WO2023190453A1 - キメラ絹糸を生産するゲノム改変カイコ - Google Patents

キメラ絹糸を生産するゲノム改変カイコ Download PDF

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WO2023190453A1
WO2023190453A1 PCT/JP2023/012392 JP2023012392W WO2023190453A1 WO 2023190453 A1 WO2023190453 A1 WO 2023190453A1 JP 2023012392 W JP2023012392 W JP 2023012392W WO 2023190453 A1 WO2023190453 A1 WO 2023190453A1
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silkworm
fibroin
protein
region
gene
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PCT/JP2023/012392
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English (en)
French (fr)
Inventor
信人 山田
陽子 高須
桂 小島
太陽 吉岡
拓也 坪田
恵郎 内野
秀樹 瀬筒
恒徳 亀田
章宗 浅沼
猛 村上
武 土肥
Original Assignee
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
興和株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof
    • D01F4/02—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof from fibroin

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for producing a genome-modified silkworm that produces chimeric silk, as well as the genome-modified silkworm and the chimeric silk obtained therefrom.
  • Bagworm is a general term for moth larvae belonging to the order Lepidoptera and the family Psychidae. Bagworm silk spun by this bagworm has higher physical properties than silk spun by silkworms, and has recently attracted attention as a useful new animal-based natural fiber (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1) .
  • bagworm silk There are several issues that need to be resolved before bagworm silk can be put to practical use as a textile material.
  • One of them is mass production.
  • techniques for mass-breeding bagworms and techniques for efficiently collecting silk from bagworms are essential for mass production.
  • mass production As the bagworm silk industry has just entered its infancy, many of these technologies are still in the development stage, and mass production will still take some time.
  • mass production of bagworm silk involves the use of genetic recombination technology, etc. to produce fibroin protein (herein often referred to as "Fib protein”), which is a fiber component of bagworm silk.
  • Fib protein fibroin protein
  • a cloned fibroin gene herein often referred to as "Fib gene”
  • this technique also has the problem that the full-length gene sequence of the fibroin H chain protein (herein often referred to as "Fib H protein”), which is a major component of bagworm silk, has not been sufficiently determined. This is because the Fib H protein has an amino acid sequence with many repeated glycine and alanine residues, making it extremely difficult to determine the base sequence using normal cloning techniques. Furthermore, since the bagworm Fib protein (herein often referred to as "bFib protein”) expressed in the host is liquid, it must be processed into a fiber if it is to be used as a fiber. However, this method involves the problem of requiring time and manufacturing costs. Furthermore, it is difficult to make bFib protein into fibers using conventional spinning techniques, and there is also the problem that a new spinning technique must be developed.
  • bFib protein the full-length gene sequence of the fibroin H chain protein
  • silkworms have been bred for more than 5,000 years as livestock insects to collect silk thread, and the technology and mass production equipment for mass breeding and mass harvesting have been established. Furthermore, in recent years, it has become possible to produce various genetically modified silk threads from genetically modified silkworms created using genetic recombination technology.
  • the object of the present invention is to create a silkworm that has a high content of bagworm silk and can thereby produce chimeric silk with silkworm silk that has physical properties similar to bagworm silk, and to convert the desired chimeric silk from the silkworm into a fiber. This is what you get.
  • Patent Document 2 a gene of interest is inserted into the silkworm genome by a method using a transposon to create a transgenic silkworm.
  • the expression efficiency of exogenous genes inserted by transposons is only a few percent of the expression efficiency of endogenous genes.
  • the present inventors presumed that this was the cause of the inhibition of imparting the physical properties of bagworm silk to the chimeric silk. Therefore, instead of the transposon method, we attempted to knock in the desired modified fibroin gene into the silkworm genome using genome editing technology using the TAL-PITCh method. As a result, they succeeded in creating a genome-modified silkworm in which the bagworm-modified fibroin gene was inserted.
  • the obtained genome-modified silkworm can not only produce a chimeric silkworm-bagworm fibroin protein (herein often referred to as "chimeric Fib protein”) in its silk gland, but also produce chimeric protein by having the silkworm spin silk.
  • chimeric Fib protein chimeric silkworm-bagworm fibroin protein
  • the present invention is based on these development results and provides the following.
  • a genome-modified silkworm production kit that produces a chimeric fibroin protein containing a silkworm-derived fibroin protein and one or more types of other silkworm-derived fibroin proteins, the production kit being capable of expressing Left-TALEN. vector, a Right-TALEN expression vector, and a donor vector, wherein the Left-TALEN expression vector includes a Left-TALEN coding region, and the Left-TALEN coding region is a silkworm fibroin gene, and the other silkworm fibroin gene.
  • the Right-TALEN expression vector encodes a Left-TALE domain that recognizes and binds to the base sequence of the 5'-side TALE-binding region located near the 5'-side of the insertion site, and a nuclease domain downstream thereof.
  • the Right-TALEN coding region is a Right-TALEN coding region that recognizes and binds to the base sequence of the 3'-side TALE-binding region located near the 3'-side of the other silkworm fibroin gene insertion site in the silkworm fibroin gene.
  • a TALE domain, and a nuclease domain downstream thereof, and the donor vector encodes a 5' TALE corresponding region, a 3' TALE corresponding region, a 5' homologous region, a 3' homologous region, and the other silk threads.
