CN113563446A - 一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子及其应用方法 - Google Patents
一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子及其应用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113563446A CN113563446A CN202110829850.2A CN202110829850A CN113563446A CN 113563446 A CN113563446 A CN 113563446A CN 202110829850 A CN202110829850 A CN 202110829850A CN 113563446 A CN113563446 A CN 113563446A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- gene
- molecule
- sequence
- mechanical properties
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims abstract description 55
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 44
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 27
- 241000239290 Araneae Species 0.000 claims abstract description 22
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 18
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 12
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 6
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 4
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 4
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 claims description 2
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 229920001872 Spider silk Polymers 0.000 description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 108010010096 glycyl-glycyl-tyrosine Proteins 0.000 description 6
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- WOJJIRYPFAZEPF-YFKPBYRVSA-N 2-[[(2s)-2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]propanoyl]amino]acetate Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)CN WOJJIRYPFAZEPF-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 4
- INLIXXRWNUKVCF-JTQLQIEISA-N Gly-Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 INLIXXRWNUKVCF-JTQLQIEISA-N 0.000 description 4
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- QPTNELDXWKRIFX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QPTNELDXWKRIFX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WMYJZJRILUVVRG-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O WMYJZJRILUVVRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gln-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 108010064995 silkworm fibroin Proteins 0.000 description 2
- 229920000271 Kevlar® Polymers 0.000 description 1
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 1
- 235000006721 Morus bombycis Nutrition 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101710086689 P25 protein Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004761 kevlar Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
- A01K67/04—Silkworms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子及其应用方法。本方法采用蜘蛛大壶状腺丝蛋白I分子4个串联蛋白序列type1～type4中的一种序列作为单一的多聚蛋白分子，构建这种单一多聚蛋白序列对应的外源基因载体，利用分子生物学技术将单一多聚蛋白序列整合到家蚕基因组内，最终获得能够稳定遗传的复合丝性能优异的新型家蚕品种，利用新型家蚕品种生产复合丝。本发明发现了一种单一多聚蛋白分子结构的构成方法及其新用途，开发了多种新型的高性能复合丝。
