CN105400817A - 利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法。具体是将能够合成、分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的转基因家蚕品种杂交，育成杂交品种；另一方面进一步通过同蛾区阳性个体自交留种，选择出2个牵引丝蛋白基因都纯合的品种。本发明借助家蚕丝腺细胞特异地合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2转基因家蚕，利用杂交育种技术育成能够同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的杂交品种和纯系品种，用于蜘蛛丝的开发利用，同时也可以用于提高蚕丝的机械性能。

Description

利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法

技术领域

本发明涉及一种家蚕合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用转基因技术的一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法。

背景技术

蜘蛛种类繁多，至今在全世界已命名的蜘蛛有112个科，3905个属，44000多种。蜘蛛丝是由蜘蛛丝腺分泌的一种天然高分子蛋白纤维，具有优良的机械性能，如弹性好、强度大、韧性强、耐高温和低温、耐冲击、比重小、生物相容性好、以及生物可降解等优良特性，其独特的综合性能是其他天然纤维和合成纤维所无法相比的。典型的蜘蛛丝有7种类型，分别由7种不同丝腺分泌的不同的蛋白质分子组成。其中由大囊状腺(Majorampullategland)分泌的主牵引丝(draglinesilk)，呈放射状分布，构成蜘蛛网基本框架。牵引丝的强度是钢的5倍，因而拥有“生物钢”之美誉。牵引丝的蛋白基因是高度保守的，主要由分子量350kDa左右的、成对的牵引丝蛋白1(MaSp1)和牵引丝蛋白2(MaSp2)2种蛋白组成。

黑寡妇蜘蛛(Latrodectushesperus)牵引丝蛋白1(MaSp1)基因具有一个单一外显子，全长9390bp，编码3129个氨基酸，基因含有大量的重复单元，每1个重复单元由4种初级类型重复序列Type1、Type2、Type3和Type4通过头尾串联而成(Type1-Type2-Type3-Type4)，而每1种初级类型重复序列都包含了典型的(GA)n、An和GGX蛋白基序。MaSp1被认为是牵引丝具有很强强度的主要分子基础。

黑寡妇蜘蛛(Latrodectushesperus)牵引丝蛋白2(MaSp2)基因具有一个单一外显子，全长11340bp，编码3779个氨基酸，基因含有大量的重复单元，每一个重复单元主要由2种初级类型重复序列以Type1-Type1-Type4串联而成，而每一种初级类型重复序列都包含了典型的An、GPGXX和GGX蛋白基序。MaSp2被认为是牵引丝具有很强韧性的主要分子基础。

由于蜘蛛丝自身的产量低，且由于其相互残杀而不能通过大规模的饲养获得批量的蜘蛛丝，所以限制了蜘蛛丝的广泛应用。随着生物技术的快速发展和对蜘蛛丝的编码序列及吐丝机理的深入了解，已有采用各种异源表达系统来表达蜘蛛丝蛋白的研究，异源表达系统包括大肠杆菌、酵母(Pichiapastoris)、昆虫细胞(sf9、BmN)、仓鼠的肾脏细胞、转基因土豆、转基因烟草、转基因山羊、转基因老鼠、以及转基因家蚕。

但是，至今为止使用的各种异源表达系统表达出来的蜘蛛丝蛋白1的分子量较小，有较多重组蛋白缺少一些关键的蛋白基序，有较多蛋白不是纯的蜘蛛丝蛋白分子，而是与荧光蛋白等分子融合的融合蛋白，这些因素最终影响了外源蛋白的机械性能，而且至今为止使用的各种异源表达系统都没有表达过蜘蛛牵引丝蛋白2。因此，现有技术缺少了一种方法能同时合成、分泌出黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的蜘蛛丝。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种将能够合成、分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的转基因家蚕品种杂交，育成杂交品种。另一方面进一步通过同蛾区阳性个体自交留种，选择出2个牵引丝蛋白基因都纯合的品种。利用转基因家蚕技术结合杂交育种技术，将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因同时导入家蚕基因组内，并在家蚕丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的家蚕，获得以家蚕丝为本底的黑寡妇蜘蛛牵引丝，用于蜘蛛丝的开发利用，同时也可以用于提高蚕丝的机械性能。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：

