JP2019510541A - 合成のクモドラグラインシルクを含む複合材料 - Google Patents

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Abstract

ポリマー及びＭａＳｐ（大瓶状腺スピドロイン）タンパク質由来のタンパク質の混合物に基づく複合材料が提供される。さらに、その調製方法、及び複合材料の使用方法が提供される。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１６年２月１１日出願の米国仮特許出願第６２／２９３，８８０号、２０１６年４月３日出願の同第６２／３１７，５７２号及び２０１６年８月１０日出願のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ２０１６／０５０８７４号の優先権の利益を主張するものである。上記文献の内容は、本明細書に完全に記載されたものとしてその全体が参照により組み込まれる。
発明の分野
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ＭａＳｐ（大瓶状腺スピドロイン（（ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ））タンパク質に由来するタンパク質に基づく複合材料、及びその調製を対象とする。
発明の背景
クモドラグラインシルクは、クモの巣のフレーム及び半径だけでなくクモが降りる又は危険を逃れるときのライフラインを構築するために、円網を作るクモによって使用されるシルクとして当技術分野で知られている。これらの作業を実行できるように、ドラグライン繊維は、高い弾性及び強度の組み合わせにより著しく高い靭性を示し、天然又は人工に関わらず最も強靭な繊維として位置づけられている。例えば、ドラグラインは、その直径において高張力鋼の６倍強く、これまでに作られた最強の合成繊維の１つであるケブラーよりも３倍強靭である。
ドラグラインシルクは、ニワオニグモ中の、たいてい大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）１及び２、またＡＤＦ−３及びＡＤＦ−４とも呼ばれる２つの主なポリペプチドからなる。これらのタンパク質は、試料の古さ及び分析の条件に応じて、２００〜７２０ｋＤａの範囲の見かけの分子量を有する。公知のドラグラインシルクスピドロインは、繊維中に結晶βシートを形成するアラニンリッチセグメントと、より柔軟であり、主に規則正しい構造を欠くグリシンリッチセグメントを交互に形成する、高度に反復したブロックで構成されている。Ｃ末端領域は、非反復性で、種間で高度に保存されており、αヘリックス立体構造をとっている。ドラグラインシルクタンパク質のＮ末端領域は、異なるスピドロイン間、また異なるクモの種間で高度に保存されていることも判明した。
細菌、酵母、植物及び組織培養中の哺乳動物細胞、さらにはトランスジェニックヤギを使用して、遺伝子工学などを介してクモシルクを合成するために多くの試みがなされてきた。
米国特許第８，４６１，３０１号は、とりわけ、半合成クモシルクタンパク質ドメイン、又はその任意の機能的相同体、バリアント、誘導体、断片又は変異体の、複数のリピートを含む単離されたアミノ酸配列に関する。この刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
クモドラグラインシルクに関するさらなる刊行物には、Ｉｔｔａｈ，Ｓ.ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，９３（５），４５８−４６８，２０１０；Ｉｔｔａｈ，Ｓ.ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，８（９），２７６８−２７７３，２００７；Ｉｔｔａｈ，Ｓ.ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，７（６），１７９０−１７９５，２００６；及びＨｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄ.，Ｉｔｔａｈ，Ｓ.ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４，２０７０−２０７４，２００４が含まれる。これらの刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ステント及びインプラントのコーティング、繊維、並びに弾道用途を含め、クモシルクに基づく複合材料を使用するために様々な用途が提案されている。
発明の概要
天然のクモシルクに似た機械的性質を有する繊維を生成するための改良された組成物及び方法に対する必要性が満たされていない。
本発明は、とりわけ、ＭａＳｐ（大瓶状腺スピドロイン）タンパク質に由来するタンパク質に基づく複合材料、及びその調製を対象とする。
いくつかの態様によれば、タンパク質の混合物及び少なくとも１つのポリマーを含む複合材料であって、タンパク質の混合物は異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、混合物中の各タンパク質は、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含み、ｍ及びｎは、独立して２〜７０の整数である、複合材料が提供される。
いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、
（ａ）各リピートは２ｋＤａ〜３.５ｋＤａの範囲の分子量を有する；
（ｂ）「ｍ」に対する「ｎ」の比は２：１〜１：２の範囲にある；
からなる群から選択される１以上の性質によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、繊維の形態である。いくつかの実施形態において、該繊維は、リンカーを介してポリマーに接着している。いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、ポリマーの少なくとも一方の表面に接着している。
いくつかの実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は２：１〜１：２の範囲にある。いくつかの実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は１.８：１〜１：１.８の範囲にある。いくつかの実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は１.６：１〜１：１.６の範囲にある。いくつかの実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は１.５：１〜１：１.５の範囲にある。いくつかの実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は１.３：１〜１：１.３の範囲にある。いくつかの実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は１.２：１〜１：１.２の範囲にある。いくつかの実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は１.１：１〜１：１.１の範囲にある。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリマーは、非ＭａＳｐタンパク質由来のポリマーである。
いくつかの実施形態において、タンパク質のそれぞれは、独立して、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む：
（Ｘ１）ｚＸ２ＧＰＧＧＹＧＰＸ３Ｘ４Ｘ５ＧＰＸ６ＧＸ７ＧＧＸ８ＧＰＧＧＰＧＸ９Ｘ１０
Ｘ１は、独立して、各場合においてＡ又はＧであり、（Ｘ１）ｚの少なくとも５０％はＡであり、Ｚは５〜３０の整数であり、Ｘ２はＳ又はＧであり、Ｘ３はＧ又はＥであり、Ｘ４はＧ、Ｓ又はＮであり、Ｘ５はＱ又はＹであり、Ｘ６はＧ又はＳであり、Ｘ７はＰ又はＲであり、Ｘ８はＹ又はＱであり、Ｘ９はＧ又はＳであり、Ｘ１０はＳ又はＧである。
いくつかの実施形態において、反復領域は配列番号３（ＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、該複合材料は、タンパク質の混合物を含まないポリマーの性質と比較して少なくとも１つの改良された機械的性質によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、性質は、ヤング率、引張強度、破断歪み、降伏点、靭性、破壊までの仕事量、衝撃、引裂強度、曲げ弾性率、曲げ歪み及び伸長時の応力からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ヤング率、引張強度、降伏点、及び伸長時の応力から選択される少なくとも１つの性質は、少なくとも５％増強される。いくつかの実施形態において、ヤング率は少なくとも２００％増強される。いくつかの実施形態において、引張強度は少なくとも４０％増強される。いくつかの実施形態において、降伏点は少なくとも４０％増強される。
いくつかの実施形態において、該複合材料は構造強度によって特徴付けられ、その構造的強度の１０％超がタンパク質の混合物から生じる。
いくつかの実施形態において、該複合材料は、引張強度によって特徴付けられ、引張強度の１０％超はタンパク質の混合物から生じる。
いくつかの実施形態において、ポリマーは合成ポリマーである。いくつかの実施形態において、該ポリマーは熱可塑性ポリマーである。いくつかの実施形態において、該ポリマーは熱硬化性である。いくつかの実施形態において、該ポリマーはエポキシである。いくつかの実施形態において、該ポリマーはポリエステルである。いくつかの実施形態において、該ポリマーは、ポリアミド、ポリウレタン、ナイロン、及びポリアクリレート、ポリカーボネート、及びケイ素からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該ポリマーは架橋ポリマーである。いくつかの実施形態において、該ポリマーはコポリマーである。いくつかの実施形態において、該ポリマーはヒドロゲルの形態である。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは液晶ポリマー、無水マレイン酸グラフト化ポリプロピレン、ポリアミド、ナイロン４,６、ナイロン６、ナイロン６,６、ナイロン１１、ナイロン１２、ポリ（アリールアミド）、ポリエチレン、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンサルファイド、ポリフタルアミド、ポリプロピレン、ポリ（フッ化ビニリデン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）、ポリウレタン、ポリビニルブチラール、エチレンビニルアルコールコポリマー、ポリラクチド酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、キサンタン、セルロース、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、綿、ゴム、セルロース、ウール及びそれらの任意の組み合わせ又は混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは、付着材料及び粘着材料からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該付着材料及び粘着材料は、エポキシ、シアノアクリレート、ポリエステル、ポリオール、ポリウレタン、及びポリイミドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、該タンパク質の全濃度は、複合材料の総重量の約０.１重量パーセント〜約１０重量％の範囲にある。いくつかの実施形態において、該濃度は約０.５重量％〜約３重量％の範囲にある。
いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物及び該ポリマーは、実質的に連続接触している。
いくつかの実施形態において、開示される複合材料は、少なくとも０.５ミクロンの厚さの層を有する。
いくつかの態様によれば、タンパク質の混合物を含む繊維が提供され、タンパク質の混合物は異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、混合物中の各タンパク質は、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含み、ｍ及びｎは、独立して、２〜７０の整数であり、該繊維は、少なくとも１つのリンカーに接着している。
一実施形態において、タンパク質の「ｍ」型又はタンパク質の混合物は、本明細書に記載の繊維の形態である。一実施形態において、タンパク質の「ｍ」型又はタンパク質の混合物は、分子間結合している。一実施形態において、タンパク質の「ｍ」型又はタンパク質の混合物は、本明細書に記載の繊維の形態で分子間結合している。一実施形態において、分子間結合は非共有結合である。一実施形態において、分子間結合は、ファンデルワールス結合、イオン結合、静電結合、水素結合、又はそれらの任意の組み合わせを介する。一実施形態において、「タンパク質の混合物」は、タンパク質の「ｍ」型及び／若しくは繊維を含むか、又はそれからなる。一実施形態において、タンパク質の「ｍ」型は、ペプチドの「ｍ」型又はポリペプチドの「ｍ」型又はポリペプチドとペプチドの混合物の「ｍ」型である。
いくつかの実施形態において、複数の繊維は、リンカーを介して互いに接着している。
いくつかの態様によれば、開示される複合材料を含む物品が提供される。いくつかの実施形態において、該物品は、生理的条件で安定である。いくつかの実施形態において、該物品は医療装置である。いくつかの実施形態において、該医療装置は、埋め込み型医療装置である。いくつかの実施形態において、該埋め込み型医療装置は、人工血管グラフト、人工心臓ポンプダイヤフラム、組織足場、整形外科用インプラント、カテーテル及びステントから選択される。
いくつかの実施形態において、該物品は、ピル、錠剤、カプセル、及びゲルキャップからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該物品は織物を含む。
いくつかの実施形態において、該物品は、熱絶縁性、熱伝導性、電気絶縁性、光導電率及び屈折から選択される１以上の性質によって特徴付けられる。
いくつかの態様によれば、タンパク質の混合物及び少なくとも１つのポリマーを含む複合材料の製造方法であって、タンパク質の混合物は、異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、混合物中の各タンパク質は、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含み、ｍ及びｎは、独立して２〜７０の整数であり、複合材料を形成するように、ポリマーへタンパク質の混合物を接着させる工程を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態において、該方法は、溶融ポリマーを得るためにポリマーを溶融し、タンパク質の混合物を溶融ポリマーへ変換する工程を含む。
いくつかの実施形態において、該方法は、溶解したポリマーを得るためにポリマーを溶解し、タンパク質の混合物を溶融ポリマーへ変換する工程を含む。
いくつかの実施形態において、該方法は、ポリマーを押出する工程を含む。
いくつかの実施形態において、該方法は、連続的な電界紡糸によりタンパク質の１以上の層を形成することを含む。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び／又は科学的用語は、一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験において使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料が下記に記載されている。矛盾する場合は、定義を含む本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、必ずしも限定することを意図するものではない。
本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照しながら、ほんの一例として本明細書に記載されている。詳細に図面を特に参照すると、示される詳細は、例であり、本発明の実施形態の例示的説明の目的のためのものであることが強調される。この点で、図面について行う説明は、本発明の実施形態を実施することができる方法を当業者に明らかにする。
開示されるタンパク質により異なる（０％、１％、２％）補強濃度（重量）を有するエポキシＥＰ−５２０の引張強度（左パネル）、ヤング率（中央パネル）、及び破断時の歪み（右パネル）を示す棒グラフである。 ＥＰ−５２０（２％補強）への開示されるタンパク質繊維の接着を示す走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。繊維の接着は、ポリマー（左パネル）上に空洞を作るように見えるが、場合によって、繊維の周囲に空洞のない良好な接着が観察された（右パネル、３.１６５μｍの長さ及び約２１５ｎｍの直径を有する接着繊維を示す）。 対照（未補強又はカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）補強）と比較した１％濃度（重量）のタンパク質補強度を有するエポキシＥＰ−５０２の引張強度（左パネル）、ヤング率（中央パネル）、及び破断時の歪み（右パネル）を示す棒グラフである。 熱硬化ＰＵについてのヤング率（図４Ａ）、３０％伸長時の応力（図４Ｂ）及び３０％伸長時の靭性（図４Ｃ）、１００％伸長時の応力（図４Ｄ）及び１００％伸長時の靭性（図４Ｅ）を含む引張試験結果である。各グラフの挿入図（左から右へ）に示されるように、全てを対照及びＳＳ補強膜上で実行した。結果は、平均±ＳＤ（ｎ＝各条件についての同じ膜からの５つの異なる薄片）として示される。 熱硬化ＰＵについてのヤング率（図４Ａ）、３０％伸長時の応力（図４Ｂ）及び３０％伸長時の靭性（図４Ｃ）、１００％伸長時の応力（図４Ｄ）及び１００％伸長時の靭性（図４Ｅ）を含む引張試験結果である。各グラフの挿入図（左から右へ）に示されるように、全てを対照及びＳＳ補強膜上で実行した。結果は、平均±ＳＤ（ｎ＝各条件についての同じ膜からの５つの異なる薄片）として示される。 熱硬化ＰＵについてのヤング率（図４Ａ）、３０％伸長時の応力（図４Ｂ）及び３０％伸長時の靭性（図４Ｃ）、１００％伸長時の応力（図４Ｄ）及び１００％伸長時の靭性（図４Ｅ）を含む引張試験結果である。各グラフの挿入図（左から右へ）に示されるように、全てを対照及びＳＳ補強膜上で実行した。結果は、平均±ＳＤ（ｎ＝各条件についての同じ膜からの５つの異なる薄片）として示される。 熱硬化ＰＵについてのヤング率（図４Ａ）、３０％伸長時の応力（図４Ｂ）及び３０％伸長時の靭性（図４Ｃ）、１００％伸長時の応力（図４Ｄ）及び１００％伸長時の靭性（図４Ｅ）を含む引張試験結果である。各グラフの挿入図（左から右へ）に示されるように、全てを対照及びＳＳ補強膜上で実行した。結果は、平均±ＳＤ（ｎ＝各条件についての同じ膜からの５つの異なる薄片）として示される。 熱硬化ＰＵについてのヤング率（図４Ａ）、３０％伸長時の応力（図４Ｂ）及び３０％伸長時の靭性（図４Ｃ）、１００％伸長時の応力（図４Ｄ）及び１００％伸長時の靭性（図４Ｅ）を含む引張試験結果である。各グラフの挿入図（左から右へ）に示されるように、全てを対照及びＳＳ補強膜上で実行した。結果は、平均±ＳＤ（ｎ＝各条件についての同じ膜からの５つの異なる薄片）として示される。 異なるローディング比率（それぞれ、曲線の下から上に向かって対照３％、及び５％）を有する熱硬化ＰＵの補強バッチの引裂強度（図５Ａ）及び曲線（図５Ｂ）を示すグラフである。 異なるローディング比率（それぞれ、曲線の下から上に向かって対照３％、及び５％）を有する熱硬化ＰＵの補強バッチの引裂強度（図５Ａ）及び曲線（図５Ｂ）を示すグラフである。 図６Ａ−図６Ｃ。開示されるタンパク質での異なる（０％、１％、３％）補強濃度（重量）を有するポリマーＴｅｃｏｆｌｅｘ（登録商標）ＳＧ−９３Ａのヤング率（図６Ａ）、引裂試験（図６Ｂ）及び引裂強度（図６Ｃ）を示す棒グラフである。 プレーンＵ−２０４７（タンパク質未補強）対照と比較した、開示されるタンパク質で１％〜３％補強されたＵ−２０４７のヤング率（左パネル）、及び引張強度（右パネル）を示す棒グラフである。 プレーンＵ−２０４７（タンパク質未補強）対照と比較した、開示されるタンパク質で１％〜３％補強されたＵ−２０４７の破断時の歪み（左パネル）及び破壊までの仕事量（右パネル）を示す棒グラフである。 １４０と２５０μｍの繊維を有するナイロン１２の応力−歪み測定を示すグラフ（それぞれ図９Ａ、右及び左パネル）である（２％補強；図９Ａ〜Ｂは押出し後のナイロン１２ワイヤを指す）。図９Ｂは、２％補強におけるナイロン１２中のタンパク質繊維の代表的なＳＥＭ画像を示す。図９Ｃ〜Ｅは、射出成形ナイロン１２のドッグボーンのヤング率（図９Ｃ）、降伏点（図９Ｄ）、及び２％補強（上のグラフ）（図９Ｅ）の応力−歪み曲線である。図９Ｆは、２％ＳＳ補強ポリ乳酸（ＰＬＡ）試料の応力−歪みグラフの改善を示す（歪み＝１の時の上の曲線）。 １４０と２５０μｍの繊維を有するナイロン１２の応力−歪み測定を示すグラフ（それぞれ図９Ａ、右及び左パネル）である（２％補強；図９Ａ〜Ｂは押出し後のナイロン１２ワイヤを指す）。図９Ｂは、２％補強におけるナイロン１２中のタンパク質繊維の代表的なＳＥＭ画像を示す。図９Ｃ〜Ｅは、射出成形ナイロン１２のドッグボーンのヤング率（図９Ｃ）、降伏点（図９Ｄ）、及び２％補強（上のグラフ）（図９Ｅ）の応力−歪み曲線である。図９Ｆは、２％ＳＳ補強ポリ乳酸（ＰＬＡ）試料の応力−歪みグラフの改善を示す（歪み＝１の時の上の曲線）。 １４０と２５０μｍの繊維を有するナイロン１２の応力−歪み測定を示すグラフ（それぞれ図９Ａ、右及び左パネル）である（２％補強；図９Ａ〜Ｂは押出し後のナイロン１２ワイヤを指す）。図９Ｂは、２％補強におけるナイロン１２中のタンパク質繊維の代表的なＳＥＭ画像を示す。図９Ｃ〜Ｅは、射出成形ナイロン１２のドッグボーンのヤング率（図９Ｃ）、降伏点（図９Ｄ）、及び２％補強（上のグラフ）（図９Ｅ）の応力−歪み曲線である。図９Ｆは、２％ＳＳ補強ポリ乳酸（ＰＬＡ）試料の応力−歪みグラフの改善を示す（歪み＝１の時の上の曲線）。 １４０と２５０μｍの繊維を有するナイロン１２の応力−歪み測定を示すグラフ（それぞれ図９Ａ、右及び左パネル）である（２％補強；図９Ａ〜Ｂは押出し後のナイロン１２ワイヤを指す）。図９Ｂは、２％補強におけるナイロン１２中のタンパク質繊維の代表的なＳＥＭ画像を示す。図９Ｃ〜Ｅは、射出成形ナイロン１２のドッグボーンのヤング率（図９Ｃ）、降伏点（図９Ｄ）、及び２％補強（上のグラフ）（図９Ｅ）の応力−歪み曲線である。図９Ｆは、２％ＳＳ補強ポリ乳酸（ＰＬＡ）試料の応力−歪みグラフの改善を示す（歪み＝１の時の上の曲線）。 １４０と２５０μｍの繊維を有するナイロン１２の応力−歪み測定を示すグラフ（それぞれ図９Ａ、右及び左パネル）である（２％補強；図９Ａ〜Ｂは押出し後のナイロン１２ワイヤを指す）。図９Ｂは、２％補強におけるナイロン１２中のタンパク質繊維の代表的なＳＥＭ画像を示す。図９Ｃ〜Ｅは、射出成形ナイロン１２のドッグボーンのヤング率（図９Ｃ）、降伏点（図９Ｄ）、及び２％補強（上のグラフ）（図９Ｅ）の応力−歪み曲線である。図９Ｆは、２％ＳＳ補強ポリ乳酸（ＰＬＡ）試料の応力−歪みグラフの改善を示す（歪み＝１の時の上の曲線）。 １４０と２５０μｍの繊維を有するナイロン１２の応力−歪み測定を示すグラフ（それぞれ図９Ａ、右及び左パネル）である（２％補強；図９Ａ〜Ｂは押出し後のナイロン１２ワイヤを指す）。図９Ｂは、２％補強におけるナイロン１２中のタンパク質繊維の代表的なＳＥＭ画像を示す。図９Ｃ〜Ｅは、射出成形ナイロン１２のドッグボーンのヤング率（図９Ｃ）、降伏点（図９Ｄ）、及び２％補強（上のグラフ）（図９Ｅ）の応力−歪み曲線である。図９Ｆは、２％ＳＳ補強ポリ乳酸（ＰＬＡ）試料の応力−歪みグラフの改善を示す（歪み＝１の時の上の曲線）。 対照バッチとしての電界紡糸した１１％（ｗ／ｗ）の熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）繊維の画像（バー：左パネル、２００μｍ；右パネル、１００μｍ）である。 電界紡糸した繊維の約１０.５％（ｗ／ｗ）のＴＰＵ＋約２％（ｗ／ｗ）の賦形剤（ＳＳ）の画像（バー：左パネル−２００μｍ;右パネル−１００μｍ）である。 ＴＰＵ（ＳＧ−６０）の固形分の９、１１、及び１３％ｗ／ｗでの対照バッチのレオロジー挙動を示すグラフである。 ＳＧ−６０に添加する賦形剤の量を増加させた時に、粘度が増加し、なおレオロジー挙動が影響を受けないままであることを示すレオロジー挙動のグラフである。 ＳＧ−６０に添加する賦形剤の量を増加させた時に、粘度が増加し、なおレオロジー挙動が影響を受けないままであることを示すレオロジー挙動のグラフである。 開示される繊維、及び賦形剤（０、１％、２％、又は３％）と共に９％ｗ／ｗのＳＧ６０（左）及び１１％ｗ／ｗのＳＧ６０（右）で作られた電界紡糸メッシュのヤング率の測定値を示す棒グラフである。 ９％ｗ／ｗの構成についての応力−歪み曲線である。 １１％ｗ／ｗの構成についての応力−歪み曲線である。 １１％ｗ／ｗの構成の弾性領域上の拡大グラフである。弾性領域で補強メッシュはより高い値を有し、その後、シフトがあり、対照メッシュはより高い値を有することが示されている。 １.３３％のクモシルク補強が最良の結果をもたらすことを実証している、異なるバッチからのＰＣＬ電界紡糸メッシュ材料の応力−歪み曲線を示す。 ＰＣＬ電界紡糸についての機械的性質：ヤング率（左パネル）、引張強度（中央パネル）、及び破断時の伸長（右パネル）の統計である。 ナノメッシュを形成する、ステントの金属棒の間のナノ繊維を示す、電界紡糸カイコ（ＢＭ）コーティングステントの写真である。 ナノメッシュを形成する、ステントの金属棒の間のナノ繊維を示す、電界紡糸カイコ（ＢＭ）コーティングステントの光学顕微鏡像である。 ステント金属棒上のナノ繊維形成を示し、コーティングを形成する電界紡糸したクモシルク（ＳＳ）コーティングステントの写真（左）及び光学顕微鏡像である。 ＢＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）溶液中のステントの浸漬コーティングを用いた膜コーティングステントを示す写真である。 様々なスケールでの、ＨＦＩＰに溶解したカイコ繊維の溶液でできたナノ繊維の電界紡糸メッシュ（約９０〜６３０ｎｍ）を示すＳＥＭ画像である。μｍ単位のスケールバー、左上から時計回り：１００、１０、２、及び５。 ＨＦＩＰ中に溶解させたクモシルク繊維の溶液でできたナノ繊維の電界紡糸メッシュを示すＳＥＭ画像を示す。μｍ単位のスケールバー、左上から時計回りに：１００、１０、１、５００、２及び５。 ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｐ−ＨＥＭＡ）中のタンパク質繊維の凝集体を示すＳＥＭ像である。スケールバーは１μｍである。 ２％補強を有するＶｅｒｏＣｌｅａｒにおけるタンパク質繊維を示すＳＥＭ画像である。スケールバーは２μｍである。 ＳＳ凍結乾燥繊維を示すＳＥＭ画像である。μｍ単位のスケールバー、左から右へ：２及び１０。左の図の数字は直径サイズ（１７９ｎｍ〜１.３４μｍ）を示す。 ＶｅｒｏＣｌｅａｒ補強の動的機械分析（ＤＭＡ）を示すグラフである。増強が、タンデルタピークの右シフトとして見られる。図２９Ａは貯蔵弾性率を示す。図２９Ｂは損失弾性率を示す。図２９Ｂはタンデルタ試験である。 ＶｅｒｏＣｌｅａｒ補強の動的機械分析（ＤＭＡ）を示すグラフである。増強が、タンデルタピークの右シフトとして見られる。図２９Ａは貯蔵弾性率を示す。図２９Ｂは損失弾性率を示す。図２９Ｂはタンデルタ試験である。 以下の実施例の節（例えば、実施例６）に記載されている反応前の活性化緩衝液中の繊維の顕微鏡検査である（バーは４００μｍである）。 