Description
技术领域
本发明涉及了一种功能蛋白分子的构建及其应用的方法，尤其是涉及了一种利用蜘蛛大壶状腺丝蛋白I分子4个串联序列(type1～4)中的一种序列构建单一的多聚蛋白序列，并利用这种单一的多聚蛋白序列制造高性能复合丝的方法。
背景技术
传统的蚕丝纤维主要应用于纺织业，随着加工技术的改进和交叉学科的发展，目前已开发出许多功能性的丝纤维，拓展了应用领域，如应用于伤口愈合、生物传感器、能量收集等。
蚕丝和蜘蛛丝都是由丝蛋白聚合而成的大分子生物纤维，但是蜘蛛丝比蚕丝具有更好的机械性能。为了适应野外生存环境，蜘蛛进化出了可生产6～7种不同类型的丝纤维的能力。大壶状腺丝又被称为牵引丝(dragline silk)，是由蜘蛛大壶状腺合成并分泌，主要含I和II两种蛋白，大壶状腺丝蛋白I由4个典型的、具有不同氨基酸组成的序列type1、type2、type3和type4重复串联组成，是构成蜘蛛网的纵丝(radius silk)及骨架丝(framesilk)的主要成分。牵引丝具有低密度，高拉伸应力和极好的应变等特点，其机械性能远胜于包括蚕丝在内的其他蛋白纤维，单位重量下应力优于尼龙、凯夫拉纤维乃至钢材料，受到科学家的极大关注。
但由于蜘蛛难以饲养，无法大量获得蜘蛛丝，而家蚕具有饲养容易、成本低、蚕丝易于加工等特点，目前利用转基因技术和基因编辑技术，将蜘蛛丝基因导入家蚕基因组，利用家蚕吐丝结茧的功能，开发出高性能的复合丝的案例已见报道。
然而，蜘蛛丝基因的种类数量有限，为了适应复合丝改良的需求，还需要挖掘更多高效功能基因，特别是开发人工设计、合成的高效功能基因。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于开发人工自主设计、合成单一多聚蛋白分子结构，以及利用这种人工蛋白分子开发生产新型高性能复合丝的方法。
具体是发明了利用蜘蛛大壶状腺丝蛋白I分子4个序列(type1～4)中的一种序列构成单一的多聚蛋白序列，并用分子生物学技术获得了能够生产包含单一多聚蛋白分子成分和蚕丝蛋白成分的、性能优异的复合丝的家蚕品种。
本发明大幅度提升了蚕丝经济价值，开创蚕桑生产新局面，具有极大的经济效益和广阔的应用前景。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
一、一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子：
所述的单一多聚蛋白分子是指由蜘蛛大壶状腺丝蛋白I分子的四种串联蛋白序列type1～type 4中的一种构成的单一的多聚蛋白序列。
所述的单一多聚蛋白分子是由四种串联蛋白序列type1～type4之一以多次重复聚合而成。
所述的单一多聚蛋白分子是由四种串联蛋白序列type1～type4之一以2-64次重复聚合而成。
所述的串联蛋白序列type1为SEQ ID NO.2，其基因碱基序列为SEQ ID NO.1，而形成第一种单一多聚蛋白分子；
所述的串联蛋白序列type2为SEQ ID NO.4，其基因碱基序列为SEQ ID NO.3，而形成第二种单一多聚蛋白分子；
所述的串联蛋白序列type3为SEQ ID NO.6，其基因碱基序列为SEQ ID NO.5，而形成第三种单一多聚蛋白分子；
所述的串联蛋白序列type4为SEQ ID NO.8，其基因碱基序列为SEQ ID NO.7，而形成第四种单一多聚蛋白分子。
所述的单一多聚蛋白分子是指2～64倍的串联蛋白序列type1(碱基和蛋白序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)、2～64倍的串联蛋白序列type2(碱基和蛋白序列如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4)、2～64倍的串联蛋白序列type3(碱基和蛋白序列如SEQ ID NO.5、SEQID NO.6)和2～64倍的串联蛋白序列type4(碱基和蛋白序列如SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8)。
本发明单一多聚蛋白分子可在基因编辑和转基因家蚕中应用，具体在用于基因编辑和转基因家蚕生产制备提高力学机械性能的复合丝应用。
二、一种提高力学机械性能的复合丝生产方法：
是一种利用上述单一多聚蛋白分子进行复合丝开发的方法，方法是先通过基因工程方法生物合成目的基因序列，所述的目的基因序列为权利要求1所述的单一多聚蛋白分子对应的基因碱基序列，将采用分子生物学技术构建外源基因载体，通过显微注射将外源基因载体导入家蚕卵内并整合到家蚕基因组内；
对家蚕进行多代培育，通过荧光显微镜筛选获得G1代阳性个体，G1代阳性个体分别与野生型交配或阳性个体自交得到G2代，G3代后均筛选阳性个体并采用阳性个体自交留种，到G8代育成稳定遗传的品种，最终获得能够稳定遗传的复合丝性能优异的新型家蚕品种；利用G8代的家蚕进行生产分泌蚕丝而作为复合丝，获得了提高力学机械性能的复合丝。
所述的阳性个体是指显现荧光的个体。
所述的野生型是指未导入外源基因载体的家蚕卵培育成的个体。
所述的多聚蛋白分子对应的外源基因载体是采用以piggyBac为骨架的转基因载体或者应用于基因编辑的同源重组载体。
所述的外源基因载体包括外源基因表达框和荧光筛选标记基因表达框；
外源基因表达框包括外源基因和表达框的启动子，外源基因为权利要求1所述的单一多聚蛋白分子对应的基因碱基序列，外源基因表达框的启动子包括丝素蛋白重链、丝素蛋白轻链、丝素蛋白P25、丝胶蛋白等基因的启动子；
荧光筛选标记基因表达框包括荧光筛选标记基因和表达框的启动子，荧光筛选标记基因包括绿色荧光蛋白基因(GFP)和红色荧光蛋白基因(DsRed)，荧光筛选标记基因表达框的启动子包括IE-1、A3、3xP3启动子。
所述的复合丝的组成包含了单一多聚蛋白分子成分和蚕丝蛋白成分。本发明设计构建的单一多聚蛋白分子在复合丝中进行了表达，并增强了复合丝的力学机械性能。
本发明是创造性地将蜘蛛大壶状腺丝蛋白I分子的蛋白序列创造性地设计提取了其中的四个部分，并将四个部分进行多倍构建获得了能够提高家蚕复合丝力学机械性能的蛋白序列。
本发明发现了一种单一多聚蛋白分子结构的构成方法及其新用途，开发了多种新型的高性能复合丝。
本发明具有的有益效果是：
本发明开发了一种人工设计、合成功能基因及其提高家蚕复合丝力学机械性能的方法，并获得了多种功能基因，利用这种基因获得了复合丝力学性能显著增强，这种发明能极大的改良蚕丝品质，创造很好的经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明的实施例如下：