(1)通过转基因育成带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕和带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕；

(2)将上述两种转基因家蚕品种杂交，育成F1代杂交品种；

(3)将F1代杂交品种同蛾区个体自交留种为F2代，F2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕饲养，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成F3代；

(4)F3代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下所有个体全部表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾在同一蛾区饲养，并同时采用WesternBlot技术检测，筛选出同时表达黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的蛾区的蚕蛾相互交配制成F4代；

(5)F4代开始均采用与F3代同样的方法饲养、筛选、制种，一直到F8代，育成两个黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白基因都纯合的家蚕品种；

(6)通过家蚕丝腺细胞同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。

所述步骤(1)带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕采用以下方式培育获得：

A1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因载体，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒以piggyBac转座子为基础包含外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；

A2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因插入到家蚕基因组内；

A3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；

A4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；

A5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；

A6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕。

所述的质粒pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3Promoter–DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和家蚕丝素蛋白重链基因3’末端的表达框，即FibroinHchainPromoter-FibroinHchainsignalpeptide-MaSp1-FibroinHchainPolyA。

所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因是包含2倍到16倍MaSp1基因重复单元Type1-Type2-Type3-Type4，1倍的MaSp2基因重复单元Type1-Type2-Type3-Type4碱基序列如SEQIDNO.1。

所述步骤(1)带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕采用以下方式培育获得：

B1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因载体，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒以piggyBac转座子为基础包含有作为外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；

B2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因插入到家蚕基因组内；

B3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；

B4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；

B5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；

B6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕。

所述的质粒pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3Promoter–DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因和家蚕丝素蛋白重链基因3’末端的表达框，即FibroinHchainPromoter-FibroinHchainsignalpeptide-MaSp2-FibroinHchainPolyA。

所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因是包含3倍到24倍MaSp2基因重复单元Type1-Type1-Type4，1倍的MaSp2基因重复单元Type1-Type1-Type4碱基序列如SEQIDNO.2。

所述步骤(6)的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白重链信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并随吐丝行为分泌到蚕茧。

本发明具有的有益效果是：

本发明借助能够合成、分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的转基因家蚕品种的杂交，育成杂交品种，并另一方面进一步通过同蛾区阳性个体自交留种，选择出2个牵引丝蛋白基因都纯合的品种，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2都具有功能活性。本发明开发了一种新型的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的生产工艺，为大量生产黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2奠定了基础，同时也为提高蚕丝的机械性能奠定了基础。

附图说明

图1是实施例pBac[3×P3-DsRed]-MaSp1×2质粒结构图。

图2是实施例pBac[3×P3-DsRed]-MaSp1×12质粒结构图。

图3是实施例pBac[3×P3-DsRed]-MaSp1×16质粒结构图。

图4是本发明涉及的piggyBac转座酶的辅助质粒结构图。

图5是实施例pBac[3×P3-DsRed]-MaSp2×24质粒结构图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的实施例如下：

A)以下各个实施例中带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕具体获得过程如下：

采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒(图1)，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒可以为pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×2质粒、pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×12质粒和pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×16质粒，其采用以下方式制备合成：

A.1)先将家蚕丝素重链蛋白基因启动子(Fib-H-P)连到pMD18-Tsimple(Takara)载体，并和基本的含有A3启动子和绿色荧光蛋白表达框的piggyBac质粒piggy6212载体分别经过XhoI/NcoI双酶切，胶回收重链启动子序列部分与piggyBac载体骨架连接，获得piggy6609载体。

A.2)pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒构建方法和步骤如下：

根据已经报导的全长黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因(MaSp1)序列特征设计质粒，并根据家蚕的密码子偏好性作了碱基优化，详细信息如下。

