CN104903445B - 后部绢丝腺基因表达单元及具有其的转基因绢丝虫 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于，提供一种在以家蚕为代表的绢丝虫的后部绢丝腺中可以大量地表达重组肽、特别是水溶性肽的后部绢丝腺基因表达单元；及该基因表达单元被转入其中的转基因绢丝虫。提供一种后部绢丝腺基因表达单元，其包含：编码在后部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的基因的启动子、与该启动子的下游功能性地连接的编码来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽的DNA、及连接于其下游的编码不含有分泌作为丝心蛋白的构成成分的蛋白质的目标肽的DNA。

Description

后部绢丝腺基因表达单元及具有其的转基因绢丝虫

技术领域

本发明涉及一种可以在绢丝虫诸如家蚕的后部绢丝腺中大量地表达目标肽的后部绢丝腺基因表达单元及具有其的转基因绢丝虫。

背景技术

家蚕(Bombyx mori)的绢丝腺具有可以在短期间内合成大量蛋白质的能力。另外，由于家蚕的绢丝腺为大型器官，因此容易摘除，另外还具有如下优点：由于所合成的蛋白质被贮藏在绢丝腺内腔，所以容易回收。因此，在绢丝腺中表达目标蛋白质的转基因蚕具有作为蛋白质的大量生产系统的前景。

家蚕的绢丝腺在形态学上为图1所示的左右1对器官，分别由前部绢丝腺、中部绢丝腺及后部绢丝腺这3个区域构成。在后部绢丝腺细胞内，构成作为绢丝的纤维成分的丝心蛋白的3种主要的蛋白质，丝心蛋白H链(以下，经常简称为“Fib H”)、丝心蛋白L链(以下，经常简称为“Fib L”)、及p25/FHX(以下，称为“p25”)进行表达。另外，在中部绢丝腺细胞内，作为绢丝的包覆成分的明胶样蛋白质，丝胶蛋白进行表达(图1)。在后部绢丝腺细胞内表达的上述3种蛋白质以Fib H：Fib L：p25＝6：6：1的比率形成复合体(silk fibroin elementaryunit；本说明书中，以下称为“SFEU复合体”。)，在后部绢丝腺内腔中被分泌。与此相对，丝胶蛋白在表达后在中部绢丝腺内腔中被分泌。在后部绢丝腺内腔中被分泌的丝心蛋白其后转移至中部绢丝腺内腔，用丝胶蛋白包覆而作为绢丝吐丝(图1：非专利文献1)。因此，将家蚕绢丝腺作为蛋白质表达系统利用的情况下，利用在中部绢丝腺或后部绢丝腺中特异性地表达的基因表达系统即可。

将家蚕绢丝腺作为蛋白质表达系统利用的情况下，迄今为止，确立了作为使用中部绢丝腺的重组蛋白质表达系统的GAL4/UAS系统(非专利文献2)、或利用组合丝胶蛋白1启动子及Hr3增强子的系统的大量表达方法(非专利文献3)。

另一方面，已知后部绢丝腺中的蛋白质合成能力为中部绢丝腺的蛋白质合成能力的约3倍(非专利文献4)。因此，如果从生产方面判断，与中部绢丝腺相比，后部绢丝腺作为蛋白质表达系统是更优选的。另外，在后部绢丝腺中所生产的重组蛋白质与茧丝同时分泌，因此还适于作为绢纤维利用(非专利文献5)。

但是，由迄今为止的研究得知：虽然其它丝心蛋白的构成蛋白质正常地表达，但在Fib H中存在异常的家蚕的突变品系(Nd品系)和在Fib L中存在异常的家蚕的突变品系(Nd-s品系及Nd-s^D品系)几乎不能吐丝(非专利文献6)。另外，由上述突变品系的分析表明：在向后部绢丝腺内腔的Fib H、Fib L、和/或p25的有效的分泌中，上述SFEU复合体的形成是重要的(非专利文献7及8)。因此，上述突变品系不能吐丝的原因被认为是：由于在任一种构成蛋白质中存在异常，因此不能形成SFEU复合体，导致Fib H、Fib L及p25均不能从后部绢丝腺细胞向内腔中分泌(非专利文献9)。根据这种观点，在后部绢丝腺细胞内表达的蛋白质在构成SFEU复合体时仅有效地分泌到细胞外，这是该领域的一般说法。因此，若要将后部绢丝腺作为蛋白质表达系统利用，必须想办法使目标重组蛋白质作为SFEU复合体的一部分表达等，以在后部绢丝腺中利用特异性分泌系统。

作为使重组蛋白质在后部绢丝腺中作为SFEU复合体的一部分表达、分泌的具体方法，已知有作为在Fib H基因或Fib L基因的启动子的下游将Fib H或Fib L的全部或一部分和重组蛋白质融合的融合蛋白质(嵌合蛋白质)表达的方法(图2a及b)(非专利文献10、11)。由于这种嵌合蛋白质作为SFEU复合体的一部分被插入，因此向后部绢丝腺的内腔的分泌会有效地进行。但是，由于插入于SFEU复合体会成为不溶性的，因此为了回收重组蛋白质，必须进行分泌的SFEU复合体的可溶性化处理。可溶性化中必须利用强的改性剂进行处理，进而，为了使生理活性地表达，有时也需要将嵌合蛋白质中的丝心蛋白的构成蛋白质部分裂解。因此，在后部绢丝腺中表达的重组蛋白质不仅回收困难，而且还存在伴有失去其活性的风险的重大问题。

另一方面，还已知不将重组蛋白质作为不溶性SFEU复合体的构成成分，而作为水溶性蛋白质在后部绢丝腺中表达、分泌的方法。可列举例如在编码目标重组蛋白质的DNA的上游附加编码p25的信号肽的DNA的方法(图2c)(非专利文献12)。该方法中，目标蛋白质可作为水溶性蛋白质表达，但存在表达量及分泌效率低的重大问题(非专利文献12)。另外，还尝试不使用后部绢丝腺特异性的蛋白质的信号肽，而如专利文献1中记载的台湾兜虫的防御素的表达方法那样，以含有目标重组蛋白质自身的信号肽的状态使该重组蛋白质在后部绢丝腺中以可溶性化的状态表达的方法。但是，该方法也与上述方法一样，存在虽然作为目标蛋白质可表达、但是表达量及分泌效率低的问题。

根据以上的理由，在该领域中，认为后部绢丝腺在使用转基因蚕的绢丝腺表达系统、以水溶性的状态简单且大量地生产蛋白质的情况下是不适合的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1日本特开2005-95063

非专利文献

非专利文献1 Inoue S.et al.，2000,The Journal of Biological Chemistry，275(51)：40517-40528.

非专利文献2 Tatematsu K.et al.，2010,Transgenic Research，19(3)：473-87.

非专利文献3 Tomita M.et al.，2007，Transgenic Research，16(4)：449-465.

非专利文献4 M.Mondal et al.，2007，Caspian J.Env.Sci 5(2)：63-7.

非专利文献5 田村俊樹他，2008，農農技術，63卷第7号：320-236.

非专利文献6 Gamo T.et al.，1985，J.seric.Sci.Jpn，54，412-419.

非专利文献7 Takei F.et al.，1984，The Journal of Cell Biology，99：2005-2010.

非专利文献8 Takei F.et al.，1987，The Journal of Cell Biology，105：175-180.

非专利文献9 Inoue S.et al.，2004，Eur.J.Biochem.271：356-366.

非专利文献10 Kojima K.et al.，2007，Biosci Biotechnol Biochem，71：2943-2951.

非专利文献11 Tomita M.et al.，2003，Nat Biotechnol，21：52-56.

非专利文献12 Royer C.et al.，2005，Transgenic Res，14：463-472.