实施例1
采用蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因中type1序列的32倍重复串联序列(type1基因碱基和蛋白序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)，按照家蚕密码子偏好性进行优化，通过基因工程的方法生物合成目的基因序列，采用家蚕丝素蛋白轻链启动子为表达框启动子，进一步与采用IE-1启动子的红色荧光蛋白标志基因表达框一起，采用分子生物学技术构建转基因载体，通过显微注射将其导入家蚕卵内，并整合到家蚕基因组内。
通过荧光显微镜筛选G1阳性个体，阳性个体分别与野生型交配得到G2代，G3代后都采用阳性个体自交留种，到G8代育成稳定遗传的品种。采用G2代为材料经PCR实验验证外源基因已经成功导入家蚕基因组内。经荧光定量PCR检测表明家蚕品种中蜘蛛丝基因表达显著。采用Western blot方法证明家蚕复合丝中含有预期大小的type1重复串联蛋白的条带。
对来自于蚕茧的复合丝的力学性能进行测试，机械性能显著高于野生型，复合丝应力、应变和韧性分别提升了27.7％、10.7％和44.4％。
Type1多聚串联重复序列复合丝力学性能比较分析结果
实施例2
采用蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因中type 2序列的64倍重复串联序列(type2基因碱基和蛋白序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)，按照家蚕密码子偏好性进行优化，通过基因工程的方法生物合成目的序列，采用家蚕丝素重链启动子为表达框启动子，进一步与采用A3启动子的绿色荧光蛋白标志基因表达框一起，采用分子生物学技术构建同源重组载体，通过显微注射将其导入家蚕卵内，并整合到家蚕基因组内。
通过荧光显微镜筛选G1代阳性个体，阳性个体自交配得到G2代，G3代后都采用阳性个体自交留种，到G8代育成稳定遗传的品种。采用G2代为材料经PCR实验验证外源基因已经成功导入家蚕基因组内。经荧光定量PCR检测表明家蚕品种中蜘蛛丝基因表达显著。采用Western blot方法证明家蚕复合丝中含有预期大小的type2重复串联蛋白的条带。
对来自于蚕茧复合丝的力学性能进行测试，机械性能显著高于野生型，复合丝应力、应变和韧性分别提升了31.9％、7.9％和58.2％。
Type2多聚串联重复序列复合丝力学性能比较分析结果
实施例3
采用蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因中type 3序列的8倍重复串联序列(type3基因碱基和蛋白序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)，按照家蚕密码子偏好性进行优化，通过基因工程的方法生物合成目的序列，采用家蚕丝素P25蛋白启动子为表达框启动子，进一步与采用IE-1启动子的绿色荧光蛋白标志基因表达框一起，采用分子生物学技术构建转基因载体，通过显微注射将其导入家蚕卵内，并整合到家蚕基因组内。
通过荧光显微镜筛选G1阳性个体，阳性个体自交配得到G2代，G3代后都采用阳性个体自交留种，到G8代育成稳定遗传的品种。采用G2代为材料经PCR实验验证外源基因已经成功导入家蚕基因组内。经荧光定量PCR检测表明家蚕品种中蜘蛛丝基因表达显著。采用Western blot方法证明家蚕复合丝中含有预期大小的type3重复串联蛋白的条带。
对来自于蚕茧复合丝的力学性能进行测试，机械性能显著高于野生型，复合丝应力、应变和韧性分别提升了12.5％、17.3％和37.3％。
Type3多聚串联重复序列复合丝力学性能比较分析结果
实施例4
采用蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因中type 4序列的16倍重复串联序列(type4基因碱基和蛋白序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)，按照家蚕密码子偏好性进行优化，通过基因工程的方法生物合成目的序列，采用家蚕丝胶启动子为表达框启动子，进一步与采用3xP3启动子的红色荧光蛋白标志基因表达框一起，采用分子生物学技术构建同源重组载体，通过显微注射将其导入家蚕卵内，并整合到家蚕基因组内。
通过荧光显微镜筛选G1阳性个体，阳性个体自交配得到G2代，G3代后都采用阳性个体自交留种，到G8代育成稳定遗传的品种。采用G2代为材料经PCR实验验证外源基因已经成功导入家蚕基因组内。经荧光定量PCR检测表明家蚕品种中蜘蛛丝基因表达显著。采用Western blot方法证明家蚕复合丝中含有预期大小的type4重复串联蛋白的条带。
对来自于蚕茧复合丝的力学性能进行测试，机械性能显著高于野生型，复合丝应力、应变和韧性分别提升了111.9％、28.8％和117.5％。
Type4多聚串联重复序列复合丝力学性能比较分析结果
从上述实施例可以看出，利用本发明方法，可以人工设计具有提高蚕丝综合力学性能的功能基因，这种改良蚕丝性能的方法具有稳定性强、效率高、成本低的优点，能提高经济效益。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
本发明的涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1：蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因的串联蛋白序列type1的DNA碱基序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GGTGGTGCTGGTCAAGGTGGTCAAGGAGGCTATGGTCGAGGTGGATACGGACAAGGTGGAGCCGGTCAAGGCGGTGCAGGTGCTGCTGCTGCGGCTGCTGCTGCC
SEQ ID NO.2：蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因的串联蛋白序列type1
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GGAGQGGQGGYGRGGYGQGGAGQGGAGAAAAAAAA