人工合成家蚕丝素重链蛋白基因的信号肽、2倍的MaSp1分子的重复单元序列、MaSp1分子的C末端(其碱基序列如SEQIDNO.3)、家蚕丝素重链蛋白基因的C末端及其PolyA的序列以及后续载体构建所需的酶切位点序列，将这些序列连接到pUC57载体上，命名为pUC4423质粒，该质粒含2倍MaSp1基因重复单元序列。

将pUC4423质粒分别利用2个同尾酶SpeI和NheI酶切，依次与不同倍数的重复单元序列连接起来，通过叠加过程获得含4倍、8倍、12倍或者16倍MaSp1基因重复单元的质粒。然后将上述含有2、8、12和16倍数MaSp1基因重复单元序列的质粒用NcoI/MunI双酶切回收含有不同长度重复单元片段以及组成元件的序列片段，同时将上述已构建好的包含重链启动子和piggyBac骨架的载体piggy6609用同样的限制性内切酶酶切，回收包含piggyBac载体骨架及重链启动子序列元件的目的片段，并分别与上述不同长度重复单元片段连接，获得piggy7540、piggy9736、piggy11200和piggy12664载体，piggy7540载体包含有2倍MaSp1基因重复单元序列，piggy9736载体包含有8倍MaSp1基因重复单元序列，piggy11200载体包含有12倍MaSp1基因重复单元序列，piggy12664载体包含有16倍MaSp1基因重复单元序列。

将piggy7540、piggy9736、piggy11200和piggy12664载体分别用BglII/AflII双酶切，回收包含有不同长度的MaSp1基因重复单元和piggyBac载体骨架的目的片段，对含有3×P3启动子-红眼基因表达框和A3启动子-绿色荧光蛋白表达框的载体piggy7785用同样的酶切，回收1230bp含有3×P3启动子和标记基因DsRed编码框的目的片段，分别连接两目的片段以加上DsRed标记基因，从而获得pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×2质粒(图1)、pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×12质粒(图2)和pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1×16质粒(图3)。

A.3)再将已构建的上述pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒和能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图4)按1:1比率混合，两种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察，分别获得表达DsRed标志基因的、含2倍、12倍和16倍MaSp1基因重复单元的转基因家蚕2蛾、10蛾和16蛾，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。

在G4代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用InversePCR扩增黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示转座子已经插入到转基因家蚕的基因组内。

从G5代开始选择红眼基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕新品种，含2倍、12倍和16倍MaSp1基因重复单元的转基因家蚕分别定名为MASP1-2、MASP1-12和MASP1-16。

B)以下各个实施例中带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕具体获得过程如下：

采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒(图5)，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒可以为pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×3质粒、pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×12质粒、pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×18质粒和pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×24质粒，其采用以下方式制备合成：

B.1)先将家蚕丝素重链蛋白基因启动子(Fib-H-P)连到pMD18-Tsimple(Takara)载体，并和基本的含有A3启动子和绿色荧光蛋白表达框的piggyBac质粒piggy6212载体分别经过XhoI/NcoI双酶切，胶回收重链启动子序列部分与piggyBac载体骨架连接，获得piggy6609载体。

B.2)pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒构建方法和步骤如下：

根据已经报导的全长黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因(MaSp2)序列特征设计质粒，并根据家蚕的密码子偏好性作了碱基优化，详细信息如下。

人工合成家蚕丝素重链蛋白基因的信号肽、3倍的MaSp2基因重复单元序列、MaSp2分子的C末端(其碱基序列如SEQIDNO.4)、家蚕丝素重链蛋白基因的C末端及其PolyA的序列、以及后续载体构建所需的酶切位点序列，将这些序列连接到pUC57载体上，命名为pUC4301质粒，该质粒含3倍MaSp2基因重复单元序列。

将pUC4301质粒分别利用2个同尾酶SpeI和NheI酶切，依次将不同倍数的重复单元序列连接起来，通过叠加过程获得含6倍、12倍、18倍和24倍MaSp2基因重复单元的质粒。

将上述获得的含有不同倍数的MaSp2基因重复单元序列的质粒用NcoI/MunI双酶切，回收含有重复片段以及组成元件的序列片段，将上述已构建好的包含重链启动子和piggyBac骨架的载体Piggy6609用同样的限制性内切酶酶切，回收包含piggyBac载体骨架及重链启动子序列元件的目的片段，分别与上述不同长度重复单元片段连接，获得piggy7471、piggy9433、piggy10741和piggy12049载体。piggy7471载体包含有3倍MaSp2基因重复单元序列，piggy9433载体包含有12倍MaSp2基因重复单元序列，piggy10741载体包含有18倍MaSp2基因重复单元序列，piggy12049载体包含有24倍MaSp2基因重复单元序列。

将piggy7471、piggy9433、piggy10741和piggy12049载体分别用BglII/AflII双酶切，分别回收包含有不同长度MaSp2基因重复单元和piggyBac载体骨架的目的片段，对含有3×P3启动子-红眼基因表达框和A3启动子-绿色荧光蛋白表达框的载体piggy7785用同样的酶切，回收1230bp含有3×P3启动子和标记基因DsRed编码框的目的片段，分别连接两目的片段以加上DsRed标记基因，从而获得pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×3质粒、pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×12质粒、pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×18质粒和pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×24质粒(图5)。

B.3)再将已构建的上述pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×3质粒或pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2×24质粒，与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图4)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察，分别获得表达DsRed标志基因的、含3倍和24倍MaSp2基因重复单元的转基因家蚕3蛾和5蛾。

将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。

在G4代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用InversePCR扩增黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示转座子已经插入到家蚕基因组内。

从G5代开始选择红眼基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕新品种，含3倍和24倍MaSp2基因重复单元的转基因家蚕分别定名为MASP2-3和MASP2-24。

实施例1：

选取黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因已插入到家蚕基因组的第3染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕品种MASP1-2-1，以及黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到基因组的25号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕家系MASP2-3-1，将这2个品种杂交，定名为MASP1-2×2-3。

提取MASP1-2×2-3家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP1-2×2-3蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的2条特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1占蚕丝轻链含量高达2.1％。黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量高达1.1％。

对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高了20.5％，最大应变提高9.8％，杨氏模量提高14.0％，韧性提高33.9％。

研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因能够同时在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，这2个蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。

实施例2：

选取黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因已插入到家蚕基因组的第5染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕品种MASP1-12-1，以及黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到基因组的22号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕家系MASP2-24-1，将这2个品种杂交，定名为MASP1-12×2-24。

提取MASP1-12×2-24家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP1-12×2-24蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的2条特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1占蚕丝轻链含量高达2.2％。黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量高达1.4％。

对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高了62.3％，最大应变提高30.4％，杨氏模量提高28.1％，韧性提高98.9％。

研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因能够同时在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，这2个蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。

实施例3：

选取黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因已插入到家蚕基因组的第10染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕品种MASP1-16-8，以及黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到基因组的22号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕家系MASP2-24-5，将这2个品种杂交，定名为MASP1-16-8×2-24-5。

提取MASP1-16-8×2-24-5家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP1-16-8×2-24-5蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的2条特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1占蚕丝轻链含量高达1.9％。黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量高达1.0％。

对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高了57.3％，最大应变提高27.4％，杨氏模量提高41.1％，韧性提高92.9％。

研究结果证明黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因能够同时在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，这2个蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。

实施例4：

选取黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因已插入到家蚕基因组的第6染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕品种MASP1-16-6，以及黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到基因组的22号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕家系MASP2-24-1，将这2个品种杂交，得F1代。

将F1代杂交品种同蛾区个体自交留种为F2代，F2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕饲养，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成F3代。

F3代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下所有个体全部表达红色荧光DsRed标记基因的蛾区饲养，并同时采用WesternBlot技术检测，筛选出同时表达黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的蛾区的蚕蛾相互交配制成F4代。

