CN104846011A

CN104846011A - 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法

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Publication number: CN104846011A
Application number: CN201510119160.2A
Authority: CN
Inventors: 钟伯雄; 钱秋杰; 叶露鹏; 尤征英; 车家倩; 王少华; 宋佳; 张玉玉
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-03-18
Filing date: 2015-03-18
Publication date: 2015-08-19

Abstract

本发明公开了一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法。先构建家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的载体pBMRJP1质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，利用piggyBac转座子的转座特性使红色荧光蛋白基因和蜂王浆主蛋白1基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，制成转基因家蚕，自交使蜂王浆蛋白1基因纯合，育成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕。本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕后部丝腺细胞特异地合成分泌蜂王浆主蛋白1，蜂王浆主蛋白1制品具有生物活性，开发了一种新型的蜂王浆主蛋白1生产工艺，简化提纯方法，降低生产成本，为大量生产蜂王浆主蛋白1奠定了基础。

Description

利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法

技术领域

本发明涉及一种用家蚕合成蛋白的方法，尤其是涉及转基因技术的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法。

背景技术

蜂王浆是工蜂哺育蜂咽下腺分泌的用来饲喂蜂王幼虫和1-3龄工蜂幼虫的食物，也是决定蜜蜂极型分化的关键物质。蜂王和工蜂具有相同的遗传背景，但是蜂王一直饲喂蜂王浆，寿命可以达到数年之久，而且产卵高峰期的产卵量可以达到2000多粒卵/日，工蜂寿命一般只有一个月左右。通过蜂王浆饲喂果蝇也发现，新鲜蜂王浆能延长寿命，并且促进雌性卵巢发育，提高繁殖力。同时蜂王浆也具有延缓衰老、抗氧化、提高免疫活性、促进细胞增殖和预防癌症等生物学活性。蜂王浆由蛋白质、氨基酸、有机酸、维生素、无机盐和水等多种物质组成，其中蛋白质包括非可溶性蛋白和可溶性蛋白，可溶性蛋白占总蛋白含量的一半以上，称为蜂王浆主蛋白(Major royal jolly proteins，MRJPs)。目前已经发现的MRJPs主要有10种，研究的比较清楚的是MRJP1-MRJP5，而王浆主蛋白中含量最高的是MRJP1，达到可溶蛋白含量的48％。

研究发现蜂王浆主蛋白1(Major royal jolly protein 1，MRJP1)是决定蜜蜂级型分化的关键因子，而且MRJP1具有缩短果蝇发育时间、提高雌性繁殖力和延长寿命的作用，进一步的研究表明，MRJP1是通过参与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor)代谢通路来实现以上功能的。通过对比新鲜蜂王浆和40℃存放7日已经降解的蜂王浆的生物学特性，发现MRJP1具有促进原代培养的鼠肝细胞分裂的作用，具有促进肝脏细胞形成和保护的作用。MRJP1和胰蛋白酶消化后的MRJP1也具有刺激巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α，起到抗肿瘤的作用。来源于MRJP1的肽段能够抑制血管紧张素酶(angiotensinI-converting enzyme，ACE)活性，起到治疗高血压疾病的功能。

中华蜜蜂蜂王浆主蛋白1(AccMRJP1)基因已经测序成功，该基因全长1462bp，编码区序列全长1302bp，可编码长433个氨基酸的糖基化蛋白，其中包含一段20个氨基酸的信号肽序列。序列分析发现，中华蜜蜂和西方蜜蜂的cDNA之间同源性达到93.78％，氨基酸序列之间同源性为90.5％。

家蚕生物反应器具有对外源蛋白进行糖基化修饰的功能，利用家蚕后部丝腺生物反应器大量生产蜂王浆主蛋1，为蜂王浆主蛋白1生物学功能研究提供支持。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，利用转基因家蚕技术将蜂王浆主蛋白1基因导入家蚕基因组内，并在家蚕后部丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌蜂王浆主蛋白1的家蚕，通过家蚕后部丝腺细胞分泌的蜂王浆主蛋白1可以在茧层中用磷酸盐缓冲液直接提取，为提高蜂王浆主蛋白1的生产效率、降低生产成本奠定基础。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：

(1)采用分子生物学方法构建用于家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的质粒pBMRJP1，质粒pBMRJP1包含有作为外源基因的蜂王浆主蛋白1基因和红色荧光DsRed标记基因表达框；

(2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBMRJP1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用piggyBac转座子将蜂王浆主蛋白1基因插入到家蚕基因组内；

(3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；

(4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；

(5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；

(6)从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育，同蛾区蚕蛾交配，经连续3代同样方法的选择、交配，育成红眼基因和蜂王浆主蛋白1基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕；

(7)通过家蚕后部丝腺细胞合成分泌蜂王浆主蛋白1，并随该转基因家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。

所述的质粒pBMRJP1是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因以用于质粒的扩增和筛选，质粒pBMRJP1包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以用于目的片段转座，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3 Promoter-DsRed-SV40，以用作转基因阳性家蚕的筛选标记；另一个功能表达框是包含蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六个组氨酸标签His-Tag、肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列、蜂王浆主蛋白1基因(MRJP1编码基因)和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-FibroinL chain signal peptide-His tag-DDDDK-MRJP1-Fibroin L chain SV40 PolyA，六个组氨酸标签His-Tag用于提纯外源蛋白，肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列用于去除六个组氨酸标签。

所述的辅助质粒pHA3PIG质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂PBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3Promoter-transposase-SV40 PolyA。

所述的蜂王浆主蛋白1基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信号肽的作用下，分泌到后部丝腺腺腔，并依次进入中部丝腺和前部丝腺，直到蚕茧。

本发明是先构建家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的载体pBMRJP1质粒，再利用显微注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使红色荧光蛋白基因和蜂王浆主蛋白1基因导入到家蚕基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种能够在家蚕后部丝腺细胞特异性合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕，自交使蜂王浆主蛋白1基因纯合，育成能分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕，然后利用该种转基因家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1。

本发明具有的有益效果是：

本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕后部丝腺细胞特异地合成分泌蜂王浆主蛋白1，蜂王浆主蛋白1制品具有生物活性，开发了一种新型的蜂王浆主蛋白1生产工艺，简化提纯方法，降低生产成本，为大量生产蜂王浆主蛋白1奠定了基础。

附图说明

图1是本发明pBMRJP1质粒结构图。

图2是能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒结构图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的实施例如下：

实施例1：

pBMRJP1质粒构建方法和步骤如下：

设计蜂王浆主蛋白1(Major royal jelly protein 1，MRJP1)的上游引物MRJP1-F：5’-gatgatgataagagcagcattcttcgaggagaa-3’，下游引物MRJP1-R：5’-ttacagatgtattgaaattttgaaagg-3’，采用PCR技术扩增MRJP1基因。MRJP1 PCR反应体系如表1所示，MRJP1 PCR反应条件如表2所示。

表1 MRJP1 PCR反应体系

名称	成分
		PrimeSTAR HS Polymerase	0.25ul
5×PrimeSTAR Buffer	2.5ul
		dNTP Mixture	2ul
上游引物DDDDK-MRJP1-F	1ul
		下游引物MRJP1-R	1ul
MRJP1质粒	0.1ul
		ddH₂O	up to 25

表2 MRJP1 PCR反应条件

上述DDDDK为肠激酶酶切位点的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳回收后插入到PMD-19质粒中，并挑选阳性菌落测序，测序正确的质粒标记为pMRJP1-PMD19。p7801质粒为本实验室构建保存，该质粒包含piggyBac转座子的左右臂(左右臂的碱基序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)、3×P3启动子(如SEQID NO.3)启动的红色荧光蛋白基因(碱基和氨基酸分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)和丝素蛋白轻链基因启动子(如SEQ ID NO.7)。pMRJP1-PMD19和p7801质粒用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切，琼脂糖电泳后回收目的片段进行连接，获得质粒pBM。人工合成一段DNA序列，该序列包括丝素蛋白轻链信号肽序列(如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13)和His6标签序列(如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9)，以及5’端3’端的BamHI和XbaI酶切位点，命名为pFLSP-His6质粒，该质粒序列为：ggatccatgaagcctatatttttggtattactcgtcgttacaagcgcctacgctgcaccacatcatcatcatcatcatcctctaga。将pBM和pFLSP-His6质粒用BamHI和XbaI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段并连接获得pBSP-M质粒。设计上游引物PA-F：gtcgacataagaactgtaaataatgtatata和下游引物PA-R：aagcttcttaaggtgtgactgcttcggactacattct，PCR扩增家蚕品种P50基因组丝素蛋白轻链基因3’polyA序列(家蚕丝素蛋白轻链基因(FL)3’末端序列如SEQ ID NO.16，polyA序列如SEQ ID NO.6)。丝素轻链Poly A PCR反应体系如表3所示，丝素轻链Poly A PCR反应条件如表4所示。

表3 丝素轻链Poly A PCR反应体系

名称	成分
		PrimeSTAR HS Polymerase	0.25ul
5×PrimeSTAR Buffer	2.5ul
		dNTP Mixture	2ul
上游引物PA-F	1ul
		下游引物PA-R	1ul
Lan10基因组	0.5ul
		ddH₂O	up to 25ul

表4 丝素轻链Poly A PCR反应条件

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后连接到PMD-19载体中，并挑选阳性菌落测序，测序结果正确的质粒命名为pFLPA质粒。将pBSP-M和pFLPA质粒用SalI和HindⅢ双酶切，酶切产物经电泳回收目的片段后连接，获得Pbsp-M-PA质粒。将7801和pBSP-M-PA质粒用EcoRI和AflⅡ双酶切后电泳回收目的片段，连接获得最终质粒pBMRJP1(图1)。