SEQ ID NO.3：蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因的串联蛋白序列type2的DNA碱基序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GGTGGTGCTGGTCAAGGTGGTCAAGGAGGCTATGGTCAAGGTGGATACGGACAAGGTGGAGCTGGTCAAGGAGGTGCCGCTGCGGCTGCTGCTGCTGCTGCA
SEQ ID NO.4：蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因的串联蛋白序列type2
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GGAGQGGQGGYGQGGYGQGGAGQGGAAAAAAAAA
SEQ ID NO.5：蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因的串联蛋白序列type3的DNA碱基序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GGTGGTGCTGGTCAAGGTGGTTATGGCAGAGGAGGTGCTGGTCAAGGAGGTGCTGCTGCTGCCGCAGCAGCTGCCGCA
SEQ ID NO.6：蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因的串联蛋白序列type3
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GGAGQGGYGRGGAGQGGAAAAAAAAA
SEQ ID NO.7：蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因的串联蛋白序列type4的DNA碱基序列
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GGTGCAGGACAAGGAGGATATGGTGGACAAGGAGCCGGTCAAGGAGGTGCAGGTGCAGCTGCCGCTGCTGCTGCTGCC
SEQ ID NO.8：蜘蛛大壶状腺丝蛋白I基因的串联蛋白序列type4
来源：人工序列(Artificial Sequence)
GAGQGGYGGQGAGQGGAGAAAAAAAA。
序列表
<110> 浙江超丝生物科技有限公司
<120> 一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子及其应用方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtggtgctg gtcaaggtgg tcaaggaggc tatggtcgag gtggatacgg acaaggtgga 60
gccggtcaag gcggtgcagg tgctgctgct gcggctgctg ctgcc 105
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Gly Tyr
1 5 10 15
Gly Gln Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala
35
<210> 3
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtggtgctg gtcaaggtgg tcaaggaggc tatggtcaag gtggatacgg acaaggtgga 60
gctggtcaag gaggtgccgc tgcggctgct gctgctgctg ca 102
<210> 4
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Gly Tyr
1 5 10 15
Gly Gln Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala
<210> 5
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtggtgctg gtcaaggtgg ttatggcaga ggaggtgctg gtcaaggagg tgctgctgct 60
gccgcagcag ctgccgca 78
<210> 6
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Gly Ala Gly Gln Gly
1 5 10 15
Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25
<210> 7
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtgcaggac aaggaggata tggtggacaa ggagccggtc aaggaggtgc aggtgcagct 60
gccgctgctg ctgctgcc 78
<210> 8
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly
1 5 10 15
Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25
Claims (10)
1.一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子，其特征在于：所述的单一多聚蛋白分子是指由蜘蛛大壶状腺丝蛋白I分子的四种串联蛋白序列type1～type 4中的一种构成的单一的多聚蛋白序列。
2.根据权利要求1所述的一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子，其特征在于：所述的单一多聚蛋白分子是由四种串联蛋白序列type1～type4之一以多次重复聚合而成。
3.根据权利要求1所述的一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子，其特征在于：所述的单一多聚蛋白分子是由四种串联蛋白序列type1～type4之一以2-64次重复聚合而成。