  • the production kit includes an insect-derived fibroin gene.
  • the minnow fibroin H chain protein is a modified fibroin H chain protein formed by linking three or more identical and/or different repeating units,
  • the repeating unit contains 30 or more G/A units consisting of two amino acid residues, a glycine residue and an alanine residue, and an alanine cluster containing 15 to 25 alanine residues on the N-terminal side.
  • the production kit according to (4) consisting of 120 to 178 amino acids.
  • the production kit according to (5), wherein the alanine cluster consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the production kit according to (5) or (6), wherein the repeat unit is any one or more selected from the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 16.
  • the production kit according to any one of (4) to (7), wherein the gene encoding the bagworm fibroin H chain protein consists of any one of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 25.
  • a method for producing a genome-modified silkworm in which a chimeric fibroin protein containing a silkworm-derived fibroin protein and one or more types of other silkworm-derived fibroin proteins is produced in the silk gland comprising: producing Left-TALEN mRNA or Left - A nucleic acid introduction step of introducing a TALEN expression vector, Right-TALEN mRNA or Right-TALEN expression vector, and a donor vector into silkworm eggs, and transformation of silkworms containing fibroin genes derived from other silkworms after the nucleic acid introduction step.
  • the mRNA includes a Left-TALE region and a region encoding a nuclease domain, and the Left-TALE region recognizes the base sequence of the 5' TALE binding region at the insertion site of the other silkworm fibroin gene in the silkworm fibroin gene.
  • the Left-TALEN expression vector encodes a Left-TALE domain that binds to a promoter
  • the Left-TALEN expression vector contains the Left-TALE region and a region encoding a nuclease domain placed under the control of a promoter and its expression
  • the Right-TALEN mRNA encodes a Right - Contains a TALE region and a region encoding a nuclease domain
  • the Right-TALE region recognizes and binds to the base sequence of the 3' TALE binding region at the insertion position of the other silkworm fibroin gene in the silkworm fibroin gene.
  • the Right-TALE expression vector encodes a Right-TALE domain
  • the Right-TALEN expression vector contains the Right-TALE region and a region encoding a nuclease domain placed under the control of a promoter and its expression
  • the donor vector contains a 5′-TALE
  • the above-mentioned production method comprising a corresponding region, a 3' side TALE corresponding region, a 5' side homologous region, a 3' side homologous region, and other silkworm fibroin genes.
  • the donor vector extends from the 5' side to the 5' side TALE-compatible region, the 3'-side homologous region, the 5'-side homologous region, and the 3'-side TALE-compatible region based on the sense strand direction of the other silkworm fibroin gene.
  • the minnow fibroin H chain protein is a modified fibroin H chain protein formed by linking three or more identical and/or different repeating units, wherein the repeating unit consists of two amino acids, a glycine residue and an alanine residue.
  • Method. The production method according to (13), wherein the alanine cluster consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • a genome-modified silkworm that includes a bagworm-derived fibroin H chain gene in its genome and produces the fibroin H chain protein within its silk gland.
  • a chimeric silk comprising a chimeric fibroin protein in which a modified bagworm fibroin H chain protein is linked to an arbitrary position of a silkworm fibroin H chain protein or a L chain protein, wherein the modified bagworm fibroin H chain protein is the same and/or or three or more different repeating units connected together, the repeating unit containing 30 or more G/A units consisting of two amino acid residues, a glycine residue and an alanine residue, and 15 to 25 G/A units on the N-terminal side.
  • the chimeric silk has a total length of 120 to 178 amino acids and contains an alanine cluster containing 120 to 178 alanine residues.
  • FIG. 2 is a diagram showing a conceptual diagram of a Left-TALEN expression vector (a), a Right-TALEN expression vector (b), and a donor vector (c) that constitute the genome-modified silkworm production kit of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram (A) showing the structure of the modified bagworm fibroin protein described in WO2018/074403, which was used as the basis for constructing the chimeric protein of the present invention in Example 1, and a diagram showing its amino acid sequence (B).
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the donor vector pDVL-MMHX4 of the present invention constructed in Example 1.
  • FIG. 2 is a schematic diagram (A) showing the structure of a chimeric protein produced by the genome-modified silkworm of the present invention produced in Example 2, and a diagram showing its amino acid sequence (B, SEQ ID NO: 34).
  • This chimeric protein consists of the N-terminal region of a modified silkworm fibroin protein (b) fused to the C-terminus of silkworm L chain fibroin (a), and a repetitive sequence of the same fibroin protein (c: partial repeat unit + repeat unit x 12). , and a 6x histidine tag (d).
  • FIG. 3 is a diagram showing Western blotting of cocoon layer proteins derived from chimeric silk threads performed in Example 2.
  • the arrow indicates the position of the chimeric L chain produced in Example 1.
  • a band (arrowhead) was observed at the position of the wild-type silkworm L chain in the heterozygous and control individuals.
  • Genome-modified silkworm production kit 1-1 The first aspect of the present invention is a genome-modified silkworm production kit.
  • the kit of this embodiment includes expression vectors and the like necessary for producing a genome-modified silkworm that produces a chimeric Fib protein containing a silkworm-derived Fib protein and a silkworm-derived Fib protein, particularly a bagworm-derived Fib protein, by genome editing technology.