F4代开始，采用F3代同样方法饲养、筛选、制种，一直到F8代，育成2个牵引丝蛋白基因都纯合的品种；定名为MASP1-16-6×2-24-1-HO。

采用与野生型家蚕品种杂交2次以检测外源基因的纯化性。具体方法是取MASP1-16-6×2-24-1-HO的6个蛾子与野生型家蚕品种杂交得F1代，F1代的家蚕全部表现红色荧光DsRed标志基因，每1个F1代分别取2个蛾子进一步再与野生型家蚕品种杂交得F2代，每一个F2代蛾区的家蚕都有3/4的个体表现红色荧光DsRed标志基因，证明MASP1-16-6×2-24-1-HO品种的外源基因-黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因已经纯合。

提取MASP1-16-6×2-24-1-HO家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP1-16-6×2-24-1-HO蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的2条特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1占蚕丝轻链含量高达1.8％。黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量高达1.3％。

对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高了67.3％，最大应变提高33.2％，杨氏模量提高44.3％，韧性提高97.2％。

研究结果证明MASP1-16-6×2-24-1-HO品种的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因已经纯合，能够同时在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，这2个蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。

实施例5：

选取黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因已插入到家蚕基因组的第18染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕品种MASP1-16-2，以及黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到基因组的11号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕家系MASP2-24-3，将这2个品种杂交，得F1代。

将F1代杂交品种同蛾区个体自交留种为F2代，F2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕饲养，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成F3代。

F3代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下所有个体全部表达红色荧光DsRed标记基因的蛾区饲养，并同时采用WesternBlot技术检测，筛选出同时表达黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的蛾区的蚕蛾相互交配制成F4代。

F4代开始，采用F3代同样方法饲养、筛选、制种，一直到F8代，育成2个牵引丝蛋白基因都纯合的品种；定名为MASP1-16-2×2-24-3-HO。

采用与野生型家蚕品种杂交2次以检测外源基因的纯化性。具体方法是取MASP1-16-2×2-24-3-HO的6个蛾子与野生型家蚕品种杂交得F1代，F1代的家蚕全部表现红色荧光DsRed标志基因，每1个F1代分别取2个蛾子进一步再与野生型家蚕品种杂交得F2代，每一个F2代蛾区的家蚕都有3/4的个体表现红色荧光DsRed标志基因，证明MASP1-16-2×2-24-3-HO品种的外源基因-黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因已经纯合。

提取MASP1-16-2×2-24-3-HO家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP1-16-2×2-24-3-HO蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的2条特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1占蚕丝轻链含量高达1.8％。黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量高达1.3％。

对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高了65.6％，最大应变提高31.8％，杨氏模量提高45.6％，韧性提高95.3％。

研究结果证明MASP1-16-2×2-24-3-HO品种的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因已经纯合，能够同时在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，这2个蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。

实施例6：

选取黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因已插入到家蚕基因组的第10染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕品种MASP1-16-14，以及黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因已插入到基因组的26号染色体内，并能够在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧的转基因家蚕家系MASP2-24-4，将这2个品种杂交，得F1代。

将F1代杂交品种同蛾区个体自交留种为F2代，F2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕饲养，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成F3代。

F3代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下所有个体全部表达红色荧光DsRed标记基因的蛾区饲养，并同时采用WesternBlot技术检测，筛选出同时表达黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的蛾区的蚕蛾相互交配制成F4代。

F4代开始，采用F3代同样方法饲养、筛选、制种，一直到F8代，育成2个牵引丝蛋白基因都纯合的品种；定名为MASP1-16-14×2-24-4-HO。

采用与野生型家蚕品种杂交2次以检测外源基因的纯化性。具体方法是取MASP1-16-14×2-24-4-HO的6个蛾子与野生型家蚕品种杂交得F1代，F1代的家蚕全部表现红色荧光DsRed标志基因，每1个F1代分别取2个蛾子进一步再与野生型家蚕品种杂交得F2代，每一个F2代蛾区的家蚕都有3/4的个体表现红色荧光DsRed标志基因，证明MASP1-16-14×2-24-4-HO品种的外源基因-黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因已经纯合。