4.根据权利要求1所述的一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子，其特征在于：所述的串联蛋白序列type1为SEQ ID NO.2，而形成第一种单一多聚蛋白分子；所述的串联蛋白序列type2为SEQ ID NO.4，而形成第二种单一多聚蛋白分子；所述的串联蛋白序列type3为SEQ ID NO.6，而形成第三种单一多聚蛋白分子；所述的串联蛋白序列type4为SEQ IDNO.8，而形成第四种单一多聚蛋白分子。
5.权利要求1所述的一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子的应用，其特征在于：在基因编辑和转基因家蚕中的应用。
6.权利要求5所述的一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子的应用，其特征在于：在用于基因编辑和转基因家蚕生产制备提高力学机械性能的复合丝的应用。
7.一种提高力学机械性能的复合丝生产方法，其特征在于：
方法是先通过基因工程方法生物合成目的基因序列，所述的目的基因序列为权利要求1所述的单一多聚蛋白分子对应的基因碱基序列，将采用分子生物学技术构建外源基因载体，通过显微注射将外源基因载体导入家蚕卵内并整合到家蚕基因组内；
对家蚕进行多代培育，通过荧光显微镜筛选获得G1代阳性个体，G1代阳性个体分别与野生型交配或阳性个体自交得到G2代，G3代后均筛选阳性个体并采用阳性个体自交留种，到G8代育成稳定遗传的品种；利用G8代的家蚕进行生产分泌蚕丝而作为复合丝，获得了提高力学机械性能的复合丝。
8.根据权利要求7所述的一种提高力学机械性能的复合丝生产方法，其特征在于：所述的外源基因载体是采用以piggyBac为骨架的转基因载体或者应用于基因编辑的同源重组载体。
9.根据权利要求7或8所述的一种提高力学机械性能的复合丝生产方法，其特征在于：所述的外源基因载体包括外源基因表达框和荧光筛选标记基因表达框；
外源基因表达框包括外源基因和表达框的启动子，外源基因为权利要求1所述的单一多聚蛋白分子对应的基因碱基序列，外源基因表达框的启动子包括丝素蛋白重链、丝素蛋白轻链、丝素蛋白P25、丝胶蛋白等基因的启动子；
荧光筛选标记基因表达框包括荧光筛选标记基因和表达框的启动子，荧光筛选标记基因包括绿色荧光蛋白基因(GFP)和红色荧光蛋白基因(DsRed)，荧光筛选标记基因表达框的启动子包括IE-1、A3、3xP3启动子。
10.根据权利要求7所述的一种提高力学机械性能的复合丝生产方法，其特征在于：所述的复合丝的组成包含了单一多聚蛋白分子成分和蚕丝蛋白成分。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110829850.2A CN113563446A (zh) | 2021-07-22 | 2021-07-22 | 一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子及其应用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110829850.2A CN113563446A (zh) | 2021-07-22 | 2021-07-22 | 一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子及其应用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113563446A true CN113563446A (zh) | 2021-10-29 |
Family
ID=78166199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110829850.2A Pending CN113563446A (zh) | 2021-07-22 | 2021-07-22 | 一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子及其应用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113563446A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023213009A1 (zh) * | 2022-05-05 | 2023-11-09 | 苏州大学 | 一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1563085A (zh) * | 2004-03-26 | 2005-01-12 | 南京师范大学 | 重组悦目金蛛大壶状腺丝蛋白及其制备方法 |
| CN103833838A (zh) * | 2012-11-22 | 2014-06-04 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高性能类蛛丝蛋白材料及其生物合成方法 |
| CN105085685A (zh) * | 2015-07-31 | 2015-11-25 | 杭州师范大学 | 一种mrrp蛋白、基因、载体、工程菌及其应用 |
| CN108290935A (zh) * | 2015-08-10 | 2018-07-17 | 赛威克斯材料科学公司 | 用于制造合成的拖丝蜘蛛丝的组合物和方法 |
| CN111454961A (zh) * | 2020-04-22 | 2020-07-28 | 西南大学 | 蜘蛛MaSps基因及其在制备载药纳米粒子中的应用 |
-
2021
- 2021-07-22 CN CN202110829850.2A patent/CN113563446A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1563085A (zh) * | 2004-03-26 | 2005-01-12 | 南京师范大学 | 重组悦目金蛛大壶状腺丝蛋白及其制备方法 |
| CN103833838A (zh) * | 2012-11-22 | 2014-06-04 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种高性能类蛛丝蛋白材料及其生物合成方法 |
| CN105085685A (zh) * | 2015-07-31 | 2015-11-25 | 杭州师范大学 | 一种mrrp蛋白、基因、载体、工程菌及其应用 |