  • a genome-modified silkworm that produces the chimeric Fib protein can be easily produced.
  • silkworm is a general term for insects that have silk glands and can spin silk threads. Specifically, among the order Lepidoptera, Hymenoptera, Neuroptera, Trichoptera, etc., those that can mainly spin silk for nesting, cocooning, or movement during the larval stage. Refers to the type. Lepidoptera includes the Bombycidae, Saturnidae, Brahmaeidae, Eupterotidae, Lasiocampidae, and Psychidae, all of which can spin large amounts of silk. ), Archtiidae, Noctuidae, and the like are preferred as silkworms in the present specification.
  • silkworms refer to silkworms other than Bombyx mori.
  • the types of other silkworms are not limited. Moreover, it is not limited to one type, and may be multiple types. Although not limited to, other silkworms are preferably bagworms.
  • silkworm which is the name of the larval stage, is used as a synonym for silkworm moth.
  • Bagworm is a general term for moth larvae belonging to the family Psychidae. Similar to the silkworm, in this specification, unless otherwise specified, the term “bagworm”, which is the name of the larval stage of the silk moth that also spins silk, is used as a synonym for the term “bagworm”. The type of bagworm in this specification is not particularly limited.
  • silk threads refers to insect-derived protein threads produced by silk glands, which are spun by insect larvae and adults for purposes such as nesting, movement, anchoring, cocooning, and capturing food.
  • Silk threads are usually composed of fibroin (Fib) protein, which is the main fiber component, and sericin protein, which is a pasty component that coats it.
  • fibroin (Fib) protein which is the main fiber component
  • sericin protein which is a pasty component that coats it.
  • silk thread in this specification refers to silk thread spun by silkworms, that is, “raw silk” containing Fib protein and sericin protein, and sericin protein removed from raw silk through scouring treatment. It shall mean both the "stripe silk” consisting of filamentous Fib proteins.
  • silk thread refers to a widely general silk thread that does not specify the name of its insect origin, and when referring to silk thread derived from a specific insect, the name of the organism it originates from is used, such as silkworm silk thread or bagworm silk thread. It shall be placed at the front.
  • “Silk glands” are tubular organs that are modified salivary glands, and have the function of producing Fib and sericin proteins, accumulating them in their lumens, and then secreting them.
  • silk glands exist in pairs on the left and right along the digestive tract of insects capable of spinning silk threads, and each silk gland is composed of three regions: anterior, middle, and posterior silk glands.
  • the posterior silk gland produces Fib protein
  • the middle silk gland produces sericin protein.
  • Fib protein produced in the posterior silk gland migrates to the lumen of the middle silk gland, and in many cases, together with sericin protein, migrates to the anterior silk gland, where it is discharged as silk from the head spinning canal.
  • the genome-modified silkworm herein produces a chimeric Fib protein.
  • the chimeric Fib gene encoding the chimeric Fib protein is a fusion gene with the endogenous Fib gene of the silkworm, and is, in principle, subject to the same expression control as the silkworm Fib gene. Therefore, in this specification, the silk gland that produces the chimeric Fib protein means the posterior silk gland unless otherwise specified.
  • Fibroin (Fib) protein refers to a protein that constitutes the fiber component of silk thread. Although it usually refers to the full-length protein, herein it also includes its peptide fragments. The peptide fragment here is preferably a functional fragment of Fib protein. "Functional fragment” refers to a peptide that has a function as a fibroin protein. For example, in silkworms, fibroin protein consists of three proteins: fibroin heavy chain (Fib H) protein, fibroin light chain (Fib L) protein, and p25/FHX (herein often simply referred to as "p25”) protein.
  • Fib H protein is the main constituent protein of Fib protein, and the physical properties of silk thread are mainly brought about by Fib H protein.
  • the silkworm-derived Fib protein may be any of the above three constituent proteins.
  • Fib Fib
  • Fib H Fib H
  • Fib L Fib L
  • the origin insect is not, in principle, limited.
  • the name of the organism from which it is derived or its abbreviation shall be placed in front of Fib.
  • it if it is a Fib gene or protein derived from a silkworm, it will be like a silkworm Fib (silkworm Fib: sFib) gene or protein, or a bagworm Fib (bagworm Fib: bFib) gene or protein.
  • silkworm Fib silkworm Fib
  • bagworm Fib bagworm Fib: bFib
  • modified Fib H protein refers to Fib H protein that has been artificially modified from wild-type Fib H protein.
  • m-Fib H includes, for example, mutant Fib H protein in which one or more amino acid additions, deletions, and/or substitutions are artificially introduced into the amino acid sequence of wild-type Fib H protein, and two types of m-Fib H protein. Examples include fusion Fib H proteins in which the amino acid sequences of wild-type Fib H proteins derived from different insects are fused.
  • n (amino acids) n is an integer
  • n amino acid residues
  • chimeric Fib protein refers to a Fib protein in which the full length and/or parts of two or more different Fib proteins are linked directly or indirectly.
  • the entire length of the Fib L protein of one species, or a portion thereof can be directly attached to the entire length of the Fib H protein of the other species, or a portion thereof, to form a single polypeptide chain. or indirectly linked via an intervening peptide, or at an appropriate position within the amino acid sequence of the Fib H protein of one species, the full length or partial amino acid sequence of the Fib H protein of the other species.