将上述构建的pBMRJP1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕1蛾，含有转基因阳性蚕4条，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使蜂王浆主蛋白1基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。

在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增MRJP1基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是在Bm_scaf 4、第16号染色体3038004处，插入位点的左侧序列为：GCTGCGTTTTTGAACAACAGTAAGTAGCTTATTACGAAAATGTCGACGCATCCTCCTTCTTTCACGAAGCTTAATTAAAGTAACTTTCAAGATTCAAAGAACACGGAGGATGCTCTTTTACCGTGAAAGTGCAAAACCCTTTAAATAATGATGAAAATAACATTTTAGCGGGGAAGAAATCGATAATAAACTTTAA--piggyBac，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。

从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，经连续3代选择、交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕新品种，定名为MRJP1-1(碱基和氨基酸序列分别如SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15)。

提取MRJP1-1家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和His Tag标签抗体的Western blot技术分析转基因家蚕MRJP1蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，蜂王浆主蛋白1占蛋白溶液中总蛋白含量达5.8％，占茧层重的0.42％，即每克茧子中可获得4.2mg蜂王浆主蛋白1。

采用磷酸缓冲液提取蚕茧可溶性蛋白，利用His Tag的特性，用GE公司的AKTA Purifier蛋白纯化仪、Ni离子柱对血清白蛋白进行亲和层析纯化，在结合缓冲液为20mM磷酸缓冲液、500mM NaCl、pH＝8.0；洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液、500mM NaCl、500mM咪唑、pH＝6.8；咪唑浓度梯度洗脱情况下，获得纯化的蜂王浆主蛋白1。

研究结果证明蜂王浆主蛋白1基因已插入到转基因家蚕新品种MRJP1-1基因组的第16染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌蜂王浆主蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。蚕茧中的蜂王浆主蛋白1能够用磷酸缓冲液提取，用Ni离子柱亲和层析纯化。

实施例2：

本实施例的pBMRJP1质粒构建方法和步骤与实施例1相同。

将pBMRJP1质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.5μg/μl，质粒溶解在pH＝7、含有5mM氯化钠的0.5mM磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后5小时以内的受精卵内，导入总体积为5nl。将显微注射的蚕卵在25℃，80％湿度，12h光照条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代(G1代)。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕1蛾，含有转基因阳性蚕15条，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代(G2)。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使蜂王浆主蛋白1基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。

在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增MRJP1基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是在Bm_scaf 53、第14号染色体14690162处，插入位点的左侧序列为：GTCTTTGAATTTGTAGTAAGAATTACCAGCACGAAATGATTGCACACAAAGAGGTAGACTGTATATTAACTAAACTGATTTTAATACTTTCTAGAAACTAAGCTAGGGTGGTTAGACTTATTGGTTATGCATAATCAAATTTACTATTACTGTGTGTGTACTATTTAAATTCATCTGGAATGTCTAGGAAAGCTATGTCTCTAAAATCATGCATGCTTTGTTTCACTGCACAAAATTAAAATTACGAAATAAAATAATTGAAAAGTTCATGTTTTTTAA--piggyBac，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。

从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，经连续3代选择、交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕新品种，定名为MRJP1-2。

提取MRJP1-2家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和His Tag标签抗体的Western blot技术分析转基因家蚕MRJP1蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，蜂王浆主蛋白1占蛋白溶液中总蛋白含量达10.8％，占茧层重的0.78％，即每克茧子中可获得7.8mg蜂王浆主蛋白1。

研究结果证明蜂王浆主蛋白1基因已插入到转基因家蚕新品种MRJP1-2基因组的第14染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌蜂王浆主蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。蚕茧中的蜂王浆主蛋白1能够用磷酸缓冲液提取，用Ni离子柱亲和层析纯化。

实施例3：

本实施例的pBMRJP1质粒构建方法和步骤与实施例1相同。

将pBMRJP1质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.45μg/μl，质粒溶解在pH＝7、含有4mM氯化钠的0.6mM磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后4小时以内的受精卵内，导入总体积为12nl。将显微注射的蚕卵在25℃，85％湿度，12h光照条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕交配续代(G1代)。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕1蛾，含有转基因阳性蚕2条。将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代(G2)。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使蜂王浆主蛋白1基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。

在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增MRJP1基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是在Bm_scaf 7、第21号染色体8245717处，插入位点的左侧序列为：GATCGTTGTTTTGGTCGAGTTAAAGTTAGAATTTGGAAATCGAAATAAAAAAATAACACGTTTTATAAATAGGATCATGGCAAAGGATTTTTCAGATATAGATAAAAATAAATTCTCAATAGTCGAAATGTCAAATCGCCACTTCGGTTACAGATAATACTCGTAATAGGTACCCACGCCTTTAA--piggyBac，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。

从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，经连续3代选择、交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕新品种，定名为MRJP1-3。

提取MRJP1-3家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和His Tag标签抗体的Western blot技术分析转基因家蚕MRJP1蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，蜂王浆主蛋白1占蛋白溶液中总蛋白含量达7.9％，占茧层重的0.57％，即每克茧子中可获得5.7mg蜂王浆主蛋白1。

研究结果证明蜂王浆主蛋白1基因已插入到转基因家蚕新品种MRJP1-3基因组的第21染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌蜂王浆主蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。蚕茧中的蜂王浆主蛋白1能够用磷酸缓冲液提取，用Ni离子柱亲和层析纯化。

从上述3个实施例可以看出，利用本发明方法，可在家蚕后部丝腺细胞高效合成蜂王浆主蛋白1，蜂王浆主蛋白1可像蚕丝一样由后部丝腺分泌进入中部丝腺，并进一步经过前部丝腺而吐出蚕体，可采用磷酸缓冲液提取，采用AKTAPurifier蛋白纯化仪纯化。最后家蚕的该性状已能够稳定表达并遗传，由此采用本方法能够大量生产王浆主蛋白1，简化提纯方法，降低生产成本，保证蜂王浆主蛋白1制品的生物活性，并且能够提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入，具有突出显著的技术效果。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

本发明涉及的基因和氨基酸序列具体如下：

SEQ ID NO.1：piggyBac转座子的左转座臂(PBL)碱基序列

来源：piggyBac转座子

TTAACCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCTTGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTTTGCAATTTAGGACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCGGCTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTAAGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGATTATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTAATATTGTTATTTCATGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCGTGACTAATATATAATAAAATGGGATGTTCTTTAGACGATGAGCATATCCTCTCTGCTCAGC

SEQ ID NO.2：piggyBac转座子的右转座臂(PBR)碱基序列

来源：piggyBac转座子

AAAGTTTTGTTACTTTAGAAGAAATTTTGAGTTTTTGTTTTTTTTTAATAAATAAATAAACATAAATAAATTGTTTGTTGAATTTATTATTAGTATGTAAGTGTAAATATAATAAAACTTAATATCTATTCAAATTAATAAATAAACCTCGATATACAGACCGATAAAAACACATGCGTCAATTTTACGCATGATTATCTTTAACGTACGTCACAATATGATTATCTTTCTAGGGTTAA

SEQ ID NO.3：3×P3启动子碱基序列

来源：3×P3启动子

GCCCGGGGATCTAATTCAATTAGAGACTAATTCAATTAGAGCTAATTCAATTAGGATCCAAGCTTATCGATTTCGAACCCTCGACCGCCGGAGTATAAATAGAGGCGCTTCGTCTACGGAGCGACAATTCAATTCAAACAAGCAAAGTGAACACGTCGCTAAGCGAAAGCTAAGCAAATAAACAAGCGCAGCTGAACAAGCTAAACAATCGGGGTACCGCTAGAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCAC

SEQ ID NO.4：红色荧光蛋白(DsRed)编码基因碱基序列

来源：DsRed红色荧光蛋白

ATGGTGCGCTCCTCCAAGAACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCCACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAAGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAG

SEQ ID NO.5：红色荧光蛋白(DsRed)编码基因氨基酸序列

来源：DsRed红色荧光蛋白

MVRSSKNVIKEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGCFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKPVQLPGYYYVDSKLDITSHNEDYTIVEQYERTEGRHHLFL

SEQ ID NO.6：SV40 Poly A碱基序列

来源：SV40的3’序列

AGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA

SEQ ID NO.7：家蚕丝素蛋白轻链基因(FL)启动子碱基序列

来源：家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因启动子

CGCATATTGGACATCCCTTTTCTTGACATCGTATAAATTCGGTAATTCTCGGTACGGTTCGGAAAGTGCACCTGCGGCTATATTCAGACTCGCCAAGTTACGTCAGTCGTATTGTAATGAGCGATTTAGTGGGCAACTTCATTCTGTTAATTTTGTGTCACGGTGCGCGCGCATCGTAAAATTTCACTCTCATAGATTTTTCATAACGTGCCTAAAGAAGTATAACTTCAATAATTTAAATTAAAAAAAAAAACATGCATAGAATAATTATATGAATTATTTAAAATGTCATTTACCGACATTGACATAACAGACGACGTTAACACTACAAAACATTTTAATTCCACATTGTTACATATTCAACAGTTAAATTTGCGTTAATTCTCGATGCGAACAAATATAAGAACAATCGGATCAATTAGATCGCTTTGTTTCGAGCAACACTTAGTTTAACTAGAGGCGTACACCTCAAGAAATCATCTTCATTAGAAACTAAACCTTAAAATCGCAATAATAAAGCATAGTCAATTTTAACTGAAATGCAAAATCTTTTGAACGTTAGATGCTGTCAGCGTTCGTTGGTACAGTTGTTTGATATTTATTTTAATTGTCTTTTTATATATAAATAGTGGAACATTAATCACGGAATCCTGTATAGTATATACCGATTGGTCACATAACAGACCACTAAA

SEQ ID NO.8：六个组氨酸标签(His-Tag)碱基序列

来源：六个组氨酸

CATCATCATCATCATCAT

SEQ ID NO.9：六个组氨酸标签(His-Tag)氨基酸序列

来源：六个组氨酸

HHHHHH

SEQ ID NO.10：肠激酶酶切位点(DDDDK)碱基序列

来源：肠激酶酶切位点

GATGATGATGATAAG

SEQ ID NO.11：肠激酶酶切位点(DDDDK)氨基酸序列

来源：肠激酶酶切位点

DDDDK

SEQ ID NO.12：丝素蛋白轻链基因(FL)信号肽碱基序列

来源：家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因信号肽

ATGAAGCCTATATTTTTGGTATTACTCGTCGTTACAAGCGCCTACGCTGCACCA

SEQ ID NO.13：丝素蛋白轻链基因(FL)信号肽氨基酸序列

来源：家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因信号肽

MKPIFLVLLVVTSAYAAP

SEQ ID NO.14：蜂王浆主蛋白1(MRJP1)编码基因碱基序列

来源：蜂王浆主蛋白1

AGCAGCATTCTTCGAGGAGAATCTTTAAACAAATCATTAAGCGTCCTTCACGAATGGAAATTCTTTGATTATGATTTCGATAGCGATGAAAGAAGACAAGATGCAATTCTATCTGGCGAATACGACTACAGGAAAAATTATCCATCCGACGTTGATCAATGGCATGGTAAGATTTTTGTCACCATGCTAAGATACAATGGCGTACCTTCCTCTTTGAACGTGATATCTAAAAAGATCGGTGATGGTGGACCTCTTCTTCAACCTTATCCCGATTGGTCGTTTGCTAAATATGACGATTGCTCTGGAATCGTGAGCGCCACAAAACTTGCGATCGACAAATGCGACAGATTGTGGGTTCTGGACTCAGGTCTTGTCAATAATACTCAACCCATGTGTTCTCCAAAACTGCTCACCTTTGATCTGACTACCTCGCAGTTGCTCAAGCAAGTCGAAATACCGCATGATGTTGCCGTAAATGCCACCACAGGAAAGGGAAGACTATCATCTCTAGCTGTTCAACCTTTAGATTGCAATATAAATGGTGATACTATGGTATACATAGCAGACGAGAAAGGTGAAGGTTTAATCGTGTATCATGATTCTGATAATTCTTTCCATCGATTGACTTCCAAAACTTTCGATTACGATCCTAAATTTACCAAAATGACGATCAATGGAGAAAGTTTCACAACGCAAAATGGAATTTCTGGAATGGCTCTTAGTCCCATGACTAACAATCTCTATTACAGTCCTGTAGCTTCTACCAGTTTGTACTATGTTAACACGGAACAATTCAGAACATCCAATTATGAACAAAATGCCGTACATTATGAAGGAGTTCAAAATATTTTGGATACCCAATCGTCTGCTAAAGTAGTATCGAAAAGTGGCGTCCTCTTCTTCGGACTGGTGGGCGATTCAGCTCTTGGCTGCTGGAACGAACATCGATCACTTGAAAGACACAATATCCGTACCGTCGCTCAAAGTGATGAGACACTTCAAATGATCGTTGGCATGAAGATTAAGGAAGCCCTTCCACACGTGCCCATATTCGATAGATATATAAACCGTGAATACATATTGGTTTTAAGTAACAGAATGCAAAAAATGGCGAATAATGACTATAACTTCAACGATGTAAACTTCAGAATTATGGACGCTAATGTAAATGACTTGATATTGAACACTCGTTGCGAAAATCCTAATAATGATGACACACCTTTCAAAATTTCAATACATCTGTAA

SEQ ID NO.15：蜂王浆主蛋白1(MRJP1)编码基因氨基酸序列

来源：蜂王浆主蛋白1

SSILRGESLNKSLSVLHEWKFFDYDFDSDERRQDAILSGEYDYRKNYPSDVDQWHGKIFVTMLRYNGVPSSLNVISKKIGDGGPLLQPYPDWSFAKYDDCSGIVSATKLAIDKCDRLWVLDSGLVNNTQPMCSPKLLTFDLTTSQLLKQVEIPHDVAVNATTGKGRLSSLAVQPLDCNINGDTMVYIADEKGEGLIVYHDSDNSFHRLTSKTFDYDPKFTKMTINGESFTTQNGISGMALSPMTNNLYYSPVASTSLYYVNTEQFRTSNYEQNAVHYEGVQNILDTQSSAKVVSKSGVLFFGLVGDSALGCWNEHRSLERHNIRTVAQSDETLQMIVGMKIKEALPHVPIFDRYINREYILVLSNRMQKMANNDYNFNDVNFRIMDANVNDLILNTRCENPNNDDTPFKISIHL