| CN108290935A (zh) * | 2015-08-10 | 2018-07-17 | 赛威克斯材料科学公司 | 用于制造合成的拖丝蜘蛛丝的组合物和方法 |
| CN111454961A (zh) * | 2020-04-22 | 2020-07-28 | 西南大学 | 蜘蛛MaSps基因及其在制备载药纳米粒子中的应用 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 侯佳男 等: "重组蛛丝蛋白——从结构、设计到应用", 生命的化学, pages 2006 - 2013 * |
| 张蕾 等: "基因工程功能化丝蛋白生物材料及其在生物医学中的应用", 生物工程学报, pages 956 - 970 * |
| 泰瑞奇 等: "主要壶腹腺丝蛋白分子结构与机械性能之间的关系", 生命科学, pages 557 - 564 * |
| 潘鸿春等: "蜘蛛丝蛋白研究进展", 《蛛形学报》 * |
| 潘鸿春等: "蜘蛛丝蛋白研究进展", 《蛛形学报》, no. 01, 30 May 2006 (2006-05-30) * |
| 郑青亮 等: "蜘蛛丝的结构性能及表达策略研究进展", 蚕业科学, pages 685 - 689 * |
| 黄晶星等: "蛋白质类医用高分子微生物合成的研究进展", 《生物技术》 * |
| 黄晶星等: "蛋白质类医用高分子微生物合成的研究进展", 《生物技术》, no. 02, 15 April 2008 (2008-04-15) * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023213009A1 (zh) * | 2022-05-05 | 2023-11-09 | 苏州大学 | 一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kuwana et al. | High-toughness silk produced by a transgenic silkworm expressing spider (Araneus ventricosus) dragline silk protein | |
| CN105400815B (zh) | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法 | |
| US20080287651A1 (en) | Silk Thread Containing Spider Thread Protein and Silk Worm Producing the Silk Thread | |
| CN111518832B (zh) | 蜘蛛梨状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法 | |
| CN111518831B (zh) | 蜘蛛葡萄状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法 | |
| US20150101541A1 (en) | Methods of producing new types of hybrid silk and hemp fibers | |
| Li et al. | Construction of transgenic silkworm spinning antibacterial silk with fluorescence | |
| CN111500591A (zh) | 蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法 | |
| GB2162190A (en) | Improvements in or relating to production of silk | |
| CN108642059B (zh) | 适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因及其表达载体和应用 | |
| CN113563446A (zh) | 一种提高力学机械性能的单一多聚蛋白分子及其应用方法 | |
| WO2023213009A1 (zh) | 一种含金丝织网蜘蛛大壶状腺丝蛋白复合丝的制备方法 | |
| CN113943360B (zh) | 提高蚕丝力学机械性能的水生生物蛋白分子及其应用方法 | |
| CN110551190B (zh) | 一种利用家蚕生产蜘蛛丝的方法 | |
| JP5098039B2 (ja) | 化合物の結合効率が向上した絹糸 | |
| CN105400817B (zh) | 利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法 | |
| CN102604953A (zh) | 家蚕表皮蛋白BmCP274启动子及其重组表达载体和应用 | |
| CN114957485B (zh) | 一种含多种蜘蛛腺丝蛋白的高强度蚕丝及其制备方法 | |
| CN105463022B (zh) | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的方法 | |
| CN114150016A (zh) | 一种金黄色丝绵专用型家蚕品种的培育方法 | |
| Hu et al. | Rapid production of chimeric silkworm/spider silk with improved mechanical properties by infection of nonpermissive Bombyx mori with recombinant AcMNPV harboring native-size of spidroin genes | |
| CN105907786B (zh) | 用于表达t4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其应用与方法 | |
| CN102604954B (zh) | 家蚕表皮蛋白BmCP231启动子及其重组表达载体和应用 | |
| WO2017067423A1 (zh) | 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白的方法 | |
| CN110317252A (zh) | 云斑蛛牵引丝性能及其丝蛋白基因序列 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |