその三重らせん構造の後ろに分岐を有していてもよい。また、ポリペプチド単分子鎖どうしは、互いに架橋されていてもよい。

本発明におけるコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖は、ポリＰＹＧのみからなるものであってもよいが、ポリＰＹＧの他にアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを含んでもよい。
アミノ酸残基としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択された少なくとも１種が挙げられる。ペプチドフラグメントとしては、前記アミノ酸残基の１種以上が複数個結合したペプチドが挙げられる。アルキレンとしては、直鎖状、分岐状のいずれでもよく、特に限定されるものではないが、具体的には炭素数１〜１８のアルキレンが挙げられ、実用的には炭素数２〜１２のアルキレンが好ましい。
本発明のポリペプチド（単分子）鎖は、ポリＰＹＧと他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを、重量比においてポリＰＹＧ：他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレン＝１：９９〜１００：０、好ましくは１０：９０〜１００：０の範囲で有する。

本発明のポリペプチドは単分子鎖での分子量が従来のものよりも大きいため、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖又は複合体の物性として新たなまたはより優れた性質を呈する。例えば、ゲル化した場合に、その力学的強度が向上する。
また、高分子量であることにより、重量平均分子量（単分子鎖）が３０００〜２００００程度のコラーゲン様ポリペプチド複合体では不可能であった単独での繊維化が可能となる。本発明のポリペプチドを含有する繊維、特にナノファイバーは、機能性材料として、医療用材料など種々の用途に供することができる。例えば、コラーゲン様ポリペプチド複合体の有する、血液凝固因子等の生体分子への高親和性を利用した吸着剤や、血液凝固能を利用した止血剤に適用したりすることができる。

繊維化する方法としては、周知の手法を適用でき特に制限されないが、例えば、本発明のポリペプチドを有機溶媒（例えばヘキサフルオロイソプロパノール等）に溶解した溶液を、シリンジを用いてメタノール中に吐出する手法などが挙げられる。
また、エレクトロスピニング法による紡糸方法も挙げられる。エレクトロスピニング法であれば、繊維径５ｎｍ〜５０μｍの均一なコラーゲン様ポリペプチド複合体繊維を得ることができ、繊維径がナノメートル単位（１〜１０００ｎｍ）のナノファイバーを得ることもできる。
エレクトロスピニング法により、本発明のポリペプチドを含有する繊維（本発明のナノファイバーを含む）を紡糸する方法を以下に説明する。
まず、本発明のポリペプチドを溶媒に溶解させて紡糸溶液を調整する。かかる溶媒としては、ポリペプチドを溶解し、かつ紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されない。例えば、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン、スルホランアセトン、プロパノール、ジクロロメタン、蟻酸、ヘキサフルオロイソプロパノール、ヘキサフルオロアセトン、メチルエチルケトン、クロロホルム、イソプロパノール、トルエン、テトラヒドロフラン、ベンゼン、ベンジルアルコール、１，４−ジオキサン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、塩化メチレン、フェノール、ピリジン、トリクロロエタン、酢酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１−メチル−２−ピロリドン、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート、ジメチルカーボネート、アセトニトリル、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、ブチレンカーボネート、１，４−ブチロラクトン、ジエチルカーボネート、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジオキソラン、エチルメチルカーボネート、メチルホルマート、３−メチルオキサゾリジン−２−オン、メチルプロピオネート、２−メチルテトラヒドロフランなどが挙げられる。溶媒は一種を単独で用いてもよく、複数の溶媒の混合物であってもよい。
紡糸溶液中のポリペプチド濃度は、連続繊維を形成しやすくするため、０．１〜１０．０重量％であることが好ましく、１．０〜８．０重量％であることがより好ましく、３．０〜６．０重量％であることがさらに好ましい。

また、本発明のポリペプチドは単分子鎖あたりの分子量が大きいため、単独で紡糸することが可能であるが、他のポリマーを共に用いて紡糸溶液を調製してもよい。この場合、得られる繊維の力学的強度を向上させたり、繊維長さを大きくしたり、種々の機能を付与することができる。他のポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリスチレン等、特に制限されない。
また、紡糸溶液は、紡糸を妨げない限りにおいて任意の成分を含有してもよい。かかる任意成分としては、接着剤、電解質などが挙げられる。
接着剤を添加すると、製造されたナノファイバーどうしが接触点で接着されるので、ナノファイバーを不織布の形態で得る際に強力で摩擦によるケバ立ちの少ない柔軟な不織布とすることができる。接着剤としては、製造されたナノファイバーどうしを接着でき、かつ紡糸溶液の溶媒に可溶であれば特に限定されないが、例えばホットメルト樹脂からなる
接着剤、エラストマー系の接着剤、アクリル系接着剤、エポキシ系接着剤、ビニル系接着剤などが挙げられる。エラストマー系の接着剤としては、ポリクロロプレンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ブチルゴム、アクリロニトリル・ブタジエンゴム、エチレン・プロピレンゴム、クロロスルフォン化ポリエチレンゴム、エピクロルヒドリンゴムが例示される。接着剤を添加する場合は紡糸溶液中のポリペプチド１００重量部に対して０．５〜１０重量部添加されることが好ましい。
電解質を添加することによって紡糸溶液表面の電荷密度を上げることが出来、結果として紡糸性を向上させることが可能となる。電解質としては、紡糸溶液に可溶で、紡糸溶液中で電離するものであれば特に限定はされないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸二水素ナトリウム、炭酸マグネシウムが例示される。電解質を添加する場合は、紡糸溶液中のポリペプチドが塩析しない程度が望ましく、紡糸溶液中のポリペプチド１００重量部に対して０．５〜１０重量部添加されることが好ましい。

