CN105400815B - 利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法。先构建家蚕合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的载体pBac[3xP3‑DsRed]‑MaSp1质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，利用piggyBac转座子的转座特性使红色荧光蛋白基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，制成转基因家蚕，蚕蛾自交使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合，育成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕。本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕丝腺细胞特异地合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，用于蜘蛛丝的开发利用，同时也可以用于提高蚕丝的机械性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种家蚕合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用转基因技术的一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法。
背景技术
蜘蛛种类繁多，至今在全世界已命名的蜘蛛有112个科，3905个属，44000多种。蜘蛛丝是由蜘蛛丝腺分泌的一种天然高分子蛋白纤维，具有优良的机械性能，如弹性好、强度大、韧性强、耐高温和低温、耐冲击、比重小、生物相容性好、以及生物可降解等优良特性，其独特的综合性能是其他天然纤维和合成纤维所无法相比的。典型的蜘蛛丝有7种类型，分别由7种不同丝腺分泌的不同的蛋白质分子组成。其中由大囊状腺(Major ampullate gland)分泌的主牵引丝(dragline silk)，呈放射状分布，构成蜘蛛网基本框架。牵引丝的强度是钢的5倍，因而拥有“生物钢”之美誉。牵引丝的蛋白基因是高度保守的，主要由分子量350kDa左右的、成对的牵引丝蛋白1(MaSp1)和牵引丝蛋白2(MaSp2)2种蛋白组成。
黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)牵引丝蛋白1(MaSp1)基因具有一个单一外显子，全长9390bp，编码3129个氨基酸，基因含有大量的重复单元，每1个重复单元由4种初级类型重复序列Type1、Type2、Type3和Type4通过头尾串联而成(Type1-Type2-Type3-Type4)，而每1种初级类型重复序列都包含了典型的(GA)n、An和GGX蛋白基序。碱基和蛋白序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。MaSp1被认为是牵引丝具有很强强度的主要分子基础。
由于蜘蛛丝自身的产量低，且由于其相互残杀而不能通过大规模的饲养获得批量的蜘蛛丝，所以限制了蜘蛛丝的广泛应用。随着生物技术的快速发展和对蜘蛛丝的编码序列及吐丝机理的深入了解，已有采用各种异源表达系统来表达蜘蛛丝蛋白的研究，异源表达系统包括大肠杆菌、酵母(Pichia pastoris)、昆虫细胞(sf9、BmN)、仓鼠的肾脏细胞、转基因土豆、转基因烟草、转基因山羊、转基因老鼠、以及转基因家蚕。
但是，至今为止使用的各种异源表达系统表达出来的蜘蛛丝蛋白的分子量较小，有较多重组蛋白缺少一些关键的蛋白基序，有较多蛋白不是纯的蜘蛛丝蛋白分子，而是与荧光蛋白等分子融合的融合蛋白，这些因素最终影响了外源蛋白的机械性能。因此，现有技术缺少了一种方法能分泌出尽可能长的、单一蜘蛛丝蛋白分子的蜘蛛丝。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法，利用转基因家蚕技术将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因导入家蚕基因组内，并在家蚕丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌单一的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的家蚕，获得以家蚕丝为本底的黑寡妇蜘蛛牵引丝，用于蜘蛛丝的开发利用，同时也可以用于提高蚕丝的机械性能。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
(1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因载体，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒(如图1～图3所示)以piggyBac转座子为基础包含外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；
(2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因插入到家蚕基因组内；
(3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；
(4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
(5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；
(6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕；
(7)通过家蚕丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
所述的质粒pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3Promoter–DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和家蚕丝素蛋白重链基因3’末端的表达框，即Fibroin H chain Promoter-Fibroin H chain signal peptide-MaSp1-Fibroin H chainPolyA。
所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因长度是包含2倍到16倍MaSp1基因重复单元Type1-Type2-Type3-Type4。
所述步骤(7)的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白重链信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并随吐丝行为分泌到蚕茧。
本发明是先构建家蚕合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因的载体pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1，再利用显微注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(如图4所示)一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使红色荧光蛋白基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因导入到家蚕基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种能够在家蚕丝腺细胞特异性合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕，自交使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合，育成能分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕，然后利用该种家蚕合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1。
本发明具有的有益效果是：
本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕丝腺细胞特异地合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1具有功能活性。本发明开发了一种新型的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1生产工艺，为大量生产黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1奠定了基础，同时也为提高蚕丝的机械性能奠定了基础。
附图说明
图1是家蚕后部丝腺细胞合成分泌重组黑寡妇牵引丝蛋白1的pBac[3×P3-DsRed]-MaSp1×2质粒结构图。
图2是家蚕后部丝腺细胞合成分泌重组黑寡妇牵引丝蛋白1的pBac[3×P3-DsRed]-MaSp1×12质粒结构图。
图3是家蚕后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇重组牵引丝蛋白1的pBac[3×P3-DsRed]-MaSp1×16质粒结构图。
图4是本发明涉及的piggyBac转座酶的辅助质粒结构图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明的实施例如下：
本发明的三个实施例中的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×2质粒、pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×12质粒和pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×16质粒采用以下方式制备合成：
A)先将家蚕丝素重链蛋白基因启动子(Fib-H-P)连到pMD18-T simple(Takara)载体，并和基本的含有A3启动子(其碱基序列如SEQ ID NO.3)和绿色荧光蛋白(其碱基序列如SEQ ID NO.4)表达框的piggyBac质粒piggy6212载体(其碱基序列如SEQ ID NO.5)分别经过XhoI/NcoI双酶切，胶回收重链启动子序列部分与piggyBac载体骨架连接，获得piggy6609载体(其碱基序列如SEQ ID NO.6)。
B)pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒构建方法和步骤如下：
根据已经报导的全长黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因(MaSp1)序列特征设计质粒，并根据家蚕的密码子偏好性作了碱基优化，详细信息如下。
人工合成家蚕丝素重链蛋白基因的信号肽、2倍的MaSp1分子的重复单元序列(其碱基序列和表达的蛋白序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)、MaSp1分子的C末端(其碱基序列和表达的蛋白序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)、家蚕丝素重链蛋白基因的C末端(其碱基序列和表达的蛋白序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)及其PolyA的序列(如SEQ ID NO.13)以及后续载体构建所需的酶切位点序列，将这些序列连接到pUC57载体上，命名为pUC4423质粒，该质粒含2倍MaSp1基因重复单元序列。
将pUC4423质粒分别利用2个同尾酶SpeI和NheI酶切，依次与不同倍数的重复单元序列连接起来，其叠加过程的具体操作步骤如下：
pUC4423质粒用SpeI/HindШ双酶切，回收长度为1698bp含2倍MaSp1基因重复单元的片段，pUC4423用NheI/HindШ双酶切，回收长度为3457bp含2倍MaSp1基因重复单元的片段，连接上述1698bp片段和3457bp片段，获得pUC5155质粒(含4倍MaSp1基因重复单元)；
pUC5155质粒用SpeI/HindШ双酶切，回收长度为2430bp含4倍MaSp1基因重复单元的片段，pUC5155用NheI/HindШ双酶切，回收长度为4189bp含4倍MaSp1基因重复单元的片段，连接上述2430bp片段和4189bp片段，获得pUC6619质粒(含8倍MaSp1基因重复单元)；
pUC6619质粒用SpeI/HindШ双酶切，回收长度为3894bp含8倍MaSp1基因重复单元的片段，pUC6619用NheI/HindШ双酶切，回收长度为5653bp含8倍MaSp1基因重复单元的片段，连接上述3894bp片段和5653bp片段，获得pUC9547质粒(含16倍MaSp1基因重复单元，其碱基序列和表达的蛋白序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15)；
将上述的2430bp片段(含4倍的MaSp1片段)与5653bp的片段(含8倍的MaSp1基因重复单元)连接，获得pUC8083质粒(含12倍MaSp1基因重复单元，其碱基序列和表达的蛋白序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17)；
将上述含有2、8、12、16倍数MaSp1基因重复单元序列的质粒用NcoI/MunI双酶切回收含有不同长度重复单元片段以及组成元件的序列片段，同时将上述A)已构建好的包含重链启动子和piggyBac骨架的载体piggy6609用同样的限制性内切酶酶切，回收包含piggyBac载体骨架及重链启动子序列元件的目的片段，并分别与上述不同长度重复单元片段连接，获得piggy7540、piggy9736、piggy11200和piggy12664载体，piggy7540载体包含有2倍MaSp1基因重复单元序列，piggy9736载体包含有8倍MaSp1基因重复单元序列，piggy11200载体包含有12倍MaSp1基因重复单元序列，piggy12664载体包含有16倍MaSp1基因重复单元序列。
将piggy7540、piggy9736、piggy11200和piggy12664载体分别用BglII/AflII双酶切，回收包含有不同长度的MaSp1基因重复单元和piggyBac载体骨架的目的片段，对含有3×P3启动子-红眼基因表达框和A3启动子-绿色荧光蛋白表达框的载体piggy7785(其碱基序列如SEQ ID NO.18)用同样的酶切，回收1230bp含有3×P3启动子和标记基因DsRed编码框的目的片段，分别连接两目的片段以加上DsRed标记基因。具体的操作步骤如下：
piggy7785载体用AflⅢ/BglⅡ双酶切，回收1230bp的片段。
piggy7540载体用AflⅡ/BglⅡ双酶切，回收7198bp的片段，并与1230bp的片段连接，获得pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×2载体(含2倍MaSp1基因重复单元，其2倍MaSp1的重复碱基如SEQ ID NO.7，其表达的蛋白序列如SEQ ID NO.8)(图1)；
piggy11200载体用AflⅡ/BglⅡ双酶切，回收10858pb的片段，并与1230pb的片段连接，获得pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×12载体(含12倍MaSp1基因重复单元，其12倍MaSp1的重复单元序列如SEQ ID NO.16，其表达的蛋白序列如SEQ ID NO.17)(图2)；
piggy12664载体用AflⅡ/BglⅡ双酶切，回收12322bp的片段，并与1230bp的片段连接，获得pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×16载体(含16倍MaSp1基因重复单元，其16倍MaSp1的重复单元序列如SEQ ID NO.14，其表达的蛋白序列如SEQ ID NO.15)(图3)。
实施例1：
将上述构建的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×2质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图4)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕2蛾，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G4代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示2个蛾区的后代插入位点都是在第3号染色体14033724位点处，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。
从G5代开始选择红眼基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕新品种，定名为MASP1-2。
提取MASP1-2家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Western blot技术分析转基因家蚕MASP1-2蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1占蚕丝轻链含量高达3.1％。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示(下表1)，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高19.31％，最大应变提高9.71％，杨氏模量提高13.51％，韧性提高32.82％。