  • An example of this is the Fib protein with an inserted .
  • a chimeric Fib protein when expressed as a chimeric Fib protein herein, it includes a chimeric Fib protein that includes a silkworm-derived Fib protein and another silkworm-derived Fib protein, particularly a silkworm-derived Fib protein and a bagworm-derived Fib protein.
  • a chimeric Fib protein (often referred to herein as "silkworm-armworm chimeric Fib protein (s/bFib protein)”) shall be meant.
  • the Fib protein derived from bagworms here is not limited, but is preferably m-bFib H protein.
  • the Fib protein derived from silkworms is not limited. It may be any of the sFib L protein, sFib H protein, or p25 protein.
  • Fib gene refers to a gene encoding the Fib protein.
  • Fib protein is not a full-length protein but a peptide fragment thereof, it means a gene fragment encoding the peptide fragment.
  • Fib H gene refers to genes encoding Fib H, Fib L, and p25, respectively.
  • modified Fibroin H chain (modified Fib H) gene refers to a gene encoding m-Fib H. Therefore, the "m-bFib H gene” is a gene encoding a modified Fib H in bagworm-derived Fib H. In this embodiment, this m-bFib H gene is targeted. Similar to the above-mentioned protein, when expressed as “Fib H gene", the insect origin does not matter in principle in this specification.
  • Fib H when referring to the Fib H gene derived from a specific insect, the name of the organism it is derived from should be prefixed to Fib H, such as the silkworm Fib H (sFib H) gene or the bagworm Fib H (bFib H) gene.
  • sFib H silkworm Fib H
  • bFib H bagworm Fib H
  • chimeric Fib gene refers to a gene encoding the chimeric Fib protein.
  • the genome-modified silkworm of the present invention includes this chimeric Fib gene in its genome.
  • chimeric silk refers to silk spun by a genome-modified silkworm that includes the chimeric Fib gene.
  • the chimeric silk is composed entirely of silk components derived from silkworms, except for the chimeric Fib protein.
  • the chimeric Fib gene is a gene obtained by fusing the sFib L gene and the m-bFib H gene
  • the chimeric silk spun by a genome-modified silkworm containing the chimeric Fib gene is a chimeric silk yarn derived from the chimeric Fib gene.
  • This is a hybrid silk thread consisting of Fib protein, silkworm-derived sFib H, p25, and sericin.
  • part of the Fib protein which is a fiber component of silkworm silk, is composed of m-bFib H protein.
  • Even silk spun by silkworms contains the modified bagworm Fib H, giving it the physical properties of bagworm silk.
  • expression vector refers to an expression system that contains a gene in an expressible state and is capable of controlling the expression.
  • an expressible state means that the gene contained in the vector is integrated into the expression vector so that it can be expressed within the host cell. Specifically, it means that the encapsulated gene is placed under the control of a promoter within an expression vector.
  • gene-modified silkworm refers to a silkworm produced by genome editing technology. In this specification, it specifically refers to a silkworm in which a bagworm-derived Fib gene, preferably the m-bFib H gene, has been inserted (knocked in) into the silkworm genome by genome editing technology.
  • Gene editing technology is an artificial DNA cutting enzyme that recognizes a specific sequence on the genome and creates a double strand break (herein referred to as "DSB") in the DNA. This is a gene targeting technology that inserts a foreign gene into a specific location (knock-in) or destroys the target gene (knock-out).
  • Known genome editing technologies include the TALEN method, the zinc finger nuclease (ZFN) method, and the CRISPR-Cas9 method. In this specification, when we refer to genome editing technology, we refer to the TALEN method unless otherwise specified. shall be taken as a thing.
  • TALEN Transcription Activator-Like Effector Nuclease
  • TALE TAL effector
  • TALEN protein is a protein consisting of a special TALE domain and a nuclease domain having repeats of a DNA binding unit consisting of about 34 amino acid residues (LTPDQVVAIASXXGGKQALETVQRLLPVLCQDHG) as exemplified by SEQ ID NO: 1.
  • the nuclease domain that has enzymatic activity to cleave DNA functions as a dimer, so TALEN proteins also act as nuclease domains near the upstream (5' side) of the double-strand break (DSB) site for the target gene. It functions as a dimer consisting of a "Left-TALEN protein” that recognizes the sense strand DNA sequence and a "Right-TALEN protein” that recognizes the antisense strand DNA sequence near the downstream (3' side) of the DSB site.
  • the DNA-binding unit constituting the TALE domain has variable amino acid residues at positions 12 and 13 from the N-terminus in SEQ ID NO: 1, and a pair of two amino acids contains the four bases (A: Adenine, G: guanine, C: cytosine, T: thymine) can be specifically recognized.
  • A: Adenine, G: guanine, C: cytosine, T: thymine can be specifically recognized.
  • the amino acid residues at positions 12 and 13 are N-I, they recognize adenine, when N-N, they recognize guanine or adenine, when they are H-D, they recognize cytosine, and when they are N-G, they recognize thymine.
  • the number of repeats of the DNA binding unit can vary depending on the base length of the target base sequence.