次いで、調製した紡糸溶液を周知のエレクトロスピニング法の手段によって紡糸する。具体的には、紡糸溶液を充填したノズルとコレクター（基板）の間に電圧を印加した状態で、ノズルから紡糸溶液を吐出させて、コレクター上に繊維を回収する。エレクトロスピニング法を行う条件は、特に限定されず、紡糸溶液の種類や得られる繊維の用途等に応じて適宜調整すればよい。本発明の方法における一般的な条件としては、例えば、印加電圧は５〜５０ｋＶ、吐出速度は０．０１〜５．００ｍＬ／時、ノズルとコレクターの間の垂直距離は５０〜３００ｍｍとすることができ、ノズルは１８〜３０Ｇ（ゲージ）の径のものを使用することができる。紡糸環境は、相対湿度１０〜７０％、温度を１０〜３０℃とすることが好ましいが、特段厳密に制御を行わなくてもよい。
これにより、直径５ｎｍ〜５０μｍの繊維を得ることができ、直径５〜１０００ｎｍのナノファイバーを得ることもできる。また、紡糸条件の設定・調整により、平均して２００〜３００ｎｍの長く途切れない繊維を得ることができる。また、ナノファイバー中に、塊状のビーズを含まないか含まれても少ない、均一なナノファイバーを得ることができる。

＜３＞ポリペプチドの分子量測定
ここで、本発明のポリペプチドの重量平均分子量を測定する方法について説明する。本発明においてコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の重量平均分子量は、溶媒としてヘキサフルオロイソプロパノールを用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィー法（以下、ＨＦＩＰ系ＧＰＣ法と記す）で測定されたものである。

従来、ポリペプチドを含む高分子量のポリマーの重量平均分子量は、水溶液を移動相とするＧＰＣ法で測定するのが一般的であった。しかしながら、水溶液中でコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖は三重らせん構造をとったりさらに三重らせん同士が会合して、クロマトグラムのピークがブロードになったり、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の正しい分子量を反映した位置にピークが出現しなかったりした。例えば、特許文献２ではカラムにSuperdex 200 HR 10/30を用いリン酸バッファーを移動相とするＧＰＣ法でポ
リペプチドの分子量を決定しているが、本発明者らによる追試ではデキストランの分子量に換算して１００，０００よりも高分子量のものについては正確な分子量の測定が不可能であることがわかっている。縮合反応により得られたコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の物性等を検討するに際しその単分子鎖の分子量を把握したいという要請があるにもかかわらず、正確に測定することが難しいという問題があった。

今回高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造するにあたり、かかる状況に鑑み、本発明者らはＨＦＩＰ系ＧＰＣ法によれば、高分子量ポリペプチド（単分子）鎖でも測定が可能となることを見出した。これは、１８〜５０℃のＨＦＩＰ中ではコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖は三重らせん構造をとらないという、やはり本発明者らが見出した知見に基づく。コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が単独分子で存在することにより、三重らせんや会合状態のみかけの分子量ではなく、正確な分子量がクロマトグラムのピークに反映される。
さらに、ＰＨＧオリゴマー及び多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）により絶対分子量を決定したコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を分子量標準として用いることにより、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の正確な分子量値が得られることをも見出した。

すなわち、本明細書におけるポリペプチド（単分子）鎖の重量平均分子量は以下の条件のＨＦＩＰ系ＧＰＣ法で測定されたものである。
移動相：ヘキサフルオロイソプロパノール
カラム：ＧＰＣＫＦ−６０６Ｍ、昭和電工株式会社製
流速：０．２〜１ｍＬ／ｍｉｎ
温度：１８〜５０℃
分子量標準：ＰＨＧオリゴマー及びＭＡＬＳにより絶対分子量を決定したコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖
検出：紫外線吸光度計
なお、分子量標準として用いたＰＨＧオリゴマー及びコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を表１に示す。また、上記移動相において中のコラーゲン様ポリペプチドは高次構造をとらず単分子鎖として存在していることは、円二色性スペクトルにより確認した。

また、本発明のポリペプチド鎖の重量平均分子量は、塩酸グアニジン処理を行えば水溶液を移動相とするＧＰＣ法でも測定することができる。従来、一般に未処理のコラーゲン様ポリペプチド複合体では三次構造が不ぞろいであるためにＧＰＣによる測定において複数のピークやブロードなピークが出現してしまい、水溶液中での正確なコラーゲン様ペプチドの分子量を測ることができなかった。本発明者らは、塩酸グアニジンによりコラーゲン様ポリペプチド複合体の三重らせんを一旦ほどき、その後巻き戻しを行うことで、水溶液を移動相とするＧＰＣ測定においてもピークが１つに収束し正確な分子量を測定できることを見出した。
具体的には、コラーゲン様ポリペプチド複合体を塩酸グアニジン水溶液中で加熱処理した後、冷却し、該溶液を水で希釈したものをＧＰＣ測定に供する試料とする。ここで、塩酸グアニジンの濃度としては４〜６Ｍが好ましく、５〜６Ｍがより好ましい。加熱は、８０〜１００℃の温度で、５〜１２０分間処理することが好ましい。
ＧＰＣ測定は通常の条件下で行うことができ、特に限定されない。例えば、リン酸塩等の水溶液（ｐＨ３〜６）を移動相として、カラムは（ＴＳＫｇｅｌＧ６０００ＰＷｘｌ；東ソー）を用い、流速０．５〜１ｍＬ／ｍｉｎ、温度２５〜４０℃で、分子量標準としてCalibration Standards for Aqueous P-series/ Shodexを用いることができる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の合成＞
ＰＨＧモノマーとして、Ｌ−プロピル−Ｌ−（４−ヒドロキシプロピル）−グリシン
０．５ｇ、ＨＯＢｔ・Ｈ₂Ｏ０．０５ｇを量り取り、ストックＰＢ溶液を希釈した希釈液５ｍＬに加えて４℃で攪拌した。別容器にＥＤＣ・ＨＣｌ１．５８ｇを量り取り、同様
にストックＰＢ溶液を希釈した希釈液５ｍＬに加えて４℃で攪拌した。両者を混合して縮合反応を開始し、４℃で２４時間反応させた。ここでストックＰＢ溶液とは、８．１ｍＭ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄、２．６８ｍＭＫＣｌ、１．４７ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄水溶液であり、これを
１×ＰＢ溶液として種々のリン酸イオン濃度の反応溶媒を調製した。なお、「×０」はストックＰＢ溶液を含まない、純水である。
得られた生成物について、水系ＧＰＣ法またはＨＦＩＰ系ＧＰＣ法で単分子鎖の分子量（Ｍｎ及びＭｗ）を測定した。水系ＧＰＣ法の測定条件は、移動相：２０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₃ＰＯ₄, ｐＨ３．０：ＭｅＯＨ=８：２、カラム：ＴＳＫＧ６０００ＰＷＸＬ−ＣＰ、流速：０．６ｍＬ/ｍｉｎ、温度：４０℃、分子量標準：Calibration Standards for
Aqueous P-series/ Shodexである。ＨＦＩＰ系ＧＰＣ法の測定条件は、５ｍＭＣＦ₃Ｃ
ＯＯＮａＨＦＩＰ溶液、カラム：ＧＰＣＫＦ−６０６Ｍ、流速：０．５ｍＬ/ｍｉｎ、
温度：４０℃、分子量標準：ＰＨＧ、（ＰＨＧ）₂、（ＰＨＧ）₄、（ＰＨＧ）₁₀及びＭＡＬＳにて絶対分子量を決定したコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖である。代表例として、実施例５の生成物のＨＦＩＰ系ＧＰＣ測定チャートを図１に示す。
表２に結果を示す。なお、実施例５は特許文献２に記載された製造方法におけるリン酸イオン濃度での製造例に相当する。また、参考例として（ＰＨＧ）₁₀＝２，６８８ｇ/ｍ
ｏｌの結果も載せた。表２に示す通り、リン酸イオン濃度が小さいほど高分子量のポリペプチド（単分子）鎖が得られ、特にリン酸イオンを含まない場合（実施例１；０ｍＭ）は格段に分子量が大きくなった。一方リン酸イオン濃度が大きいほど低分子量となった。また、実施例５の生成物は、特許文献２ではゲル濾過法により数万レベルの分子量であるとされていたが、ＨＦＩＰ系ＧＰＣによる測定ではずっと小さい分子量であったことがわかった。
また、水系ＧＰＣでは高分子量のものは測定不能であったが、ＨＦＩＰ系ＧＰＣではポリペプチドの単分子鎖を測定対象とすることができ、高分子量のポリマーであっても正確に分子量を測定できることがわかった。