发明概述

然而，如果重组肽不作为丝心蛋白的构成成分，而是作为水溶性肽可以在后部绢丝腺中简单且大量地表达及分泌，则通过其高的蛋白质合成能力可以提高使用转基因蚕的有用肽的生产效率，另外，由此也可以降低制造成本。

因此，本发明的目的在于，开发一种在以家蚕为代表的绢丝虫的后部绢丝腺中可以大量地表达、分泌水溶性重组肽的后部绢丝腺基因表达单元，提供该基因表达单元被转入其中的转基因绢丝虫。

为了解决上述课题，本发明人等反复进行潜心研究，使编码将外来的水溶性肽与来自在中部绢丝腺细胞中特异性地表达的蛋白质的信号肽连接的嵌合肽的基因在后部绢丝腺中表达，结果，惊人地发现：与现有的后部绢丝腺基因表达系统相比，可以以10～50倍的效率表达并分泌目标水溶性肽。本申请发明是基于该新见解，具体而言，提供以下的发明。

(1)一种后部绢丝腺基因表达单元，其包含：基因的启动子，所述基因的启动子编码在后部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质；及与该启动子的下游功能性地连接的编码来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽的DNA；及连接于其下游的编码不含有丝心蛋白的构成蛋白质的肽的DNA。

(2)如(1)所述的后部绢丝腺基因表达单元，其中，所述信号肽为丝胶蛋白1～3中任一个的信号肽。

(3)如(1)或(2)所述的后部绢丝腺基因表达单元，其中，所述在后部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质为Fib H、Fib L或p25。

(4)一种后部绢丝腺基因表达单元，其由(a)第1辅助单元和(b)第2辅助单元构成，所述第1辅助单元包含：编码在后部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的基因的启动子；及与该启动子的下游功能性地连接的编码转录调节因子的基因；所述第2辅助单元包含：该转录调节因子的标靶启动子、与该启动子的下游功能性地连接的编码来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽的DNA、及连接于其下游的编码不含有丝心蛋白的构成蛋白质的肽的DNA。

(5)如(4)所述的后部绢丝腺基因表达单元，其中，所述信号肽为丝胶蛋白1～3中任一个的信号肽。

(6)如(4)或(5)所述的后部绢丝腺基因表达单元，其中，所述在后部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质为Fib H、Fib L或p25。

(7)一种转基因绢丝虫，其具有(1)～(3)中任一项所述的后部绢丝腺基因表达单元。

(8)一种转基因绢丝虫，其具有(4)～(6)中任一项所述的后部绢丝腺基因表达单元。

(9)如(8)所述的转基因绢丝虫，所述第1辅助单元和所述第2辅助单元存在于不同的染色体上。

(10)如(8)或(9)所述的转基因绢丝虫，其是将具有所述第1辅助单元的品系和具有所述第2辅助单元的品系交配而得到的。

(11)如(7)～(10)中任一项所述的转基因绢丝虫，其中，所述绢丝虫为家蚕、蓖麻蚕、或柞蚕。

(12)一种转基因绢丝虫的制作方法，其将(1)～(6)中任一项所述的后部绢丝腺基因表达单元转入作为宿主的绢丝虫中，在后部绢丝腺中表达目标肽。

(13)一种使用(7)～(11)中任一项所述的转基因绢丝虫制备目标肽的方法。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2012-281330号的说明书和/或附图中所记载的内容。

附图简述

图1是在家蚕的绢丝腺及其各部位表达的丝心蛋白的构成蛋白质和绢丝被吐丝之前的概念图。

图2是表示现有的后部绢丝腺中的重组蛋白质表达单元的构成的图。(a)该重组蛋白质的表达单元具有将在分别编码Fib H的N末端区域及C末端区域的基因区域之间融合编码目标重组蛋白质X的基因(Gene X)而成的融合基因在Fib H基因启动子的下游以可表达的状态连接的结构。(b)该重组蛋白质的表达单元具有将在编码Fib L的全长基因区域的下游融合编码目标重组蛋白质X的基因(Gene X)而成的融合基因在Fib L基因的启动子的下游以可表达的状态连接的结构。(c)该重组蛋白质的表达单元具有将编码p25的信号肽的基因区域和编码目标重组蛋白质X的基因(Gene X)融合而成的融合基因在p25基因启动子的下游以可表达的状态连接的结构。需要说明的是，(a)～(c)的3’末端侧的白框表示含有多聚A信号的3’UTR。

图3表示本发明的后部绢丝腺基因表达单元的构成示例。(a)本发明的后部绢丝腺基因表达单元为由1个基因表达单元构成的情况的构成示例。(b)本发明的后部绢丝腺基因表达单元为由2个辅助单元构成的情况的第1辅助单元的构成示例。(c)本发明的后部绢丝腺基因表达单元为由2个辅助单元构成的情况的第2辅助单元的构成示例。需要说明的是，(a)～(c)的3’末端侧的白框表示含有多聚A信号的3’UTR。

图4表示实施例1中构建的表达载体。(a)表示中部绢丝腺基因表达单元用的第1辅助单元。(b)表示后部绢丝腺基因表达单元用的第1辅助单元。(c)表示第2辅助单元。

图5是表示分别转入现有的中部绢丝腺基因表达单元及本发明的后部绢丝腺基因表达单元的转基因蚕的中部绢丝腺及后部绢丝腺中的EGFP的表达的图。

图6是表示分别转入现有的中部绢丝腺基因表达单元及本发明的后部绢丝腺基因表达单元的转基因蚕的中部绢丝腺或后部绢丝腺中的EGFP量的图。

图7是表示分别转入现有的中部绢丝腺基因表达单元及本发明的后部绢丝腺基因表达单元的转基因蚕的茧中的EGFP的存在的图。

图8中，A是表示实施例6中使用的第2辅助单元的一个结构的概念图。B是表示转入后部绢丝腺基因表达单元用第1辅助单元，和具有来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质丝胶蛋白1的信号肽或来自在后部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质p25的信号肽的任一个的第2辅助单元(分别为图4(c)和图8A所示)的转基因蚕的后部绢丝腺中的EGFP量的图。

图9中，A是表示实施例7中使用的第2辅助单元的结构的概念图。信号肽构建来自猪IL-2的信号肽和来自丝胶蛋白1的信号肽这2种。B为检测由实施例7中构建的具有各后部绢丝腺基因表达单元的家蚕品系的各绢丝腺的提取液的猪IL-2的免疫印迹法的结果。C为检测由实施例7中构建的具有各中部绢丝腺基因表达单元的家蚕品系的各绢丝腺的提取液的猪IL-2的免疫印迹法的结果。

图10中，A是表示实施例8中使用的第2辅助单元的结构的概念图。信号肽构建来自牛IFN-γ的信号肽和来自丝胶蛋白1的信号肽这2种。B是检测由实施例7中构建的具有各后部绢丝腺基因表达单元的家蚕品系的各绢丝腺的提取液的牛IFN-γ的免疫印迹法的结果。C是检测由实施例7中构建的具有各中部绢丝腺基因表达单元的家蚕品系的各绢丝腺的提取液的牛IFN-γ的免疫印迹法的结果。

发明的具体实施方式

1.后部绢丝腺基因表达单元

1-1.概要及定义

本发明的第1实施方式为后部绢丝腺基因表达单元。本发明的后部绢丝腺基因表达单元通过将其转入绢丝虫中，可以使目标重组肽在该绢丝虫的后部绢丝腺中不是作为丝心蛋白构成成分的一部分、而是作为水溶性肽大量地表达及分泌。

本说明书中，“后部绢丝腺基因表达单元”是指在绢丝虫的后部绢丝腺中可以大量地表达并分泌上述重组肽的一组基因表达系统。

本说明书中，“绢丝虫”是指具有绢丝腺、可以吐丝绢丝的昆虫的总称。具体而言，是指鳞翅目、膜翅目、脉翅目、毛翅目等中的主要在幼虫期为了筑巢、做茧或移动而可以吐丝的种类。如果为鳞翅目，作为本说明书的绢丝虫，优选可以吐出大量绢丝的蚕蛾科(Bombycidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、箩纹蛾科(Brahmaeidae)、带蛾科(Eupterotidae)、枯叶蛾科(Lasiocampidae)、蓑蛾科(Psychidae)、灯蛾科(Archtiidae)、夜蛾科(Noctuidae)等。作为优选的实例，可列举：属于Bombyx属、Samia属、Antheraea属、Saturnia属、Attacus属、Rhodinia属的种，具体而言为家蚕、桑蚕(Bombyx mandarina)、日樗蚕(含有Samia cynthia；蓖麻蚕Samia cynthia ricini及日樗蚕和蓖麻蚕的交配种)、天蚕蛾(Antheraea yamamai)、柞蚕(Antheraea pernyi)、银杏珠天蚕蛾(Saturniajaponica)、大水青(Actias gnoma)等。

“绢丝腺”是指产生液体状绢丝并蓄积、另外具有分泌功能的唾液腺的变化的管状器官。绢丝腺沿上述绢丝虫主要是幼虫的消化管以左右一对的形式存在，各绢丝腺由前部绢丝腺、中部绢丝腺及后部绢丝腺这3个区域构成。如上所述，后部绢丝腺产生并分泌作为绢丝的纤维成分的丝心蛋白。另外，中部绢丝腺产生并分泌作为包覆成分的丝胶蛋白，与从后部绢丝腺转移的丝心蛋白一起蓄积于其内腔中。