SEQ ID NO.16：家蚕丝素蛋白轻链基因(FL)3’末端序列

来源：家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因

ATAAGAACTGTAAATAATGTATATATATAATTATATAAAAGATATATATAAACCATATACAAACATATATATATCATTATAAGACAATCTACCTATATAAAAACAGACTAAAATTAATAATTATGTATACTTTAATTGTGTTTAGGACATTTTATGCAAATTGTGTTTGCGTTAGGATTTTTTTTGGAAGTTTTTTAGATTATTTATGAATATATAAATAAATATACGTTAATATAATATATATTATATAAATCAACGACACGGCTTTTCATTTTGGTGATGATCAATCTTATTGTTCTTCTAATTGATTTTTTTGTACAATAAAGATGTATCCAGTTTTCCAGATAAAGAATTTAGTTTGTTATTTCTGGCCCCATTAAAATAAGTACGGTATTCGATAATACCATATACCATACGGCATATACAATGGATTTCGGTGCTGTTGTCAATTGCTTTCCAACTGGAGAGACTGTATGCGATTTTTTTCATGTATTCGGAGATTAAGCTGCGAAACATACAAAAATGTACCTTATTTTTTCATCGCATTAGGCACAATTCACTTTAATAAAGCCCCTATAACGAGAATGTAGTCCGAAGCAGTCACAC

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 379

<212> DNA

<213> piggyBac转座子

<400> 1

ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60

tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt ttgcaattta ggacatctca gtcgccgctt 120

ggagctcggc tgaggcgtgc ttgtcaatgc ggtaagtgtc actgattttg aactataacg 180

accgcgtgag tcaaaatgac gcatgattat cttttacgtg acttttaaga tttaactcat 240

acgataatta atattgttat ttcatgttct acttacgtga taacttatta tatatatatt 300

ttcttgttat agatatcgtg actaatatat aataaaatgg gatgttcttt agacgatgag 360

catatcctct ctgctcagc 379

<210> 2

<211> 239

<212> DNA

<213> piggyBac转座子

<400> 2

aaagttttgt tactttagaa gaaattttga gtttttgttt ttttttaata aataaataaa 60

cataaataaa ttgtttgttg aatttattat tagtatgtaa gtgtaaatat aataaaactt 120

aatatctatt caaattaata aataaacctc gatatacaga ccgataaaaa cacatgcgtc 180

aattttacgc atgattatct ttaacgtacg tcacaatatg attatctttc tagggttaa 239

<210> 3

<211> 263

<212> DNA

<213> 3×P3启动子

<400> 3

gcccggggat ctaattcaat tagagactaa ttcaattaga gctaattcaa ttaggatcca 60

agcttatcga tttcgaaccc tcgaccgccg gagtataaat agaggcgctt cgtctacgga 120

gcgacaattc aattcaaaca agcaaagtga acacgtcgct aagcgaaagc taagcaaata 180

aacaagcgca gctgaacaag ctaaacaatc ggggtaccgc tagagtcgac ggtaccgcgg 240

gcccgggatc caccggtcgc cac 263

<210> 4

<211> 681

<212> DNA

<213> DsRed红色荧光蛋白

<400> 4

atggtgcgct cctccaagaa cgtcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 60

ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 120

ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 180

atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg tgaagcaccc cgccgacatc 240

cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 300

gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccaa gactcctccc tgcaggacgg ctgcttcatc 360

tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag 420

accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc 480

gagatccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagtcc 540

atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact actacgtgga ctccaagctg 600

gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg caccgagggc 660

cgccaccacc tgttcctgta g 681

<210> 5

<211> 226

<212> PRT

<213> DsRed红色荧光蛋白

<400> 5

Met Val Arg Ser Ser Lys Asn Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys

1 5 10 15

Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys

35 40 45

Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro

50 55 60

Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile

65 70 75 80

Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

85 90 95

Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser

100 105 110

Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val

115 120 125

Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp

130 135 140

Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly

145 150 155 160

Glu Ile His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val

165 170 175

Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly

180 185 190

Tyr Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp

195 200 205

Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu

210 215 220

Phe Leu

225

<210> 6

<211> 229

<212> DNA

<213> SV40的3'序列

<400> 6

agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac 60

acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg 120

cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 180

tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatctta 229

<210> 7

<211> 692

<212> DNA

<213> 家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因启动子

<400> 7

cgcatattgg acatcccttt tcttgacatc gtataaattc ggtaattctc ggtacggttc 60

ggaaagtgca cctgcggcta tattcagact cgccaagtta cgtcagtcgt attgtaatga 120

gcgatttagt gggcaacttc attctgttaa ttttgtgtca cggtgcgcgc gcatcgtaaa 180

atttcactct catagatttt tcataacgtg cctaaagaag tataacttca ataatttaaa 240

ttaaaaaaaa aaacatgcat agaataatta tatgaattat ttaaaatgtc atttaccgac 300

attgacataa cagacgacgt taacactaca aaacatttta attccacatt gttacatatt 360

caacagttaa atttgcgtta attctcgatg cgaacaaata taagaacaat cggatcaatt 420

agatcgcttt gtttcgagca acacttagtt taactagagg cgtacacctc aagaaatcat 480

cttcattaga aactaaacct taaaatcgca ataataaagc atagtcaatt ttaactgaaa 540

tgcaaaatct tttgaacgtt agatgctgtc agcgttcgtt ggtacagttg tttgatattt 600

attttaattg tctttttata tataaatagt ggaacattaa tcacggaatc ctgtatagta 660

tataccgatt ggtcacataa cagaccacta aa 692

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 六个组氨酸

<400> 8

catcatcatc atcatcat 18

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 六个组氨酸

<400> 9

His His His His His His

1 5

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 肠激酶酶切位点

<400> 10

gatgatgatg ataag 15

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 肠激酶酶切位点

<400> 11

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因信号肽

<400> 12

atgaagccta tatttttggt attactcgtc gttacaagcg cctacgctgc acca 54

<210> 13

<211> 18

<212> PRT

<213> 家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因信号肽

<400> 13

Met Lys Pro Ile Phe Leu Val Leu Leu Val Val Thr Ser Ala Tyr Ala

1 5 10 15

Ala Pro

<210> 14

<211> 1245

<212> DNA

<213> 蜂王浆主蛋白1

<400> 14

agcagcattc ttcgaggaga atctttaaac aaatcattaa gcgtccttca cgaatggaaa 60

ttctttgatt atgatttcga tagcgatgaa agaagacaag atgcaattct atctggcgaa 120

tacgactaca ggaaaaatta tccatccgac gttgatcaat ggcatggtaa gatttttgtc 180

accatgctaa gatacaatgg cgtaccttcc tctttgaacg tgatatctaa aaagatcggt 240

gatggtggac ctcttcttca accttatccc gattggtcgt ttgctaaata tgacgattgc 300

tctggaatcg tgagcgccac aaaacttgcg atcgacaaat gcgacagatt gtgggttctg 360

gactcaggtc ttgtcaataa tactcaaccc atgtgttctc caaaactgct cacctttgat 420

ctgactacct cgcagttgct caagcaagtc gaaataccgc atgatgttgc cgtaaatgcc 480

accacaggaa agggaagact atcatctcta gctgttcaac ctttagattg caatataaat 540

ggtgatacta tggtatacat agcagacgag aaaggtgaag gtttaatcgt gtatcatgat 600

tctgataatt ctttccatcg attgacttcc aaaactttcg attacgatcc taaatttacc 660

aaaatgacga tcaatggaga aagtttcaca acgcaaaatg gaatttctgg aatggctctt 720

agtcccatga ctaacaatct ctattacagt cctgtagctt ctaccagttt gtactatgtt 780

aacacggaac aattcagaac atccaattat gaacaaaatg ccgtacatta tgaaggagtt 840

caaaatattt tggataccca atcgtctgct aaagtagtat cgaaaagtgg cgtcctcttc 900

ttcggactgg tgggcgattc agctcttggc tgctggaacg aacatcgatc acttgaaaga 960

cacaatatcc gtaccgtcgc tcaaagtgat gagacacttc aaatgatcgt tggcatgaag 1020

attaaggaag cccttccaca cgtgcccata ttcgatagat atataaaccg tgaatacata 1080

ttggttttaa gtaacagaat gcaaaaaatg gcgaataatg actataactt caacgatgta 1140

aacttcagaa ttatggacgc taatgtaaat gacttgatat tgaacactcg ttgcgaaaat 1200

cctaataatg atgacacacc tttcaaaatt tcaatacatc tgtaa 1245

<210> 15

<211> 414

<212> PRT

<213> 蜂王浆主蛋白1

<400> 15

Ser Ser Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Asn Lys Ser Leu Ser Val Leu

1 5 10 15

His Glu Trp Lys Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Asp Ser Asp Glu Arg Arg

20 25 30

Gln Asp Ala Ile Leu Ser Gly Glu Tyr Asp Tyr Arg Lys Asn Tyr Pro

35 40 45

Ser Asp Val Asp Gln Trp His Gly Lys Ile Phe Val Thr Met Leu Arg

50 55 60

Tyr Asn Gly Val Pro Ser Ser Leu Asn Val Ile Ser Lys Lys Ile Gly

65 70 75 80

Asp Gly Gly Pro Leu Leu Gln Pro Tyr Pro Asp Trp Ser Phe Ala Lys

85 90 95

Tyr Asp Asp Cys Ser Gly Ile Val Ser Ala Thr Lys Leu Ala Ile Asp

100 105 110

Lys Cys Asp Arg Leu Trp Val Leu Asp Ser Gly Leu Val Asn Asn Thr

115 120 125

Gln Pro Met Cys Ser Pro Lys Leu Leu Thr Phe Asp Leu Thr Thr Ser

130 135 140

Gln Leu Leu Lys Gln Val Glu Ile Pro His Asp Val Ala Val Asn Ala

145 150 155 160

Thr Thr Gly Lys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ala Val Gln Pro Leu Asp

165 170 175

Cys Asn Ile Asn Gly Asp Thr Met Val Tyr Ile Ala Asp Glu Lys Gly

180 185 190

Glu Gly Leu Ile Val Tyr His Asp Ser Asp Asn Ser Phe His Arg Leu

195 200 205

Thr Ser Lys Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Lys Phe Thr Lys Met Thr Ile

210 215 220

Asn Gly Glu Ser Phe Thr Thr Gln Asn Gly Ile Ser Gly Met Ala Leu

225 230 235 240

Ser Pro Met Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Val Ala Ser Thr Ser

245 250 255

Leu Tyr Tyr Val Asn Thr Glu Gln Phe Arg Thr Ser Asn Tyr Glu Gln

260 265 270

Asn Ala Val His Tyr Glu Gly Val Gln Asn Ile Leu Asp Thr Gln Ser

275 280 285

Ser Ala Lys Val Val Ser Lys Ser Gly Val Leu Phe Phe Gly Leu Val

290 295 300

Gly Asp Ser Ala Leu Gly Cys Trp Asn Glu His Arg Ser Leu Glu Arg

305 310 315 320

His Asn Ile Arg Thr Val Ala Gln Ser Asp Glu Thr Leu Gln Met Ile

325 330 335

Val Gly Met Lys Ile Lys Glu Ala Leu Pro His Val Pro Ile Phe Asp

340 345 350

Arg Tyr Ile Asn Arg Glu Tyr Ile Leu Val Leu Ser Asn Arg Met Gln

355 360 365

Lys Met Ala Asn Asn Asp Tyr Asn Phe Asn Asp Val Asn Phe Arg Ile

370 375 380

Met Asp Ala Asn Val Asn Asp Leu Ile Leu Asn Thr Arg Cys Glu Asn

385 390 395 400

Pro Asn Asn Asp Asp Thr Pro Phe Lys Ile Ser Ile His Leu

405 410

<210> 16

<211> 606

<212> DNA

<213> 家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因

<400> 16

ataagaactg taaataatgt atatatataa ttatataaaa gatatatata aaccatatac 60

aaacatatat atatcattat aagacaatct acctatataa aaacagacta aaattaataa 120

ttatgtatac tttaattgtg tttaggacat tttatgcaaa ttgtgtttgc gttaggattt 180

tttttggaag ttttttagat tatttatgaa tatataaata aatatacgtt aatataatat 240

atattatata aatcaacgac acggcttttc attttggtga tgatcaatct tattgttctt 300

ctaattgatt tttttgtaca ataaagatgt atccagtttt ccagataaag aatttagttt 360

gttatttctg gccccattaa aataagtacg gtattcgata ataccatata ccatacggca 420

tatacaatgg atttcggtgc tgttgtcaat tgctttccaa ctggagagac tgtatgcgat 480

ttttttcatg tattcggaga ttaagctgcg aaacatacaa aaatgtacct tattttttca 540

tcgcattagg cacaattcac tttaataaag cccctataac gagaatgtag tccgaagcag 600

tcacac 606

Claims

1. 一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

（1）采用分子生物学方法构建用于家蚕合成分泌蜂王浆主蛋白1的质粒pBMRJP1，质粒pBMRJP1包含有作为外源基因的蜂王浆主蛋白1基因和红色荧光DsRed标记基因表达框；

（2）采用显微注射转基因家蚕方法将pBMRJP1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用piggyBac转座子将蜂王浆主蛋白1基因插入到家蚕基因组内；

（3）蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代成为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；

（4）G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；

（5）G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；

（6）从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的方式再连续3代进行选择和交配，育成红眼基因和蜂王浆主蛋白1基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌蜂王浆主蛋白1的转基因家蚕；

（7）通过该转基因家蚕后部丝腺细胞合成分泌蜂王浆主蛋白1，该蜂王浆主蛋白1随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。

2. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其特征在于：所述的质粒pBMRJP1是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质粒pBMRJP1包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框；一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3 Promoter –DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六个组氨酸标签His-Tag、肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列、蜂王浆主蛋白1基因和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His tag-DDDDK-MRJP1- Fibroin L chain PolyA，六个组氨酸标签His-Tag用于提纯外源蛋白，肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列用于去除六个组氨酸标签。

3. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其特征在于：所述的辅助质粒pHA3PIG质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂PBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3 Promoter-transposase- SV40 PolyA。

4. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法，其特征在于：所述的蜂王浆主蛋白1基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信号肽的作用下分泌到后部丝腺腺腔，并依次进入中部丝腺、前部丝腺直到蚕茧。