表1实施例1转基因家蚕MASP1-2茧丝机械性能测定结果
研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因已插入到转基因家蚕新品种MASP1-2基因组的第3染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。
实施例2：
将上述构建的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×12质粒(图2)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图4)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕10蛾，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G4代时，随机取4个蛾区的5龄第3天家蚕各1条，提取后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示MASP1-12-1这个蛾区的后代插入位点是在第5号染色体17280911位点处，MASP1-12-5插入位点是在第8号染色体11229702位点处，MASP1-12-10插入位点是在第8号染色体11385343位点处，MASP1-12-8插入位点是在第9号染色体13448009位点处，证明转座子已经插入到每一个转基因家蚕家系的基因组内。
从G5代开始选择红眼基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕新品种，定名为MASP1-12。
提取上述测定插入位点的4个家系的家蚕茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Western blot技术分析转基因家蚕MASP1-12蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1占蚕丝轻链含量最高达2.4％。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示(下表2)，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高58.82％，最大应变提高19.93％，杨氏模量提高38.93％，韧性提高89.94％。
表2实施例2转基因家蚕MASP1-12茧丝机械性能测定结果
上述研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因已插入到4个转基因家蚕家系MASP1-12基因组的不同染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。
实施例3：
将上述构建的pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×16质粒(图3)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图4)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕16蛾，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G4代时，随机取4个蛾区的5龄第3天家蚕各1条，提取后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示MASP1-16-2这个蛾区的后代插入位点是在第18号染色体11456596位点处，MASP1-16-6插入位点是在第6号染色体5682251位点处，MASP1-16-8和MASP1-16-14这2个家系的插入位点都是在第10号染色体3608552位点处，证明转座子已经插入到每一个转基因家蚕家系的基因组内。
从G5代开始选择红眼基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕新品种，定名为MASP1-16。
提取上述测定插入位点的4个家系的家蚕茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Western blot技术分析转基因家蚕MASP1-16蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1占蚕丝轻链含量最高达2.3％。
对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示(下表3)，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高61.34％，最大应变提高29.17％，杨氏模量提高43.32％，韧性提高96.90％。
表3实施例3转基因家蚕MASP1-16茧丝机械性能测定结果
上述研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因已插入到4个转基因家蚕家系MASP1-16基因组的不同染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。
综合从上述3个实施例可以看出，利用本发明方法，可以在家蚕丝腺细胞高效合成黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1可以像蚕丝一样由丝腺分泌进入腺腔，并进一步吐出蚕体。该性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够大量生产黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，能够提高蚕丝机械性能，能够提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
(1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因载体，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒以piggyBac转座子为基础包含外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；
所述的质粒pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3Promoter–DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和家蚕丝素蛋白重链基因3’末端的表达框，即Fibroin H chain Promoter-Fibroin H chain signal peptide-(2-16)xMaSp1-FibroinH chain PolyA；
所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因序列长度是包含2倍到16倍的MaSp1基因重复单元Type1-Type2-Type3-Type4；MaSp1基因重复单元Type1-Type2-Type3-Type4基因序列如SEQID NO.1；
(2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因插入到家蚕基因组内；
(3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；
(4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
(5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；
(6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕；
(7)通过家蚕丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
2.根据权利要求1所述的一种利用家蚕丝腺生物反应器合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的方法，其特征在于：所述步骤(7)的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白重链信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并随吐丝行为分泌到蚕茧。
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