1-2.构成

1-2-1.元素的构成

后部绢丝腺基因表达单元除编码不含有丝心蛋白的构成蛋白质的肽的DNA之外，还包含该肽的表达所需要的后部绢丝腺表达启动子、及编码分泌所需要的信号肽的DNA等元素等。下面，对本发明的后部绢丝腺基因表达单元的各元素的构成进行具体说明。

(1)编码不含有丝心蛋白的构成蛋白质的肽的DNA

本说明书中，在表述为“肽”的情况下，是指2个以上的氨基酸通过酰胺键连接的分子。肽包含低聚肽及蛋白质那样的多肽。肽既可以来自1个基因或来自该基因片段，也可以来自连接有多个基因的一部分的嵌合基因。另外，肽的氨基酸长度没有特别限定。例如，氨基酸残基数可以为10～10,000个。

本说明书中，“不含有丝心蛋白的构成蛋白质的肽”是应该通过本发明的后部绢丝腺基因表达单元大量地表达并分泌的目标肽(以下，经常简称为“目标肽”)，指丝心蛋白的构成蛋白质及其片段以外的肽、及不含有丝心蛋白的构成蛋白质的全部或一部分的嵌合肽。丝心蛋白的构成蛋白质，相当于构成SFEU复合体的Fib H、Fib L、或p25等。不含有丝心蛋白的构成蛋白质的肽不作为SFEU复合体的一部分等表达，因此，从后部绢丝腺细胞中分泌之后，也不会成为茧丝的纤维成分的一部分。因此，作为目标肽，例如，使水溶性肽在本实施方式的后部绢丝腺基因表达单元中表达及分泌的情况下，该水溶性肽可以从后部绢丝腺内腔或茧丝中使用水、或不含有蛋白质改性剂的中性提取缓冲液容易地分离、回收。作为这种水溶性肽的实例，可列举：胰岛素、降钙素、甲状旁腺激素及生长激素那样的肽激素、上皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及转化生长因子β(TGF-β)那样的细胞因子、免疫球蛋白、血清白蛋白、酶、或骨胶原、或它们的片段(包含嵌合肽)。

(2)后部绢丝腺表达启动子

本发明的后部绢丝腺基因表达单元中的后部绢丝腺表达启动子只要是可在绢丝虫的后部绢丝腺中工作的启动子，则可以为任一种基因的启动子。例如，除后部绢丝腺特异性启动子之外，可列举可遍在地表达的过量表达型启动子、组成型活性启动子或时期特异性活性启动子、或表达诱导型启动子等。优选后部绢丝腺特异性启动子。其中，优选编码在绢丝虫的后部绢丝腺中特异性地且大量地表达的蛋白质的基因的启动子，进一步特别优选从终龄后期至前蛹期在后部绢丝腺中特异性地活化的终龄后期后部绢丝腺特异性活性启动子。具体而言，可列举例如作为丝心蛋白的构成蛋白质的Fib H、Fib L、或p25的基因启动子(本说明书中，分别称为“Fib H启动子”、“Fib L启动子”、或“p25启动子”)。

后部绢丝腺表达启动子所源自的生物种类没有特别限定，只要在转入本发明的后部绢丝腺基因表达单元的绢丝虫的细胞内工作即可。特别是在使用Fib H、Fib L、或p25的各启动子的情况下，可以来自任一种绢丝虫。这是因为，这些启动子的碱基序列在绢丝虫间的进化性非常好地被保存，即使在来自后部绢丝腺表达启动子的绢丝虫和转入本申请发明的后部绢丝腺基因表达单元的绢丝虫的种类不同的情况下，其启动子也可在宿主绢丝虫的后部绢丝腺中工作(Sezutsu H.，et al.，2009，Journal of Insect Biotechnology andSericology，78：1-10)。作为本发明的后部绢丝腺基因表达单元中的后部绢丝腺表达启动子，优选为与转入本发明的后部绢丝腺基因表达单元的宿主绢丝虫来自分类学上相同的目、更优选来自相同的科、进一步优选来自相同的属、最优选来自相同种的启动子。

作为Fib H启动子的具体实例，可列举含有序列号1所示的碱基序列的来自家蚕的Fib H启动子、含有序列号2所示的碱基序列的来自柞蚕的Fib H启动子等。另外，作为Fib L启动子的具体实例，可列举含有序列号3所示的碱基序列的来自家蚕的Fib L启动子、含有序列号4所示的碱基序列的来自柞蚕的Fib L启动子等。进而，作为p25启动子的具体实例，可列举含有序列号5所示的碱基序列的来自家蚕的p25启动子等。

(3)编码信号肽的DNA

本发明的后部绢丝腺基因表达单元包含编码信号肽的DNA(以下称为“信号肽DNA”)。该信号肽为将在绢丝腺细胞内表达的目标肽分泌于绢丝腺内腔内的基础上需要的肽。通常，信号肽配置在分泌性蛋白质的N末端侧，在分泌前通过信号肽酶而被裂解除去。在本发明的后部绢丝腺基因表达单元中，信号肽DNA被连接于编码目标肽的DNA的5’末端侧。因此，本发明的后部绢丝腺基因表达单元将编码连接信号肽和目标肽的细胞外分泌性的嵌合蛋白质(以下，将编码该嵌合蛋白质的DNA称为“嵌合基因”)。

本发明的后部绢丝腺基因表达单元中的信号肽DNA对所来自的细胞外分泌性蛋白质的种类没有特别限定，可以利用所有的信号肽DNA，只要是来自绢丝虫的在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽DNA即可。信号肽的氨基酸长度没有特别限定，只要可作为信号肽起作用即可。通常在3～60氨基酸的范围内即可。因此，信号肽DNA的碱基长度也可以为9～180碱基。

作为本发明的后部绢丝腺基因表达单元中的信号肽DNA优选的实例为来自丝胶蛋白1～3的信号肽DNA。作为来自丝胶蛋白1～3的信号肽DNA的具体实例，可列举：编码含有序列号6所示的氨基酸序列的家蚕的丝胶蛋白1信号肽的信号肽DNA(例如含有序列号7所示的碱基序列的DNA)、编码含有序列号8所示的氨基酸序列的家蚕的丝胶蛋白2信号肽的信号肽DNA(例如含有序列号9所示的碱基序列的DNA)、编码含有序列号10所示的氨基酸序列的家蚕的丝胶蛋白3信号肽的信号肽DNA(例如含有序列号11所示的碱基序列的DNA)。

(4)其它元素

本发明的后部绢丝腺基因表达单元除上述元素之外，可以根据需要含有可在目标肽的表达及分泌中起作用的元素。可列举例如：增强子、5’UTR、信号序列后插入序列、信号肽酶识别位点、3’UTR、终止子、选择标记、绝缘子及转座子的反向末端重复序列等。

“信号序列后插入序列”在连接上述信号肽和目标肽的细胞外分泌性的嵌合肽中，由编码促进信号肽的裂解和分泌的氨基酸序列的碱基序列构成。

“信号肽酶识别位点”由编码信号肽酶识别并消化上述嵌合肽中的信号肽所需要的氨基酸序列的碱基序列构成。

“终止子”在转入本发明的后部绢丝腺基因表达单元的宿主的后部绢丝腺细胞内，由可以终止编码融合蛋白质的DNA的转录的碱基序列构成。

“5’UTR”及“3’UTR”在上述嵌合基因的mRNA编码区域中分别由配置于启始密码子的上游(5’末端侧)及终止密码子的下游(3’末端侧)的碱基序列构成。3’UTR可以含有多聚A信号。

“选择标记”可作为确认后述的本发明的转基因绢丝虫具有本发明的后部绢丝腺基因表达单元时的标记起作用。可列举例如：含有EGFP或DsRed那样的荧光基因的复眼的荧光标记3xP3-EGFP和3xP3-DsRed、及杀稻瘟菌素耐性基因那样的药剂耐性基因等。

“绝缘子”是可以不受周围的染色体的染色质的影响而稳定地控制夹持于其序列的基因的转录的序列。可列举例如：鸡的cHS4序列和果蝇的gypsy序列等。

在本发明的后部绢丝腺基因表达单元为可同源重组的表达载体的情况下，可含有“转座子的反向末端重复序列(Inverted terminal repeat sequence)”。反向末端重复序列配置在本发明的后部绢丝腺基因表达单元的上游及下游。作为转座子，可以使用piggyBac、mariner、minos等(Shimizu，K.et al.，2000,Insect Mol.Biol.，9，277-281；Wang W.et al.，2000,Insect Mol Biol 9(2)：145-55)。