以下の実施例の節（例えば、実施例６）に記載されている反応の１０分後の結合緩衝液中の繊維の顕微鏡検査である（バーは４００μｍである）。 以下の実施例の節（例えば、実施例６）に記載されている３０分後の結合緩衝液中の繊維の顕微鏡検査である（バーは４００μｍである）。 以下の実施例の節（例えば、実施例６）に記載されている活性化緩衝液でのボルテックス操作後の顕微鏡検査である。繊維の形状及び大きさの変化は観察されなかった（バーは４００μｍである）。 コーティングされたシリコンの顕微鏡画像である（左側有機相、右側水相）。 コーティングされたシリコンのより詳細な顕微鏡画像である（左側有機相、右側水相）。 繊維のコーティングされた表面に到達する前（左）及び到達時（右）の大滴を示す環境型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）画像である。矢印は、遷移中の１個の液滴を指す。白線／リボンは輪郭であり、繊維の大部分はより暗い。 繊維上ではなく、繊維の周りに形成された液滴を示すＥＳＥＭ画像である。左画像上の矢印は、繊維表面に見られない基板上の液滴を示す。右画像上の矢印は、表面上に液滴が形成されていない繊維表面の浸漬している水位の上昇を示す。 水位の上昇及び繊維の周りにより暗いハローを生じさせる繊維の湿潤を示すＥＳＥＭ画像である。水滴が明らかに右画像上の繊維の周りに見られ、表面上には液滴は形成されていない。バーは５０μｍである。 繊維表面上ではなく、繊維の周りの水の凝縮を示すセルロース繊維のＥＳＥＭ画像である。下部パネルは、セルロースで良好に浸潤した水及びセルロースによる吸収の少なさを実証している。バーは１００μｍである。 図４０Ａ−図４０Ｂ。繊維の厚さ及び細胞層の数の分析のための工程である：青チャンネル（ＤＡＰＩ）を使用して、定義されたクラスターの直交視野におけるＬ９２９層の数を計数した（図４０Ａ）。細胞のクラスターを含有する２３の領域を分析のために選択した。選択された領域のエッジが高まり、画像をバイナリモードに変換した。各座標の最大Ｚ点をグラフにセットし、その平均厚さを算出した。図４０Ｂの上部パネルは、選択された領域におけるＳＳコーティング（ＤＡＰＩ＋明視野）の直交図であり、中央パネルは、ＳＳの座標を示す、明視野信号のバイナリモードへの変換を示し、かつ下部パネルのグラフは、ＳＳコーティングの厚さを示す、二値化した明視野信号の定量化を示す。 図４１Ａ−図４１Ｂ。高密度でＳＳ上に播種した時の、コラーゲン対照（図４１Ｂ）と比較して、播種後５日目（図４１Ａ）に３Ｄ成長及び独特な移行パターンをとるＨＥＫ２９３細胞である（バーは４００μｍである）。 繊維の厚さの分析（図４０Ｂと同様）であり、ＳＳ上の細胞成長の層を調べるための定量化のために使用した代表的な領域を示す。 図４３Ａ−図４３Ｃ。異なる濃度のＳＳでコーティングされたＴＣプレートを示す顕微鏡検査である。左パネル：１層、約６×１０５繊維／ｃｍ２（図４３Ａ）；中央パネル：２層、約１２×１０５繊維／ｃｍ２（図４３Ｂ）；右パネル：約２４×１０５繊維／ｃｍ２（図４３Ｃ）。異なる濃度の繊維は、細胞の異なる表現型の成長を可能にする、異なる層の数を生成する。図４３Ａの矢印は、繊維数の限界により生じるコーティング欠陥を示す表面コーティング内の穴を指す。この繊維の量（６×１０５／ｃｍ２）でのコーティングは、コーティング中の繊維の１層の平均をもたらす。 一定面積当たりの繊維の量及び生じた層の数を示す顕微鏡検査である。３Ｄ構造が成長し、結合し始める：左パネル：播種後３日目、中央パネル：播種後５日目、右パネル：播種後７日目。バー：上部パネル：２００μｍ、下部パネル：１０００μｍ。 Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｓｐｈｅｒａ（商標）マイクロプレート（スフェロイド形成のために設計された）上に播種した細胞（Ｌ９２９）は、ＳＳの存在下で独特な異なる特徴を有するスフェロイドを生成することを実証する、カルセイン及びヨウ化プロピジウムで染色したスフェロイドの共焦点画像である。５０００個の細胞を各ウェルに播種した。左パネル：播種後５日目、右パネル：播種後７日目。各チャンネルの積層写真を分析し、スフェロイド（カルセイン染色）の最大面積及び壊死性コア（ＰＩ染色）の面積を決定した。 図４６Ａ−図４６Ｃ。Ｌ９２９細胞の大きさ及び生きているゾーン／壊死したゾーンの分析を示す棒グラフである。図４６Ａは、生細胞／死細胞の比がＳＳスフェロイド中で７５％より高いことを示す。図４６Ｂは、ＳＳ含有スフェロイドの体積が、対照スフェロイドの体積よりも３.５〜４.８倍大きいことを示す。図４６Ｃは、ＳＳ含有スフェロイド内の生きた領域の体積が、対照スフェロイドの体積よりも４.７倍大きいことを示す。バーの各３連において、左から右に、対照（未処理）、コラーゲン、及びＳＳ。 図４７Ａ−図４７Ｃ。ＳＳと混合したＨＥＫ２９３の低密度播種を（ＳＳを含めずに播種した細胞の対照と比較して）示す顕微鏡画像を示す（図４７Ａ）：下部焦点面（図４７Ｂ）上部焦点面（図４７Ｃ）。スケールバーは２００μｍである。 図４８Ａ−図４８Ｃ。５０００個の細胞／ウェルでＳＳコーティングされたプレート上に播種した時の、播種後４日目のＨＥＫ２９３細胞の３Ｄ成長パターンを示す画像を示す：非コーティング（図４８Ａ）。下面（図４８Ｂ）、及び上面（図４８Ｃ）。 図４９Ａ−図４９Ｂ。顕微鏡で可視化した時の、ポリスチレン上に播種したＬ９２９細胞とＳＳコーティングプレート上に播種した細胞の細胞運動性の定量比較（図４９Ａ）、及びポリスチレン対ＳＳ上での細胞の遊走を示す棒グラフである（図４９Ｂ）。
発明の詳細な説明
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ポリマー及びＭａＳｐ（大瓶状腺スピドロイン）タンパク質由来のタンパク質の混合物を含む複合材料、それらの改善された機械的性質、及びその調製を対象とする。
本発明は、いくつかの実施形態において、（ａ）合成のクモドラグラインシルクの調製に有用な、異なる分子量を有するタンパク質の混合物、及び（ｂ）ポリマーを含む複合材料を提供する。
いくつかの実施形態において、用語「複合材料」は、異なる特性を有する２以上の物質で構成され、所望の特性が全体に寄与しながら、各物質がそのアイデンティティを保持している材料を指す。
いくつかの実施形態において、用語「材料」は固体材料を指す。いくつかの実施形態において、用語「材料」は半固体材料（例えば、ゲル）を指す。
いくつかの実施形態において、開示される複合材料は、優れた機械的性質を示す。
いくつかの実施形態において、タンパク質の混合物を含む繊維が提供される。
いくつかの実施形態において、そのいくつかの実施形態において開示される複数の繊維は、リンカーを介して互いに接着している。リンカーの実施形態は、以下に記載されている。
タンパク質
本発明は、異なる分子量のタンパク質の混合物を使用して合成され、ＭａＳｐタンパク質に由来する人工のクモドラグラインシルクが、天然のクモドラグラインシルクと同様の例外的な機械的性質を有しているという予想外の発見に部分的に基づいている。
いくつかの実施形態において、混合物中の各タンパク質は、独立して、主要ＭａＳｐタンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含み、ｍ及びｎは、独立して２〜７０の整数である。
本明細書で使用する用語「タンパク質の混合物」又は「タンパク質混合物」は、タンパク質のそれぞれの種類が特有かつ均一な分子量を有する、限定されないが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０種類のタンパク質などの複数のタンパク質を指す。
いくつかの実施形態において、用語「タンパク質の混合物」又は「タンパク質混合物」は、２０〜４０種のタンパク質又は２０〜３５種のタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、該タンパク質は、折り畳まれた単一タンパク質を指す。
用語「大瓶状腺スピドロインタンパク質」と「スピドロインタンパク質」は、本明細書全体を通して互換的に使用され、全ての公知の大瓶状腺スピドロインタンパク質を包含し、典型的には、ニワオニグモの場合には「ＭａＳｐ」、又は「ＡＤＦ」と略記される。これらの大瓶状腺スピドロインタンパク質は、一般的に２つのタイプ１及びタイプ２のタンパク質である。これらの用語は、さらに、本明細書に開示されるような、公知の大瓶状腺スピドロインタンパク質の少なくとも反復領域と同一度及び／又は類似度が高い非天然タンパク質を含む。さらなる適切なクモシルクタンパク質には、ＭａＳｐ２、ＭｉＳｐ、ＭｉＳｐ２、ＡｃＳｐ、ＦＬＹＳ、ＦＬＡＳ、及びフラベリフォーム（ｆｌａｂｅｌｌｉｆｏｒｍ）が含まれる。
本明細書で使用する用語「反復領域」、「反復配列」又は「リピート」は、クモシルクのアミノ酸配列（例えば、ＭａＳｐ−１タンパク質）中に複数回天然に存在するリピート単位から誘導される組換えタンパク質配列を指す。当業者なら、クモシルクタンパク質の一次構造が、ほとんど、一連のリピート単位の小さな変化からなると考えられると理解する。天然に存在するタンパク質中のリピート単位は、互いに区別される場合が多い。すなわち、タンパク質の長さに沿ってリピート単位の正確な重複がほとんど又は全く存在しない。いくつかの実施形態において、タンパク質の一次構造が単一のリピート単位のいくつかの正確な反復を含む本発明の合成のクモシルクが作製される。さらなる実施形態において、本発明の合成のクモシルクは、第２のリピート単位のいくつかの反復と共に、１つのリピート単位のいくつかの反復を含む。このような構造は、典型的なブロックコポリマーと同様である。いくつかの異なる配列のリピート単位はまた、特定の用途に適した性質を有する合成のクモシルクタンパク質を提供するために組み合わせることができる。本明細書で使用される用語「ダイレクトリピート」は、同様のリピートとタンデム（頭から尾の配置）のリピートである。別の実施形態において、本発明の合成のクモシルクを形成するために使用されるリピートは、ダイレクトリピートである。いくつかの実施形態において、リピートは天然に見出されない（すなわち、天然に存在するアミノ酸配列ではない）。
反復配列を含む例示的配列は、ＡＤＦ−４：ＡＡＡＡＡＡＡＳＧＳＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＶＡＹＧＰＧＧＰＶＳＳＡＡＡＡＡＡＡＧＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＳＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＳＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＳＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＶＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＧＳＧＰＧＧＹＧＰＧＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＳＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＳＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＳＲＧＹＧＰＧＳＱＧＰＧＧＰＧＡＳＡＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＹＱＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＳＰＳＡＳＡＳ（配列番号１０）である。いくつかの実施形態において、本発明の合成反復配列は、ＡＤＦ−４（配列番号１０）に由来する１以上の反復配列に基づいている（例えば、以下に定義されるように、高い割合の同一性を有する）。本明細書で使用する場合、用語「に基づく」は、反復配列と相同性の高い割合を有する配列を指す。
いくつかの実施形態において、各反復配列は、最大６０個のアミノ酸、最大５５個のアミノ酸、最大５０個のアミノ酸、最大４９個のアミノ酸、最大４８個のアミノ酸、最大４７個のアミノ酸、最大４６個のアミノ酸、最大４５個のアミノ酸、最大４４個のアミノ酸、最大４３個のアミノ酸、最大４２個のアミノ酸、最大４１個のアミノ酸、最大４０個のアミノ酸、最大３９個のアミノ酸、最大３８個のアミノ酸、最大３７個のアミノ酸、最大３６個のアミノ酸又は最大３５個のアミノ酸を含み、可能性は本発明の別々の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、各反復配列は、５〜６０個のアミノ酸、１０〜５５個のアミノ酸、１５〜５０個のアミノ酸、２０〜４５個のアミノ酸、２５〜４０個のアミノ酸、２５〜３９個のアミノ酸又は２８〜３６個のアミノを含み、可能性は本発明の別々の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、各反復配列は、３０〜４０個のアミノ酸、３１〜３９個のアミノ酸、３２〜３８個のアミノ酸、３３〜３７個のアミノ酸、３４〜３６個のアミノ酸を含み、各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。さらなる実施形態において、各反復配列は３５個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、ｎは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９及び７０のいずれか１つに等しい整数である。
いくつかの実施形態において、ｍは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９及び７０のいずれか１つに等しい整数である。
別の実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は、２：１〜１：２の範囲にある。別の実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は、１.８：１〜１：１.８の範囲にある。別の実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は、１.５：１〜１：１.５の範囲にある。別の実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は、１.２５：１〜１：１.２５の範囲内にある。別の実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は、１.２：１〜１：１.２範囲にある。いくつかの実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は、１．１：１〜１：１．１の範囲にある。別の実施形態において、「ｎ」と「ｍ」は等しい。
いくつかの実施形態において、ｎは混合物中のそれぞれの種類のタンパク質について同一である。本明細書で使用する用語「ｎは混合物中のそれぞれの種類のタンパク質について同一である」は、それぞれの種類のタンパク質について、すなわち、同一の分子量を有する１以上のタンパク質についての反復配列の数に関連する。非限定的な例として、分子量の異なる１６種のタンパク質を有するタンパク質の混合物について、タンパク質の各グループは、異なる数の反復配列を有する。
いくつかの実施形態において、混合物のタンパク質の様々なグループは、各種類のタンパク質の反復配列の数とグループのモル比の間に反比例の関係を有している。いくつかの実施形態において、タンパク質（例えば、同じ数のリピートを有する）の各グループについて、タンパク質の分子量が低いほど、グループのモル比は高い。
いくつかの実施形態において、「異なる分子量」とは、少なくとも、例えば、０.０１％、０.１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、又は少なくとも３０％異なる値を有する分子量を指すことを意味する。
別の実施形態において、各リピートは、１.５ｋＤａ〜４.５ｋＤａの範囲、２ｋＤａ〜３.５ｋＤａの範囲、２.１ｋＤａ〜３.４ｋＤａの範囲、２.２ｋＤａ〜３.３ｋＤａの範囲、２.４ｋＤａ〜３.２ｋＤａの範囲、２.５ｋＤａ〜３.１ｋＤａの範囲、２.６ｋＤａ〜３ｋＤａの範囲、又は２.７ｋＤａ〜２．９ｋＤａの範囲の分子量を有し、各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。別の実施形態において、各リピートは約２.８ｋＤＡの範囲の分子量を有する。
別の実施形態において、該組成物は、２ｋＤａ〜３．５ｋＤａ、２．１ｋＤａ〜３．４ｋＤａ、２．２ｋＤａ〜３．３ｋＤａ、２．４ｋＤａ〜３．２ｋＤａ、２．５ｋＤａ〜３．１ｋＤａ、２．６ｋＤａ〜３ｋＤａ、又は２．７ｋＤａ〜２．９ｋＤａの分子量増分を有する混合物の２以上のタンパク質を含み、各可能性は本発明の別々の実施形態を表す。別の実施形態において、該組成物は、約２.８ｋＤａの分子量増分を有する混合物の２以上のタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、反復領域は、第１の部分及び第２の部分を有し、第１の部分及び第２の部分は近接している（すなわち、互いに直接隣接している）。典型的には、第１の部分及び第２の部分は、ペプチド結合によって連結されている。
いくつかの実施形態において、反復領域の第１の部分は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、又は少なくとも５０％のアラニン残基を含む５〜３０個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、第１の部分は１以上のグリシン残基を含んでよい。いくつかの実施形態において、第１の部分は、最大５％、最大１０％、最大１５％、最大２０％、最大２５％、最大３０％、最大４５％、又は最大５０％のグリシン残基を含む。
いくつかの実施形態において、第１の部分は、（ＡＧ）１〜１５の式などにアラニン−グリシンジペプチドの１〜５０個の「ｎ」リピートを含む。いくつかの実施形態において、第１の部分は、（ＧＡ）１〜１５の式などにグリシン−アラニンジペプチドの１〜５０個の「ｎ」リピートを含む。
いくつかの実施形態において、反復領域の第２の部分は、グリシン、セリン、プロリン及びチロシンからなる群から選択される少なくとも８０％の残基を含む２０〜６０個のアミノ酸のアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態において、反復領域の第２の部分は、グリシン、セリン、プロリン及びチロシンからなる群から選択される少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の残基を含む２０〜６０個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、反復領域の第２の部分は、１又は２個以下のグルタミン残基を含む。当業者なら、反復領域内のグリシン、セリン、プロリン及びチロシン残基の正確な量及び順序は、配列が自己集合繊維を形成する限り異なっていてもよいことを理解する。
いくつかの実施形態において、反復領域は、
（ｉ）１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％ 、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％又は５０％のアラニン残基；
（ｉｉ）２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％ 、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％又は５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％又は６０％のグリシン残基；
（ｉｉｉ）１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％又は３０％のセリン残基；
（ｉｖ）１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％又は３０％のプロリン残基；
（ｖ）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％のチロシン残基；
（ｖｉ）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％のグルタミン残基；及び
（ｖｉｉ）０％、１％、２％、３％、４％、５％のアルギニン残基、
を含む。
いくつかの実施形態において、反復領域は、１３〜４２％のアラニン残基、２５〜５５％のグリシン残基、１０〜１８％のセリン残基、１２〜２１％のプロリン残基、４〜７％のチロシン残基、４〜７％のグルタミン残基、及び０〜３％アルギニン残基を含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質のそれぞれは、独立して、配列番号１：
（Ｘ１）ｚＸ２ＧＰＧＧＹＧＰＸ３Ｘ４Ｘ５ＧＰＸ６ＧＸ７ＧＧＸ８ＧＰＧＧＰＧＸ９Ｘ１０
（式中、Ｘ１は、独立して、各場合においてＡ又はＧである）
に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、（Ｘ１）ｚの少なくとも５０％はＡであり、Ｚは５〜３０の整数であり、Ｘ２はＳ又はＧであり、Ｘ３はＧ又はＥであり、Ｘ４はＧ、Ｓ又はＮであり、Ｘ５はＱ又はＹであり、Ｘ６はＧ又はＳであり、Ｘ７はＰ又はＲであり、Ｘ８はＹ又はＱであり、Ｘ９はＧ又はＳであり、Ｘ１０はＳ又はＧである。
いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、
（ａ）各リピートは２ｋＤａ〜３.５ｋＤａの範囲の分子量を有し；かつ
（ｂ）「ｍ」に対する「ｎ」の比は２：１〜１：２の範囲にある；
からなる群から選択される１以上の性質によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態において、ｎは、混合物中のタンパク質の各種類について同一である。
別の実施形態において、ｎは、４及び３２と等しいか、又は４〜３２の整数である。別の実施形態において、ｍは、４及び３２と等しいか、又は４〜３２の整数である。別の実施形態において、「ｍ」に対する「ｎ」の比は１.８：１〜１：１.８の範囲にある。別の実施形態において、「ｎ」及び「ｍ」は等しい。
いくつかの実施形態において、Ｚは６〜１１の整数、６〜１０の整数又は７〜９の整数である。一実施形態において、Ｚは、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２から選択される整数である。別の実施形態において、Ｚは８である。
別の実施形態において、ＭａＳＰ１タンパク質の反復領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列（ＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）を含む。別の実施形態において、ＭａＳＰ１タンパク質の反復領域は、配列番号３に記載のアミノ酸配列（ＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）を含む。
別の実施形態において、相同体は、配列番号１と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性を共有する。
別の実施形態において、相同体は、配列番号２と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性を共有する。
別の実施形態において、相同体は、配列番号３と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性を共有する。
別の実施形態において、ＭａＳＰ１タンパク質の反復領域は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＭａＳＰ１タンパク質の反復領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する。
別の実施形態において、混合物の各タンパク質は、さらに、配列番号５（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶ）；配列番号６（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶＲＰＬＳＮＬＤＮＡＰ）；配列番号７（ＭＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＤＰＥＦＫＧＬＲＲＲＡＱＬＶＤＰＰＧＣＲＮＳＡＲＡＧＳＳ）、又はその任意の機能的相同体、バリアント、誘導体、又は断片からなる群から選択される単一Ｎ末端領域を含む。別の実施形態において、Ｃ末端領域の相同体は、配列番号５〜７のいずれか１つと少なくとも７０％の相同性を共有する。
別の実施形態において、混合物の各タンパク質は、さらに、配列番号８（ＶＡＡＳＲＬＳＳＰＡＡＳＳＲＶＳＳＡＶＳＳＬＶＳＳＧＰＴＮＧＡＡＶＳＧＡＬＮＳＬＶＳＱＩＳＡＳＮＰＧＬＳＧＣＤＡＬＶＱＡＬＬＥＬＶＳＡＬＶＡＩＬＳＳＡＳＩＧＱＶＮＶＳＳＶＳＱＳＴＱＭＩＳＱＡＬＳ）、及び配列番号９（ＧＰＳＧＰＧＡＹＧＰＳＰＳＡＳＡＳＶＡＡＳＲＬＳＳＰＡＡＳＳＲＶＳＳＡＶＳＳＬＶＳＳＧＰＴＮＧＡＡＶＳＧＡＬＮＳＬＶＳＱＩＳＡＳＮＰＧＬＳＧＣＤＡＬＶＱＡＬＬＥＬＶＳＡＬＶＡＩＬＳＳＡＳＩＧＱＶＮＶＳＳＶＳＱＳＴＱＭＩＳＱＡＬＳ）、又はその任意の機能的相同体、バリアント、誘導体、断片若しくは変異体からなる群から選択される単一Ｃ末端領域を含む。別の実施形態において、Ｎ末端領域の相同体は、配列番号８〜９と少なくとも７０％の相同性を共有する。
いくつかの実施形態において、混合物の１以上のタンパク質は、さらに少なくとも１つのタグ配列を含む。本発明において使用することができるタグの非限定的な例としては、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、及びＴ７タグなどが挙げられる。例示的なＨｉｓタグは、６個のＨｉｓ残基を含むか、又は配列番号１１に記載の６個のＨｉｓ残基（ＨＨＨＨＨＨ）からなる。別の実施形態において、該タグは、配列番号１２（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＡタグである。別の実施形態において、該タグは、アミノ酸配列１３（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＴ７タグである。当業者は、適切なタグ又は他の融合パートナーの代替をよく知っている。
本明細書中で使用する「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、並びに後に修飾されるそれらのアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基又は修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。アミノ酸は、その一般に公知の３つの文字記号によって、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号のいずれかによって本明細書で言及され得る。
「アミノ酸配列」又は「ペプチド配列」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基がペプチド及びタンパク質中の鎖に存在する順序である。配列は一般に、遊離アミノ基を含有するＮ末端から遊離カルボキシル基を含有するＣ末端に報告される。アミノ酸配列は、多くの場合、タンパク質の１次構造を表す場合に、ペプチド配列、タンパク質配列と呼ばれるが、タンパク質が特定の三次元構造に折り畳まれるアミノ酸配列として定義され、典型的には、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、スルフヒドリル結合形成、及び切断などの翻訳後修飾を受けているので、用語「アミノ酸配列」又は「ペプチド配列」及び「タンパク質」は区別されなければならない。
本発明によって例示される合成のクモシルクのアミノ酸配列又はそれをコードする核酸分子の文脈において、本明細書で使用する「単離された」又は「実質的に精製された」は、その天然の環境から取り出されるか、若しくはその自然の状態から変更されているアミノ酸配列又はポリヌクレオチドを意味する。そのような「単離された」は、必ずしもアミノ酸配列又は核酸分子が精製された程度を反映するものではない。しかしながら、ある程度まで精製されたそのような分子は「単離」されていると理解される。分子が自然環境に存在しない場合、すなわち、天然に存在しない場合、分子はそれが存在する場所に関係なく「単離される」。一例として、ヒトに存在する場合でも、ヒトには天然に存在しないアミノ酸配列又はポリヌクレオチドは「単離される」。
アミノ酸配列又は核酸に適用される場合、用語「単離された」又は「実質的に精製された」は、アミノ酸配列又は核酸が天然状態に関連付けられている他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。これは均一な状態で、或いは乾式又は水溶液のいずれかの状態であり得る。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する優勢な種であるアミノ酸配列又は核酸は、実質的に精製される。
いくつかの実施形態において、リピートは、ＭａＳｐ１タンパク質又はその断片の反復領域の相同体、バリアント、誘導体のものである。いくつかの実施形態において、リピートは、ＡＤＦ−４タンパク質又はその断片の反復領域の相同体、バリアント、誘導体のものである。
本明細書で使用する「機能的相同体、バリアント、誘導体又は断片」における用語「機能的」は、定義された機能アッセイにより特定される生物学的機能又は活性を有するアミノ酸配列を指す。より具体的には、定義された機能アッセイは、機能的相同体、バリアント、誘導体又は断片を発現する細胞における自己集合繊維の形成である。
アミノ酸配列又は核酸配列は、相同性が少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であると決定された場合に、対応するアミノ酸配列又は核酸の相同体である配列である。
本明細書で使用する相同性は、２個のアミノ酸（ペプチド）又はＤＮＡ配列間の％同一性に基づいて決定され得る。一般に、比較される２つの配列は、配列間の最大相関を与えるように整列される。２つの配列のアラインメントを調べ、決定した２つの配列間の正確なアミノ酸（又はヌクレオチド）対応関係を与える位置の数をアラインメントの全長で割り、１００を乗じることで、％同一性の数字が得られる。この％同一性の数字は、同じ又は非常に類似した長さの配列に特に適しており、高度に相同性がある比較される配列の全長にわたって決定されるか、又は等しくない長さの配列により適しているか、若しくはより低いレベルの相同性を有するより短い定義された長さにわたって決定され得る。２以上の配列の同一性を比較するための方法は当技術分野でよく知られている。したがって、例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージバージョン９.１で利用可能なプログラム、例えば、プログラムＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴは、２つのアミノ酸配列間の％同一性及び２つのポリヌクレオチド配列間の％同一性を決定するために使用することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの「局所相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最良の単一領域を見つける。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが異なる２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列の比較により適しており、そのプログラムは、より短い配列がより長い部分を表すと仮定する。比較では、ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムに従って「最大類似性」を見つける２つの配列を整列させる。ＧＡＰは、ほぼ同じ長さの配列の比較により適しており、アラインメントが全長にわたって予想される。好ましくは、各プログラムで使用されるパラメータの「ギャップの重み付け」及び「長さの重み付け」は、それぞれ、ポリヌクレオチド配列について５０及び３並びにポリペプチド配列について１２及び４である。好ましくは、％同一性及び％類似性は、比較される２つの配列が最適に整列された場合に決定される。
２以上のアミノ酸又は核酸配列の文脈において、用語「同一」、「実質的な同一性」、「実質的な相同性」又は％「同一性」は、以下に記載のデフォルトパラメータでＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ ２.０配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動アラインメント及び目視検査によって測定した場合、同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの特定の割合（すなわち、比較ウィンドウ又は指定領域にわたる最大一致のために比較及び整列させた時に、特定領域（例えば、アミノ酸配列の配列番号２又は３）にわたって約６０％の同一性、又は少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は９９％の同一性）を有する２以上の配列又はサブ配列を指す。次いで、かかる配列は、「実質的に同一」である。この定義はまた、試験配列のコンプリメントを指すか、又はそれに適用することができる。定義はまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有するものを含む。好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮することができる。
配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であればサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用することができるか、又は別のパラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の％配列同一性を計算する。
本発明は、さらに、配列番号の１、２、又は３のいずれか１つの変異体の「ｎ」リピートを含むアミノ酸配列を包含することを理解されたい。本明細書で使用する用語「変異体」又は「実質的に類似の」は、１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０又は２５）のアミノ酸残基又はヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されている点で、特異的に同定された配列とは異なるアミノ酸又はヌクレオチドの配列を含む。該変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体又は非天然由来の変異体であり得る。変異体又は実質的に類似の配列は、最先端技術で使用される一般的なアルゴリズムによって決定した場合に、本明細書に記載のアミノ酸配列若しくはヌクレオチド配列と、それらのアミノ酸配列若しくはヌクレオチド配列の同一性の割合によって特徴付けられ得るアミノ酸配列又は核酸の断片を指す。アミノ酸又は核酸の好ましい断片は、参照配列と比較した場合に、少なくとも約４０又は４５％の配列同一性、好ましくは約５０％又は５５％の配列同一性、より好ましくは約６０％又は６５％の配列同一性、より好ましくは約７０％又は７５％の配列同一性、より好ましくは約８０％又は８５％の配列同一性、さらにより好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸又はヌクレオチドの配列を有するものである。
一実施形態において、タンパク質の混合物は繊維である。一実施形態において、繊維は、タンパク質の混合物を含む。一実施形態において、繊維は、タンパク質の「ｍ」型を含む。一実施形態において、タンパク質の「ｍ」型は繊維である。一実施形態において、タンパク質の「ｍ」型は、タンパク質の混合物である。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、タンパク質の「ｍ」型中の各タンパク質は、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含む。一実施形態において、タンパク質の混合物は、異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、タンパク質の混合物中の各タンパク質は、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体又は断片の反復領域の「ｎ」リピートを含む。
一実施形態において、タンパク質の混合物又は繊維は、モノマーで構成されている。一実施形態において、複数のモノマーは、ナノ原繊維に配置されている。一実施形態において、複数のナノ原繊維は繊維に配置されるか、又は繊維を作る。一実施形態において、タンパク質の混合物若しくは繊維内のモノマー又はナノ原繊維は４〜１６ｎｍの直径を有する。一実施形態において、タンパク質の混合物若しくは繊維内のモノマー又はナノ原繊維は、６〜１４ｎｍの直径を有する。一実施形態において、タンパク質の混合物若しくは繊維内のモノマー又はナノ原繊維は、８〜１２ｎｍの直径を有する。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、７０〜４５０ｎｍの直径を有する。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、８０〜３５０ｎｍの直径を有する。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、８０〜３００ｎｍの直径を有する。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、１５０〜２５０ｎｍの直径を有する。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、コイルとして配置されている。一実施形態において、単繊維又はタンパク質の１つの混合物は、コイルとして配置されている。一実施形態において、コイルは、５〜８００マイクロメートルの直径を有する。一実施形態において、コイルは、５〜５００マイクロメートルの直径を有する。一実施形態において、コイルは、５〜３０マイクロメートルの直径を有する。一実施形態において、コイルは、５〜２０マイクロメートルの直径を有する。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、５〜８００マイクロメートルの長さを有する。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、３０〜３００マイクロメートルの長さを有する。
一実施形態において、本明細書に記載の複合材料及び／又は組成物は、複合材料及び／若しくは組成物内の繊維の総数に等しいか、又はそれより５マイクロメートル（長さ）より短い繊維を５％若しくは３％未満の量で含む。一実施形態において、本明細書に記載の複合材料及び／又は組成物は、複合材料及び／若しくは組成物内の繊維の総含量の総数に等しいか、又はそれより８マイクロメートル（長さ）より短い繊維を５％又は３％未満の量で含む。
一実施形態において、本明細書に記載の複合材料及び／又は組成物は、複合材料及び／若しくは組成物内の繊維の総重量に等しいか、又はそれより５マイクロメートル（長さ）より短い繊維を５％又は３％ｗ／ｗ未満含む。一実施形態において、本明細書に記載の複合材料及び／又は組成物は、複合材料及び／若しくは組成物内の繊維の総含量の総重量に等しいか、又はそれより８マイクロメートル（長さ）より短い繊維を５％又は３％ｗ／ｗ未満の量で含む。
一実施形態において、５又は８マイクロメートルに等しいか又はそれより短い繊維は、不安定性を引き起こす。一実施形態において、５又は８マイクロメートルに等しいか又はそれより短い繊維は、本明細書に記載の組成物又は複合材料の完全性を低下させる。一実施形態において、５又は８マイクロメートルに等しいか又はそれより短い繊維は、本明細書に記載の組成物又は複合材料の物理的強度を低下させる。
一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は分枝状である。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、１〜１０個の分岐を含む。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、炭水化物を含まない。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、非グリコシル化である。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、脂肪又は脂肪酸を含まない。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、リンを含まない。一実施形態において、「含まない」は、「欠いている」又は本質的に「欠いている」である。
一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の少なくとも５０％は、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の重量中央値よりもより大きい／より大型である／より重い（ｋＤａ単位で）。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の少なくとも５５％は、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の重量中央値よりもより大きい／より大型である／より重い（ｋＤａ単位で）。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の少なくとも６０％は、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の重量中央値よりもより大きい／より大型である／より重い（ｋＤａ単位で）。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の少なくとも６５％は、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の重量中央値よりもより大きい／より大型である／より重い（ｋＤａ単位で）。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の少なくとも７０％は、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の重量中央値よりもより大きい／より大型である／より重い（ｋＤａ単位で）。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の少なくとも７５％は、繊維又はタンパク質の混合物内のタンパク質の重量中央値よりもより大きい／より大型である／より重い（ｋＤａ単位で）。
一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物の直径に対する長さのアスペクト比は、少なくとも１：１０である。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物の直径に対する長さのアスペクト比は、少なくとも１：１０〜１：１５００である。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物の直径に対する長さのアスペクト比は、少なくとも１：５０〜１：１０００である。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物の直径に対する長さのアスペクト比は、少なくとも１：１００〜１：１２００である。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物の直径に対する長さのアスペクト比は、少なくとも１：１００〜１：１０００である。一実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物の直径に対する長さのアスペクト比は、少なくとも１：５００〜１：１０００である。
本明細書で使用する用語の誘導体及び機能的誘導体は、任意の挿入、欠失、置換及び修飾を有する本発明のアミノ酸配列を意味する。
本明細書で使用する用語「挿入」とは、本発明の配列に１〜５０個のアミノ酸残基、特に、１〜２０個のアミノ酸残基、より特に、１〜１０個のアミノ酸残基を付加することを意味することを理解されたい。最も具体的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０個のアミノ酸残基。さらに、本発明のアミノ酸配列は、そのＮ末端及び／又はＣ末端の位置において、様々な同一又は異なるアミノ酸残基で伸ばすことができる。
アミノ酸「置換」は、類似の構造及び／又は化学的性質、すなわち、保存的アミノ酸置換を有する別のアミノ酸と１個のアミノ酸を置換した結果である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。
別の実施形態において、本発明のリピート配列は、配列番号２又は３のいずれか１つの配列に対して１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下８以下、又は７以下のアミノ酸置換を有する。一実施形態において、本発明のリピート配列は、配列番号２又は３のいずれか１つの配列に対して少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、又は少なくとも１３個のアミノ酸置換を有する。
アミノ酸配列に関して、当業者なら、コード配列中の単一アミノ酸又は少ない割合のアミノ酸を変更、追加又は欠失する、アミノ酸、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失又は付加が、「保存的修飾変異体」であり、その変更が化学的に類似したアミノ酸とのアミノ酸置換をもたらすことを認識する。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。このような保存的修飾変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に追加されるものであり、それらを排除するものではない。
例えば、脂肪族アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、若しくはＶ）が別のグループのメンバーと置換される置換が行われるか、又はアルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、又はグルタミンとアスパラギンなどの、１つの極性残基の別の残基への置換などの置換が行われ得る。以下の８つのグループのそれぞれは、互いに保存的置換である他の例示的なアミノ酸を含有している：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）;３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）;４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）;５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）;６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）;及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
保存的核酸置換は、上記で定義した保存的アミノ酸置換をもたらす核酸置換である。
本発明のアミノ酸配列の変異体は、配列番号２又は３のいずれか１つによって示されるリピート単位と、アミノ酸レベルで少なくとも８０％の配列類似性、少なくとも８５％の配列類似性、９０％の配列類似性、又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列類似性を有してよい。
本発明のアミノ酸配列は、配列番号１若しくは配列番号３又はそれらの任意の断片の「ｎ」リピートを含んでよい。「断片」は、特定の領域のアミノ酸又はＤＮＡの配列の一部を構成している。ペプチド配列の断片は、特定の領域よりも短い少なくとも１つのアミノ酸であり、ＤＮＡ配列の断片は、特定の領域よりも少なくとも１つの塩基対分短い。断片は、Ｃ末端若しくはＮ末端側、又はその両方で切断され得る。アミノ酸断片は、配列番号１若しくは３の少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２４、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、又は少なくとも３４個のアミノ酸を含んでよい。
本発明のアミノ酸配列の変異体は、別のアミノ酸の１以上に対するそのアミノ酸の１個（点変異）又はそれ以上、最大約１０個の交換を特徴とする。それらは、異なるコドンをもたらすＤＮＡレベルでの対応する変異の結果である。
さらに、本発明は、本発明のアミノ酸配列の誘導体に関する。本発明のアミノ酸配列の誘導体は、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基又はカルボキシル基などの官能基が、誘導体化、例えば、それぞれ、グリコシル化、アシル化、アミド化又はエステル化されている。グリコシル化誘導体において、オリゴ糖は、通常、アスパラギン、セリン、スレオニン及び／又はリジンに連結されている。アシル化誘導体は、天然に存在する有機酸又は無機酸、例えば、酢酸、リン酸又は硫酸によって特にアシル化され、これは、通常、特に、それぞれチロシン又はセリンのＮ末端アミノ基、又はヒドロキシ基で生じる。エステルは、天然に存在するアルコール、例えば、メタノール又はエタノールのものである。さらなる誘導体は、塩、特に、薬学的に許容される塩、例えば、アルカリ金属及びアルカリ土類金属塩などの金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム又は亜鉛の塩、又は低級アルキルアミン、例えば、トリエチルアミン、及びヒドロキシ−低級アルキルアミン、例えば、２−ヒドロキシエチルアミンなどのアンモニア若しくは適切な有機アミンとで形成されたアンモニウム塩である。
いくつかの態様によれば、本発明は、本発明のタンパク質の混合物の２以上のタンパク質をコードする単離された核酸配列に関する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、本発明のタンパク質混合物をコードする単離された核酸配列を提供する。
「核酸」は、糖、リン酸及びプリン又はピリミジンのいずれかを含有するモノマー（ヌクレオチド）で構成された一本鎖又は二本鎖であり得る分子を指す。細菌、下等真核生物、並びに高等動物及び植物において、「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）は遺伝物質を指し、「リボ核酸」（ＲＮＡ）は、ＤＮＡからタンパク質への情報の翻訳に関与する。
遺伝子コードの変性の性質により、複数の異なる核酸配列は、本発明のアミノ酸配列をコードするために使用することができることは明らかである。本発明の核酸配列に含まれるコドンは、Ｓｆ９宿主細胞における発現のために最適化され得ることを理解されたい。
用語「コドン最適化」は、様々な宿主の変換のための遺伝子又は核酸分子のコード領域を指すとき、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなく、宿主生物の典型的なコドン利用を反映するような遺伝子又は核酸分子のコード領域中のコドンの変更を指す。本発明の文脈内で、遺伝子及びＤＮＡコード領域は、宿主細胞、特定の例では、Ｓｆ９細胞のスポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞における最適な発現のためにコドン最適化される。
本明細書で使用する用語「発現」は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物への転写及び翻訳を意味することを意図している。発現において、遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖は、最初に、メッセンジャーＲＮＡである場合が多い相補的なＲＮＡに転写され、次いで、このように転写されたメッセンジャーＲＮＡは、遺伝子産物がタンパク質である場合に、上記の遺伝子産物に翻訳される。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質混合物をコードする核酸配列を含む１以上の発現ベクターに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質混合物（例えば、異なる分子量を有するタンパク質の２以上のグループ）の少なくとも一部をコードする核酸配列を含む１以上の発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターに含まれる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列は、必要に応じて、さらに、Ｃ末端領域（例えば、配列番号８又は９として示される）及びＮ末端領域（例えば、配列番号５〜７から選択される）の少なくとも一方を含んでよい。核酸配列は作動可能に連結されたプロモーター、及び必要に応じて、調節配列の発現制御下にあることに留意されたい。
本明細書で使用する「ベクター」、「発現ベクター」又は「プラスミド」は、本明細書で言及するように、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を保有する場合が多い染色体外要素であり、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。所望の配列が異なる遺伝子環境間の輸送又は宿主細胞における発現についての制限酵素切断及びライゲーションにより挿入することができるいくつかの核酸のいずれかであり得る。ＲＮＡベクターも利用可能であるが、ベクターは、典型的にはＤＮＡで構成されている。ベクターには、プラスミド及びファージミドが含まれるが、これらに限定されるものではない。クローニングベクターは、宿主細胞中で複製することができるものであり、これはさらに、新しい組換えベクターが宿主細胞内で複製する能力を保持するように、ベクターが決定可能な様式で切断され、所望のＤＮＡ配列がライゲーションされ得る１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によって特徴付けられる。プラスミドの場合には、所望の配列の複製は、宿主細菌内でプラスミドのコピー数が増えるほど何回も、又は宿主が有糸分裂により再生する前に宿主当たり１回のみ生じ得る。ファージの場合、複製は、溶原相の間に能動的に又は溶菌相の間に受動的に生じ得る。発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が、それが作動可能に調節配列に結合され、ＲＮＡ転写物として発現され得るように、制限酵素切断及びライゲーションにより挿入することができるものである。ベクターは、ベクターで変換又はトランスフェクトされた細胞の特定及び選択において使用するのに適する１以上のマーカー配列を含んでよい。本明細書で使用する「変換」又は「トランスフェクション」は、核酸の取り込みによる細胞における新しい遺伝子の獲得である。マーカーには、例えば、抗生物質若しくは他の化合物に対する耐性又は感受性のいずれかを増加又は減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が当技術分野で公知の標準的なアッセイにより検出される酵素（例えば、βガラクトシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、及び形質転換された細胞若しくはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー又はプラークの表現型に見かけ上影響を与える遺伝子が含まれる。好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されるＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の自律複製及び発現、すなわち、合成のクモシルクタンパク質の発現が可能なものである。
特定の実施形態において、該ベクターは、ウイルスベクター、最も具体的には、バキュロウイルスベクター系又はワクシニアウイルスベクター系である。そのような市販品の例として、バキュロウイルス系のバキュロ−Ｇｏｌｄ（登録商標）、フラッシュ−ＢＡＣ（登録商標）及びｂａｃ ｔｏ ｂａｃシステムが挙げられる。さらなるウイルスベクター系も本発明で使用することができる。場合に応じて、ベクトルの修飾が必要になることがある。さらなるウイルスベクターの例としては、アデノウイルス及び全てのマイナス鎖のＲＮＡウイルス、例えば、狂犬病、麻疹、ＲＳＶなどが挙げられる。
一実施形態において、バキュロウイルス系は、本発明の合成のシルクタンパク質を発現するために使用される。バキュロウイルスは、２つの属：核多角体病ウイルス及び顆粒球−ウイルスに分類することができる大型棒状ウイルスのファミリーである。それらは、それらが感染することができる制限された範囲の宿主を有し、典型的には、限られた数の密接に関連する昆虫種に制限される。バキュロウイルスはヒトに有害ではないので、それらは、研究及び商業用途又は産業用途での使用のための安全な選択である。昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現は、組換え糖タンパク質を生成するための堅牢な方法であり、グリコシル化の点で欠けており、その結果、適切なタンパク質の折り畳みを欠く原核発現を上回る重要な利点がある。
上記に示したように、本発明の発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されている。用語「プロモーター」及び「プロモーター領域」は、通常、正確な部位で転写が開始するのに必要なＲＮＡポリメラーゼ及び／又は他の要因の認識を提供することによって、コード領域の発現を制御する構造遺伝子のタンパク質コード配列の上流（５'側）のＤＮＡの配列を指す。プロモーター配列は、遺伝子の発現を促進するのに必要であるが、必ずしも十分ではない。用語「適切なプロモーター」は、合成のクモシルク変異体遺伝子の発現を促進することができる任意の真核生物又は原核生物プロモーターを指す。
Ｓｆ９内で異種ＤＮＡ断片の発現を促進するのに有用であるプロモーターは、多数あり、当業者によく知られている。シルク変異体タンパク質をコードする遺伝子を促進することができる実質的に任意のプロモーターが、本発明に適している。例えば、ポリヘドリン、塩基性タンパク質、ｐ１０、ＯｐＩＥ２及びｇｐ４プロモーターは、発現に適するプロモーターであり得る。
コード配列及び調節配列は、コード配列の発現又は転写を調節配列の影響又は制御下に置くように共有結合された場合、「作動可能に連結」されるか、又は「作動可能に結合」される。調節配列が、産生される遺伝子産物の量に対して測定可能な効果を発揮することができるように遺伝子に対して配置される場合、調節配列は遺伝子に作動可能に連結される。コード配列が機能タンパク質に翻訳されることが望まれる場合、５'調節配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、かつ２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさないか、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨害しないか、又は（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しない場合に、２つのＤＮＡ配列は作動可能に結合される。このように、プロモーター領域は、得られる転写物が所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳されるように、そのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができる場合に、プロモーター領域はコード配列に作動可能に結合される。
遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種間又は細胞型間で変化し得るが、一般的に、必要であれば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの転写の開始及び翻訳にそれぞれ関与する５'非転写配列並びに５'非翻訳配列を含む。特に、そのような５'非転写調節配列は、作動可能に結合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。所望であれば、調節配列はまた、エンハンサー配列又は上流アクチベーター配列を含んでよい。
「調節」及び「調節する」は、遺伝子の転写開始点の上流（５'側）に主に位置するが、排他的ではないＤＮＡ配列要素によって制御される遺伝子発現の調節を指す。調節は、刺激への全か無かの応答をもたらすことができるか、又は遺伝子発現のレベルの変化をもたらすことができる。
さらなる態様において、本発明は、本発明による発現ベクターで変換された宿主細胞に関する。
「細胞」、「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」は、本明細書において互換的に使用される用語である。このような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫又は潜在的子孫を指すことを理解されたい。特定の修飾が、変異又は環境の影響のいずれかによって次の世代で生じ得るので、そのような子孫は、実際、親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される用語の範囲内になお含まれる。
本明細書で使用する「宿主細胞」は、裸のＤＮＡ又は組換えＤＮＡ技術を用いて構築された発現ベクターで組換え変換することができる細胞を指す。薬物耐性又は他の選択マーカーは、部分的に、変換体の選択を容易にすることが意図される。また、薬物耐性マーカーなどの選択マーカーの存在は、汚染微生物が培地中で増殖するのを防ぐのに使用され得る。形質転換された宿主細胞のこのような純粋な培養物は、生存のために誘導された表現型を必要とする条件下で細胞を培養することによって得られる。
本発明の宿主細胞は、本発明の合成のクモシルクタンパク質を発現させるために、本明細書に記載の発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされる。本明細書で使用する「形質転換」は、細胞の遺伝子型が外因性ＤＮＡ又はＲＮＡの細胞取り込みの結果として変化し、例えば、形質転換された細胞が所望の合成のクモシルクタンパク質の組換え型を発現する方法を指す。用語「トランスフェクション」は、核酸媒介遺伝子移入によってレシピエント細胞への核酸、例えば、裸のＤＮＡ又は発現ベクターの導入を意味する。
特定の一実施形態において、本発明による発現ベクターで形質転換された宿主細胞は昆虫細胞である。昆虫細胞として、鱗翅目昆虫の細胞、より具体的には、スポドプテラ・フルギペルダからの細胞及びイラクサギンウワバからの細胞を使用することができる。最も具体的には、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞、Ｓf２１細胞又はハイ５細胞である。
いくつかの実施形態において、本発明のシルクタンパク質は、翻訳後修飾を欠いている。
いくつかの実施形態において、本発明のシルクタンパク質は生分解性である。この特性は、シルクタンパク質が生物学的分解を望まれるインビボ使用を意図するものであるときはいつでも、例えば、医学の分野において重要であり得る。この特性は、特に、縫合材料及び創傷閉鎖及びカバレッジ・システムで適用され得る。
いくつかの態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列を含む発現ベクターに関し、該核酸配列は、作動可能に連結されたプロモーター、及び必要に応じて、調節配列の発現制御下にある。
いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、定義された構造の自己集合形成をもたらす。いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、ネットワークの形態である。いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、複合材料の形態である。いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、定義された二次構造、例えば、ベータターン、ガンマターン、ベータシート、及びアルファヘリックスの立体構造などを誘導する。
いくつかの態様によれば、開示されるタンパク質の混合物は、繊維の形態である。本明細書で使用する「繊維」は、撚り合わせた２以上のフィラメントで構成された繊維材料の微細なコードを意味する。「フィラメント」とは、微視的長さから１マイル若しくはそれ以上の長さに及ぶ、不定長の細い、細長い糸状物体又は構造を意味する。具体的には、合成のクモシルクフィラメントは、微小であり、タンパク質性である。「バイオフィラメント」とは、組換え産生されたクモシルクタンパク質を含むタンパク質から作られたフィラメントを意味する。いくつかの実施形態において、用語「繊維」は、非構造化凝集体又は沈殿物を包含しない。
いくつかの実施形態において、タンパク質の繊維は、少なくとも１つの寸法（例えば、直径、長さ）の大きさによって特徴付けられる。例えば、限定されないが、繊維の直径は、１０ｎｍ〜１μｍ、２０〜１００ｎｍ、又は１０〜５０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、繊維は、ナノ繊維で構成されている。いくつかの実施形態において、ナノ原繊維は、その間の任意の値又は範囲を含む、例えば、１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約１１ｎｍ、約１２ｎｍ、約１３ｎｍ、約１４ｎｍ、約１５ｎｍ、約１６ｎｍ、約１７ｎｍ、約１８ｎｍ、約１９ｎｍ、約２０ｎｍ、約２１ｎｍ、約２２ｎｍ、約２３ｎｍ、約２４ｎｍ、約２５ｎｍ、約２６ｎｍ、約２７ｎｍ、約２８ｎｍ、約２９ｎｍ、約３０ｎｍ、約３１ｎｍ、約３２ｎｍ、約３３ｎｍ、約３４ｎｍ、約３５ｎｍ、約３６ｎｍ、約３７ｎｍ、約３８ｎｍ、約４０ｎｍ、約４２ｎｍ、約４４ｎｍ、約４６ｎｍ、約４８ｎｍ、又は約５０ｎｍの直径を有する。一実施形態において、ナノ原繊維は、３〜７ｎｍの直径を有する。一実施形態において、ナノ原繊維は４〜６ｎｍの直径を有する。
いくつかの実施形態において、開示される繊維の長さは、１〜２００μｍ、１０〜１００μｍ、１００〜５００μｍ又は２００〜５００μｍである。
本明細書で説明する実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態において、開示される繊維は、多孔性構造によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該多孔性構造は、少なくとも３０％（例えば、３０〜９９％）の多孔率によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該多孔性構造は、少なくとも５０％（例えば、５０〜９９％）の多孔率によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該多孔性構造は、少なくとも６０％（例えば、６０〜９９％）の多孔率によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該多孔性構造は、少なくとも７０％（例えば、７０から９９％）の多孔率によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該多孔性構造は、少なくとも８０％（例えば、８０〜９９％）の多孔率によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該多孔性構造は、少なくとも９０％（例えば、９０〜９９％）の多孔率によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該多孔性構造は、約９０％の多孔率によって特徴付けられる。
本明細書において、用語「多孔率」とは、空隙からなる物質（例えば、「スポンジ状」材料）の体積の割合を指す。別の実施形態において、多孔率は、表面領域内の空隙を（多孔性及び非多孔性の）全体表面領域で割ることで測定される。
いくつかの実施形態において、開示される繊維の多孔性構造は、繊維表面上で効率的に水を吸収することができる。すなわち、任意の特定の理論に縛られることなく、この驚くべき発見は、自然界で見出される天然のクモシルクとは全く区別される、開示される繊維構造及びその多孔率の観点から説明することができる。
本明細書に記載の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態において、開示される繊維は、ナノサイズの平均直径によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態において、開示される繊維は、１〜５０ｎｍの範囲にある平均直径によって特徴付けられる。いくつかのこのような実施形態において、平均直径は３〜５０ｎｍの範囲にある。いくつかのこのような実施形態において、平均直径は、５〜５０ｎｍの範囲にある。いくつかのこのような実施形態において、平均直径は、１〜４０ｎｍの範囲にある。いくつかのこのような実施形態において、平均直径は、１〜３０ｎｍの範囲にある。いくつかのこのような実施形態において、平均直径は、５〜４０ｎｍの範囲にある。以下の実施例の節においてさらに例示されるように、いくつかの実施形態において、複数の開示される繊維は、自己集合構造又はマトリックスの形態であってよい。いくつかの実施形態において、このマトリックスは、生体材料の用途に適するようにさせられ得る。
いくつかの実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、タンパク質の前記「ｍ」型の中の各タンパク質は、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含み、ｍは２〜７０の整数であり、ｎは６〜７０の整数である。いくつかの実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、タンパク質の前記「ｍ」型の中の各タンパク質は、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含み、ｍは２〜７０の整数であり、ｎは７〜７０の整数である。いくつかの実施形態において、繊維又はタンパク質の混合物は、異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、タンパク質の前記「ｍ」型の中の各タンパク質は、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含み、ｍは２〜７０の整数であり、ｎは８〜７０の整数である。一実施形態において、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質の反復領域の「ｎ」リピートは、細胞成長、細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、多層細胞アセンブリ、細胞移動、細胞死の減少、組織の再生及び／又は治癒方法を有効に支持するために、６以上でなければならない。一実施形態において、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質の反復領域の「ｎ」リピートは、細胞成長、細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、多層細胞アセンブリ、細胞移動、細胞死の減少、組織の再生及び／又は治癒方法を有効に支持するために、７以上でなければならない。一実施形態において、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質の反復領域の「ｎ」リピートは、細胞成長、細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、多層細胞アセンブリ、細胞移動、細胞死の減少、組織の再生及び／又は治癒方法を有効に支持するために、８以上でなければならない。一実施形態において、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質の反復領域の「ｎ」リピートは、細胞成長、細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、多層細胞アセンブリ、細胞移動、細胞死の減少、組織の再生及び／又は治癒方法を有効に支持するために、９以上でなければならない。一実施形態において、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質の反復領域の「ｎ」リピートは、細胞成長、細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、多層細胞アセンブリ、細胞移動、細胞死の減少、組織の再生及び／又は治癒方法を有効に支持するために、１０以上でなければならない。
いくつかの実施形態において、開示されるマトリックス内の１以上の繊維は、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、又は少なくとも１２個のリピート（上記で定義される「ｎ」）を含む。いくつかの実施形態において、開示されるマトリックス内の１以上の繊維は、６〜７０、７、８〜７０、９〜７０、１０〜７０、１１〜７０、１２〜７０、１３〜７０、１４〜７０、１５〜７０、１６〜７０、１７〜７０、１８〜７０、１９〜７０、又は２０〜７０個のリピート（本明細書で定義される「ｎ」）である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞、医学的及び生物学的組成物並びに方法は、少なくとも６回のリピートを必要とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞、医学的及び生物学的組成物並びに方法は、少なくとも７回のリピートを必要とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞、医学的及び生物学的組成物並びに方法は、少なくとも８回のリピートを必要とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞、医学的及び生物学的組成物並びに方法は、６〜７０、７、８〜７０、９〜７０、１０〜７０、１１〜７０、１２〜７０、１３〜７０、１４〜７０、１５〜７０、１６〜７０、１７〜７０、１８〜７０、１９〜７０、又は２０〜７０個のリピート（本明細書で定義される「ｎ」）を必要とする。
いくつかの実施形態において、このマトリックスは、さらに本明細書の以下で実証するように、細胞成長、及び細胞活性の維持又は促進に適している。
いくつかの実施形態において、用語「自己集合」とは、繊維（複数可）の少なくとも２つのドメイン間の一連の結合化学反応に基づいて生じた自己集合方法（例えば、自発的な自己集合方法）の構造を指し、１つのドメイン上の結合基が、十分近接しており、他のドメインとの建設的な結合を可能にするように配向されている場合に生じる。いいかえれば、結合性相互作用は、相互に繊維又は複数の繊維のドメインの接着をもたらす接触を意味する。いくつかの実施形態において、接着ドメインは、互いに平行ではない。自己集合構造の２以上のドメインがあり、それぞれが異なる平面に係合する配置も企図される。
いくつかの実施形態において、ナノ繊維の密度はまた、自己集合繊維の性質に影響を与える。いくつかの実施形態において、ナノ原繊維の密度（ｇ／ｃｍ３単位）は、その間の任意の値又は範囲を含む、０.５〜１.５、例えば、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５である。例示的な実施形態において、単一のナノ原繊維の密度は約１.３ｇ／ｃｍ３であった。
いくつかの実施形態において、自己集合繊維の密度（例えば、約８０％の空隙）は、０.１ｇ／ｃｍ３〜０．４ｇ／ｃｍ３又は０．２ｇ／ｃｍ３〜０．３ｇ／ｃｍ３の範囲にある。例示的な実施形態において、自己集合繊維の密度は約０.２６ｇ／ｃｍ３であった。
ナノスケールの空間分解能での表面の水和性研究及び高い時間分解能は、理論と実践の両方の観点から新興分野である。
以下の実施例の節で実証されるように、開示される繊維は、それらの体積と重量と比較して、流体を吸収する顕著な能力を示す高い程度の表面水和性を示した。
複合材料及び機械的性質
いくつかの実施形態において、開示される複合材料は、標準物質と比較して改良された機械的性質によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、用語「標準物質」は、１以上のタンパク質を含まない、複合材料中と同じ化学組成を指す。いくつかの実施形態において、用語「標準物質」は、複合材料中のようなポリマー分子量（Ｍｗ）を有する（すなわち、タンパク質を含まない）プレーンポリマーを指す。
いくつかの実施形態において、用語「標準物質」は、同じモノマー及び分子の構造（例えば、結晶の割合及び種類）を有するプレーンポリマーを指す。いくつかの実施形態において、用語「標準物質」は、同じ分子構造（例えば、結晶の割合及び種類）を有するプレーンポリマーを指す。いくつかの実施形態において、用語「標準物質」は、同じモノマー単位から誘導された骨格を有するプレーンポリマーを指す。いくつかの実施形態において、用語「標準物質」は、対応するモノマーを指す。
「改善された機械的性質」とは、より望ましい機械的性質を有することを意味する。
いくつかの実施形態において、該複合材料は、マトリックスの形態である。本明細書中で、用語「マトリックス」（「コアマトリックス」を含む）は、多層マトリックスを指すことができる。いくつかの実施形態において、用語「マトリックス」は、さらに、層（複数可）内に組み込まれ、かつ／又は層の間に挿入されるタンパク質の混合物を含む１以上のポリマーの１以上の層を指す。
いくつかの実施形態において、改善された機械的性質は弾性率を指す。いくつかの実施形態において、語句「弾性率」はヤング率を指す。いくつかの実施形態において、語句「弾性率」は、引張応力の印加に対する材料の応答によって（例えば、当技術分野で公知の手順に従って）決定される。
いくつかの実施形態において、さらに以下の実施例の節に示されているように、改善された機械的性質は曲げ弾性率を指す。本明細書及び当技術分野で使用されるように、曲げ弾性率（ｆｌｅｘｕｒａｌ ｍｏｄｕｌｕｓ）（「曲げ弾性率（ｆｌｅｘｕｒａｌ ｍｏｄｕｌｕｓ）」とも呼ばれる）は、曲げ変形の歪みに対する応力の比、又は屈曲する材料の傾向である。曲げ弾性率は、応力−歪み曲線の傾きから決定することができる。
いくつかの実施形態において、性質は、限定されないが、ヤング率、引張強度、破断歪み、降伏点、靭性、剛性、耐クリープ性、破壊までの仕事量、応力及び伸長の割合から選択される。
剛性は、荷重変形曲線の直線部分の傾きを指す。破壊までの仕事量は、破壊前の荷重変形曲線下面積を指す。これらのそれぞれを測定し、当技術分野で公知の標準的な方法によって計算することができる。
いくつかの実施形態において、材料の引張強度は、破壊、例えば、切断前に生じ得る引張応力の最大量を指す。
いくつかの実施形態において、本明細書で使用する用語「引張強度」は、材料が引裂、切断、ネッキング、微小亀裂若しくは破断の形成を起こすことなく、又はそれらが起きる前に耐えることができる、例えば、ニュートン単位で測定した場合の力の最大量である。
「引裂、切断、ネッキング、微小亀裂若しくは破断の形成」とは、永久変形を指すことを意味する。いくつかの実施形態において、用語「永久変形」は、微小亀裂又は破断を含んでいない。いくつかの実施形態において、「永久変形」とは、その間の任意の値を含む、元の寸法又は構造の少なくとも０.１％、０.２％、０.３％、０.４％、０.５％、又は１％に対して言及することを意味する。
いくつかの実施形態において、用語「破断歪み」とは、例えば、引張試験における応力−歪み曲線によって決定される破断時の歪み（変位）を意味する。
いくつかの実施形態において、用語「降伏点」は、応力−歪み曲線がプラトーを有しており、弾性限界に達する時点の応力を指す。本明細書で使用する「クリープ」は、ポリマー試料を一定の引張応力、例えば、重力又は印加される機械的若しくは物理的応力にさらされた時の引張歪みの変化の尺度である。言い換えると、クリープは、一定の引張応力の影響下で恒久的にゆっくりと移動するか、又は変形する固体材料の傾向である。本明細書で使用する用語「耐クリープ性」は、長期間にわたる負荷の下で、任意の種類の歪みに抵抗するポリマーの能力を指す。「改善された耐クリープ性」は、例えば、５％の引張歪みまでの時間の、例えば、２０％の改善を指す。
いくつかの実施形態において、用語「伸長時の応力」は、延伸状態における材料に作用する力を指す。例えば、「１００％伸長時の応力」は、２倍の長さに延伸された材料に作用する力を指す。
いくつかの実施形態において、ヤング率、引張強度、降伏点、及び伸長時の応力から選択される１以上の性質は、例えば、少なくとも１％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、又は少なくとも５００％増強される。
いくつかの実施形態において、ヤング率、引張強度、降伏点、及び伸長時の応力から選択される少なくとも２つの性質は、例えば、少なくとも１％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、又は少なくとも５００％増強される。
いくつかの実施形態において、ヤング率、引張強度、降伏点、及び伸長時の応力から選択される少なくとも３つの性質は、例えば、少なくとも１％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、又は少なくとも５００％増強される。
いくつかの実施形態において、ヤング率は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、又は少なくとも５００％増強される。
いくつかの実施形態において、引張強度は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、又は少なくとも５０％増強される。
いくつかの実施形態において、降伏点は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、又は少なくとも５０％増強される。
いくつかの実施形態において、該複合材料は、構造的強度の１％超がタンパク質繊維から生じる構造強度によって特徴付けられる。
いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、タンパク質の混合物が自己集合に成功すると、次に、タンパク質繊維をもたらすことを理解されたい。ポリマー複合材料の補強は、その中に組み込まれる繊維（複数可）に由来する。いくつかの実施形態において、該複合材料は、構造強度の５％超がタンパク質繊維（複数可）の取り込みから生じる構造強度によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該複合材料は、構造強度の１０％超がタンパク質繊維の取り込みから生じる構造強度によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態において、該複合材料は、構造強度の２０％超がタンパク質繊維（複数可）の取り込みから生じる構造強度によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該複合材料は、構造強度の３０％超がタンパク質繊維（複数可）の取り込みから生じる構造強度によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態において、該複合材料は、引張強度の１％超がタンパク質繊維（複数可）の取り込みから生じる構造強度によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該複合材料は、引張強度の５％超がタンパク質繊維（複数可）の取り込みから生じる構造強度によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該複合材料は、引張強度の１０％超がタンパク質繊維（複数可）の取り込みから生じる構造強度によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該複合材料は、引張強度の２０％超がタンパク質繊維（複数可）の取り込みから生じる構造強度によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該複合材料は、引張強度の３０％超がタンパク質繊維（複数可）の取り込みから生じる構造強度によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態において、本明細書で使用する語句「構造強度」は、限定されないが、弾性率、引張応力、伸長（歪み）及び靭性[例えば、引張応力と伸長（歪み）の組み合わせなどの機械的性質を指す。
いくつかの実施形態において、本明細書全体で使用される用語「ポリマー」は、互いに共有結合され、ポリマーのポリマー骨格を形成している複数の繰り返し構造単位（互換的に、骨格単位又はモノマー単位と呼ばれる）で構成された物質、例えば、有機物質であるが、代替的に無機物質を説明する。本明細書で使用する用語「ポリマー」は、有機及び無機ポリマーを包含し、さらに、ホモポリマー、コポリマー又はそれらの混合物（例えば、ブレンド）の１以上を包含する。本明細書で使用する用語「ホモポリマー」は、１種類のモノマー単位から作られ、したがって、ホモジェニック骨格単位で構成されているポリマーを説明する。本明細書で使用する用語「コポリマー」は、２種以上のモノマー単位から作られ、したがって、異種骨格単位で構成されているポリマーを説明する。異種骨格単位は、そのペンダント基が互いに異なり得る。
簡単に説明すると、本明細書全体で互換的に使用される用語「ポリマー」及び「ポリマー骨格」は、それらのホモポリマー、コポリマー及び混合物の両方に関する。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは疎水性である。いくつかの実施形態において、該ポリマーはＵＶ硬化される。
いくつかの実施形態において、開示される複合材料は生体安定性である。いくつかの実施形態において、開示される複合材料は生体切断可能である。いくつかの実施形態において、開示される複合材料は生分解性である。
いくつかの実施形態において、用語「生体安定性」は、生理学的条件下で無傷のままである（例えば、インビボで分解されず、したがって、生分解性でも、又は生体切断可能でもない）化合物又はポリマーを説明する。
いくつかの実施形態において、用語「生分解性」は、生理学的条件下及び／又は環境条件下（複数可）で分解産物に分解することができる物質を説明する。そのような生理学的条件及び／又は環境条件には、例えば、加水分解（加水分解切断を介する分解）、酵素触媒（酵素分解）、及び機械的な相互作用が含まれる。この用語は、典型的には、物質の５０重量％が１年より短い時間内に分解するように、これらの条件下で分解する物質を指す。
いくつかの実施形態において、本発明の実施形態の文脈で使用される用語「生分解性」はまた、宿主生物への生体吸収を受ける生成物を分解するための生理学的条件下で分解する、すなわち、宿主生物の生化学系の代謝物になる物質を説明する用語「生体吸収性」を包含する。
ポリマー
いくつかの実施形態において、該ポリマーは、合成ポリマーであるか、又は合成ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、該ポリマーは、天然のポリマーであるか、又は天然のポリマーを含む。天然ポリマーは、限定されないが、植物、動物及びミネラル源などの天然源から作られたポリマーを指し得るか、又は、綿、リネン、ジュート、亜麻、カラムシ、サイザル、及び麻、ケラチン繊維（髪）の構造、並びに羊毛などの天然繊維から織られ得る。
さらなる例示的な天然ポリマーには、ポリラクチド、コラーゲン、ケラチン、セルロース、アクチン、ミオシン、キチン、カイコのシルクが含まれる。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは熱可塑性ポリマーである。いくつかの実施形態において、該ポリマーは熱硬化性である。いくつかの実施形態において、該ポリマーはエポキシである。いくつかの実施形態において、該ポリマーは、ポリエステル（例えば、脂肪族ポリエステル）である。いくつかの実施形態において、該ポリマーは、ポリアミド、ポリウレタン、及びナイロンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該ポリマーは架橋ポリマーである。いくつかの実施形態において、該ポリマーはコポリマーである。いくつかの実施形態において、該ポリマーは、ヒドロゲルの形態である。
いくつかの実施形態において、該ポリマー材料は、２以上の成分材料（例えば、コポリマー）である。以下の実施例の節において実証されるように、成分（「部」とも称される）Ａは、主な（基礎となる）ポリマーであり得、部Ｂは、例えば、硬化剤又は触媒であり得る。
硬化剤の化学ファミリーは、ポリマーベースで変化するが、アミン、イソシアネート、過酸化物及びいくつかの他のものを含む。
コポリマーは、ラジカル重合法（例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮと略記される）を用いて）、段階成長重合及び連鎖成長重合から選択される機構によって生成することができる。
本明細書で使用する用語「エポキシ」は、−Ｃ２Ｈ３Ｏの分子式を有する１つの酸素及び２つのメチレン基を有する３員の複素環式分子である反応基を指す。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは、限定されないが、液晶ポリマー、無水マレイン酸グラフト化ポリプロピレン、ポリアミドナイロン４，６、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１１、ナイロン１２、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）などのポリアクリレート、ポリ（アリールアミド）、ポリエチレン（ＰＥ）、高密度ＰＥ（ＨＤＰＥ）、低密度ＰＥ（ＬＤＰＥ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＨＭＷＰＥ）、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンサルファイド、ポリフタルアミド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（フッ化ビニリデン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）、熱硬化性及び熱可塑性ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリビニルブチラール、エチレンビニルアルコールコポリマー、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などのフッ素化ポリマー、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、又はそれらのコポリマー（例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ））、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）又はそのコポリマー、ポリエチレングリコール、ラテックス、ゴム（例えば、天然ゴム、合成ゴム、ブタジエンゴム、スチレンブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ブチルゴム、ニトリルゴム、イソプレンゴム、ポリウレタンゴム、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ））、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルケトンケトン（ＰＥＫＫ）及びポリエーテルエーテルケトンケトン（ＰＥＥＫＫ）、熱可塑性エラストマー、スチレン−ブタジエンコポリマーゴム（ＳＢＲ））、キサンタン、セルロース、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、綿、羊毛、シルク、及びそれらの任意の組み合わせ又は混合物から選択される。
「セルロース」とは、限定されないが、硝酸セルロース、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）、セルロースアセテートプロピオネート（ＣＡＰ）を含むその誘導体を含むことも意味する。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは、限定されないが、エポキシ、シアノアクリレート、ポリエステル、ポリオール、ポリウレタン、及びポリイミドから選択される、限定されないが、接着剤として使用される材料から選択される。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは、タンパク質由来のポリマーである。いくつかの実施形態において、タンパク質誘導性ポリマーは、ＭａＳｐタンパク質から誘導されない。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは、非タンパク質誘導性ポリマーである。
本明細書で使用する用語「ヒドロゲル」は、約５０％から、又は約８０％、及び最高で９９.９％（質量で）の水を含有する三次元繊維網を指す。ヒドロゲルは、大部分が水であり、液体内の３次元架橋ネットワークによってなお固体又は半固体のように振る舞い、天然及び／又は合成ポリマー鎖から作られている材料とみなすことができる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ヒドロゲルは、化学結合（例えば、共有結合、水素結合及びイオン結合／複合結合／金属結合）によって相互連結（架橋）されているモノマー、オリゴマー、ブロックポリマー単位に由来し得る様々な長さ及び化学組成のポリマー鎖を含有してよい。
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、主な架橋ネットワークに化学的に連結されていないが、むしろ機械的にそれと絡み合いかつ／若しくはその中に浸漬されている高分子ポリマー及び／又は繊維要素を含有してよい。そのような高分子繊維要素は、（例えば、メッシュ構造中のように）織られることができるか、又は織られておらず、いくつかの実施形態において、ヒドロゲルの繊維ネットワークの補強材として機能することができる。このような高分子の非限定的な例としては、ポリカプロラクトン、ゼラチン、ゼラチンメタクリレート、アルギン酸塩、アルギン酸メタクリレート、キトサン、キトサンメタクリレート、グリコールキトサン、グリコールキトサンメタアクリレート、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ＨＡメタクリレート、及び他の架橋されていない天然又は合成のポリマー鎖などが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、以下に議論されるような治療剤及び標識剤などの特定の用途に有用にさせる追加の構成要素、足場及び他の構造要素、生細胞、及び細胞成分などを含有してよい。
いくつかの実施形態において、ポリマー材料、例えば、ヒドロゲルは、さらに１以上の界面活性剤ビルダー、増粘剤及び１以上の酵素を含む。
いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、軟質で、脆く、弱い状態から硬質までの、弾性かつ強靭な材料の範囲の物理的形態をとることができる。軟質ヒドロゲルは、弾性パラメータ及び粘弾性パラメータを含むレオロジーパラメータによって特徴付けることができるが、硬質ヒドロゲルは、引張強度パラメータ、弾性、貯蔵及び損失弾性率によってより適切に特徴付けられ、これらの用語は上記で定義されるか、又は当技術分野で知られている。
いくつかの実施形態において、用語「熱硬化性」は、加熱による、化学反応（例えば、エポキシ中のような）又は照射による硬化を含めて、任意の技術によって不可逆的に硬化された合成ポリマーを指す。熱硬化性ポリマーの例としては、限定されないが、熱硬化性ポリエステル（例えば、ガラス繊維に使用される）、ポリウレタン、加硫ゴム、フェノール−ホルムアルデヒド（例えば、Ｂａｋｅｌｉｔｅ（登録商標）ポリマー）、デュロプラスト、尿素−ホルムアルデヒド（例えば、合板に使用されるような）、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、ポリイミド、シアネートエステル及びポリシアヌレートが挙げられる。
いくつかの実施形態において、用語「熱可塑性」は、容易にポリマーの塑性変形を可能にするために特定の温度以上で十分に軟質であり、かつ所望の形状を保持するために特定温度以下で十分に剛性であるポリマーを指す。熱可塑性ポリマーの軟化は、ポリマーの転移温度（例えば、ガラス転移温度、融点）に近い及び／又はそれ以上の温度で生じる場合が多い。そのような転移温度は、例えば、熱量測定によって決定されてよい。
本明細書で使用する語句「軟化温度」は、熱可塑性ポリマーのガラス転移温度範囲の中の最低温度を指す。
いくつかの実施形態において、複合体内のタンパク質の総濃度（「％ローディング」又は「％補強」とも呼ばれる）は、複合材料の総重量の約０.１重量％〜約１０重量％の範囲にある。いくつかの実施形態において、該複合材料内のタンパク質の総濃度は、約０.５重量％〜約３重量％の範囲にある。
いくつかの実施形態において、複合材料内のタンパク質の総濃度は、その間の任意の値又は範囲を含む、例えば、約０.１重量％、約０.５重量％、約１重量％、約１.５重量％、約２重量％、約２.５重量％、約３重量％、約３.５重量％、約４重量％、約４.５重量％、約５重量％、約５.５重量％、約６重量％、約６.５重量％、約７重量％、約７.５重量％、約８重量％、約８.５重量％、約９重量％、約１０重量％、約２０重量％、約３０重量％、約４０重量％、約５０重量％である。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは、開示されるタンパク質以外の１種以上の添加剤を含む。いくつかの実施形態において、用語「添加剤」は、その意図される用途に有害になることなく、ポリマー材料に添加することができる材料を指すことができる。いくつかの実施形態において、該添加剤は、酸化防止剤、顔料、帯電防止剤、及び難燃剤からなる群から選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、添加剤は、その中に／その上にタンパク質の混合物の添加を容易にし、かつ／又は制御するために用いられる。いくつかの実施形態において、用語「添加剤」は、界面活性剤又は分散剤を指す。
いくつかの実施形態において、上記の１以上の機械的性質（例えば、ヤング率、引張強度、降伏点、及び伸長時の応力）の向上は、タンパク質の総濃度と相関する。本明細書で使用する用語「相関する」又は「相関」は、２つの事象の出来事間の関連、例えば、複合材料の％添加と機械的性質の間の因果関係、相補的関係、平行関係、又は相互関係を持つことを指す。
いくつかの実施形態において、タンパク質の混合物及びポリマーは、実質的に連続接触している。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは透明であり、そのため、視覚が必要とされる場合、例えば、ビヒクル窓などでの使用に適している。
いくつかの実施形態において、該ポリマーは、例えば、弱点の形成を避けるため、かつ／又は実質的に連続したタンパク質との接触を可能にするために、１以上の実質的に平坦な表面を含む、湾曲か、平坦か、又はその組み合わせであろうと、実質的にはプレートである。
いくつかの実施形態において、タンパク質の混合物及びポリマーは、少なくとも部分的に連続接触している。いくつかの実施形態において、タンパク質の混合物及びポリマーは、実質的に連続接触している。
いくつかの実施形態において、開示されるタンパク質の混合物及び／又はタンパク質の混合物由来の開示される繊維はさらにリンカーを含むと定義される。そのようなリンカーは、標的化機能、又は標的化部分のいずれかに悪影響を及ぼすことなく、別の薬剤、標的部分、又は表面に結合するのに役立つ化学部分であり得る。
いくつかの実施形態において、タンパク質の開示される複数の混合物及び／又はタンパク質の混合物由来の開示される繊維は、相互に（例えば、静電結合によって）非共有結合している。
いくつかの実施形態において、タンパク質の開示される複数の混合物及び／又はタンパク質の混合物由来の開示される繊維は、相互に共有結合架橋している。いくつかの実施形態において、繊維の架橋された形態は、（例えば、加熱によって）可逆的である。
いくつかの実施形態において、共有結合架橋はインビボで影響を受ける。あるいは、共有結合架橋はエクソビボで影響を受ける。
いくつかの実施形態において、共有結合架橋の存在は、本明細書に記載のより強い機械的性質に関連している。
いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、ポリマーの少なくとも一方の表面上に接着又は堆積する。
いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、無機基材の少なくとも一方の表面上に接着又は堆積する。例示的な無機基材は、シリコン、アルミナのようなセラミックス、チタニア、ニッケル、ガラス、ニチノールなどから選択されるが、これらに限定されない１種以上の材料を含む。
いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、リンカーを介してポリマーの少なくとも一方の表面上に接着又は堆積する。いくつかの実施形態において、該リンカーは有機リンカーである。いくつかの実施形態において、該リンカーは無機リンカーである。一実施形態において、該有機リンカーは、単一の直鎖リンカーである。いくつかの実施形態において、該リンカーは分枝鎖を含むこともできる。
いくつかの実施形態において、該リンカーは、（例えば、ジスルフィド結合によって含む）非開裂性架橋剤を含んでもよい。
さらなる例示的なリンカーは、限定されないが、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、４又はそれ以上のポリエチレングリコール単位を含有するフォームカルボキシＰＥＧアミンのペグ化アミノ酸、及びＢＳ３（ビス[スルホスクシンイミジル]スベレート）などのヘテロ官能性架橋を含む水溶性の薬剤であり得る。
さらなる例示的なリンカーは、限定されないが、Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）、グルタルアルデヒド（ＧＡ）を含むが、これらに限定されない水溶性剤であり得る。
いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、試験ポリマーのマトリックスとさらなる接着又は共有結合を作成するために、他の官能基を有する繊維を機能化する。
いくつかの実施形態において、用語「リンカー」は、結合、例えば、共有結合を指す。一実施形態において、有機リンカーは、リンカーの一部を形成する反応性基を含む。
本明細書で使用する語句「反応性基」は、典型的には結合形成をもたらす化学反応を受けることができる化学基を説明する。結合形成をもたらす化学反応は、例えば、求核置換及び求電子置換、求核付加反応及び求電子付加反応、アルキル化、付加−脱離反応、付加環化反応、転位反応及び官能基を含む任意の他の公知の有機反応、並びにそれらの組合せを含む。
反応性基は、必要に応じて、例えば、反応性基の反応性部分（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｏｒｔｉｏｎ）を部分（ｍｏｉｅｔｙ）に結合させるのに役立ち得る非反応性部分（例えば、アルキル）を含むことができる。
例示的な実施形態において、該リンカーは、カルボニル基、アミン基、又はスルフヒドリル基、又はカルボキシル基から選択される基を含む。
いくつかの実施形態において、該リンカーは、他の官能基を別の方法で求核基として作用するように促進する中間グループを作成することができる。
いくつかの実施形態において、用語「無機リンカー」は、限定されないが、シラノール基などの無機結合実体を指す。
いくつかの実施形態において、該複合材料は、その間の任意の値又は範囲を含む、例えば、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１ｍｍ、１０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍの厚さによって特徴付けられる。
いくつかの実施形態において、該複合材料は、例えば、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、少なくとも１μｍ、少なくとも５μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも３０μｍ、少なくとも４０μｍ、又は少なくとも５０μｍの厚さによって特徴付けられる。
いくつかの実施形態において、開示される繊維は、金属の表面に又はポリマー材料に接着している。いくつかの実施形態において、開示される繊維は金属又はポリマー材料をコーティングする。
本明細書で使用する用語「コーティングする」は、外側がコーティングされた部分（基材）の少なくとも１０％、２０％、３０％、５０、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のカバーを識別するために使用される。
いくつかの実施形態において、コーティング方法は、基材の表面の少なくとも一部上に開示される繊維を堆積させるために適用される。
コーティング法の非限定的な例としては、ディップコーティング、スプレーコーティング、ブラシコーティング、ナイフコーティング、ローラーコーティング、リール・ツー・リールコーティング、スピンコーティング、プリントコーティング、スクリーン印刷及び膜キャスティングが挙げられる。以下の実施例の節にさらに記載されるように、いくつかの実施形態において、メトリック（ステント）上での開示される繊維のコーティングは、電気紡糸法によって適用される。
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本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本明細書に記載の複合材料を含む物品（例えば、製造物品）が提供される。
いくつかの実施形態において、該物品は医療機器である。いくつかの実施形態において、語句「医療装置」は、対象、好ましくはヒト対象の治療に利用可能な任意の装置を指す。
いくつかの実施形態において、該医療装置は、埋め込み型医療装置である。該医療装置は、移植、注射のために使用するか、又はそうでなければ体内に完全に又は部分的に配置することができ、したがって、該装置は薬剤溶出装置であることが望ましい。いくつかの実施形態において、該医療装置は、対象における経皮的及び／又は局所的な適用のためのものである。所定の組織を治療するために使用される場合、このような医療機器は、最小限の組織刺激を引き起こす必要があり、したがって、薬物をその中に含めることが有益である。いくつかの実施形態において、該医療装置は、対象の身体器官内に移植するための埋め込み型医療機器である。
語句「埋め込み型装置」は、長期間（例えば、数時間から数年、及びさらに一生の間）、体腔内に配置されるのに適している任意の医療装置を説明するために使用される。
例示的な非限定的な埋め込み型装置には、プレート、メッシュ、ネジ、ピン、鋲、ロッド、縫合アンカー、大動脈グラフト、動脈管、人工関節、血液酸素膜、血液酸素供給チューブ、身体インプラント、カテーテル、透析膜、薬物送達系、内部人工器官、気管内チューブ、ガイドワイヤ、心臓弁、大動脈内バルーン、ペースメーカー、ペースメーカーリード線、ステント、限外濾過膜、血管グラフト、血管チューブ、静脈チューブ、ワイヤ、整形外科インプラント、埋め込み型拡散ポンプ及び注入ポートが含まれる。
経皮適用のために使用することができる例示的な装置には、限定されないが、縫合糸、絆創膏及び皮膚パッチが含まれる。局所適用のために使用することができるさらなる例示的な装置には、限定されないが、縫合、付着薄片、包帯、絆創膏、創傷包帯及び皮膚パッチが含まれる。
さらなる非限定的な例示的な装置には、吻合クリップ又はプラグ、歯科用インプラント又は装置、大動脈瘤グラフト装置、房室シャント、血液透析カテーテル、骨折治癒装置、骨置換装置、関節交換用装置、組織再生装置、血液透析グラフト、留置用動脈カテーテル、留置静脈カテーテル、針、中隔閉鎖装置、ステント、例えば、血管ステント、気管ステント、食道ステント、尿道ステント、直腸ステント、ステントグラフト、縫合、糸、チューブ、血管動脈瘤オクルダー、血管クリップ、血管補綴フィルタ、血管鞘及び薬剤送達ポート、静脈弁及びワイヤが含まれる。
医療装置を移植することができる身体部位の例としては、限定されないが、皮膚、頭皮、毛髪、皮膚層、眼、耳、小腸組織、大腸組織、腎臓、膵臓、肝臓、消化管の組織又は空洞、気道の組織又は空洞、骨、関節、骨髄組織、脳の組織又は空洞、粘膜、鼻粘膜、血液系、血管、筋肉、肺の組織又は空洞、腹部の組織又は空洞、動脈、静脈、毛細血管、心臓、心臓の空洞、男性の生殖器、女性の生殖器官及び内臓が挙げられる。
本明細書の上記のように、いくつかの実施形態において、該埋め込み型医療装置はステントである。該ステントは、様々な型、形状及び材料のものであり得る。任意の市販のステントは、現在又は将来において、本発明の実施形態に従って使用することができる。
いくつかの実施形態において、該埋め込み型医療装置は、人工血管グラフトである。いくつかの実施形態において、該埋め込み型医療装置は、人工心臓ポンプのダイヤフラム、埋め込み型心臓弁尖である。いくつかの実施形態において、該埋め込み型医療装置は、組織足場である。
いくつかの実施形態において、該埋め込み型医療装置は、整形外科用インプラントである。いくつかの実施形態において、該埋め込み型医療装置は、歯科用インプラント、空洞充填、及び歯列矯正装置から選択されるが、これらに限定されない。
本発明の複合材料及びそれを含む物品は、さらに運動の脅威から保護するために使用することができる。該物品は、装甲シート、防弾ベスト、ボディアーマー、ドアパネル、フロアパネル、壁パネル、補強ウィンドウ、チューブ、ヘルメット、ガラス、シート、航空機、装甲車両、及び自動車から選択されるが、これらに限定されない形状を有してよい。例えば、該物品は、動力学的脅威から物体を保護するのに有用である。すなわち、開示される複合材料（及び／又はそれを含む物品）は、ライフル弾丸などの動力学的脅威の複数のヒットからの保護を提供することができる。動力学的脅威から物体を保護する方法は、本明細書に記載の、すなわち、上記の複合材料を含む物品を物体に提供することを含む。
いくつかの実施形態において、該物品は、ピル、錠剤、カプセル、及びゲルキャップからなる群から選択される。本発明による物品の他の非限定的な例としては、医療用接着剤薄片、皮膚移植、置換靭帯、及び外科用メッシュが挙げられ、かつ織物、防弾ベストの裏地、コンテナの織物、バッグ又は財布のストラップ、ケーブル、ロープ、釣り糸、接着性結合材料、非接着性結合材料、結束材、自動車のカバー及び部品、航空機建設材料、耐候性材料、柔軟な隔壁材料、スポーツ用品などの産業用及び商業用製品の広い範囲、かつ実際には、高い引張強度及び弾性が所望の特徴である繊維又は織物のほぼ全ての使用に含まれる。ドライスプレーコーティング、ビーズ様粒子などの他の形態の安定した繊維製品の適合性及び使用、又は他の組成物との混合での使用も、本発明によって企図される。
いくつかの実施形態において、該物品は、本明細書上記の生理学的条件で安定である（例えば、生体安定性である）。
いくつかの実施形態において、該物品は織物を含む。いくつかの実施形態において、用語「織物」は、本発明のタンパク質繊維から作られている織布又は不織布アーティファクトを指す。必要に応じて、織物は、対照形状、寸法、多孔度及び／又は細孔サイズで作られている。
いくつかの実施形態において、該物品は、断熱材によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、該物品は、熱抵抗度が高く、したがって、断熱材として作用する剛体ポリウレタンプラスチック材料で構成されている。断熱材としてのこの材料の使用は、冷蔵装置及びビヒクルに含まれる断熱材中のように、当技術分野で知られている。
さらに別の実施形態において、開示される物品又は複合材料は、化粧品組成物であってよい。用語「化粧品組成物」は、皮膚の色調及び色の改善又は増強、ケラチン構造の強化、毛髪及び爪及びまつげの滑らかさの改善、厚さ、髪の色及び輝き、髪のストレート化、傷及び傷跡などの表面的な組織の欠陥を隠すこと、又は日光による損傷及び皮膚の老化などの将来的な若しくは累積した損傷の防止などの有益な皮膚又は他の表面組織の美的性質を有する組成物に関する。本明細書で、「向上」とは、強化すること、彩りを与えること、長期化させること、及び厚くすることを含むことを意味する。
本発明によれば、治療のための皮膚科又は美容組成物は、軟膏ポマード、ローション、クリーム及びゲルとして表皮上に、かつクリーム、ローション又はゲルなどの水エマルジョンとして粘膜上に局所的に適用される。そのような組成物を用いて生成することができる化粧品は、シェービングクリーム、ハンドクリーム、シャンプー、石鹸、コンディショナー、ボディクリーム、日焼けどめ、皮膚保護、フェイスクリーム、又はボディーローションなどの製品を含む。化粧品組成物中の成分の比率は、化粧品組成物の意図する用途に応じて調整することができる。
さらなる物品は、インク関連材料などの三次元印刷材料のための添加剤、ＦＤＭ（溶融堆積モデリング）用の熱可塑性ポリマー並びにＳＬＳ（選択的レーザー焼結）用のポリマー粉末、スピーカ、フィルタ、及び弦の振動板から選択されるが、これらに限定されない。
方法
本発明はまた、開示される複合材料を製造する方法であって、複合材料を形成するように、タンパク質の混合物をポリマーに接着させる工程を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態において、該方法は、溶融ポリマーを得るためにポリマーを溶融し、タンパク質の混合物を溶融ポリマーに変換する工程を含む。一般的に、溶融ポリマーを最終的な形態に変換することは、所望のポリマー−タンパク質複合材料又はマトリックスの構造が形成されるように、溶融ポリマーを冷却することを含む。
複合材料を所望の形状に成形するための例示的な方法には、溶融ポリマーの成形、射出成形、圧縮成形及び押出成形などのポリマーの当技術分野で公知の方法が含まれる。
いくつかの実施形態において、タンパク質の混合物を該ポリマーに接着させることは、以下の実施例の節に記載するように、例えば、配合することにより、タンパク質の混合物をポリマーに接着させるように、ポリマーとタンパク質の混合物とを接触させることを含む。そのような実施形態は２つの成分（すなわち、ポリマー及びタンパク質の混合物）が相互に接着している場合、又は例えば、ポリマーの唯一の接触面の局所的溶融により、タンパク質とポリマーが十分に頑強に接着し、例えば、単一の複合材料が得られる場合に有用である。
いくつかの実施形態において、該ポリマーとタンパク質の混合物を接着させることは、タンパク質を溶融ポリマーに変換し、ポリマー及びタンパク質の混合物の接触を維持することを含む。いくつかの実施形態において、該ポリマーが金型内に配置されるか、又は溶融ポリマーが成形のために配置される。
いくつかの実施形態において、ポリマー及びタンパク質の混合物を接着させることは、タンパク質の混合物にポリマーを接着させることを補助するために、少なくとも１つの接着剤（例えば、熱硬化性樹脂（ポリマー）、又は本明細書で議論した熱可塑性樹脂）を使用することを含む。いくつかの実施形態において、接着剤を使用することは、例えば、接着剤をスプレー塗装すること、接着剤を塗ること、接着剤をブラッシングすること、接着剤を堆積させること、接着剤を流し込むこと、又は２つの成分の一方若しくは両方上に接着剤のシートを敷設することによって接着剤を適用することを含む。いくつかの実施形態において、２つの成分は、その後、一緒にされ、接着剤が固化するまで、典型的には、排他的ではないが加熱することで所定の位置にしっかりと保持される。
いくつかの実施形態において、接着促進剤は、接着剤のポリマーへの接着の靭性を高めるために、ポリマーの接触表面に適用される。いくつかの実施形態において、該ポリマーは、少なくとも１つの接着促進剤を含む。いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、１以上の接着促進剤を含む。一実施形態において、少なくとも１つの接着促進剤は、溶融ポリマーに添加される。本発明の実施形態において、少なくとも１つの接着促進剤は、接着剤に添加される。いくつかの実施形態において、該ポリマーは、少なくとも１種の耐衝撃性改良剤を含む。いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、少なくとも１種の耐衝撃性改良剤を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１種の耐衝撃性改良剤は溶融ポリマーに添加される。いくつかの実施形態において、タンパク質の混合物を該ポリマーに接着させる工程は、溶解されたポリマーを得るためにポリマーを溶解し、タンパク質の混合物を溶解したポリマーに変換することを含む。
いくつかの実施形態において、該方法は、最終製品を作成するために、例えば、水溶液又は有機溶液（又は溶媒）にポリマーを溶解し、ポリマーが溶解した溶液とタンパク質とを接触させ、その後、溶媒蒸発することによって行われる（「溶媒キャスティング」と呼ばれる）。いくつかの実施形態において、該方法には溶融押出しが続く。
いくつかの実施形態において、該タンパク質の混合物は、複数のペプチドとポリマー及び水溶液とを接触させる前に、例えば、水混和性溶媒に溶解される。
いくつかの実施形態において、該ポリマー、又はポリマー及びタンパク質の混合物は、電界紡糸される。電界紡糸は、限定されないが、ナノ及びマイクロワイヤなどの様々な種類のポリマー構造の製造に適していることが知られている。本実施形態の複合材料を製造するための電界紡糸方法の１つの利点は、このような生成方法が比較的低い温度で実行することができ、そのため、該方法の早い段階でタンパク質の混合物を組み込むことができることである。別の利点は、電界紡糸ポリマーが比較的高量のタンパク質の混合物を運ぶことができるということである。
本発明の実施形態のさらなる利点は、電界紡糸方法が電界紡糸ポリマー、ひいては、本実施形態の複合材料に、伝統的な複合材料の機械的性質をはるかに超えて向上した機械的性質を提供することができる。
機械的性質は、製造方法中に制御することができるいくつかの変形に依存する。１つの変形は、ポリマーの化学的性質である。この変形は、例えば、電界紡糸方法で使用されるポリマー（複数可）の適切な選択によって制御することができる。別の変形は、例えば、電界紡糸ポリマー繊維の自由表面を変化させることによって制御することができる体液及び電界紡糸ポリマーとの間の接触面積である。
電界紡糸方法のパラメータ、例えば、電圧、射出速度及びコレクター速度は、需要に応じて調整することができる最終製品の機能を制御するのを可能にし得る。電界紡糸方法はまた、前述した医療用装置（例えば、カテーテル）をコーティングするために使用されてもよい。限定されないが、スピンコーティング、湿式紡糸、乾式紡糸、及びゲル紡糸を含む様々なコーティング方法が、開示される繊維を生成するために利用され得ることを理解されたい。
細胞の成長及び培養
一実施形態において、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせは、埋め込み型又は生体適合性の材料として、又は埋め込み型又は生体適合性の材料と共に使用される。一実施形態において、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせは、細胞増殖のために使用される。一実施形態において、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせは、細胞生存率の維持、保存及び／又は誘導のために使用される。一実施形態において、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせは、細胞死の低減及び／又は最小化のために使用されている。一実施形態において、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせは、細胞遊走の誘導のために使用される。一実施形態において、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせは、細胞接着の誘導のために使用される。一実施形態において、ポリマーの有無に関わらず、組織足場は、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態において、繊維は本明細書に記載の繊維である。
一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、生体適合性材料及び繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む組成物である。一実施形態において、生体適合性材料は、生体埋め込み型材料である。一実施形態において、生体適合性材料は、細胞又は組織と接触するように適合された材料である。一実施形態において、生体適合性材料は、細胞又は組織の生存能力を促進する物質である。
一実施形態において、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせは、骨再生を誘導するために使用される。一実施形態において、骨再生組成物又は足場は、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、（１）細胞、（２）繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む組成物である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、（１）細胞培地、（２）繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む組成物である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、（１）抗生物質、（２）繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む組成物である。
一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む創傷治癒組成物である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物である。
一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む、身体組織と接触するように適合された医療装置である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む、傷害又は手術後に共に生体組織を保持するように適合された医療装置である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む縫合糸である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせでコーティングされた縫合糸である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む創傷ケア包帯である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む滅菌パッド又は湿布である。
一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、（１）細胞、細胞培地、又はその両方、及び（２）繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む組成物である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、細胞を維持又は成長させる方法であって、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む組成物と該細胞とを接触させることを含む方法である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、多層細胞培養物をアセンブルさせる方法であって、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む組成物と細胞とを接触させることを含む方法である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、多層細胞培養物をアセンブルさせる方法であって、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む表面と細胞とを接触させることを含む方法である。
一実施形態において、本明細書に提供されるのは、事前に定義された数の細胞層をアセンブルさせる方法であって、ポリマーの有無に関わらず、事前に定義された量の繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせを含む表面と細胞とを接触させることを含む方法である。一実施形態において、ポリマーの有無に関わらず、事前に定義された量の繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせは、細胞に接触するように適合され、予め定義された厚さの表面である。一実施形態において、本明細書に記載の組成物又は方法内の細胞は、３Ｄで相互作用する。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、細胞が相互作用するセット数の細胞層の製造方法である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、細胞が相互作用し、繊維に結合するセット数の細胞層の製造方法である。
一実施形態において、「事前に定義された数の細胞層」又は「セット数の細胞層」は、ポリマーの有無に関わらず、限定されないが、細胞成長プレート又は細胞成長皿などの細胞成長表面上に塗布される繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせの量にしたがって決定される。一実施形態において、「事前に定義された数の細胞層」又は「セット数の細胞層」は、ポリマーの有無に関わらず、生体適合性材料などの細胞成長表面上に塗布される繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせの量にしたがって決定される。
一実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物によれば、１×１０３繊維／ｃｍ２〜８×１０５繊維／ｃｍ２は、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせでコーティングされた表面の少なくとも７０％又は８０％上で単一細胞層のみを維持する。一実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物によれば、１×１０２繊維／ｃｍ２〜１×１０６繊維／ｃｍ２は、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせでコーティングされた表面の少なくとも７０％又は８０％上で単一細胞層のみを維持する。一実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物によれば、４×１０５繊維／ｃｍ２〜１８×１０５繊維／ｃｍ２は、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせでコーティングされた表面の少なくとも７０％又は８０％上で２層の細胞層を維持する。一実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物によれば、８×１０５繊維／ｃｍ２〜１４×１０５繊維／ｃｍ２は、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせでコーティングされた表面の少なくとも７０％又は８０％上で２層の細胞層を維持する。一実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物によれば、１０×１０５繊維／ｃｍ２〜１４×１０５繊維／ｃｍ２は、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせでコーティングされた表面の少なくとも７０％又は８０％上で２層の細胞層を維持する。一実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物によれば、１５×１０５繊維／ｃｍ２又はそれ以上は、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせでコーティングされた表面の少なくとも７０％又は８０％上で３層以上の細胞層を維持する。一実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物によれば、１８×１０５繊維／ｃｍ２又はそれ以上は、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせでコーティングされた表面の少なくとも７０％又は８０％上で３層以上の細胞層を維持する。一実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物によれば、２０×１０５繊維／ｃｍ２又はそれ以上は、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせでコーティングされた表面の少なくとも７０％又は８０％上で３層以上の細胞層を維持する。一実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物によれば、２４×１０５繊維／ｃｍ２又はそれ以上は、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせでコーティングされた表面の少なくとも７０％又は８０％上で３層以上の細胞層を維持する。一実施形態において、多層、多細胞層又は３層以上の細胞層は、各層内で３Ｄの細胞間相互作用をもたらす。一実施形態において、多層、多細胞層又は３層以上の細胞層は、各層内及び層の間で３Ｄの細胞間相互作用をもたらす。
一実施形態において、ＳＳは、機械的に細胞を保護する。一実施形態において、ＳＳは、ＳＳに結合した細胞に機械的な保護を提供する。一実施形態において、ＳＳは、ＳＳでカプセル化された細胞に機械的保護を提供する。
一実施形態において、多層、多細胞層又は３層以上の細胞層は、各層内で３Ｄの細胞間相互作用及び３Ｄの細胞−ＳＳ相互作用をもたらす。一実施形態において、多層、多細胞層又は３層以上の細胞層は、各層内で３Ｄの細胞間相互作用及び３Ｄの細胞−ＳＳ相互作用をもたらす。
一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、（１）繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせ；（２）ラフトに接着した細胞で構成されたラフトである。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、ポリマーの有無に関わらず、（１）繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせ；（２）ラフトに接着した孤立細胞で構成されたラフトである。一実施形態において、ラフトは、細胞をカプセル化する。一実施形態において、細胞はラフトに接着している。
一実施形態において、本明細書に提供されるのは、孤立細胞を成長、維持又は増殖させる方法であって、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせと該細胞を混合することを含む方法である。一実施形態において、本明細書に提供されるのは、細胞表面接着を必要とする孤立細胞を成長、維持又は増殖させる方法であって、ポリマーの有無に関わらず、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はこれらの任意の組み合わせと該細胞を混合することを含む方法である。一実施形態において、孤立細胞を成長、維持又は増殖させる方法は、インビトロ法である。
いくつかの実施形態において、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又は任意の組み合わせは、少なくとも６個のリピート（ｎ）を必要とする。いくつかの実施形態において、繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又は任意の組み合わせは、少なくとも７個のリピートを必要とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又はそれらの任意の組合せは、少なくとも８回のリピートを必要とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の繊維、タンパク質の混合物、タンパク質の「ｍ」型又は任意の組み合わせは、６〜７０、７、８〜７０、９〜７０、１０〜７０、１１〜７０、１２〜７０、１３〜７０、１４〜７０、１５〜７０、１６〜７０、１７〜７０、１８〜７０、１９〜７０、又は２０〜７０回のリピート（本明細書で定義される「ｎ」）を必要とする。
一実施形態において、本明細書に記載の方法はインビトロ法である。一実施形態において、本明細書に記載の方法はエクスビボ法である。
総則
本明細書で使用する用語「約」は、±１０％を指す。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」及びそれらの同根語は、「含むが、限定されない」を意味する。用語「からなる」は、「含み、かつそれに限定される」を意味する。用語「実質的にからなる」は、組成物、方法又は構造が、さらなる成分、工程及び／又は部分を含むことができるが、ただし、追加の成分、工程及び／又は部分が特許請求の範囲の組成物、方法又は構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変えない場合を意味する。
単語「例示的」は「例、事例又は例示として役立つこと」を意味するために本明細書で使用される。「例示的」として記載される任意の実施形態は、必ずしも、他の実施形態よりも好ましい又は有利であると解釈されるべきではなく、かつ／又は他の実施形態からの特徴の組み込みを除外することでもない。単語「任意に」は、「いくつかの実施形態で提供され、他の実施形態で提供されていないこと」を意味するために本明細書で使用される。本発明の任意の特定の実施形態は、このような特徴が矛盾しない限り、「任意の」複数の特徴を含むことができる。
本明細書で使用する単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含む複数の化合物を含むことができる。
本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で示されてもよい。範囲形式での記載は便宜と簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲において柔軟性のない限定として解釈すべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、並びに例えば、１、２、３、４、５、及び６の範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。数値範囲が本明細書に示されているときはいつでも、示された範囲内の任意の引用された数字（分数又は整数）を含むことを意味する。語句「第１の示された数と第２の示された数の間の範囲（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲（ｒａｎｇｅ）」及び第１の示された数「から」第２の示された数「までの範囲（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲（ｒａｎｇｅ）」は、本明細書で互換的に使用され、第１及び第２の示された数並びにその間の全ての小数及び整数を含むことを意味する。
本明細書で使用する用語「方法」は、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の実施者に知られている、又はそれらの実施者によって既知の方法、手段、技術及び手順から容易に開発された方法、手段、技術及び手順を含むが、これらに限定されない与えられた仕事を達成するための方法、手段、技術及び手順を指す。本明細書で使用する用語「治療」は、病態の進行を抑止する、実質的に阻害する、遅くする又は逆転させる、病態の臨床的又は審美的症状を実質的に改善する、又は病態の臨床的又は審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
明確にするために、別々の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴はまた、単一実施形態と組み合わせて提供することができることを理解されたい。逆に、簡潔にするために、単一実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別々に若しくは任意の適切なサブコンビネーションで提供されるか、又は本発明の任意の他の記載の実施形態において好適なものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしに動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
本明細書上記で描写し、かつ下記の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態並びに態様は、以下の実施例で支援される。
実施例
材料及び方法
プラスミド：Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（＋）プラスミド中のＤＮＡ配列。ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。
制限酵素：ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｓｉＩを（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＭＡ、ＵＳＡ）から入手した。
トランスフェクション及び形質転換：バクミド及びヘルパープラスミド（Ｉｎｖｉ培地ｔｒｏｇｅｎ）を含有するコンピテント大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ細胞。ＥＳＣＯＲＴトランスフェクション試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
培地：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手したＥＳＦ９２１昆虫細胞培地、無血清、又はＧＩＢＣＯから入手したＳＦ９００ ＩＩ ＳＦＭ；無血清；ヨウ化プロピジウム（ＳＩＧＭＡ，ＩＳＲＡＥＬ）；カルセインＡＭ（Ｃａｙｍａｎ，ＵＳＡ）；及びＤＡＰＩ（ｉｂｉｄｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
イメージング：逆位相差顕微鏡、ＥＶＯＳ ＸＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。共焦点画像の場合：オリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡：。Ｍａｇｎａｆｉｒｅ ＳＰのカメラはＯｐｔｒｏｎｉｃｓ社製であった。
タンパク質混合物を形成するための実験手順
クモドラグラインシルクタンパク質の単一リピート単位をコードする配列の合成：ＡＤＦ−４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｕ４７８５６）の反復領域を構成する１５個のリピートの平均コンセンサス配列を表す３５アミノ酸長の配列を設計した。平均的なコンセンサス配列のペプチド配列は、１０５個のＤＮＡ塩基対の配列：５'−ＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＴＣＣＡＧＧＣＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＣＴＡＧＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡ−３'（配列番号１５）によってコードされるＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１４）である。上記合成ＤＮＡは、ＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（＋）プラスミドの中で得られる。該配列を、クモシルクタンパク質及び繊維の合成に使用されるスポドプテラ・フルギペルダ細胞のコドン使用に従って発現のために最適化した。
ドナープラスミドの構築：ＳｃｒｉｐｔＡｍｐＳＫ（＋）プラスミドを、Ｘｂａ Ｉ及びＸｈｏ Ｉで切り出し、Ｎｓｉ Ｉ及びＰｓｔ Ｉ制限部位と隣接し、基本リピート配列を含有する１３６塩基対の配列を単離し、バキュロウイルスドナープラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＴａのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）にクローニングした。したがって、人工の４９個のアミノ酸Ｎ末端ドメイン及び３５個のアミノ酸コアドメインをコードする基本ドナープラスミドを作製した。
単一リピートの多量体化：クモシルクタンパク質の１個のリピート（モノマー）をコードする基本モジュールには、互換性のある制限酵素部位ＮｓｉＩ及びＰｓｔＩが隣接している。最初の工程において、該モノマーを、二重制限酵素切断によって解放し、ＰｓｔＩで切断した同じドナープラスミドにインフレームで挿入する。インサートが正しいセンス配向で連結されている場合のみ、ダブル切断は二量体を放出する[２個のリピート間の制限部位をライゲーション時に排除した]。第２の工程において、二量体が放出された後、同じ方法で再挿入し、４個のリピートを有するベクターを得た。次の工程において、この手順を繰り返し、複数の合成リピートを含有するドナープラスミドを得た。使用する分子生物学ツール及び配列の反復性に起因する制約が、同一のリピートの達成可能な最大数を制限する。
下流の天然Ｃ末端ドメインの合成リピートへのライゲーション：ＡＤＦ４の１１４個のアミノ酸のＣ末端ドメインの挿入を、以下のプライマー：ＰｓｔＩ制限部位（下線）を含有する配列５'−ＡＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡ−３'（配列番号１６）を有するセンスプライマー、並びに３' ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線）をコードする配列５'−ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡ−３配列'（配列番号１７）を有するアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲを使用して行った。異なるリピート数及びＰＣＲ産物を有するドナープラスミドベクターを、ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、精製し、ライゲーションして、人工Ｎ末端ドメインの一部であるＨｉｓ６タグ、その後に様々な数の同一リピート（本発明者らが得た核酸配列の１、２、４、８、１２、１６、２０、２４、３２個のリピートを含有するコンストラクト）及び天然Ｃ末端ドメインをコードするｐＦａｓｔＢａｃＨＴａドナープラスミドを得た。
細胞培養：Ｓｆ９細胞を、ＥＳＦ９２１無血清昆虫細胞培地で、２７℃で増殖させた。Ｓｆ９細胞を、いずれか６ウェルプレートのカバーガラス上で単層として、又は１３０ｒｐｍで攪拌振盪フラスコ中のいずれかで成長させた。
組換えバキュロウイルスの生成：バクミド（バキュロウイルスシャトルベクタープラスミド）及びヘルパープラスミドを含含有するコンピテント大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ細胞を用いて、製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って組換えバクミドを作製した。バクミドへの遺伝子の挿入は、ＰＣＲによって確認した。Ｓｆ９細胞を、６ウェルプレート中のＥＳＣＯＲＴトランスフェクション試薬を用いて組換えバクミドＤＮＡでトランスフェクトした。細胞を、２７℃で５時間インキュベートし、すすぎ、さらに７２時間インキュベートした。培地を収集し、遠心分離して、ウイルスを含有する上清を２〜３回の連続感染症のために使用し、ウイルス粒子の力価を高めた。
合成ＡＤＦ−４ベースのタンパク質の発現：Ｓｆ９細胞（３×１０６個の細胞／ｍｌ）を、０.１〜１０の範囲の様々なＭＯＩ（感染多重度）で組換えウイルスを感染させた。４日後に、感染細胞を、１０分間、１６０００ｇで遠心分離することによって収集した。
ポリマーの性質強化：製品開発の方法で、いくつかの潜在的な材料を、開示されるクモシルクを用いて性質強化について試験した。目的は、産業界のニーズ及び困難さ、すなわち、より高い靭性、より高い耐衝撃性、より高い破壊靭性及びより高い応力並びに弾性係数に答えるために、特定の材料の性質を強化することである。
複合材料、熱可塑性ポリマー並びに熱硬化性ポリウレタンシート及び膜及びｐＨＥＭＡを含む生体適合性ヒドロゲル、３Ｄ印刷産業用インクジェット材料のために、エポキシ樹脂の異なる適用範囲を有する様々な材料を使用した。
試験材料のリスト：
１．エポキシ樹脂：（ａ）ポリマーＧｖｕｌｏｔによるＥＰ−５２０；及び（ｂ）ポリマーＧｖｕｌｏｔによるＥＰ−５０２
２．熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）：（ａ）ＬｕｂｒｉｚｏｌによるＴｅｃｏｆｌｅｘ（登録商標）ＳＧ−９３Ａ；（ｂ）ＬｕｂｒｉｚｏｌによるＥＧ−７２；及び（ｃ）ＨｕｎｔｓｍａｎｎによるＰＥ３９９
３．熱硬化性ポリウレタン（ＰＵ）：（ａ）ポリマーＧｖｕｌｏｔによる−２０４７
４．ＰｏｌｙＲａｍにより供給されるパレットの形態のナイロン１２
５．ＡＲＡＮにより供給される粉末の形態のナイロン１２
６．Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社により供給されるｐＨＥＭＡ
７．Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社により供給されるＢｕｔｖａｒ（Ｂ−９８）
８．Ｋｕｒａｒａｙにより供給されるＥＶＯＨ（ＥＶＡＬ Ｆ１０１Ｂ）
９．ＮａｔｕｒｅＷｏｒｋｓ ＬＬＣにより供給されるＰＬＡ（２００３Ｄ）
１０．ＣＡＰＡ ８０ Ｐｅｒｓｔｏｒｐにより供給されるＰＣＬ（ＣＡＰＡ ８０）
１１．Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈにより供給されるＰＣＬ（８０Ｍｎ）
１２．Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇにより供給されるシリコン−シルガード１８４
１３．Ｓｔｒａｔａｓｙｓにより供給されるＶｅｒｏＣｌｅａｒ−アクリル系ＵＶ硬化インクジェット
溶媒鋳造、金型鋳造、溶媒電界紡糸及び溶融配合を含む試料調製及び分析のためのいくつかの処理技術を試験した。
実施例１
エポキシ樹脂を含む複合材料
二成分系を複合材料のマトリックスとして試験した。目的は、系全体の良好な機械的性質を可能にするために、マトリックスの性質を改善することである。カスタムメイドのＰＴＦＥ金型を材料調製のために使用した。
エポキシベースの二成分系についての実験：
例示的な手順において、パートＡ−樹脂ベース及びＢ−硬化剤を製造業者の推奨に従って秤量した。クモシルク（「ＳＳ」、本明細書全体を通して「ＳＳＳ」とも呼ばれる）繊維を、０、１％及び２％ｗ／ｗの異なるローディング比率で秤量し、金型に注いだ。硬化プロファイルを、室温で２４時間、その後、８０℃で３時間であった。被検査物を金型から取り出し、試料の引張強度、弾性率、歪み及び破壊までの仕事量のエネルギー（ｗｏｒｋ ｔｏ ｆａｉｌｕｒｅ ｅｎｅｒｇｙ）について、引張試験機による機械的性質について試験した。各試験セットは、統計データを確立するために、５〜６種の被検査物からなっていた。
ポリマーＧｖｕｌｏｔによるエポキシＥＰ−５２０：ヤング率は約１０％改善（上昇）した（図１）。繊維マトリックスの接着は、（図２左パネルのＳＥＭ像に示されるように）不良であると思われる。しかし、場合によって、繊維の周囲に空洞を有するより良好な接着が検出された（図２右パネル：３.１６５μｍの長さ及び約２１５ｎｍの直径を有するＳＳ繊維を示す）。
異なる解像度かつ１０〜３０ｋｅＶの異なる電子加速速度で、ＦＥＩ顕微鏡で測定を行い、ＨＲＳＥＭモードを、繊維の長さ及び直径のより良好な視覚化並びに測定のために使用した。
エポキシ−ＥＰ−５０２：機械的試験（引張強度、ヤング率、及び降伏点；ＳＳでの１％補強）の結果を図３（１％のＣＮＴ補強とも比較した）に示し、以下の表１にまとめる。
Figure 2019510541
曲げ結果：追加の例示的な手順において、曲げ実験を、対照及び１％補強試料にて試験した。
被検査物の型寸法は６３.５×１２.７×１３.１ｍｍであった。
結果を、とりわけ、向上した曲げのヤング率、及び１％補強被検査物の破壊までの作業量の減少を示す以下の表２４にまとめる。
Figure 2019510541
実施例２
熱可塑性及び熱硬化性ポリウレタン（ＰＵ）を含む複合材料
いくつかのポリウレタンを試験した。引裂抵抗及び引張強度の改善を評価した。熱硬化ＰＵは主に二成分系であり、熱可塑性ＰＵは、シート状又はペレットで供給され、ＳＳ繊維が添加された有機溶媒に溶解した。溶液を金型にキャストし、蒸発させた。
熱可塑性ポリマーのための例示的な実験手順：
供給されたシートを、溶解速度について試験するために、いくつかの有機溶媒に溶解した。溶解はまた、最終被検査物から生成された最終の機械的性質に影響を与えた。調製方法は、全ての試料について均一であった。
ＨＵＮＴＳＭＡＮからのＰｅ−３９９（脂肪族ポリウレタンポリマー）を、１，４−ジオキサン中に１０重量％溶解させ、次いで、２４時間蒸発させた。蒸発が終了した後に、膜を幅８ｍｍ、長さ８０ｍｍの薄片に切断し、引張試験機で延伸した。ＡＳＴＭ Ｄ−８８２に係る引張試験。試料寸法は、長さ７ｃｍ及び幅０.８ｃｍの薄片であった。
図４Ａ〜Ｄは、ヤング率（図４Ａ）、３０％伸長での応力（図４Ｂ）及び３０％伸長での靭性（図４Ｃ）、１００％伸長での応力（図４Ｄ）及び１００％伸長での靭性（図４Ｅ）を含む引張試験結果を表す。各グラフの挿入図に示されるように、全てを対照及びＳＳ補強膜にて行った。結果を平均±ＳＤとして表す（各条件に対してｎ＝５個の同じ膜からの異なる薄片）。
図５Ａは、ＳＳで補強した後の引裂強度の結果を表し、各バーは１つの被検査物からの結果を表す。図５Ｂは、対照、３％及び５％の補強膜を示す典型的な引裂試験グラフを表す。
繊維は、ドープ溶液及び硬化膜に完全に分散している（図４Ａ及び図４Ｂ参照）。図４Ａに見られるように、ヤング率は３４％〜１５０％増加しており、３０％及び１００％伸長時の応力並びに靱性挙動も同様に大幅に増加している（図４Ｂ〜Ｅ）。図５Ａ〜Ｂに見られるように、引裂強度及び破壊靭性は、膜における繊維濃度の増加につれて用量依存的に４０〜１０５％増加している。
ＬｕｂｒｉｚｏｌからのＴｅｃｏｆｌｅｘ（登録商標）ＳＧ−９３Ａ（脂肪族ポリエーテルベースの熱可塑性ポリウレタン）を、いくつかの溶媒：ＴＨＦ、トルエン、クロロホルム及びジオキサンに１０％ｗ／ｖ溶解し、次に、２４時間蒸発させた。その後、膜を幅８ミリ及び長さ８０ｍｍの切片に切断し、引張試験機により延伸した。
引裂試験結果：結果を図６Ａ〜Ｃに示し、ヤング率及び引裂強度は増加した。
熱硬化性ポリウレタンの例示的な実験手順：
Ｕ−２０４７の二成分ポリウレタン化合物−ベース（パートＡ−ポリオール）及び硬化剤（パートＢ−ＨＤＩ）。ポリマーＧ−Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ Ｓｕｃｃｅｓｓによって提供される。２成分の調製は製造業者の指示に従う。繊維補強の場合、繊維を、パートＢと混合する前にパートＡと混合した。混合物を、脱気するために、１０００ＲＰＭで４分間遠心分離し、次いで、さらに脱気するために、１００ｍＢａｒで７分間吸引した。硬化プロファイルは、室温で２４時間、その後、８０℃で３時間、後硬化した。実験を以下のバッチ：対照、１％、２％及び３％ＳＳバッチを用いて行った。性質の改善が、測定した全４つのパラメータで観察され、ＬＬＯＹＤ引張試験機で試験した。
結果を図７及び８に示し、ヤング率、引張強度、破断時の歪み、及び破壊までの仕事量の改善率を示す以下の表３にさらにまとめる。
Figure 2019510541
引裂試験：例示的な手順において、ズボン引裂試験方法を、ＡＳＴＭ Ｄ−１９３８プロトコルに従って行った。
材料：「ポリマーＧ株式会社」によって供給される熱硬化性ポリウレタン２０４７。被検査物の寸法は、６０ｍｍ×２０ｍｍ×０.８ｍｍであった。例示的な手順において、２つの対照の被検査物（１％添加被検査物）を使用した。結果を、添加した被検査物の引裂強度が２４４％改善したことを実証する以下の表４Ａ〜Ｂに示す。
Figure 2019510541
Figure 2019510541
実施例３
配合及び射出成形によって生成されるナイロンを含む複合材料
ナイロン６、ナイロン６，６及びナイロン１２の使用は業界で普及している。クモシルクでナイロンを補強することにより、機械的性質の有意な改善が示された。最初の試験を、受け取ったままのペレットで行った。これは、大きなペレットが完全に溶融せず、ＳＳとの十分な混合が達成されなかった時に、混合相で問題を引き起こした。さらなる試験を、ナイロン１２の微粉末形態で実施した。例示的な手順において、配合をＤＳＭ Ｘｐｌｏｒｅツインスクリューマイクロ配合機（ＤＳＭ，Ｈｅｅｒｌｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で行った。調製手順は次の通りである：直径約１００μｍのフィラメントを、マイクロ配合機を用いて取得し、機械的性質について試験した。５つの被検査物を試験した。
結果を図９Ａに示し、２％、４％繊維補強の機械的性質の改善及びＣＮＴ比較（ヤング率、１５０％の伸長時の応力、及び降伏点）を以下の表５に示す。
Figure 2019510541
示された補強の割合が４％であっても、効果的な添加の割合はそれより低いことは注目に値する。生成工程中、繊維の一部は、配合のフィーダに残った。さらに、複合材料の強度への寄与が減少するにつれて、複合材料中の繊維は凝集した。実際の補強の割合は約２％であると想定される。
図９Ａは、直径１４０及び２５０μｍ（押出による２％の補強）の繊維とナイロン１２の応力−歪み測定値を示す。図９Ｂは、ＳＳ繊維が約１２０ｎｍ〜１８０ｎｍの直径を有することを示す、２％補強時のナイロン１２の繊維の断面の代表的なＳＥＭ像を示す。クモシルクがよく接着されているいくつかの点を見ることができ、図９Ｂの中央パネルは、ポリマーマトリックスに浸漬した伸長時の繊維を示す。
ナイロン１２も、ＨａｋｋｅによるミニジェットＰｒｏシステムを用いる射出成形を用いて製造した。ドッグボーン被検査物を、ナイロン１２の微粉末を用いて注入した。２％ＳＳ補強試料を、引張試験機システムにおける評価のために調製し、その結果を図９Ｃ〜Ｅに示す。
さらなる手順において、以下のパラメータに従って、配合を、ポリ乳酸（ＰＬＡ；直径１３０μｍ）を用いて行った：
Figure 2019510541
結果を、２％ＳＳ補強ＰＬＡ試料の応力−歪み曲線の改善を示す図９Ｆに示す。
実施例４
電界紡糸によるクモシルクでの被覆
電気紡糸は、有機溶媒に溶解されたポリマー及び繊維の電界加速によって、非常に細いワイヤを生成することができる方法である。この方法は、３０キロボルトの電圧で負に帯電した、集電装置に向かう内容物の加速によって、溶媒の急速蒸発によって機能する。高電位差は、集電装置に向かうポリマー及び溶媒の液滴内容物を引き寄せる電界を形成し、溶媒は急速に蒸発し、ポリマーは集電装置上で固化し、システムの設定パラメータに従ってナノからマイクロの繊維の形成を可能にする。
例示的な手順において、直径１〜１０μｍの複合繊維を生成した。試験したポリマーマトリックス：ＴＰＵ（熱可塑性ポリウレタン）及びＰＣＬ（ポリカプロラクトン）；並びにいくつかの補強の割合を、得られる多孔度及びメッシュの厚さを変化させて試験した。ＴＰＵ補強：ＳＧ−６０、ＴＰＵはＴｅｃｏｆｌｅｘから購入し、そのまま使用した。
ドープ溶液の調製：例示的な手順において、ＴＰＵ（ＳＧ６０Ｄ）を、ＤＭＦ及びＴＨＦ（７：３（ｗ／ｗ））の混合物に溶解し、９、１１、又は１３％（ｗ／ｗ）の溶液を得た。各構成を１、２、又は３％のクモシルクの割合で補強し、１２の構成のマトリックス試験を構築した。
紡糸工程：例示的な手順において、対照溶液の設定は、ｉ．流速０.９ｍＬ／時；ｉｉ．静電場約１.２ｋＶ／ｃｍ；ｉｉｉ．温度２６℃；ｉｖ．湿度約６０％；及びＶ．紡糸口金（針２３Ｇ）。
例示的な手順において、補強溶液の設定は、ｉ．流速０.９ １．２ｍＬ／時；ｉｉ．静電場約１.２ｋＶ／ｃｍ；ｉｉｉ．温度２６℃；ｉｖ．湿度約６０％；及びｖ．紡糸口金（針２３Ｇ）。
機械的性質の評価：電界紡糸マットを、５００Ｎのロードセルで、Ｌｌｏｙｄ社製の引張試験機を用いて、室温で引張試験により調べた。試料は、長さ約２０ｍｍ、幅５ｍｍ、及び厚さ０.１５ｍｍであった。応力−歪み曲線を１ｍｍ／分の延伸速度で記録した。応力を次式に従って試料の有効面積に応じて算出した：
σ ＝ Ｆ／（Ａ・ρｍａｔ／ρｂｕｌｋ），
式中、Ｆは測定された力であり、Ａは測定断面であり、見掛け密度はρｍａｔ／ρｂｕｌｋであり、ρｂｕｌｋはデンプンタップ粉体（ｓｔａｒｃｈ ｔａｐｐｅｄ ｐｏｗｄｅｒ）密度であり、ρｍａｔは繊維マット密度である。
ドープ溶液のレオロジー：溶液のレオロジーをｒｈｅｏｍｅｔｅｒ ＴＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ２によって調べた。
ＰＣＬ補強：ＰＣＬ、８００００ Ｍｎをｓｉｇｍａから購入し、そのまま使用した。
例示的な手順において、ＣＨＣｌ３：ＤＭＦの６：４の比で溶液を作製し、以下のもの：対照−１０ｗ／ｗのＰＣＬ、９．７５のＰＣＬと０.７のクモシルク、９．５のＰＣＬと１．３３のクモシルク、又は９．２５のＰＣＬと１.７７のクモシルク（数字はポリマー個体に関して重量％を示す）を調製した。電界紡糸設定は、ＳＧ６０Ｄについて上記と同様であった。
ＴＰＵの結果：
電界紡糸方法：電界紡糸方法は、繊維の平均直径が０.８μｍであるＴＰＵ １２％（ｗ／ｗ）安定方法、及び繊維の平均直径が３.０μｍであるＴＰＵ １６％（ｗ／ｗ）安定方法をもたらした。補強溶液は粘度が高すぎることが判明したので、約１０.５％に希釈した。
図１０は、対照バッチとしての１１％（ｗ／ｗ）のＴＰＵの電界紡糸繊維を示す。図１１は、約１０.５％（ｗ／ｗ）のＴＰＵ＋約２％（ｗ／ｗ）の賦形剤の静電紡糸繊維を示す。図１２は、９、１１、１３％ｗ／ｗのＳＧ−６０固形分での対照バッチのレオロジー挙動を示す。図１３Ａ〜Ｂは、ＳＧ−６０に添加する賦形剤の量を増加させた時に、粘度が増加しても、レオロジー挙動は影響を受けないことを実証する。
機械的性質の結果を、ヤング率の改善を示す表６にまとめる。

Figure 2019510541
図１４は、ヤング率の結果を示し、左側の画像は９％のＴＰＵ固形分のヤング率の結果を示し、ＳＳの２％及び３％添加時に有意な補強に達することがわかる。右側の画像は、１１％のＴＰＵ固形分のヤング率の結果を示し、ＳＳの２％添加時に有意な補強に達することがわかる。
応力−歪み曲線をさらに本明細書に示す。図１５は、９％ｗ／ｗ構成の応力−歪み曲線を示す。
図１６は、１１％ｗ／ｗの構成の応力−歪み曲線を示す。
図１７は、１１％ｗ／ｗの構成の弾性領域の拡大画像を示す。弾性領域において、補強メッシュはシフト後により高い値を有し、対照メッシュはより高い値を有する。
ＰＣＬ結果：ＰＣＬ電気紡糸試験の結果を、ＰＣＬ電気紡糸試験についての以下の表７にまとめる。
Figure 2019510541
応力−歪み曲線をさらに本明細書に示す。図１８は、１.３３％のクモシルク補強が最良の結果をもたらしたことを実証する、ＰＣＬ電界紡糸バッチについての応力−歪み曲線を示す。図１９は、ＰＣＬ電界紡糸の結果の統計を示す。
溶媒系、極性、繊維の溶解及び蒸発：繊維は、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、濃硫酸又はメタ−クレゾールに可溶性である。これは、強い水素結合と密な結晶繊維形態によるものである。実験データに基づいて、繊維を完全に溶解させるのに使用するために選択した溶媒は、その高い蒸気圧及び極性により、電界紡糸に優れた担体にさせるＨＦＩＰである。完全溶解後、試料を、Ｌｕｅｒ ｌｏｃｋ ２２Ｇ針と連結させたシリンジに入れた。
シリンジポンプ速度：シリンジポンプ速度を、０.００１〜１.０ｍｌ／分の範囲の間で調べた。例示的な手順において、ＨＦＩＰの４〜５％（ｗｔ／容量）の凍結乾燥繊維の溶液を作製した。溶解方法は、溶解し、清澄な粘性溶液を形成するのに２時間程度かかった。次いで、体積が減少し、濃度が８〜１３％（ｗｔ／体積）になるまで、ＨＦＩＰをフード内で蒸発させた。電圧を３０ｋＶに設定した。
追加の例示的な手順において、繊維溶液を電界紡糸し、最初にアルミニウム箔又は回転マンドレル上で収集されるメッシュを形成させた。次に、医療装置上のコーティング実現可能性を実証するために、繊維をステント上で収集した。２種類の繊維溶液を作製した。規準繊維は、ＨＦＩＰに溶解させたカイコ（ＢＭ）繊維であり、他方は、生成後に凍結乾燥させ、電界紡糸のためにＨＦＩＰに再溶解した合成のクモシルク（ＳＳ）繊維であった。
図２０は、ナノメッシュを形成するナノ繊維でコーティングしたバスケット（折り畳まれたまま、動脈に挿入される薄い中空ダクトから出る）を示す写真画像を示す。コーティングを、記載したステント上にカイコの繊維を用いて行った。
図２１は、ナノメッシュを形成するナノ繊維でコーティングしたバスケットを示す光学顕微鏡画像を示す。
追加の例示的な手順において、コーティング技術を、バスケットロッドをコーティングするためにクモシルク（ＳＳ）溶液を用いて適用した。図２２に示すように、マイクロコーティングを、電気紡糸コーティング技術を用いて形成し、光学顕微鏡で見ることができるように、コーティングはナノ繊維で構成されている。
追加の例示的な手順において、繊維ＨＦＩＰ溶液中でステントを浸漬コーティングする別の手法を調べた。
図２３は、ステント全体をコーティングする均一な薄膜を実証する、ＢＭ ＨＦＩＰ溶液中のバスケットのディップコーティングを用いる膜コーティングステントを示す。
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析：基準の電界紡糸は、ＨＦＩＰに溶解したカイコ（ＢＭ）繊維であり、他方は、生成後に凍結乾燥させ、電界紡糸のためにＨＦＩＰに再溶解した合成のクモシルク（ＳＳ）繊維であった。高分解能走査型電子顕微鏡（ＨＲ−ＳＥＭ；Ｓｉｒｉｏｎ,ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ,Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、コーティング表面形態を分析した。ＨＲ−ＳＥＭ顕微鏡写真を、ポリマー試料について３〜７ｋＶの電圧範囲を用いて撮影した。分析前に、試料を、帯電を防止するために、約１０ｎｍの金／白金層を形成させるために、６０秒間スパッタコーティングした。超高空間分解能は、構造及び高分解能分析の両方に使用した。エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＡＸ）測定を、電子顕微鏡内で生成された特徴的なＸ線の値を検出するために微量分析に使用した。顕微鏡写真を、以下の図：カイコについては図２４に、及び合成のクモシルク繊維については図２５に示す。以下の表８は、ＳＥＭ顕微鏡写真を用いて測定し、測定繊維直径をまとめたものである。
Figure 2019510541
ＨＲ−ＳＥＭ分析から、両方の材料は均一な繊維の形成を可能にすることが実証された。ＢＭ繊維は、より厚く、２０５±１６６ｎｍの平均直径を有し、ＳＳ繊維は５４±３８ｎｍの平均直径を示す。ＳＳ繊維メッシュは、高密度小直径の繊維で構成され、様々な用途のために高性能で機能することができる。
この技術は、ステント及びメッシュのための繊維コーティングを作るために利用することができ、コーティングに効率的なツールであり、溶液から繊維をリメイクし、表面への良好な接着を示すと結論付けることができる。成果はｎｍスケールの厚さの繊維であり、繊維密度は様々な用途に有益なコーティングを行うのに十分に高い。これは、繊維の機械的性質がＨＦＩＰ可溶化中に損傷され得るので、そのような装置のコーティングにとって、電界紡糸繊維の複合材料はＨＦＩＰに溶解した純粋なＢＭシルク又はＳＳよりも有益であることに留意されたい。
実施例５
ＢＵＴＶＡＲ、ＥＶＯＨ、ＰＨＥＭＡ、及びＵＶ硬化型アクリル酸製剤を含む複合材料
合成繊維の機械的性質を特徴付けるために、合成繊維により補強されたポリマーマトリックス試料を調製した。研究のために選択したポリマーマトリックスは、
・ｐＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルメタクリレート）
・ポリビニルブチラール樹脂（ＢＵＴＶＡＲ Ｂ−９８）
・Ｖｅｒｏ Ｃｌｅａｒ（Ｓｔｒａｔａｓｙｓから供給されるＵＶ硬化インクジェット材料）
であった。
繊維を、ポリマー溶液、及び重合により硬化させた溶液に分散させた。試料を、０〜５％の様々な補強率で補強した。硬化後、試料を、長さ８０ｍｍ、幅８ｍｍ、及び厚さ０.９ｍｍの薄片にスライスした。ＶｅｒｏＣｌｅａｒ試料を、２枚のガラス板の間に保持された金型に注入した。ＵＶ硬化方法を、１０〜１５分の硬化時間、１５０Ｗの水銀灯により行った。硬化後、試料を型から離し、長さ８０ｍｍ、幅８ｍｍ及び厚さ１〜２ｍｍの薄片にスライスした。試料を、（必要な変更を加えたＡＳＴＭ Ｄ６２８によるインストロン４５０２）引張試験機により延伸した。結果を以下の表９Ａ〜Ｅに詳述する。

Figure 2019510541
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Figure 2019510541
Figure 2019510541
Figure 2019510541
ヤング率を、Ｖｅｒｏ Ｃｌｅａｒ結果をもとにして、混合物のルールに従って計算する：
Figure 2019510541
マトリックス中の繊維のランダム分散のため、１％補強により、約０.７％のみが張力軸に寄与すると仮定することができる。それによると、計算は次のようになる：
Figure 2019510541
繊維のヤング率について得られた値は、１４ ＧＰａである。
図２６は、ｐＨＥＭＡ中の繊維の凝集体を示す。図２７は、ＶｅｒｏＣｌｅａｒ ２％補強の繊維を示す。図２８は、凍結乾燥繊維のＳＥＭ像を示す。図２９Ａ〜Ｃは、試料基準のＶｅｒｏＣｌｅａｒ補強の動的機械分析（ＤＭＡ）を示す（貯蔵率対温度）。グラフは、タンデルタグラフのピークに見られるような、約３°のガラス遷移のシフトを示す。全体的に同じ挙動が少ない補強量から導かれる。全体的な改善率は補強から導かれる。
実施例６
合成繊維の架橋
さらなる例示的な手順は、織物の最終的な性質がスレッド、ケーブルなどに製織できるようにするために、クモシルクに基づいて、より長い連続繊維を作成することを目的とした。方法は、異なるｐＨレベルの無機緩衝剤ベースの溶液中で架橋剤を用いる湿式化学に基づく。繊維を分散用緩衝液に添加し、次いで、架橋剤を添加する。ｐＨレベル、架橋剤の濃度、温度、インキュベーション時間などの方法のパラメータは、達成される架橋の程度に影響を与える。様々な注入速度での注入方法などの方法のパラメータは、開発される繊維生成のための連続方法を作るために、架橋剤が繊維と接触するのを可能にする。湿式紡糸、乾式紡糸、ゲル紡糸のような方法をベースとする紡糸口金である他の方法も、繊維生産のための生成方法として使用することができる。以下の架橋剤は水系反応に利用され、いくつかは以下に詳述する有機溶媒を用いて行われる。
ＥＤＣ／ＮＨＳを用いる例示的な手順：
材料：ＥＤＣ（１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩）；ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）；結合緩衝液：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１００ｍＭのナトリウム；リン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７.２；及び活性化緩衝液：０.１ＭのＭＥＳ、０.５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６.０。
方法：典型的な手順において、架橋のためのタンパク質の混合物を、活性化緩衝液に約５ｍｇの量を浸漬することによって調製した。次いで、ＥＤＣ及びＮＨＳを緩衝液に添加し、アミド結合をもたらす基とアミン反応を可能にする反応性エステル基を作成した。結合緩衝液をこの緩衝液に添加し、ｐＨ及び反応の効率を増大させた。反応時間は、室温（２５℃）で１０分であった。
結果：架橋及び凝集が類似の挙動につながる可能性があるので、対照バッチを調製し、同様に調べた。凝集体は、ボルテックス又はスライド上の小さな衝撃で破壊することができるが、架橋されたタンパク質は安定なままであった。
図３０は、反応前の活性化緩衝液中の繊維の顕微鏡検査を示す（バーは４００μｍである）。図３１は、反応１０分後の、結合緩衝液中の繊維の顕微鏡検査を示す（バーは４００μｍである）。図３２は、３０分後の結合緩衝液中の繊維の顕微鏡検査を示す（バーは４００μｍである）。図３３は、活性化緩衝液中でボルテックス操作した後の顕微鏡検査を示す。繊維の形状及び大きさに変化は観察されなかった（バーは４００μｍである）。
実施例７
共有結合コーティング
材料及び方法：

Figure 2019510541
基材の表面を共有結合させたクモシルクでコーティングした。例示的な手順において、シリコン表面を、ピラニア溶液によって、続いてアミン基係留用３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）処理で活性化した。例示的な手順において、３０ｍｌのＨ２ＳＯ４ ９８％と１０ｍｌのＨ２Ｏ２（３０％）をゆっくり混合することにより、ピラニア溶液を調製した。表面をピラニア溶液処理のために３０分間浸漬し、表面を活性化し、次いで、再蒸留水（ＤＤＷ）で洗浄した。水滴試験により表面活性化を試験した。
ＡＰＴＥＳ表面処理：溶液を以下の処方：６８.２５ｍｌのエタノール；３.７５ｍｌのＤＤＷ；３ｍｌの酢酸により調製した。スライドを浸漬する直前に、２ｍｌのＡＰＴＥＳを加えた。表面を、溶液処理のために浸漬し、その後、真空オーブンに６０℃、１００ミリバールで２０分間入れ、真空オーブンに１２０℃、１００ミリバールで１時間入れ、次いで、エタノールで洗浄し、乾燥させ、オーブンに戻した。以下に記載するように、その後、追加の例示的な手順において、基材の表面を再蒸留水（ＤＤＷ）に入れた。
水相繊維ドープ溶液：１０ｍｇのクモシルク繊維を、５ｍｌのＰＢＳ ０.１Ｍ緩衝液に入れた。３枚のスライドを、連続的に攪拌しながら３０分間浸漬した。
有機相繊維ドープ溶液：１０ｍｇのクモシルク繊維を、５ｍｌのＤＭＳＯに入れた。３枚のスライドを、連続的に攪拌しながら３０分間浸漬した。
架橋水相溶液：５ｍｌのＭＥＳ０.１Ｍ＋０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６を、２００ｍｇのＥＤＣ及び１３０ｍｇのスルホＮＨＳに加えた。
ＥＤＣ、ＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳを室温まで平衡化してから、容器を開けた。３枚のスライドを、連続的に攪拌しながら一晩浸漬した。
架橋有機相溶液：５ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、５０ｍｇのＣＤＩを加えた。ＣＤＩを室温まで平衡化してから、容器を開けた。次いで、３枚のスライドを、連続的に攪拌しながら一晩浸漬した。
図３４は、コーティングしたシリコンの顕微鏡画像を示す（左に有機相、右に水相）。図３５は、コーティングしたシリコンの詳細な顕微鏡画像を示す（左に有機相、右に水相）。
実施例８
ＥＳＥＭ中のＳＳの湿潤研究
材料及び方法：いくつかの試料を調製した：凍結乾燥ＳＳ繊維をエタノールに分散させ、スライドガラス上に置き、風乾した。凍結乾燥ＳＳ繊維を、カーボンテープ上に広げた。凍結乾燥ＳＳ繊維を石英シート上に広げた。対照実験として、セルロース繊維をエタノールに分散させ、スライドガラス上に置いた。
測定をＦＥＩ Ｑｕａｎｔａ ２００Ｆ ＥＳＥＭで実施し、真空チャンバに入れる際に、水滴を試料の周りに広げた。チャンバ圧力を増加させることによって、水を蒸発させ、試料ホルダー上で濃縮し、動的湿潤挙動を測定するのを可能した。
結果：高空間分解能での湿潤性試験のための２つの主な撮像法は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）及び環境走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）である。ＡＦＭは、数分の時間分解能に限定される、固体表面上でのナノスケールの液滴の水和性試験を提供するが、ＥＳＥＭによる湿潤試験は、通常、１秒の時間分解能でバルク表面上でのミクロンサイズの液滴に制限される。
滑らかで織り目加工されたバルク表面上のＥＳＥＭでのインサイツ凝縮及び蒸発実験は、静的接触角、並びに電子−被検査物相互作用によって反射される二次電子の分析による遅角及び前進角を提供する。
ＥＳＥＭは、インサイツ液滴凝縮の前後に、高い空間分解能及び繊維材料の粗い表面の特徴付けに必要とされている、数十ミクロンの視野の比較的大きい深さを提供する。試料の近傍にいくつかの水滴を滴下し、チャンバ圧力を増加させることによって、小さな表面上の接触角の測定を可能にする測定の間に、試料上の水を凝縮させることができる。水滴の視野角は、滴の形状及び角度を正確に解析するのに重要である。しかし、十分な滴が、変化を研究することができる計算のために使用されるときには、液滴は量が等しくない。
正しく接触角を計算するために、画像の角度は、正確に滴上ではなく、側面視される。また、必ずしもそうではないが、滴の球形状を含むいくつかの仮定が考慮される。
図３６に示すように、動的湿潤におけるＳＳの挙動を研究するために設定した時に、繊維表面上に液滴が形成されていないことが観察され、試料ホルダー中の凝縮水を吸収する「スポンジ」として作用する繊維の非常に小さな湿潤角又は吸湿性挙動のいずれかが示唆される。図３６の各行は、時間が進むにつれて、液滴のサイズの増加を確認できる異なる時間線を表す。いくつかの観察結果が見つかった：滴が繊維の表面に達すると、それらはすぐに壊れ、繊維を濡らす。結露が、いくつかの画像に見られるように繊維上ではなく、基材表面上に生じ、繊維のいずれかが水滴を吸収しているか、又はそれらの量があまりに多すぎるために、ＳＳのナノフィラメントベース構造上に凝縮されないという結論に至る（図３７参照）。時間が進むにつれて、水は繊維に到達し、繊維の周りに集まり、完全な浸漬が得られるまで、より暗い外観をもたらす（図３８参照）。図３９に見ることができるとおり、同様の挙動がセルロース対照について観察され、同じ結論に至る。湿潤段階でのセルロースの同様の挙動は、多孔性構造が湿潤角を測定することが困難であるという結論と一致する。しかし、図３８及び３９に示されるように、セルロース繊維はそれらの周囲の白いハローを収縮するが、ＳＳ繊維はより暗い領域として見られる水を吸収した。この湿潤実験によって、ＳＳ繊維が、セルロースと比較して、水吸収に対して非常に高い親和性を有する「スポンジ状」繊維であることが示される。
実施例９
クモシルク上での３Ｄ細胞成長の評価
例示的な手順において、クモシルク上での３Ｄ細胞成長の評価を、いくつかの態様：コーティングしていない培養皿及びコラーゲンコーティングした培養皿上での形態、接着、増殖及び細胞の２Ｄ成長比較で実施した。
材料、装置及び消耗品：
Figure 2019510541
Figure 2019510541
培養Ｌ９２９及び他の細胞：例示的な手順において、Ｌ９２９を、１０％ ＤＨＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０.１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び０.２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンを補充したＭＥＭ−ＮＥＡＡ培地で培養した。
酵素消化による培養フラスコ皿からの細胞の除去：例示的な手順において、培地を、血清ピペットを用いてＴ７５フラスコで培養した細胞から除去し、廃棄した。細胞単層を４ｍｌのＰＢＳで洗浄し、血清を除去した。２ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡを細胞単層へ加え、全面を覆うようにフラスコ回旋した。細胞が剥離するまでフラスコを５〜１０分間インキュベーターに戻した。細胞を１０ｍｌの新鮮な血清含有培地で再懸濁し、トリプシンを不活性化し、血清ピペットで５回粉砕して、細胞を互いに分離した。
５０μｌの細胞を、５ｍｇ／ｍｌのトリパンブルー５０μｌと混合し、１０μｌの混合物を血球計数器に入れた。細胞の大部分が分離し、生存率が９５％超であることを確認した（死細胞はトリパンブルー染色の取り込みにより、生細胞と区別される）。次いで、細胞を計数した。
クモシルク（ＳＳ）コーティングプレート上への細胞の播種：
９６ウェルプレート：細胞を、２００，０００個のＬ９２９細胞／ｍｌの密度まで新鮮な培地で希釈した。２００μｌの細胞懸濁液を、指定のウェルに加え、５％ＣＯ２、加湿した３７℃のインキュベーターに入れた（最終播種濃度：４０，０００細胞／ウェル）。
２４ウェルプレート：細胞を、２４０，０００個のＬ９２９細胞／ｍｌの密度まで新鮮な培地で希釈した。１ｍｌの細胞懸濁液を、指定のウェルに加え、５％ＣＯ２、加湿した３７℃のインキュベーターに入れた（最終播種濃度：２４０，０００細胞／ウェル）。正常な細胞成長のための対照として、細胞をコラーゲンコーティング又は非コーティングプレートに同じ濃度で播種した。
培養物を１０日まで成長させた。強力に接着した細胞の長期培養のために、細胞培地を２〜３日ごとに半交換した。プレートを傾け、古い培地の半分を非常に慎重にピペットチップで吸引して廃棄した。等量の新鮮な培地を各ウェルに加えた。
ＳＳ上での細胞の３Ｄ成長の評価：
細胞を、ＳＳ境界線上に播種し、横方向だけでなく３次元構造で成長させ、生存可能な細胞クラスターを形成させた。培養物の成長及び形態を、倒立顕微鏡を用いて毎日検査する。細胞を、異なる倍率及び異なる焦点面で顕微鏡を用いて観察する。培養皿の底から開始し、ダイアルをゆっくり回し、より高い平面に焦点を合わせる。ＳＳ上に播種した細胞によって形成されたクラスターがいくつかの焦点面上に見られ、各焦点レベルで異なる細胞の輪郭を明らかにする。
これらの実験から得られた結果は、コラーゲンが細胞の単層の成長を支持しながら、ＳＳが細胞の２〜５層の成長を支持すること（図４０Ａ、４０Ｂ及び図４１Ａ〜Ｂ、４２参照）、プレートに添加されるＳＳの厚さに依存すること（図４３Ａ〜Ｃ）を示した。このように、本システムは、相互作用する細胞の設定された数の層の事前製作を可能にする。具体的には、１〜６×１０５繊維／ｃｍ２で覆われたプレートが単層のみを支持し、１２×１０５繊維／ｃｍ２が細胞の２層（層の少なくとも８０％が２層で構築された）の成長を支持することが示されている。２４×１０５繊維／ｃｍ２は細胞の平均３.７層（層の少なくとも８０％が３〜４層で構築された）の成長を支持した。再び、これらの設定で、コラーゲンコーティングしたプレートは、添加したコラーゲンの厚さに関わらず、単層のみをもたらした（データは示さず）。
図４４に示すように、細胞をＳＳでコーティングしたプレート上に播種し、対照プレート内の孤立細胞組織と比較し（同量の細胞で播種した）、細胞間相互作用で多層を形成するだけでなく、実際には、結合組織構造又はマイクロ構造で組織化されていた。この一連の実験で、ＳＳ上で成長した細胞の運動性は、コラーゲンコーティングされたポリスチレン組織培養皿上で成長させた細胞よりも少なくとも２倍高いことが明確に示された（図４９Ａ〜Ｃも参照されたい）。
図４５に示されるように、ＳＳの存在下でスフェロイド誘導プレート上に播種した細胞は、コラーゲンの存在下で、又はサプリメントなしで播種した細胞（同量の細胞）よりも著しく大きいスフェロイドへと発達した。インキュベーションの７日後に、ＳＳ含有スフェロイドは、サプリメントなしで、コラーゲンスフェロイド又は対照スフェロイドと比較して約４.７以上の生存細胞を維持した。ＳＳで成長したスフェロイドの表面積は、コラーゲンやサプリメントなしで培養したスフェロイドの表面積と比較して約４.１倍大きかった。これらの実験は、図４６Ａ〜Ｃに示すように、ＳＳが細胞の増殖を強く支持することを示しているだけでなく、スフェロイド内の細胞死を阻害する。
まとめると、これらのデータは、細胞の成長及び維持におけるＳＳの予想外の利点に関する決定的な証拠を提供する。驚くべきことに、少なくとも４回の反復（ｎ）が、細胞の生存率及び増殖を維持するのに必要であることが判明した。最近の結果はまた、好ましくは８個以上のリピートが細胞の成長パラメータを最大化するために使用されるべきであることを示した。
実施例１０
コーティングプレートのクモシルク（ＳＳ）上への細胞の播種及びコーティングされていないプレート上へのＳＳと混合した細胞の播種
ＨＥＫ２９３細胞をＳＳでコーティングしたプレート上に播種し、未処理プレートにＳＳを細胞培地と混合して播種した。
以下の細胞培養材料を使用した：

Figure 2019510541

Figure 2019510541
ＨＥＫ２９３細胞培養手順：ＨＥＫ２９３を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０.１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び０.２５μｇ／ｍｌのアンホテリシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。細胞を酵素消化により培養フラスコ皿から除去した。トリプシンを不活性化するために、新鮮な血清含有培地で洗浄し、再懸濁した。次いで、細胞をトリパンブルーと混合し、生存率を評価した。
ＳＳコーティングしたプレート上への細胞の播種：細胞を５０，０００個のＨＥＫ２９３細胞／ｍｌの密度及び２００，０００細胞／ｍｌの密度まで新鮮な培地で希釈した。２００μｌの細胞懸濁液を、指定された細胞培養ウェルに加え、５％ＣＯ２、加湿した３７℃のインキュベーターに入れた（最終播種濃度：１０，０００細胞／ウェル及び４０，０００細胞／ウェル）。細胞を、培地交換なしで、最大６日間成長させた。
ＳＳ補強培地での細胞成長：細胞を５０，０００個のＨＥＫ２９３細胞／ｍｌの密度及び２００，０００細胞／ｍｌの密度まで新鮮な培地で希釈した。ＳＳを、ＳＳの４００，０００ユニット／ｍｌ（２.５μｌのＳ／ｍｌ）の最終濃度で懸濁細胞に加えた。２００μｌのＳＳ細胞懸濁液を指定した細胞培養ウェルに加え、５％ＣＯ２、加湿した３７℃のインキュベーターに入れた（最終播種濃度：１０，０００細胞／ウェル及び４０，０００細胞／ウェル）。細胞を、培地交換なしで最大６日間成長させた。
結果
ＳＳコーティングプレート上に播種した細胞：ＨＥＫ２９３のクラスターが播種後３〜４日目に観察された。ＳＳコーティング上に播種した高密度と低密度の両方の細胞は、播種後５日以内に多層３次元構造で組織化することが示された（図４７Ａ）。コーティングしていないプレート上に播種した対照細胞は単層として成長した（図４７Ｂ）。細胞死は５％未満であった。ほとんどの領域で、細胞の３以上の層が観察された。
「未処理」プレート上にてＳＳ補強培地中で成長させた細胞：ＨＥＫ２９３のクラスターが播種後３〜４日目に観察され、細胞が繊維に接着することが示された。図４８Ａ〜Ｃに示すように、多くの細胞がプレートに物理的に接着することなく成長した。これらの細胞はＳＳに接着した。ＳＳは、細胞接着表面を支持するだけでなく、ＳＳに接着した細胞は、ＳＳ繊維を介して増殖し、クラスターの高さを高くした。このように、接着を必要とする細胞は、プレート又はプレートに接着した他の細胞に部分的に接着する繊維上で成長した。
図４９Ａ〜Ｂは、ポリスチレンに播種した細胞とＳＳコーティングプレートに播種した細胞の間の細胞の運動性定量化−比較を示す。組織培養皿をＳＳで部分的にコーティングした。Ｌ９２９細胞を、７０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。ＳＳでコーティングされた部分では、細胞クラスターが形成され、コーティングされていない部分では単層が観察された。２つの部分の境界の一連の時間経過の画像を撮影し、単一細胞の運動性を分析した。ＳＳで培養した細胞の平均運動性は、コーティングされていないポリスチレン表面上で培養した細胞の運動性よりも２.２倍高い。さらに、ＳＳ上に播種した細胞の高い運動性は、細胞クラスターの密度に正に相関する。
本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、多くの代替、変更及び変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内に入る全てのそのような代替、変更及び変形を包含することが意図される。

Claims (30)

  1. タンパク質の混合物及び少なくとも１つのポリマーを含む複合材料であって、前記タンパク質の混合物が異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、前記混合物中の各タンパク質は、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の「ｎ」リピートを含み、ｍ及びｎは、独立して２〜７０の整数である、複合材料。
  2. 前記タンパク質の混合物が、
    （ａ）各リピートが２ｋＤａ〜３.５ｋＤａの範囲の分子量を有する；
    （ｂ）「ｍ」に対する「ｎ」の比が１．５：１〜１：１．５の範囲にある；
    からなる群から選択される１以上の性質によって特徴付けられる、請求項１に記載の複合材料。
  3. 前記タンパク質の混合物が繊維の形態にある、請求項１〜２のいずれか一項に記載の複合材料。
  4. 少なくとも１つのポリマーが、非ＭａＳｐタンパク質由来のポリマーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合材料。
  5. 前記タンパク質のそれぞれが、独立して、配列番号１：
    （Ｘ１）ｚＸ２ＧＰＧＧＹＧＰＸ３Ｘ４Ｘ５ＧＰＸ６ＧＸ７ＧＧＸ８ＧＰＧＧＰＧＸ９Ｘ１０
    （式中、Ｘ１が、独立して、各場合においてＡ又はＧであり、（Ｘ１）Ｚの少なくとも５０％がＡであり、Ｚが５〜３０の整数であり、Ｘ２がＳ又はＧであり、Ｘ３がＧ又はＥであり、Ｘ４がＧ、Ｓ又はＮであり、Ｘ５がＱ又はＹであり、Ｘ６がＧ又はＳであり、Ｘ７がＰ又はＲであり、Ｘ８がＹ又はＱであり、Ｘ９がＧ又はＳであり、かつＸ１０がＳ又はＧである）
    に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合材料。
  6. 前記反復領域が、配列番号３（ＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＧＳＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰＧＳＳ）に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合材料。
  7. タンパク質の前記混合物を含まないポリマーの性質と比較して少なくとも１つの改良された機械的性質によって特徴付けられ、前記性質が、ヤング率、引張強度、破断歪み、降伏点、靭性、破壊までの仕事量、衝撃強度、引裂強度、曲げ弾性率、曲げ歪み及び特定の割合の伸長時の応力からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合材料。
  8. 前記ポリマーが、合成ポリマー、熱可塑性ポリマー、熱硬化性エポキシ、ポリエステル、ポリアミド、ポリオール、ポリウレタン、ポリエチレン、ナイロン、ポリアクリレート、ポリカーボネート、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又はそのコポリマー、シリコン、液晶ポリマー、無水マレイン酸グラフト化ポリプロピレン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ゴム、セルロース、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合材料。
  9. 前記タンパク質の総濃度が、前記複合材料の総重量の約０.１重量％〜約１０重量％の範囲にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合材料。
  10. 少なくとも０.５ミクロンの厚さの層を有する、請求項１に記載の複合材料。
  11. 前記繊維が、少なくとも３０％の多孔度によって特徴付けられる、請求項３に記載の複合材料。
  12. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合材料を含む物品。
  13. 生体適合性材料又は埋め込み用材料を含む、請求項１２に記載の物品。
  14. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合材料及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  15. 前記複合材料を形成するために、前記タンパク質の混合物を前記ポリマーに接着させる工程を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合材料を作製する方法。
  16. 溶融ポリマーを取得するために前記ポリマーを溶融し、前記タンパク質の混合物を前記溶融ポリマーに変換する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ポリマーを溶解し、溶解ポリマーを取得し、前記タンパク質の混合物を前記溶融ポリマーに変換する工程を含む、請求項１５及び１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ポリマーを押し出す工程を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 連続した電界紡糸により前記タンパク質の１以上の層を形成することを含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. （ａ）異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、前記タンパク質の「ｍ」型中の各タンパク質が、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含み、ｍ及びｎは独立して２〜７０の整数である繊維、並びに（ｂ）生体適合性材料、細胞培地、細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含む、組成物。
  21. 前記生体適合性材料が、組織足場、医療用装置、創傷ケア包帯、又は縫合糸である、請求項２０に記載の組成物。
  22. 細胞遊走を増強するか、細胞増殖を増強するか、細胞死を阻害するか、細胞の接着を増強するか、又はそれらの任意の組み合わせの方法であって、異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、前記タンパク質の「ｍ」型中の各タンパク質が、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含み、ｍ及びｎは独立して２〜７０の整数である繊維を含む組成物と、前記細胞とを接触させることを含む、方法。
  23. 前記組成物が表面上に接着している、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記組成物が細胞培地と混合される、請求項２２に記載の方法。
  25. 表面上の所定数の細胞層をアセンブルするための方法であって、異なる分子量のタンパク質の「ｍ」型を含み、前記タンパク質の「ｍ」型中の各タンパク質が、独立して、大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）タンパク質、又はその機能的相同体、バリアント、誘導体若しくは断片の反復領域の「ｎ」リピートを含み、ｍ及びｎは独立して２〜７０の整数である所定量の繊維を前記表面に適用することを含み、前記所定量が所定数の細胞層と相関する、方法。
  26. 前記所定数の細胞層が、１〜４枚の細胞層である、請求項２３に記載の方法。
  27. １層が１×１０３〜８×１０５の前記繊維／ｃｍ２を必要とする、請求項２４に記載の方法。
  28. ２層が４×１０５〜１８×１０５の前記繊維／ｃｍ２を必要とする、請求項２４に記載の方法。
  29. ３〜４層が１８×１０５の前記繊維／ｃｍ２を必要とする、請求項２４に記載の方法。
  30. 前記方法が、インビトロ法又はエクスビボ法である、請求項２５に記載の方法。
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