提取MASP1-16-14×2-24-4-HO家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和黑寡妇蜘蛛牵引丝抗体的Westernblot技术分析转基因家蚕MASP1-16-14×2-24-4-HO蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的2条特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1占蚕丝轻链含量高达2.0％。黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2占蚕丝轻链含量高达1.7％。

对转基因家蚕丝的机械性能测定结果显示，与野生型对照品种Lan10相比，最大应力提高了69.4％，最大应变提高33.9％，杨氏模量提高46.3％，韧性提高97.1％。

研究结果证明MASP1-16-14×2-24-4-HO品种的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因已经纯合，能够同时在丝腺细胞合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，这2个蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，转基因家蚕丝的机械性能得到显著改善。

综合从上述6个实施例可以看出，利用本发明方法在家蚕丝腺细胞高效合成了黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2可以像蚕丝一样由丝腺分泌进入腺腔，并进一步吐出蚕体，且该性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够大量生产黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，能够提高蚕丝机械性能，能够提高蚕桑经济效益，提高蚕农的收入。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

(1)通过转基因育成带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕和带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕；

(2)将上述两种转基因家蚕品种杂交，育成F1代杂交品种；

(3)将F1代杂交品种同蛾区个体自交留种为F2代，F2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕饲养，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成F3代；

(4)F3代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下所有个体全部表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾在同一蛾区饲养，并同时采用WesternBlot技术检测，筛选出同时表达黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的蛾区的蚕蛾相互交配制成F4代；

(5)F4代开始均采用与F3代同样的方法饲养、筛选、制种，一直到F8代，育成两个黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白基因都纯合的家蚕品种；

(6)通过家蚕丝腺细胞同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。

2.根据权利要求1所述的一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法，其特征在于：

所述步骤(1)带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕采用以下方式培育获得：

A1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因载体，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒以piggyBac转座子为基础包含外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；

A2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因插入到家蚕基因组内；

A3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；

A4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；

A5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；

A6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因纯合、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1的转基因家蚕。

3.根据权利要求1所述的一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法，其特征在于：

所述步骤(1)带有红色荧光DsRed标记基因、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕采用以下方式培育获得：

B1)采用分子生物学方法构建pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒作为在家蚕丝腺中表达的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因载体，pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒以piggyBac转座子为基础包含有作为外源基因的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因和作为标记基因的红色荧光DsRed基因表达框；

B2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2质粒中的piggyBac转座子将黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因插入到家蚕基因组内；

B3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；

B4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；

B5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；

B6)从G4代开始并经连续3代采用红眼表型纯一的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成红眼基因和黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因纯合、能够合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2的转基因家蚕。

4.根据权利要求2所述的一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法，其特征在于：

所述的质粒pBac[3xP3-DsRed]-MaSp1是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3Promoter–DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因和家蚕丝素蛋白重链基因3’末端的表达框，即FibroinHchainPromoter-FibroinHchainsignalpeptide-MaSp1-FibroinHchainPolyA。

5.根据权利要求3所述的一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法，其特征在于：

所述的质粒pBac[3xP3-DsRed]-MaSp2是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3Promoter–DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白重链基因信号肽、黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因和家蚕丝素蛋白重链基因3’末端的表达框，即FibroinHchainPromoter-FibroinHchainsignalpeptide-MaSp2-FibroinHchainPolyA。

6.根据权利要求1、2或4所述的一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法，其特征在于：所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1基因是包含2倍到16倍MaSp1基因重复单元Type1-Type2-Type3-Type4。

7.根据权利要求1、3或5所述的一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法，其特征在于：所述的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白2基因是包含3倍到24倍MaSp2基因重复单元Type1-Type1-Type4。

8.根据权利要求1～7任一所述的一种利用家蚕同时合成分泌黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2的方法，其特征在于：所述步骤(6)的黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白1和蛋白2基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白重链信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并随吐丝行为分泌到蚕茧。