另外，在本发明的后部绢丝腺基因表达单元由后述的第1辅助单元及第2辅助单元这2个单元构成的情况下，包含编码转录调节因子的DNA及该转录调节因子的标靶启动子。

本说明书中，“编码转录调节因子的DNA”是指：为第1辅助单元的必须元素、转录调节因子的基因。本说明书中所说的“转录调节因子”是指：识别后述的标靶启动子和/或与其结合、可以将该标靶启动子活化的蛋白质因子。可列举例如：作为酵母的半乳糖代谢活化蛋白质的GAL4蛋白质、及作为四环素控制性转录活化因子的tTA及其变体等。

本说明书中，“转录调节因子的标靶启动子”是指：为第2辅助单元的必须元素、识别在上述第1辅助单元中所编码的转录调节因子和/或与其结合、由此可以将在其控制下的基因表达活化的启动子。上述转录调节因子的标靶启动子与上述转录调节因子存在对应关系，通常，如果转录调节因子确定，则其标靶启动子也必然确定。例如，在转录调节因子为GAL4蛋白质的情况下，可使用UAS(Upstream Activating Sequence；上游激活序列)。

1-2-2.后部绢丝腺基因表达单元的构成

本发明的后部绢丝腺基因表达单元可以为例如质粒或杆粒(Bacmid)那样的可自主复制的表达载体、或在染色体中可同源重组的表达载体或将其插入宿主的染色体组中的染色体组的一部分。表达载体即使在大肠杆菌等其它细菌内也可以作为可复制的穿梭载体。

后部绢丝腺基因表达单元存在(1)由1个基因表达单元构成、可以单独地(単体で)在宿主细胞内起作用的情况；和(2)由2个辅助单元构成，该2个辅助单元在宿主细胞内存在并可开始起作用的情况。下面，对各自的情况进行说明。

(1)由1个基因表达单元构成的情况

后部绢丝腺基因表达单元由1个基因表达单元构成的情况下，该基因表达单元包含至少1个含有图3(a)所示的后部绢丝腺表达启动子(图3(a)中相当于Fib H启动子)、信号肽DNA(图3(a)中相当于丝胶蛋白1信号肽DNA)及编码目标肽的DNA(图3(a)中相当于EGFP基因)而形成的基因表达系统。

本构成的后部绢丝腺表达启动子优选编码在后部绢丝腺中特异性地且大量地表达的蛋白质的基因的启动子，如编码丝心蛋白的构成蛋白质、例如Fib H、Fib L或p25的基因的启动子。

本构成的后部绢丝腺基因表达单元包含来自中部绢丝腺特异性地表达的蛋白质的信号肽DNA、及在其下游连接有编码目标肽的DNA而形成的嵌合基因。在信号肽DNA和编码目标肽的DNA之间，可以含有信号序列后插入序列和/或信号肽酶识别位点。另外，在信号肽DNA的上游可以含有5’UTR，在编码目标肽的DNA的下游可以含有3’UTR。在编码目标肽的DNA的下游或3’UTR的下游可以进一步配置终止子。本构成的后部绢丝腺基因表达单元既可以为在1个后部绢丝腺表达启动子控制下含有1个嵌合基因的单顺反子的系统，也可以为含有2个以上嵌合基因的多顺反子的系统。

上述嵌合基因与后部绢丝腺表达启动子的下游功能性地连接。本说明书中，“与后部绢丝腺表达启动子的下游功能性地连接”是指：在后部绢丝腺表达启动子的下游、在受到该启动子的表达控制的位置配置嵌合基因等基因，并将这些基因连接。

(2)由2个辅助单元构成的情况

后部绢丝腺基因表达单元由第1辅助单元及第2辅助单元构成的情况下，各辅助单元具有以下的构成。

如图3(b)所示，第1辅助单元包含后部绢丝腺表达启动子(图3(b)中相当于Fib H启动子)、及在该启动子的下游功能性地连接的编码转录调节因子的DNA(图3(b)中相当于GAL4基因)。在编码转录调节因子的DNA的上游可以含有5’UTR，另外，在其下游可以含有3’UTR。

第1辅助单元的后部绢丝腺表达启动子优选编码在后部绢丝腺中特异性地且大量地表达的蛋白质的基因的启动子，如编码丝心蛋白的构成蛋白质、例如Fib H、Fib L或p25的基因的启动子。

如图3(c)所示，第2辅助单元包含与上述第1辅助单元所编码的转录调节因子结合的标靶启动子(图3(c)中相当于UAS)、来自与标靶启动子的下游功能性地连接的在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽DNA(图3(c)中相当于丝胶蛋白1信号肽DNA)和编码目标肽的DNA(图3(c)中相当于EGFP基因)而形成的嵌合基因。在信号肽DNA和目标肽DNA之间，可以含有信号序列后插入序列和/或信号肽酶识别位点。另外，在嵌合基因的上游可以含有5’UTR，在其下游可以含有3’UTR。第2辅助单元既可以为在1个后部绢丝腺表达启动子控制下含有1个嵌合基因的单顺反子的系统，也可以为含有2个以上嵌合基因的多顺反子的系统。

本构成的后部绢丝腺基因表达单元在第1及第2辅助单元的1组中起作用。通过后部绢丝腺表达启动子的活化而由第1辅助单元表达的转录调节因子，通过将第2辅助单元的标靶启动子活化而表达含有目标肽的嵌合肽。第2辅助单元可以为含有不同的嵌合基因的2个以上的辅助单元。该情况下，由第1辅助单元表达的转录调节因子通过将第2辅助单元的每一个的标靶启动子活化，可以表达在第2辅助单元的每一个中所编码的目标肽。

本构成的后部绢丝腺基因表达单元可以经由在第1辅助单元中所编码的转录调节因子而增加在第2辅助单元中所编码的目标肽的表达。因此，在后部绢丝腺表达启动子的基因表达能力不高的情况下是适合的。另外，仅需替换第2辅助单元中的目标肽DNA，而第1辅助单元可共同使用，因此无论在构建本发明的后部绢丝腺基因表达单元方面，还是在制作后述的转基因绢丝虫方面，都很便利。

1-3.效果

根据本发明的后部绢丝腺基因表达单元，在目前该领域中认为作为水溶性肽的生产系统是不适合的绢丝虫的后部绢丝腺中可以大量地合成该肽。另外，如果与作为使用中部绢丝腺的现有的蛋白质生产系统的转基因绢丝虫相比，使用本发明的后部绢丝腺基因表达单元则可以制作生产效率高的转基因绢丝虫。

2.转基因绢丝虫

2-1.概要

本发明的第2实施方式为转基因绢丝虫。本发明的转基因绢丝虫的特征在于，具有上述第1实施方式的后部绢丝腺基因表达单元，在后部绢丝腺中可以大量地表达并分泌目标肽。

2-2.构成

本发明的“转基因绢丝虫”是指在宿主绢丝虫中转入上述第1实施方式的后部绢丝腺基因表达单元的绢丝虫或其后代。宿主绢丝虫可以为上述任一种绢丝虫。饲养方法和人工试样已确立，可多只饲养的家蚕、蓖麻蚕及柞蚕作为宿主绢丝虫特别优选。

本发明的转基因绢丝虫既可以在细胞内短暂性地具有上述第1实施方式的后部绢丝腺基因表达单元，也可以在转入染色体组中的状态等情况下稳定地具有。优选稳定地具有。

本发明的转基因绢丝虫可以具有2种以上不同的上述第1实施方式的后部绢丝腺基因表达单元。例如，转基因绢丝虫可以具有由1个基因表达单元构成的后部绢丝腺基因表达单元和由2个辅助单元构成的后部绢丝腺基因表达单元这两者。

在后部绢丝腺基因表达单元由第1辅助单元及第2辅助单元这2个辅助单元构成、分别被插入绢丝虫的染色体的情况下，各辅助单元既可以存在于同一染色体上，也可以存在于不同的染色体上。在各辅助单元存在于不同的染色体上的情况下，如果将仅具有第1辅助单元(优选为同质接合体)的转基因绢丝虫的品系和仅具有第2辅助单元(优选为同质接合体)的转基因绢丝虫的品系交配，则在F1中可以容易地得到具有第1辅助单元和第2辅助单元的本发明的转基因绢丝虫。该情况下，仅具有上述第1辅助单元的转基因绢丝虫的品系可以在与仅具有各种第2辅助单元的转基因绢丝虫的品系的交配中使用。另一方面，在第1辅助单元及第2辅助单元存在于同一染色体上的情况下，以在继代过程中通过重组而彼此不分离的方式，优选辅助单元间的距离近、相互连锁的情况。

2-3.效果

根据本发明的转基因绢丝虫，可以将后部绢丝腺表达型的转基因绢丝虫作为水溶性肽的生产系统利用。

3.转基因绢丝虫的制作方法

3-1.概要

本发明的第3实施方式为制作转基因绢丝虫的方法。本发明的特征在于，制作可以在绢丝虫的后部绢丝腺中表达目标肽的转基因绢丝虫。

3-2.制作方法

本发明的转基因绢丝虫的制作方法可列举将上述第1实施方式中记载的后部绢丝腺基因表达单元转入作为宿主的绢丝虫的方法、或将在不同的染色体上具有本发明的后部绢丝腺基因表达单元的第1辅助单元和上述第2辅助单元的绢丝虫进行交配的方法。

利用该领域中公知的方法进行将上述第1实施方式中记载的后部绢丝腺基因表达单元转入作为宿主的绢丝虫即可。在绢丝虫卵、例如蚕卵中导入第1实施方式的后部绢丝腺基因表达单元的情况下，例如，可以利用Tamura等的方法(Tamura T.et al.，2000,NatureBiotechnology，18，81-84)。具体而言，将具有编码转座子转移酶的DNA的辅助载体，与含有两端具有转座子的反向末端重复序列(Handler AM.et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：7520-5)的第1实施方式中记载的后部绢丝腺基因表达单元的表达载体一起注射到绢丝虫的发生初期卵中即可。作为辅助载体，可列举例如pHA3PIG。将得到的转化子基于选择标记进行选择。根据需要进行兄妹交配或同系交配，可以得到被插入染色体组的后部绢丝腺基因表达单元的同质接合体。

将在不同的染色体上具有本发明的后部绢丝腺基因表达单元的第1辅助单元和上述第2辅助单元的绢丝虫交配而制作本发明的转基因绢丝虫的情况下，将各自的基因表达单元转入绢丝虫的方法通过与上述相同的方法、例如Tamura等的方法进行即可。将在不同的染色体上具有各自的基因表达单元的转基因绢丝虫交配而制作具有2个基因表达单元的转基因绢丝虫的方法也可以通过该领域中公知的交配方法来得到。例如，将具有各自的基因表达单元的绢丝虫交配，对F1个体选择具有2个基因表达单元的选择标记的个体即可。根据需要进行兄妹交配或同系交配，可以得到被插入于染色体组的后部绢丝腺基因表达单元的同质接合体。

4.制备肽的方法

4-1.概要

本发明的第4实施方式涉及一种制备目标肽的方法。根据本发明，可以使用上述第2实施方式的转基因绢丝虫大量地制备目标肽、特别是水溶性肽。

4-2.制备方法

本发明的制备方法包含饲养工序及回收工序。下面，对各工序进行说明。

(1)饲养工序

“饲养工序”为饲养第2实施方式的转基因绢丝虫的工序。关于转基因绢丝虫的饲养方法，对各自的绢丝虫利用该领域中公知的技术饲养即可。例如，如果绢丝虫为家蚕，则参照“蚕種総論；高見丈夫著、全国蚕種協会刊”即可，另外，如果绢丝虫为蓖麻蚕，则参照“エリサンの人工飼料と飼育法；2000、野蚕39 7-8”即可。就饲料而言，例如，如果为家蚕和桑蚕，则既可以为桑属(Morus)的叶那样的食草树种的天然叶，也可以为SilkMateL4M或原蚕种1-3龄用(日本农产工业)那样的人工饲料；如果为蓖麻蚕，则既可以为蓖麻(Ricinuscommunis)的叶或臭椿(Ailanthus altissima)的叶那样的食草树种的天然叶，也可以为SilkMateL4M或原蚕种1-3龄用(日本农产工业)那样的人工饲料；如果为柞蚕，则既可以为丁钠橡胶科(Fagaceae)的叶那样的食草树种的天然叶，也可以为SilkMateL4M或原蚕种1-3龄用(日本农产工业)那样的人工饲料。鉴于抑制疾病的发生、可以以稳定的质及量给饵、另外可以根据需要无菌地饲养，优选人工饲料。下面，以家蚕为例对简单的饲养方法进行说明。

把幼蚕从产卵纸上移开，以适当的只数(例如4～10只)的同系的转基因绢丝虫的雌虫产的卵进行。将孵化的幼虫从卵台纸移至铺设有作为蚕座的防干纸(石蜡加工纸)的容器内，将SilkMate等人工饲料在防干纸上排列而给饵。原则上，饵的更换在1～2龄进行各1次，在3龄进行1～3次。就旧食饵而言，在吃剩的东西多的情况下，为了防止腐败而除去。在4～5龄的壮蚕幼虫时的饲养中，移至大型容器，适当调整每容器的只数。根据湿度和容器内的状态，可以在容器中盖上防干纸、丙烯酸、或网制的盖。饲养温度为全龄在25～28℃下饲养。

(2)回收工序

“回收工序”是指：第2实施方式的转基因绢丝虫的幼虫在后部绢丝腺细胞内表达、分泌之后，回收蓄积于绢丝腺内腔内的目标肽的工序。

第2实施方式的转基因绢丝虫主要从幼虫的终龄后期将后部绢丝腺基因表达单元中所含的目标肽作为与信号肽的嵌合肽在后部绢丝腺细胞内表达。嵌合肽通过信号肽的作用向小胞体转运，该信号肽通过小胞体内的肽酶等酶作用被裂解之后，向后部绢丝腺内腔分泌。目标肽被转移并蓄积于中部绢丝腺，在蛹化期与丝胶蛋白和丝心蛋白一起从前部绢丝腺分泌至个体外并吐丝。因此，在目标肽的回收方法中，可列举从茧回收的方法、或在终龄后期至前蛹期从虫体摘除绢丝腺而直接回收的方法。特别是从茧回收的方法，在可以简单地回收目标肽方面是优异的。

从茧回收目标肽的方法，首先，将终龄后期的幼虫进行上蔟(上蔟：将幼虫移至蔟)并做茧。接着，从茧提取目标肽。提取方法没有特别限定。例如，仅在水或不含有蛋白质改性剂的适当的中性提取缓冲液(例如含有或不含有1％Tween-20及0.05％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水，pH7.2)中浸渍茧，可以回收目标肽。为了提高提取效果，可以在浸渍前将茧截断或粉碎。就提取温度而言，为了防止目标的蛋白质的热变性，在0～10℃、优选0～5℃的低温下进行。但是，如果目标肽不是热感受性肽，即使在10～40℃下也可以进行。提取液可以根据需要进行搅拌。提取时间因茧的状态(例如未截断状态、或粉末状态)、提取液的量、提取温度、搅拌的有无等提取条件而不同，因此根据条件适当确定即可。丝心蛋白等不溶性成分可以从提取液中根据需要通过离心或过滤而除去。

从终龄后期至前蛹期的虫体中摘除绢丝腺而回收目标肽的方法可以通过该领域中公知的方法来实现。例如，在终龄(5龄)第6天的吐丝之前将蚕在冰上施加麻碎，切开背侧用镊子以不损伤绢丝腺的方式摘除即可(参照森靖编，カイコによる新生物学実験，三省堂，1970,pp.249-255)。使摘除的绢丝腺在例如上述提取缓冲液中在0～10℃、优选0～5℃的温度下缓慢地振荡，可以使目标肽在缓冲液中溶出。如果目标肽不是热感受性肽，则可以在10～40℃的温度下进行。之后，通过离心或过滤除去组织片等夹杂物，回收含有目标肽的上清液即可。

4-3.效果

根据本发明的肽制备方法，通过将第2实施方式的转基因绢丝虫的幼虫用作蛋白质生产系统，与使用有现有的转基因绢丝虫的情况相比，可以大量地制备目标肽、特别是水溶性肽，并且容易回收。

下面，对本发明的实施方式，列举具体的实施例进行说明，但本实施例只不过是本发明的一个概念，本发明并不限定于此。

需要说明的是，在本实施例中，作为宿主绢丝虫，使用该领域中最为普遍使用的家蚕。

＜实施例1：后部绢丝腺基因表达单元的构建＞

构建含有本发明的后部绢丝腺基因表达单元的各种表达载体。在本实施例中，构建由第1及第2辅助单元构成的后部绢丝腺基因表达单元等表达载体。

(方法)

1.表达载体的构建

(1)中部绢丝腺基因表达单元用第1辅助单元：pBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2(图4(a))

作为对照用的中部绢丝腺基因表达单元用第1辅助单元，构建了在中部绢丝腺中特异性地表达的丝胶蛋白1基因的启动子及在其下游功能性地连接的转录调节因子GAL4基因、进而在其下游连接的具有hsp70 polyA附加序列的pBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2。

使用序列号12所示的含有限制酶AscI位点的引物和序列号13所示的含有BamHI位点的引物，通过PCR从家蚕大造品系的染色体组DNA扩增序列号14所示的丝胶蛋白1基因(GenBank Accession No.NM-001044041)的-666～+40(将转录开始点设为0位。以下相同)的启动子区域来制备丝胶蛋白1基因启动子。将扩增片段插入pCR-BluntII-TOPO载体(lifetechnologies)中。将得到的质粒用AscI及BamHI进行处理，将所分离的AscI-BamHI扩增片段插入pBacA3dGAL4(Uchino K.et al.，2006，J Insect Biotechnol Sericol 75：89-97)的GAL4基因上游的AscI-BamHI位点。在该质粒中，将从pBacA3GAL4/3xP3DsRed2(UchinoK.et al.，2006，J Insect Biotechnol Sericol 75：89-97)利用BglII酶切的3xP3-DsRed表达盒作为选择标记插入，以构建中部绢丝腺基因表达单元用第1辅助单元。

(2)后部绢丝腺基因表达单元用第1辅助单元：pBacFibH-pro GAL4/3xP3DsRed2(图4(b))

作为本发明的后部绢丝腺基因表达单元用第1辅助单元，构建了在后部绢丝腺中特异性地表达的Fib H基因的启动子及在其下游功能性地连接的转录调节因子GAL4基因、进而在其下游连接的具有hsp70polyA附加序列的pBacFibH1-pro GAL4/3xP3DsRed2。

使用序列号15所示的含有限制酶AscI位点的引物和序列号16所示的含有BamHI位点的引物，通过PCR从家蚕大造品系的染色体组DNA扩增序列号1所示的Fib H基因(GenBankAccession No.AF226688)的-858～+11的约870bp的区域来制备Fib H基因启动子。将扩增片段插入pCR-BluntII-TOPO载体(life technologies)。将得到的质粒用AscI及BamHI进行处理，将所分离的AscI-BamHI扩增片段插入pBacA3dGAL4(Uchino K.et al.，2006，JInsect Biotechnol Sericol 75：89-97)的GAL4基因上游的AscI-BamHI位点。在该质粒中，将从pBacA3GAL4/3xP3DsRed2(Uchino K.et al.，2006，J Insect Biotechnol Sericol75：89-97)利用BglII酶切的3xP3-DsRed表达盒作为选择标记插入，以构建后部绢丝腺基因表达单元用第1辅助单元。

(3)第2辅助单元：pBacSerUAS-ser-sigEGFP/3xP3EGFP(图4(c))

作为中部及后部绢丝腺基因表达单元兼用的第2辅助单元，将在UAS序列的下游编码丝胶蛋白1基因的分泌信号(序列号6)的碱基序列(序列号7)、和附加于其3’末端侧的克隆用附加碱基序列(序列号17)和目标水溶性肽DNA的EGFP基因(序列号18)连接，构建在其下游连接有丝胶蛋白1的3’UTR(序列号19)的pBacSerUAS-ser-sigEGFP/3xP3EGFP。

2.表达载体的精制

构建的上述各表达载体使用HiSpeed Plasmid Midi Kit(QIAGEN)进行精制。进而，通过苯酚/氯仿提取及乙醇沉淀进行精制，溶解于0.5mM的磷酸盐缓冲液(pH7.0)/5mM的KCl缓冲液。

＜实施例2：转基因蚕的制作＞

使用实施例1中构建的各表达载体制作各种转基因蚕。

(材料和方法)

(1)家蚕品系

将在农业生物资源研究所维持的白眼、白卵、非休眠品系的w1-pnd品系用作宿主品系。

(2)饲养条件

在25～27℃的饲养室中，将幼虫的全龄用人工饲料(SilkMate原种1-3龄S、日本农产工)饲养。人工饲料每2～3天更换(Uchino K.et al.，2006，J Insect BiotechnolSericol，75：89-97)。

(3)转基因蚕的制作

转基因蚕按照Tamura等的方法(Tamura T.et al.，2000,，NatureBiotechnology，18，81-84)制作。

将实施例1中构建的后部绢丝腺基因表达单元用第1辅助单元及后部绢丝腺基因表达单元用第2辅助单元分别与单独地表达转座酶的辅助质粒pHA3PIG(Tamura T.et al.，2000,，Nature Biotechnology，18，81-84)以1：1的比例混合，注射于产卵后2～8小时的蚕卵中。注射后的卵在加湿状态、25℃下进行孵育，直至孵化。将用上述的方法饲养孵化的幼虫，进行兄妹交配。将得到的卵，对第1辅助单元通过利用3xP3 DsRed2标记的眼的荧光的有无选择，另外，对第2辅助单元通过利用3xP3EGFP标记的眼的荧光的有无选择，分别得到具有本发明的转基因蚕的第1及第2辅助单元的品系。将分别具有第1辅助单元和第2辅助单元的品系交配，将在一个个体中具有两者的基因表达单元的品系与上述同样地，通过利用3xP3EGFP标记及3xP3DsRed2标记的眼的荧光的有无选择，分别得到进行中部绢丝腺特异性地表达的转基因蚕和作为本发明的进行转基因绢丝虫的后部绢丝腺特异性地表达的转基因蚕。

＜实施例3：绢丝腺中的重组蛋白质的表达＞

(方法)

用与实施例2相同的方法饲养实施例2中制作的各转基因蚕，在5龄第6天的吐丝之前在冰上施加麻碎，切开背侧，用镊子以不损伤中部及后部绢丝腺的方式摘除(参照森靖编，カイコによる新生物学実験，三省堂，1970,pp.249-255)。不使其固定而用荧光显微镜(OLYMPUS SZX16、GFP滤波器)观察。

(结果)

图5表示结果。具有中部绢丝腺基因表达单元的重组蚕的绢丝腺仅在中部绢丝腺中观察到荧光。另一方面，具有后部绢丝腺基因表达单元的重组蚕的绢丝腺在后部及中部绢丝腺这两者中观察到荧光。该结果显示：EGFP在后部绢丝腺细胞内表达之后，分泌到后部绢丝腺内腔，其后转移至中部绢丝腺。

＜实施例4：绢丝腺中的重组蛋白质的表达量＞

(方法)

用与实施例2相同的方法饲养实施例2中制作的各转基因蚕，在5龄第6天的吐丝之前在冰上施加麻碎，如上述那样切开背侧，用镊子以不损伤绢丝腺的方式摘除。根据实施例3的结果，对绢丝腺而言，分别从具有中部绢丝腺基因表达单元的重组蚕中仅摘除中部绢丝腺，从具有后部绢丝腺基因表达单元的重组蚕中摘除中部绢丝腺及后部绢丝腺。分别将这些绢丝腺的每1根放入10mL的PBS(pH7.2)/1％Tween20/0.05％叠氮化钠中，在室温下振荡24小时，由此提取水溶性蛋白质。将得到的水溶性蛋白质提取液以2,000×g进行10分钟离心，回收上清液。用Reacti-Bind Anti-GFP Coated Plates(PIERCE)测定上清液中所含的水溶性蛋白质中的EGFP蛋白质浓度。具体而言，在Reacti-Bind Anti-GFP Coated Plates中添加上清液100μL，在室温下静置1小时。用PBS/0.05％Tween 20洗涤3次之后，添加辣根过氧化物酶缀合的抗GFP抗体(Rockland Immunochemicals)，在室温下静置1小时。用PBS/0.05％Tween 20洗涤3次之后，使用TMB Peroxidase EIA Substrate Kit(Bio-Rad)进行显色反应，加入1N硫酸使反应停止。将显色用酶标仪(SpectraMax250；Molecular Devices)定量。使用重组GFP蛋白质(Takara Bio；Z2373N)的系列稀释液(1-400pg/μL)制作标准曲线。

(结果)

图6显示了结果。从具有中部绢丝腺基因表达单元的重组蚕的中部绢丝腺中回收的水溶性蛋白质的EGFP表达量每1只为1000μg，与此相对，从具有后部绢丝腺基因表达单元的重组蚕的后部绢丝腺及中部绢丝腺中回收的EGFP表达量分别为750μg及1600μg。该情况下的中部绢丝腺内的EGFP是在后部绢丝腺中表达的EGFP的转移，因此在后部绢丝腺中，2350μg的EGFP进行了表达。该表达量与图2(c)所示的现有的后部绢丝腺基因表达系统的表达量(Royer C.et al.，2005，Transgenic Res，14：463-472)相比，多10～50倍。

上述结果显示：在本发明的转基因蚕中，作为在后部绢丝腺中表达的重组水溶性蛋白质的EGFP有效地、且以高于中部绢丝腺中的表达量的量被分泌至细胞外。

＜实施例5：茧中的重组蛋白质＞

(方法)

用与实施例2相同的方法饲养实施例2中制作的各转基因蚕并做茧之后，不使该茧固定而用荧光显微镜(OLYMPUS SZX16、GFP滤波器)观察。

(结果)

图7显示了结果。确认在具有中部及后部绢丝腺基因表达单元的重组蚕的茧中含有EGFP。该结果暗示：可以将由后部绢丝腺基因表达单元表达的作为水溶性肽的EGFP从茧中回收。

＜实施例6：后部绢丝腺中的信号肽的效果＞

对来自在后部绢丝腺中或在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽引起的后部绢丝腺中的EGFP的表达及分泌量进行了验证。

(方法)

(1)表达载体的构建

构建比较用第2辅助单元pBacSerUAS-p25-sigEGFP/3xP3EGFP(图8A)。该辅助单元与实施例1中构建的后部绢丝腺基因表达单元用第2辅助单元基本结构相同，仅信号肽为来自在后部绢丝腺中特异性地表达的p25的信号肽。需要说明的是，在p25的信号肽DNA中，使用从外显子1至外显子2的第1氨基酸的染色体组序列(序列号20)，进而将p25的信号肽中的胞嘧啶置换为异亮氨酸(序列号21)(后部绢丝腺基因表达单元用第2辅助单元的信号肽来自丝胶蛋白1)。p25的信号肽DNA的外显子-内含子序列(Royer C.et al.，2005，TransgenicRes，14：463-472)使用序列号22所示的含有限制酶NheI位点的引物和序列号23所示的含有BspHI位点的引物，通过PCR从家蚕大造品系的染色体组DNA扩增而制备。将扩增片段插入pBluescriptII SK(-)(安捷伦科技)的EcoRV位点。将得到的质粒用SmaI和BspHI进行处理，将所分离的SmaI-BspHI片段插入pEGFP-NcoI-NheI质粒(Tatematsu K.et al.，2010,Transgenic Research，19(3)：473-87)的HincII-NcoI位点。将得到的质粒用NheI进行部分消化，将约1.3kb的NheI片段进行分离。将该NheI片段插入pBac[SerUAS/3xP3EGFP]质粒(Tatematsu K.et al.，2010,Transgenic Research，19(3)：473-87)的BlnI位点，构建比较用第2辅助单元pBacSerUAS-p25-sigEGFP/3xP3EGFP。

(2)家蚕品系

具有后部绢丝腺基因表达单元的第1辅助单元和第2辅助单元这两者的品系使用实施例2中制作的品系。

另一方面，具有后部绢丝腺基因表达单元的第1辅助单元和比较用第2辅助单元这两者的品系如下得到：首先，制作具有比较用第2辅助单元的品系，之后，将分别具有第1辅助单元和比较用第2辅助单元的品系进行交配，将在一个个体中具有两者的基因表达单元的品系与实施例2同样地通过利用3xP3EGFP标记及3xP3DsRed标记的眼的荧光的有无而选择。制作具有比较用第2辅助单元的品系的方法及将分别具有第1辅助单元和比较用第2辅助单元的品系进行交配的方法，按照实施例2中记载的方法进行。

(3)饲养条件

按照实施例2中记载的方法。

(4)绢丝腺中的EGFP的表达量

测定后部绢丝腺基因表达单元的第1辅助单元和具有含有丝胶蛋白1的信号肽的第2辅助单元的品系或具有含有p25的信号肽的比较用第2辅助单元的品系中的EGFP的表达量。方法按照实施例4中记载的方法。

(结果)

图8B显示了结果。任一种品系均具有后部绢丝腺基因表达单元的第1辅助单元，因此显示：在此所检测的EGFP蛋白质全部在后部绢丝腺中表达，在中部绢丝腺中所检测的EGFP蛋白质为在后部绢丝腺中的表达后进行的转移。因此，在后部绢丝腺中表达的EGFP蛋白质的实际表达量为中部绢丝腺和后部绢丝腺的EGFP蛋白质量之和。

如该图所示，得知：相对于具有含有来自在后部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质p25的信号肽的比较用第2辅助单元的品系(图8B的p25)的EGFP蛋白质量，具有含有来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质丝胶蛋白1的信号肽的第2辅助单元的品系(图8B的丝胶蛋白1)的EGFP蛋白质量约为10倍。该结果显示：与来自丝胶蛋白1的信号肽连接的EGFP从后部绢丝腺细胞中有效地分泌，与此相对，与来自p25的信号肽连接的EGFP不从后部绢丝腺细胞中有效地分泌。由上述结果显示：在本发明的后部绢丝腺基因表达单元中的信号肽中，来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽是适当的。

另外，在具有含有来自丝胶蛋白1的信号肽的第2辅助单元的品系中，由于表达的EGFP蛋白质的90％以上转移至中部绢丝腺，因此还具有在后部绢丝腺中表达的目标肽更容易回收的优点。

＜实施例7：来自哺乳动物的信号肽和目标肽的影响(1)＞

对含有来自哺乳动物的信号肽和/或目标肽的基因表达单元引起的绢丝腺中的目标肽的表达及分泌量进行了验证。

(方法)

(1)表达载体的构建

构建第1验证用第2辅助单元I：pBacSerUAS-ser-sigpoIL2/3xP3EGFP(图9A：信号肽为丝胶蛋白1的情况)。该辅助单元与实施例1中构建的后部绢丝腺基因表达单元用第2辅助单元基本结构相同，仅在目标肽为来自猪的白细胞介素2(IL-2)方面不同。在丝胶蛋白1的信号肽DNA序列的下游连接有编码猪IL-2的序列号24所示的基因(但是，猪IL-2本来具有的序列号25所示的信号肽DNA除外)的片段，使用序列号26所示的含有限制酶BlnI位点的引物和序列号27所示的含有限制酶BlnI位点的引物、及具有丝胶蛋白1的信号肽和IL-2的连接部分的序列的引物序列号28和序列号29，通过PCR扩增pAcPIL2(Inumaru S.et al.，2000Biotechnol.Bioprocess Eng.5：146-149)和pBacSerUAS-ser-sigEGFP/3xP3EGFP而制备。将扩增片段插入pZErO-2载体(invitrogen)。将得到的质粒用BlnI进行处理，将所分离的BlnI片段插入于pBac[SerUAS/3xP3EGFP]质粒的BlnI位点，以构建第1验证用第2辅助单元I：pBacSerUAS-ser-sigpoIL2/3xP3EGFP。

构建第2验证用第2辅助单元I：pBacSerUAS-poIL2/3xP3EGFP(图9A：信号肽为猪IL-2的情况)。该辅助单元与实施例1中构建的后部绢丝腺基因表达单元用第2辅助单元基本结构相同，但在信号肽及目标肽均为来自猪IL-2方面不同。编码猪IL-2的肽的DNA片段，使用序列号30所示的含有限制酶BlnI位点的引物和序列号31所示的引物，通过PCR扩增pAcPIL2而制备。将扩增片段插入pZErO-2载体(invitrogen)。将得到的质粒用BlnI进行处理，将所分离的BlnI片段插入pBac[SerUAS/3xP3EGFP]质粒的BlnI位点，构建第2验证用第2辅助单元I：pBacSerUAS-poIL2/3xP3EGFP。

(2)家蚕品系

具有后部或中部绢丝腺基因表达单元的各自的第1辅助单元和上述第1或第2验证用第2辅助单元I这两者的品系如下得到：首先，制作分别具有第1或第2验证用第2辅助单元I的品系，之后，将具有第1辅助单元和各验证用第2辅助单元I的品系进行交配，将在一个个体中具有第1或第2辅助单元的品系与实施例2同样地通过利用3xP3EGFP标记及3xP3DsRed标记的眼的荧光的有无选择。制作具有第1或第2验证用第2辅助单元I的品系的方法、及将具有第1辅助单元和第1或第2验证用第2辅助单元I这两者的品系进行交配的方法，按照实施例2中记载的方法进行。

另外，作为比较用，具有实施例1中构建的中部绢丝腺基因表达单元用第1辅助单元(pBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2)(图4(a))和上述验证用第2辅助单元I这两者的品系也与上述同样地制作。

(3)饲养条件

按照实施例2中记载的方法。

(4)免疫印迹法

按照实施例4中记载的方法，从各品系摘除中部绢丝腺及后部绢丝腺，提取各绢丝腺中的蛋白质。接着，将绢丝腺提取液与等量的EZ Apply(AE-1430、ATTO)混合，通过在95℃下加热5分钟而进行SDS化。将进行了SDS化的样品使用9cm×8cm的13％SDS-PAGE凝胶，以20mA恒定电流电泳约90分钟。将凝胶使用半干转移装置(NA-1512S、日本EIDO)，在120mA、60分钟的条件下转移至PVDF薄膜(RPN303F、GE health care)。将转移后的薄膜用EZ wash(AE-1480、ATTO)轻轻地振荡5分钟之后，与一抗(抗IL-2兔血清、2,000倍稀释)在4℃下反应一夜。将薄膜用Ez wash经10分钟洗涤3次之后，与二抗(NA934-100UL、GE health care、50,000倍稀释)在室温下反应1小时。将薄膜用Ez wash经10分钟洗涤3次之后，使ECL prime(RPN2232、GE health care)反应5分钟，用LAS3000(Fuji膜)检测信号。

(结果)

图9B、C显示了结果。

首先，得知：在含有第1验证用第2辅助单元的来自丝胶蛋白1的信号肽和猪IL-2的嵌合基因的基因表达单元的情况下，后部绢丝腺基因表达单元(图9B)及中部绢丝腺基因表达单元(图9C)均被有效地表达、分泌。特别是在后部绢丝腺基因表达单元中，非常多的猪IL-2被表达、分泌。其暗示：根据本申请发明的后部绢丝腺基因表达单元，即使目标肽为来自绢丝虫以外的其它生物种的水溶性肽，也作为与来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽的嵌合蛋白质表达，由此可以在绢丝虫的后部绢丝腺内大量地制备目标水溶性肽。

另一方面，信号肽和目标肽均为具有来自猪IL-2的第2验证用第2辅助单元的基因表达单元时，在中部绢丝腺基因表达单元(图9C)中有效地表达、分泌，但在后部绢丝腺基因表达单元(图9B)中，表达量及从后部绢丝腺向中部绢丝腺的转移的效率都非常低。该结果与专利文献1中记载的防御素的结果不矛盾。即，得知：与来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质及丝心蛋白的构成蛋白质的任一个的信号肽以外的信号肽连接的蛋白质抑制从后部绢丝腺细胞的分泌。

以上证明：来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽适于水溶性肽在绢丝虫的后部绢丝腺中的大量表达、分泌、及向中部绢丝腺的转移。

＜实施例8：来自哺乳动物的信号肽和目标肽的影响(2)＞

使用含有与实施例7不同的来自哺乳动物的信号肽和/或目标肽的基因表达单元，对各绢丝腺中的目标肽的表达及分泌量再次进行了验证。

(方法)

(1)表达载体的构建

构建第1验证用第2辅助单元II：pBacSerUAS-ser-sigboIFNγ/3xP3EGFP(图10A：信号肽为丝胶蛋白1的情况)。该辅助单元与实施例1中构建的后部绢丝腺基因表达单元用第2辅助单元基本结构相同，但在仅目标肽为来自牛的干扰素γ(IFN-γ)方面不同。在丝胶蛋白1的信号肽序列的下游连接有IFNγ(IFNγ本来具有的信号肽除外)的片段，使用序列号32所示的含有限制酶BlnI位点的引物和序列号33所示的含有限制酶BlnI位点的引物、及具有丝胶蛋白1的信号肽和IFNγ的连接部分的序列的引物序列号34和序列号35，通过PCR扩增pBIFN-γ(Murakami K.et al.，2001CYTOKINE.13(1)18-24)和pBacSerUAS-ser-sigEGFP/3xP3EGFP而制备。将扩增片段插入pZErO-2载体(invitrogen)。将得到的质粒用BlnI进行处理，将所分离的BlnI片段插入pBac[SerUAS/3xP3EGFP]质粒的BlnI位点，以构建第1验证用第2辅助单元II：pBacSerUAS-ser-sigboIFNγ/3xP3EGFP。

构建第2验证用第2辅助单元II：pBacSerUAS-boIFNγ/3xP3EGFP(图10A：信号肽为牛IFN-γ的情况)。该辅助单元与实施例1中构建的后部绢丝腺基因表达单元用第2辅助单元基本结构相同，但在信号肽及目标肽均为来自牛IFN-γ方面不同。编码牛IFNγ的氨基酸序列的DNA片段(序列号36：但是，牛IFN-γ本来具有的序列号37所示的信号肽DNA除外)，使用序列号38所示的含有限制酶BlnI位点的引物和序列号39所示的含有限制酶BlnI位点的引物，通过PCR扩增pBIFN-γ而制备。将扩增片段插入pZErO-2载体(invitrogen)。将得到的质粒用BlnI进行处理，将所分离的BlnI片段插入pBac[SerUAS/3xP3EGFP]质粒的BlnI位点，以构建第2验证用第2辅助单元II：pBacSerUAS-boIFNγ/3xP3EGFP。

(2)家蚕品系

具有后部或中部绢丝腺基因表达单元的各自的第1辅助单元和上述第1或第2验证用第2辅助单元II这两者的品系，按照实施例2及7中记载的方法进行。

另外，作为比较用，具有实施例1中构建的中部绢丝腺基因表达单元用第1辅助单元(pBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2)(图4(a))和上述验证用第2辅助单元II这两者的品系也与实施例7同样地制作。

(3)饲养条件

按照实施例2中记载的方法。

(4)免疫印迹法

按照实施例4中记载的方法，从各品系统摘除中部绢丝腺及后部绢丝腺，提取各绢丝腺中的蛋白质。接着，将绢丝腺提取液与等量的EZ Apply(AE-1430、ATTO)混合，通过在95℃下加热5分钟而进行SDS化。将进行了SDS化的样品使用9cm×8cm的13％SDS-PAGE凝胶，以20mA恒定电流电泳约90分钟。凝胶使用半干转移装置(NA-1512S、日本EIDO)，在120mA、60分钟的条件下转移至PVDF薄膜(RPN303F、GE health care)。将转移后的薄膜用EZ wash(AE-1480、ATTO)轻轻地振荡5分钟之后，与一抗(抗IFNγ抗体：AS1019.2、Cosmo Bio、2,000倍稀释)在4℃下反应一夜。将薄膜用EZ wash经10分钟洗涤3次之后，与二抗(NA934-100UL、GEhealth care、50,000倍稀释)在室温下反应1小时。将薄膜用EZ wash经10分钟洗涤3次之后，使ECL prime(RPN2232、GE health care)反应5分钟，用LAS3000检测信号。

(结果)

如图10B、C所示，即使在为来自与实施例7不同的哺乳动物的水溶性蛋白质及信号肽的情况下，结果也显示与实施例7几乎相同的趋势。

由以上的结果确认：如果为与来自在中部绢丝腺中特异性地表达的蛋白质的信号肽连接的嵌合蛋白质，则即使为水溶性肽，也在后部绢丝腺中不被抑制而有效地表达及分泌。

工业实用性

根据本发明的后部绢丝腺基因表达单元，通过将后部绢丝腺基因表达单元转入绢丝虫，可以进行重组肽等大量表达并分泌、及简便的回收。

根据本发明的转基因绢丝虫，可以提供上述重组肽的大量生产性绢丝虫品系。

根据本发明的转基因绢丝虫的制作方法，通过将本发明的后部绢丝腺基因表达单元转入绢丝虫，可以容易地制备上述重组肽的大量生产性生物系统。

根据制备本发明的重组肽的方法，可以容易地制备水溶性肽。

将本说明书中引用的全部发行物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书中。

Claims (4)

1.一种后部绢丝腺基因表达单元，其包含：

编码丝心蛋白H链、丝心蛋白L链或p25中任一个的基因的启动子；及

与该启动子的下游功能性地连接的编码来自丝胶蛋白1～3中任一个的信号肽的DNA；及连接于其下游的编码不含有丝心蛋白的构成蛋白质的肽的DNA。

2.一种后部绢丝腺基因表达单元，其由(a)第1辅助单元和(b)第2辅助单元构成，其中，

所述第1辅助单元包含：编码丝心蛋白H链、丝心蛋白L链或p25中任一个的基因的启动子；及与该启动子的下游功能性地连接的编码转录调节因子的基因，

所述第2辅助单元包含：该转录调节因子的标靶启动子；与该启动子的下游功能性地连接的编码来自丝胶蛋白1～3中任一个的信号肽的DNA；及连接于其下游的编码不含有丝心蛋白的构成蛋白质的肽的DNA。

3.一种转基因绢丝虫的制作方法，其将权利要求1或2所述的后部绢丝腺基因表达单元转入作为宿主的绢丝虫中，在后部绢丝腺中表达目标肽。

4.一种使用通过权利要求3的方法获得的转基因绢丝虫制备目标肽的方法。