JP2018531040A - 合成ドラグラインスパイダーシルクを製作するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、合成ドラグラインスパイダーシルクの調製のためのMaSP(大瓶状腺スピドロイン)タンパク質に由来するタンパク質の混合物を含む組成物を対象とする。
ドラグラインスパイダーシルクは、クモの巣の枠および半径、ならびにクモが降下または危険回避する際の命綱を構築するために、巣をかけるクモによって用いられるシルクとして当該技術分野で知られている。これらの労作の実践を可能にするために、ドラグライン繊維は、高い弾性および強度の組み合わせにより著しく高い靭性を示し、そのことで天然または人工にかかわらずドラグライン繊維は靭性繊維と見なされている。例えばドラグラインは、その直径で高張力鋼の6倍強く、これまで作製された最強の合成繊維の1種であるKevlarよりも3倍強靭である。
本発明は、合成ドラグラインスパイダーシルクの製作のためなどの、異なる分子量を有しMaSPタンパク質に由来するタンパク質の混合物を含む組成物を対象とする。
(X1)ZX2GPGGYGPX3X4X5GPX6GX7GGX8GPGGPGX9X10
(ここでX1は、独立して、各例でAまたはGであり(X1)zの少なくとも50%がAであり、Zが5〜30の間の整数であり;X2は、SまたはGであり;X3は、GまたはEであり;X4は、G、SまたはNであり;X5は、QまたはYであり;X6は、GまたはSであり;X7は、PまたはRであり;X8は、YまたはQであり;X9は、GまたはSであり;X10は、SまたはGである)で示されるアミノ酸配列を有する。
(X1)ZX2SGPX3GGYGX4PX5QGPX6GGYGP
(ここでX1は、独立して、各例でAまたはGであり(X1)zの少なくとも50%がAであり、Zはが5〜30の間の整数であり;X2は、S−Gまたは非存在であり;X3は、G−Qまたは非存在であり;X4は、Gまたは非存在であり;X5は、SまたはGであり;X6は、S−P、G−Rまたは非存在である)で示されるアミノ酸配列を含む。
本発明は、幾つかの実施形態において、合成ドラグラインスパイダーシルクの調製に有用な、異なる分子量を有するタンパク質の混合物を含む組成物、このタンパク質をコードする核酸配列、発現ベクターおよび細胞を提供する。本発明はさらに、上記組成物を含む物品および繊維を提供する。
(i)10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%もしくは50%のアラニン残基、またはそれらの間の任意の範囲;
(ii)20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%もしく50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%または60%のグリシン残基、またはそれらの間の任意の範囲;
(iii)10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%もしくは30%のセリン残基、またはそれらの間の任意の範囲;
(iv)10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%もしく30%のプロリン残基、またはそれらの間の任意の範囲;
(v)1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%もしく10%のチロシン残基、またはそれらの間の任意の範囲;
(vi)1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%もしくは10%のグルタミン残基、またはそれらの間の任意の範囲;および
(vii)0%、1%、2%、3%、4%、5%のアルギニン残基、またはそれらの間の任意の範囲、
を含む。
(X1)ZX2GPGGYGPX3X4X5GPX6GX7GGX8GPGGPGX9X10
(ここでX1は、独立して、各例でAまたはGであり(X1)zの少なくとも50%がAであり、Zが5〜30の間の整数であり;X2は、SまたはGであり;X3は、GまたはEであり;X4は、G、SまたはNであり;X5は、QまたはYであり;X6は、GまたはSであり;X7は、PまたはRであり;X8は、YまたはQであり;X9は、GまたはSであり;X10は、SまたはGである)で示されるアミノ酸配列を有する。
(X1)ZX2GPGGYGPGX3X4GPX5GX6GGX7GPGGPGX8X9
(ここでX1は、独立して、各例でAまたはGであり(X1)zの少なくとも50%がAであり、Zが5〜30の間の整数であり;X2は、SまたはGであり;X3は、GまたはSであり;X4は、QまたはYであり;X5は、GまたはSであり;X6は、PまたはRであり;X7は、YまたはQであり;X8は、GまたはSであり;X9は、SまたはGである)で示されるアミノ酸配列を有する。
幾つかの態様によれば、本発明は、本発明の組成物を含む繊維を提供する。
特別な実施形態によれば、組成物は、ゲル、フォーム、もしくはステントおよびインプラントをコートするのに用いられるコーティングの形態で、または組織エンジニアリング目的のために有用な形態で提供され得る。別の実施形態において、本発明の組成物は、医薬組成物である。
別の態様において、本発明は、(i)細胞と、(ii)本発明の少なくとも1種の繊維を含む細胞足場材料と、を含む組成物を提供する。
培養される細胞の試料を用意すること;
上記試料を、本発明の少なくとも1種の繊維を含む細胞足場材料に適用すること;および
細胞培養に適した条件下で適用された細胞を有する上記細胞足場材料を維持すること、
を含む、細胞の育成(cultivation)の方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による組換えタンパク質で構成された少なくとも1種の繊維を含む物品を提供する。
本発明は、幾つかの実施形態において、(a)合成ドラグラインスパイダーシルクの調製に有用な異なる分子量を有するタンパク質の混合物と、(b)ポリマーと、を含む複合材料を提供する。
幾つかの実施形態において、本発明のタンパク質混合物を生成する方法が提供される。具体的な実施形態において、本発明の方法は、
a.上記アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用意するステップであって、上記核酸が、動作可能に連結されたプロモーターと、場合により調節配列と、の発現制御下にある、用意するステップと;
b.宿主細胞を(a)の発現ベクターで形質転換するステップと;
c.(b)の宿主細胞による異種タンパク質の発現のための条件を提供するステップと;
d.発現されたタンパク質を単離し、それにより本発明の合成アミノ酸配列を得るステップと、
を含む。
材料と方法
プラスミド:Geneart(ドイツ、レゲンスブルグ)から得られたPCR-ScriptAmpSK(+)プラスミド中のDNA配列。Invitrogenから得られたpFastBacHTa。
ドラグラインシルクタンパク質のシングルリピート単位をコードする配列の合成:ADF−4(Genbank登録番号U47856)の反復領域を構成する15リピートの平均コンセンサス配列を表す35アミノ酸長配列を設計した。平均コンセンサス配列のペプチド配列は、105のDNA塩基対配列:5’−TCTGGTCCTGGAGGTTATGGCCCAGGAAGCCAAGGACCATCTGGTCCAGGAGGATATGGTCCAGGCGGACCTGGCTCTAGTGCAGCAGCTGCCGCAGCAGCTGCA−3’(SEQ ID NO:15)によってコードされるSGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSSAAAAAAAA(SEQ ID NO:14)である。上記の合成DNAは、PCR−ScriptAmpSK(+)プラスミドで得られた。この配列をスポドプテラ・フルギペルダのコドン使用に従って発現のために最適化し、その細胞をスパイダーシルクおよび繊維の合成に用いた。
C1(SEQ ID NO:35および36):SGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSSAGAGAGAXaaA(XaaはAlaまたはGlyのいずれかを表す)
C2(SEQ ID NO:38および40):XaaGSGPGGYGPGGQGPGGYGPGGQGPYGPGAAAAAAA(XaaはSerまたはGlyのいずれかを表す)
C3(SEQ ID NO:42および44):XaaGPGQGGYGGPGGQGPGRGGYGPGAGSAAAAAAAAA(XaaはSerまたはGlyのいずれかを表す)。
この3つ(C1〜C3)の構築物のシングルリピートをコードするポリヌクレオチド配列を、それぞれSEQ ID NO:45〜47として示す。
ミクロ繊維を構成するナノ繊維の特徴づけ
1.8ナノメーターの直径を有する金粒子(Ni−NTA−Nanoprobes)を、本発明のモノマーそれぞれのN末端His6タグに結合させた。免疫TEMの観察により、モノマーが最初に頭−尾結合方式で互いに相互作用し、このように最初のステージとしておよそ5ナノメーターの直径のナノフィブリルを作り出す、二段階組立工程が明らかとなった(図1A)。結論として、ナノフィブリルは、非配向方式で互いに相互作用し(図1B)、このようにおよそ150ナノメーターの直径を有する繊維を作り出す(図1C)。
特有のラダリング現象が本発明の繊維を特徴づける
非反復性N末端およびC末端ドメインが隣接した様々な数のリピート(0、1、2、3,4、5、8、12、16、20、24、32)を含むモノマーは、自己組織化して不溶性になる傾向がある。それゆえ、モノマーの分子量(MW)を決定するために、繊維を精製して、6MグアニジンSCNで分解した。引き続き、グアニジン溶液を8M尿素に対し透析し(10KDaのMWカットオフのPierce透析カセットを用いて)、試料緩衝液を添加し、試料を変性10%アクリルアミドゲルで分析した。
(1)N末端ドメイン、24の同一リピート(2.7kDa)、C末端ドメインで構成された遺伝子からのバンドのラダー;
(2)N末端ドメイン、16の同一リピート(2.7kDa)、C末端ドメインで構成された遺伝子からのバンドのラダー;および
(3)N末端ドメイン、15の非同一リピート(アラネウス・ジアデマタスのネイティブ配列から採取)、C末端ドメインで構成された遺伝子からのバンドのラダー。
先に記載された通り、Sf9細胞を、バクミドDNAの構築物でトランスフェクトし、トランスフェクションの72時間後に回収した。
溶解された精製繊維は連続繊維へと電界紡糸され得る
SF9感染細胞から単離された合成繊維を、脱水した(摂氏55度(℃)の条件下で一晩)。ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)を、ドープの最終濃度が23%w/vになるように乾燥繊維に添加した。電界紡糸のプロトコルを以下の通り実施した:注入速度:0.5ml/時間、電圧:18キロボルト、ノズルの先端とコレクターとの間の距離:16センチメートル、湿度:40%、温度:28℃。
精製された繊維の凍結乾燥および直線状特徴の決定
精製された繊維を、二段蒸留水(DDW)中に0.5%w/vで懸濁させて、液体窒素により凍結させた後(−200℃の温度で)、およそ24時間、凍結乾燥させた。上記手順から、乾燥繊維を含む白色粉末が得られた。この繊維のより深い検査は、それらは、それらの直径を保ちつつ直線化され、直線構造を取り(図4A)かつそれらの機械的性質を保持しながら、種々のマトリクスで容易に分散されたことを明らかにした。
本発明の繊維上での多層細胞成長
本発明の繊維(PBS中に1:25)を滅菌96ウェル組織培養プレートのウェルに添加した。インキュベーション(4℃)および洗浄ステップに続いて、HEK293細胞を各繊維コーティングウェル中に入れた後、インキュベーションステップに供した(37℃、5%CO2で72時間)。
本発明の繊維の熱フィンガープリント
本発明の繊維の熱フィンガープリントを特徴づけるために、複数のテストを実施した。
1.−120℃〜160℃での発熱ピーク
2.230〜260℃での吸熱ピーク
3.265±5℃から320±5℃までの分解ピーク
を有する熱フィンガープリントを示した。
Claims (33)
- 異なる分子量のmタイプのタンパク質を含むタンパク質の混合物を含む組成物であって、前記混合物中の各タンパク質が、独立して、大瓶状腺スピドロイン(MaSP)タンパク質、またはその機能的相同体、変異体、誘導体もしくは断片の反復領域のnリピートを含み、mおよびnが、独立して、2〜70の間の整数である、組成物。
- 前記nが、前記混合物中のタンパク質の各タイプについて同一である、請求項1に記載の組成物。
- 各リピートが、2kDa〜3.5kDaの範囲の分子量を有する、請求項1に記載の組成物。
- 各リピートが、2.6kDa〜3kDaの範囲の分子量を有する、請求項3に記載の組成物。
- 2kDa〜3.5kDaの分子量増分を有する前記混合物の2種以上のタンパク質を含む、請求項1に記載の組成物。
- 2.6kDa〜3kDaの分子量増分を有する前記混合物の2種以上のタンパク質を含む、請求項1に記載の組成物。
- nが、4および32に等しい整数または4〜32の間の整数である、請求項1に記載の組成物。
- mが、4および32に等しい整数または4〜32の間の整数である、請求項1に記載の組成物。
- 「n」対「m」の比率が、2:1〜1:2の範囲である、請求項1に記載の組成物。
- 「n」と「m」が、等しい、請求項1に記載の組成物。
- 前記リピートが、ADF−4もしくはMaSP1タンパク質またはその断片の反復領域の相同体、変異体、誘導体のものである、請求項1に記載の組成物。
- 前記反復領域が、第一の部分とそれに連続する第二の部分とを有し、前記第一の部分がアラニン残基を少なくとも50%含む5〜30アミノ酸のアミノ酸配列であり、前記第二の部分がグリシン、セリン、プロリンおよびチロシンからなる群から選択される残基を少なくとも80%含む20〜60アミノ酸のアミノ酸配列である、請求項1に記載の組成物。
- 前記反復領域の第二の部分が、最大で2つのグルタミン残基を含む、請求項12に記載の組成物。
- 前記反復領域が、SEQ ID NO:1
(X1)ZX2GPGGYGPX3X4X5GPX6GX7GGX8GPGGPGX9X10
(ここでX1は、独立して、各例でAまたはGであり(X1)zの少なくとも50%がAであり、Zが5〜30の間の整数であり;X2は、SまたはGであり;X3は、GまたはEであり;X4は、G、SまたはNであり;X5は、QまたはYであり;X6は、GまたはSであり;X7は、PまたはRであり;X8は、YまたはQであり;X9は、GまたはSであり;X10は、SまたはGである)で示されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の組成物。 - 前記反復領域が、SEQ ID NO:33
(X1)ZX2SGPX3GGYGX4PX5QGPX6GGYGP
(ここでX1は、独立して、各例でAまたはGであり(X1)zの少なくとも50%がAであり、Zはが5〜30の間の整数であり;X2は、S−Gまたは非存在であり;X3は、G−Qまたは非存在であり;X4は、Gまたは非存在であり;X5は、SまたはGであり;X6は、S−P、G−Rまたは非存在である)で示されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の組成物。 - 前記反復領域が、SEQ ID NO:2〜4および35〜44のいずれか1つで示されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記反復領域が、SEQ ID NO:2(SGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSS)で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記反復領域が、SEQ ID NO:3(AAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSS)で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記相同体が、SEQ ID NO:1〜3、33および35〜44のいずれか1つと少なくとも70%の相同性を共有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記混合物の各タンパク質が、
SEQ ID NO:5(MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMDPEFKGLRRRAQLV);
SEQ ID NO:6(MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMDPEFKGLRRRAQLVRPLSNLDNA);
SEQ ID NO:7(MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMDPEFKGLRRRAQLVDPPGCRNSARAGSS)
からなる群から選択される単一N末端領域、またはそれらの任意の機能的相同体、変異体、誘導体、もしくは断片をさらに含む、請求項1に記載の組成物。 - 前記N末端領域の前記相同体が、SEQ ID NO:5〜7のいずれか1つと少なくとも70%の相同性を共有する、請求項20に記載の組成物。
- 前記混合物の各タンパク質が、SEQ ID NO:9(GPSGPGAYGPSPSASASVAASRLSSPAASSRVSSAVSSLVSSGPTNGAAVSGALNSLVSQISASNPGLSGCDALVQALLELVSALVAILSSASIGQVNVSSVSQSTQMISQALS)からなる群から選択される単一C末端領域、またはそれらの任意の機能的相同体、変異体、誘導体もしくは断片をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記C末端領域の前記相同体が、SEQ ID NO:9と少なくとも70%の相同性を共有する、請求項22に記載の組成物。
- 前記混合物の1つまたは複数のタンパク質が、少なくとも1つのタグ配列をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- タンパク質の前記混合物が、ADF−3またはMASP−2タンパク質をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 250〜330℃の範囲の少なくとも1つの吸熱ピークを示すDSCパターンによって特徴づけられる、請求項1に記載の組成物。
- 前記DSCパターンが、220〜250℃の範囲の吸熱ピークをさらに含む、請求項26に記載の組成物。
- 担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項1〜27のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1〜28のいずれか1項に記載の組成物を含む物品。
- 請求項1〜28のいずれか1項に記載の組成物を含む繊維。
- 請求項1に記載のタンパク質の前記混合物の2種以上のタンパク質をコードする単離された核酸配列。
- 請求項31の核酸配列を含む発現ベクターであって、前記核酸配列が、動作可能に連結されたプロモーターと、場合により、調節配列との発現制御下にある、発現ベクター。
- 請求項32に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
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