＜参考：グアニジン塩酸塩処理＞
実施例５のポリペプチド水溶液０．５ｍｇ／ｍＬを、６Ｍ塩酸グアニジン中で９０℃で１時間加熱後、室温（１５〜３５）℃に冷却し、ＧＰＣ移動相で５倍に希釈し、これを水系ＧＰＣ法での測定に供した。測定条件は、（ＴＳＫｇｅｌＧ６０００ＰＷｘｌ東ソー、流速０．５〜１ｍＬ／ｍｉｎ、温度２５〜４０℃、分子量標準Calibration Standards for Aqueous P-series/ Shodex）である。
結果を図２に示す。グアニジン塩酸塩処理をせずにＧＰＣ測定を行った場合のチャートでは、複数のピークがブロードに現れ、分子量を把握することが難しかった（図２ａ）。一方、グアニジン塩酸塩処理を行った場合は、ピークが１本に収束し、コラーゲン様ポリペプチド複合体の三重らせんが巻き戻されたことによりその三次構造が１つになったためと考えられる（図２ｂ）。なお、図２ｂにおいて２５．０９３分に出現するピークは使用した塩酸グアニジンに由来する。

＜ナノファイバーの作製＞
実施例１の反応後のポリペプチド水溶液を凍結乾燥し（ＥＹＥＬＡＦＤＵ−２０００；東京理科機械製、以下同じ）、これを用いて、エレクトロスピニング法によりナノファイバーを作製した。紡糸溶液は、該ポリペプチドをヘキサフルオロイソプロパノールに溶解して５重量％の溶液とし、２７Ｇステンレスニードルとコレクターとの間（垂直距離１５０ｍｍ）に高電圧発生装置により２５ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．５ｍＬ／時でコレクター上に押し出した。なお、紡糸環境の相対湿度は３７％、温度は２４℃であった。
得られたナノファイバーを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。使用機器はＪＳＭ-５６００（ＪＥＯＬ社製）、加速電圧は３０ｋＶで観察を行った。図３及び図４に示す
結果のとおり、本発明のコラーゲン様ポリペプチドナノファイバーは、直径１００〜２００ｎｍの均一で長い繊維状であった。
なお、実施例５の反応後のポリペプチド水溶液を用いて同様の操作を行ったが、紡糸の際に途切れたりビーズが形成されたりして繊維状とはならず、ナノファイバーを得られなかった。

＜ファイバーの作製＞
実施例１の反応後のポリペプチド水溶液を凍結乾燥し、ヘキサフルオロイソプロパノールに溶解して８重量％の溶液とした。これを２５Ｇの注射針を装着したシリンジに充填し、該注射針からメタノール中に該溶液を押し出したところ、糸を得ることができた。
なお、実施例５の反応後のポリペプチド水溶液については、同様の操作では糸状のものは得られなかった。

＜ゲルの作製＞
実施例１の反応後のポリペプチド水溶液を凍結乾燥し、ギ酸に溶解して１重量％の溶液とした。ガラス容器中でこの溶液の上に純水を重層して、ギ酸を水で置換することによりゲルを得た。ゲルは容器の底に形成したが、容器を転倒放置してもなお、その形状を保った。
また、実施例５の反応後のポリペプチド水溶液についても、同様の操作でゲルを得た。ただし、このゲルは実施例１の物よりも軟らかく、容器の転倒により崩れる程度の強度であった。

本発明によれば、簡便かつ安価な手段によって、生成するコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の分子量を所望の大きさに制御することができ、従来よりも高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造することができる。種々の分子量、特に高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖及びその複合体を得られることにより、その加工性が飛躍的に向上し、機能性材料としての用途の幅が広がるため、産業上非常に有用である。

Claims

下記式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合反応させる工程を含むポリペプチドの製造方法であって、前記縮合反応を０Ｍ以上０．００２５Ｍ未満のリン酸イオンを含む水系溶媒中で、縮合剤又は縮合剤及び縮合助剤の存在下で行うことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_ｎ−ＯＨ（１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）_ｎ−ＯＨ（２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）_ｎ−ＯＨ（３）
（式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは１〜１０の整数である。）
リン酸イオンを含む水系溶媒中で、下記式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合させる反応において、前記リン酸イオンの濃度を０〜０．００５Ｍの範囲で調節することにより前記縮合反応の生成物の分子量を制御する方法。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）_ｎ−ＯＨ（１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）_ｎ−ＯＨ（２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）_ｎ−ＯＨ（３）
（式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは１〜１０の整数である。）