  • a TALE domain is created by linking binding units that recognize each base according to any DNA sequence arranged in the 5' to 3' direction on the genome, and by fusing the nuclease domain to this, it is possible to It becomes a nuclease monomer (Left-TALEN protein) that binds to any DNA sequence.
  • a TALEN that binds to the complementary strand of the genome at an appropriate interval (15 to 30 bases) on the 3' side from this 5' TALEN-binding region is created in the same way, and then the other nuclease monomer (Right-TALEN protein). By working together as a dimer, it becomes possible to perform gene targeting by cleaving any DNA sequence as a target.
  • PITCh Precise Integration into Target Chromosome
  • MMEJ microhomology-mediated end joining
  • HR homologous recombination
  • the PITCh method using MMEJ is a method that allows for knock-in with higher efficiency than conventional techniques using HR, regardless of the species used.
  • TAL-PITCh method is a method using TALEN as a genome editing tool in the PITCh method.
  • promoter is a gene expression regulatory region that can control the expression of a gene (target gene) placed under its control.
  • the genome-modified silkworm production kit of this embodiment includes a Left-TALEN expression vector, a Right-TALEN expression vector, and a donor vector as essential components. As a general rule, the three above are used in pairs.
  • the vectors contained in the genome-modified silkworm production kit do not need to be separate vectors as long as they contain the respective components. It may also be a configuration in which two or three vectors are combined into one vector. Examples include a configuration such as a Left/Right-TALEN expression vector in which a Left-TALEN expression vector and a Right-TALEN expression vector are combined into one, and a configuration in which all three vector configurations are included in one vector. The configuration of each vector will be specifically explained below.
  • Left-TALEN expression vector refers to an expression vector containing a Left-TALEN region and a promoter as essential components.
  • the Left-TALEN expression vector may be introduced into silkworm cells undergoing genome editing to express the Left-TALEN protein in vivo, or may be used for in vitro transcription to express the Left-TALEN protein.
  • TALEN mRNA may also be prepared.
  • the Left-TALEN region herein refers to a region that encodes a Left-TALE domain and a nuclease domain located downstream thereof, and encodes the aforementioned Left-TALEN protein.
  • the Left-TALE domain and the nuclease domain which are components of the Left-TALEN region, will be explained below.
  • Left-TALE domain refers to a DNA-binding domain in TALEN, which includes an amino acid repeating sequence of a DNA-binding unit consisting of 34 amino acids shown in SEQ ID NO: 1 above. It consists of an array.
  • the number of repeats corresponds to the number of bases in the 5' TALE binding region in the sFib gene. For example, when the number of bases in the 5′-side TALE binding region is 15 bases, the number of repeats of the DNA binding unit is 15.
  • the nucleotide sequence encoding the Left-TALE domain may include an N-terminal domain at the 5' end and a C-terminal domain at the 3' end.
  • the 5' side of the 5' TALE binding region may contain thymine (T).
  • the "5'-side TALE-binding region” is a region consisting of a specific base sequence in the sFib gene on the silkworm genome, which is specifically recognized by the Left-TALEN protein of the present invention via the Left-TALE domain. , is the target region to bind.
  • the base sequence and base length that constitute the 5' side TALE binding region are selected within the desired position of the sFib gene on the silkworm genome where the bFib gene is to be inserted, that is, within the sequence 5 to 55 bases upstream from the DSB site11 Consists of any base sequence of bases to 31 bases, 12 bases to 30 bases, 13 bases to 28 bases, 14 bases to 26 bases, or 15 bases to 25 bases. Therefore, the base sequence of the 5'-side TALE binding region may be appropriately designed depending on the DSB site.
  • nuclease domain is a domain consisting of an endonuclease or its active domain linked downstream of a Left-TALE domain or a Right-TALE domain described below.
  • the Left-TALEN protein and the Right-TALEN protein that bind to the 5'-side TALE-binding region and the 3'-side TALE-binding region on the silkworm Fib gene through the Left-TALE domain or the Right-TALE domain, respectively, have their respective nuclease domains. cleaves the desired DSB site using its endonuclease activity.
  • the type of endonuclease is not particularly limited as long as it does not have a specific recognition sequence and has DSB activity against any sequence. An example is FokI with the base sequence recognition domain removed.
  • promoter refers to a transcriptional regulatory region that controls downstream gene expression.
  • the promoter used in the present invention may be derived from any gene as long as it is a promoter that can operate under the environment that allows transcription of downstream genes.
  • operble as used herein means that it can function as a promoter and transcribe the target gene.
  • promoter does not matter.
  • a ubiquitously expressible constitutive promoter for transcription in silkworm cells, a ubiquitously expressible constitutive promoter, a constitutively active promoter, a period-specific active promoter, a site-specific promoter that controls the expression of housekeeping genes, or Examples include expression-induced promoters.
  • a constant expression promoter or a time-specific active promoter is preferred.
  • An example of a constitutively expressed promoter is the actin promoter.
  • an expression-induced promoter is the hsp70 promoter.
  • promoters for in vitro transcription using bacteriophage-specific RNA polymerase include SP6 promoter, T3 promoter, and T7 promoter.
  • a specific example of the base sequence of an in vivo promoter derived from silkworms is the actin promoter derived from silkworms, which includes the base sequence shown by SEQ ID NO:2.
  • Right-TALEN expression vector refers to an expression vector that functions in pair with the Left-TALEN expression vector, and includes the Right-TALEN region and promoter as essential components. say. Therefore, the basic configuration is similar to the Left-TALEN expression vector.
  • a Right-TALEN expression vector may also be introduced into silkworm cells undergoing genome editing to express the Right-TALEN protein in vivo, or it may be used for in vitro transcription to express the Right-TALEN protein. mRNA may also be prepared.
  • Right-TALEN region refers to a region that encodes the Right-TALE domain and the nuclease domain located downstream thereof, and encodes the aforementioned Right-TALEN protein.
  • the basic configuration follows the configuration of the Left-TALEN region in the Left-TALEN expression vector described above. Therefore, the explanation of the configurations common to the Left-TALEN area will be omitted here, and the explanation will focus on the different configurations.
  • Right-TALE domain is a DNA-binding domain in TALEN, which is composed of a repeating sequence of a DNA-binding unit consisting of 34 amino acids shown in SEQ ID NO: 1 above. ing. The basic structure is similar to the Left-TALE domain described above, but the Right-TALE domain targets the 3' TALE binding region in the sFib gene, and the number of repeats matches the number of bases in the 3' TALE binding region in the sFib gene. .
  • Thymine is usually placed on the 5' side of the 3' TALE binding region recognized by the Right-TALE domain, as well as on the 5' side of the 5' TALE binding region recognized by the Left-TALE domain. ing. However, this thymine does not necessarily have to be placed.
  • the "3'-side TALE-binding region” is a region consisting of a specific base sequence of the Fib gene on the silkworm genome, which is specifically recognized by the Right-TALEN protein of the present invention via the Right-TALE domain. , refers to the target region that binds.
  • the base sequence and base length that constitute the 3'-side TALE binding region are selected within the desired position of the sFib gene on the silkworm genome where the bFib gene should be inserted, that is, 5 to 55 bases downstream from the DSB site. It consists of any base sequence of 11 bases to 31 bases, 12 bases to 30 bases, 13 bases to 28 bases, 14 bases to 26 bases, or 15 bases to 25 bases.
  • the base sequence of the 3'-side TALE binding region may be appropriately designed depending on the DSB site.
  • the 5'-side TALE-binding region functions as a pair of two regions sandwiching the DSB site, but the base sequence and/or base length may be the same or different from the 5'-side TALE-binding region. It's okay.
  • nuclease domain The structure of the nuclease domain conforms to the structure of the nuclease domain in the Left-TALEN expression vector.
  • the nuclease domain in the Right-TALEN expression vector may be the same as or different from that in the Left-TALEN expression vector, but is preferably the same.
  • the type of nuclease is the same as the nuclease in the Left-TALEN expression vector.
  • the structure of the promoter conforms to the structure of the promoter in the Left-TALEN expression vector.
  • the promoter in the Right-TALEN expression vector may be the same as or different from that in the Left-TALEN expression vector, but is preferably the same.
  • Donor vector refers to a vector that expresses the Fib H gene derived from other silkworms by being inserted into the host silkworm genome using genome editing technology.
  • the donor vector contains as components a 5' TALE corresponding region, a 3' TALE corresponding region, a 5' homologous region, a 3' homologous region, and other silkworm fibroin genes. Each component will be explained below.
  • the "5'-side TALE-corresponding region” is a target region that a TALEN protein specifically recognizes and binds to via its TALE domain.
  • the donor vector needs to become linear upon insertion.
  • the 5' side TALE-compatible region has substantially the same function as the TALE-binding region on the genome, and among the TALE-compatible regions that form a pair across the DSB site on the donor vector, other silkworms that should be knocked in The fibroin gene is located on the upstream side with respect to the insertion direction of the fibroin gene.
  • the 5'-side TALE-compatible region does not necessarily have the same base sequence as the 5'-side TALE-binding region on the genome side.
  • the 5' TALE-corresponding region has a sequence recognized by either Left-TALEN proteins or Right-TALEN proteins. good.
  • the 5'-side TALE corresponding region is located on the coding sequence of a protein to be expressed in silkworms, or on the regulatory sequence such as a promoter inserted as a selective element, it is subject to restrictions of that sequence.
  • the base length of the base sequence constituting the 5' side TALE compatible region may be 11 bases to 31 bases, 12 bases to 30 bases, 13 bases to 28 bases, 14 bases to 26 bases, or 15 bases to 25 bases. .
  • the "3'-side TALE-compatible region” refers to a region that is specifically recognized by a TALEN protein via its TALE domain, similar to the 5'-side TALE-compatible region, and This is the target region that binds.
  • the 3'-side TALE-compatible region also has the same function as the TALE-binding region on the genome, and among the TALE-compatible regions that form a pair across the DSB site on the donor vector, the fibroin gene of another silkworm to be knocked in can be inserted. It shall be located on the downstream side with respect to the direction.
  • the 3'-side TALE-compatible region does not necessarily have the same base sequence as the 3'-side TALE-binding region on the genome side.
  • the 3' TALE corresponding region has a sequence recognized by either the Left-TALEN protein or the Right-TALEN protein. good.
  • the base length of the base sequence constituting the 3' side TALE compatible region may be 11 bases to 31 bases, 12 bases to 30 bases, 13 bases to 28 bases, 14 bases to 26 bases, or 15 bases to 25 bases. .
  • the 3'-side TALE-compatible region functions as a pair of two regions with the 5'-side TALE-compatible region.
  • 5' homologous region refers to a region required for knocking in the bFib H gene in the donor vector to a predetermined position in the silkworm genome. It consists of a base sequence that is the same or homologous to the 5'-side base sequence of the DSB site. Although the length of the nucleotide sequence of the 5' homologous region is not limited, the nuclease activity of the dimer by the Left-TALEN protein and/or Right-TALEN protein bound to the 5' TAL corresponding region or 3' TALE corresponding region is within the range that can be reached.
  • the base length of the 5' homologous region varies depending on the TALEN used, but may be, for example, 5 to 15 bases, 6 to 14 bases, 7 to 13 bases, 8 to 12 bases, or 9 to 11 bases. Preferably it is 8 to 10 bases. Since the base length of the 3' side homologous region described below is in principle the same or equivalent base length to the corresponding 5' side homologous region, the 5' side homologous region that constitutes between the 5' side and 3' side TALEN corresponding region.
  • the base length of the spacer sequence consisting of the 3' homologous region is twice as long as the 5' homologous region, for example, 10 to 30 bases, 12 to 28 bases, 14 to 26 bases, 16 to 24 bases, or 18 bases. ⁇ 22 bases. Preferably it is 16 to 20 bases.
  • HDR homology-directed repair
  • MMEJ microhomology-mediated end joining
  • NHEJ non-homologous end joining
  • the "3'-side homologous region” is a region necessary for knocking in the bFib H gene in the donor vector to a predetermined position in the silkworm genome, and Functions in pairs with homologous regions. It consists of a base sequence that is the same or homologous to the insertion position on the silkworm genome, that is, the base sequence adjacent to the 3' side of the DSB site. Although the length of the base sequence of the 3' side homologous region is not limited, the nuclease activity of the dimer by the Left-TALEN protein and/or Right-TALEN protein bound to the 5' side TALE corresponding region and the 3' side TALE corresponding region is within the range that can be reached. For example, it may be 5 to 15 bases, 6 to 14 bases, 7 to 13 bases, 8 to 12 bases, or 9 to 11 bases. Preferably it is 8 to 10 bases.
  • Fibroin gene of other silkworms is a gene encoding the Fib protein of silkworms other than silkworms. It may be the full length or a part of a Fib gene of a single species, or a Fib gene that is a combination of full-length nucleotide sequences of multiple types of Fib genes, full-length nucleotide sequences and partial nucleotide sequences, or partial nucleotide sequences of Fib genes. It may be. Further, the Fib gene of other silkworms may be any of the Fib H gene, Fib L gene, and p25 gene. Preferably it is the Fib H gene. Although the type of other silkworms is not limited, bagworms are preferred. Therefore, although not limited to, the bagworm fibroin H chain gene is particularly preferred as the Fib gene of other silkworms.
  • bagworm fibroin H chain gene (bFib H gene) is a gene that encodes the bagworm fibroin H chain protein.
  • the composition of the bagworm fibroin H chain protein will be explained below.
  • the "lippedworm fibroin H chain protein (bFib H protein)" may be either a wild-type fibroin H chain protein or a modified fibroin H chain protein. Preferably it is a modified fibroin H chain protein.
  • Modified bagworm fibroin H chain protein (m-bFib H protein) refers to some amino acids of the Fib H protein of E. japonica, which was revealed by transcriptome analysis using a next-generation DNA sequencer. Based on the sequence, m-Fib H is supplemented by referring to the corresponding amino acid sequence information of silkworm Fib H for missing amino acid sequence information.
  • composition of the m-bFib H protein herein is not limited.
  • a configuration including an N-terminal region, a central region, and a C-terminal region as basic components in order from the N-terminal side can be mentioned.
  • N-terminal region refers to a selective amino acid region located on the N-terminal side of the central region described below in the amino acid sequence constituting the m-bFib H protein.
  • C-terminal region refers to a selective amino acid region located on the C-terminal side of the central region described below in the amino acid sequence constituting the m-bFib H protein.
  • central region is a region that exhibits the physical properties of the m-bFib H protein, and is composed of three or more repeating units that are the same and/or different.
  • a "repeat unit” is a unit that has a total length of 120 to 178 amino acids and includes multiple G/A units and one alanine cluster.
  • G/A unit is a unit consisting of two amino acid residues, glycine (Gly:G) residue and alanine (Ala:A) residue, and is either glycine residue-alanine residue (GA) or alanine residue. -Composed of glycine residues (AG). The majority of repeating units are composed of G/A units, with each unit containing 30 or more, 35 or more, or 40 or more G/A units, or 60 or less, 55 or less, or 50 or less G/A units. Contains.
  • Ala cluster is a subunit with consecutive alanine (Ala) residues, and is included on the N-terminal side of the repeating unit.
  • Ala cluster contains 15 to 25 alanine residues, and in addition to the alanine residues, it also contains one glutamic acid or glutamine in the center of the Ala cluster (for example, the 10th position from the N-terminus of the Ala cluster).
  • a specific example of the Ala cluster in the m-bFib H protein includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 (AAAAAAAAAEAAAAAAAAAAAAAA and AAAAAAAAAAAQAAAAAAAAA, respectively).
  • the repeat unit may include a non-G/A portion containing amino acid residues consisting of 5 to 7 amino acids other than glycine and alanine residues.
  • the amino acid sequence of the non-G/A portion is not limited.
  • SEQ ID NO: 5 YGSALNS
  • SEQ ID NO: 6 SALNS
  • SEQ ID NO: 7 TSVVYV
  • amino acid sequence constituting the repeating unit of the m-bFib H protein herein is not particularly limited as long as it satisfies the conditions for each component described above. Specific examples include, but are not limited to, the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 16 listed in Table 1.
  • each repeat unit is linked to each other directly or via any other linker sequence consisting of 1 to 30 amino acids, 1 to 20 amino acids, or 1 to 10 amino acids.
  • the sequence number shown in Table 2 below encodes repeat units No. 1 to 9 shown in Table 1, respectively. Examples include the base sequences shown as 17 to 25.
  • the arrangement order of each component is based on the 5' to 3' direction of the sense strand of other silkworm fibroin genes contained in the donor vector, and the 5' side homology between the two TALE corresponding regions is determined.
  • the region and the 3' homologous region are placed adjacent to each other across the DSB site.
  • the order is from the 5' side to the 3' homologous region - the 5' homologous region.
  • the two TALE-compatible regions are arranged in the order of the 5'-side TALE-compatible region and the 3'-side TALE-compatible region based on the 5'-3' direction, and each is a Left-TALEN protein or a Right-TALEN protein. It suffices if it has a recognized sequence.
  • the order is the 5' side TALE corresponding region, 3' side homologous region, 5' side homologous region, and 3' side TAL corresponding E region, (i) When the Left-TALEN protein recognizes the 5'-side TALE-corresponding region and the 3'-side TALE-corresponding region, (ii) the Left-TALEN protein recognizes the 5'-side TALE-corresponding region and the 3'-side homologous region as Right-TALEN.
  • the 5' side TALE corresponding region is recognized by the Right-TALEN protein and the 3' side homologous region is recognized by the Left-TALEN protein, and (vi) the 5' side TALE corresponding region and One example is the case where the Right-TALEN protein recognizes the 3'-side TALE corresponding region.
  • the second aspect of the present invention is a method for producing genome-modified silkworms.
  • a genome-edited silkworm can be produced that produces a chimeric Fib protein containing a bagworm-derived fibroin protein and a silkworm-derived fibroin protein in its silk gland.
  • the method for producing a genome-modified silkworm of the present invention includes a nucleic acid introduction step, a transformant selection step, and a genome insertion individual selection step as essential steps. Each process will be explained below.
  • nucleic acid introduction step is a step of introducing Left-TALEN mRNA or Left-TALEN expression vector, Right-TALEN mRNA or Right-TALEN expression vector, and donor vector into silkworm eggs.
  • the configurations of the Left-TALEN expression vector and Right-TALEN expression vector correspond to the configurations of the Left-TALEN expression vector and Right-TALEN expression vector described in the first embodiment, respectively.
  • the Left-TALEN expression vector and Right-TALEN expression vector of this embodiment contain a promoter that is expressed in early embryos. These expression vectors therefore express Left-TALEN and Right-TALEN proteins in early embryos.
  • Left-TALEN mRNA and “Right-TALEN mRNA” are mRNAs containing a Left-TALEN region and a Right-TALEN region, respectively.
  • the configurations of the Left-TALEN area and Right-TALEN area are similar to the configurations of the Left-TALEN area and Right-TALEN area described in the first aspect.
  • the combination of the Left-TALEN mRNA or Left-TALEN expression vector and the Right-TALEN mRNA or Right-TALEN expression vector to be introduced into silkworm eggs is not limited. All four types may be introduced, or three types selected arbitrarily may be introduced. or a combination of Left/Right-TALEN mRNA, a combination of Left/Right-TALEN expression vectors, a combination of Left-TALEN mRNA/Right-TALEN expression vectors, or a combination of Left-TALEN expression vectors/Right-TALEN mRNA. good.
  • the structure of the donor vector is similar to the structure of the donor vector described in the first aspect.
  • the expression vector and/or mRNA may be introduced into silkworm eggs by any method known in the art.
  • the method of Tamura et al. (Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84) can be used.
  • an administration solution is prepared by diluting the expression vector or mRNA with a solvent such as water or a buffer to an appropriate concentration.
  • Nucleic acid is introduced by microinjection into fertilized silkworm eggs within 6 hours immediately after birth. Injection is generally, but not limited to, performed using a special injection device that utilizes air pressure. For example, patent No. 1654050 or the method of Tamura et al. (Tamura T, et al., 2007, J Insect Biotechnol Sericol, 76: 155-159) may be used.
  • the amount of nucleic acid to be introduced is not particularly limited. It may be determined as appropriate depending on the type, property, and purpose of the nucleic acid. Usually 1nL to 5nL.
  • the "transformant selection step” is a step of selecting transformants containing the donor vector from the silkworms after the nucleic acid introduction step.
  • the method for selecting transformants is not limited as long as it is a method known in the art. For example, when the donor vector contains a marker gene, a transformant of interest can be easily selected based on the expression of the marker gene.
  • a “marker gene” is a polynucleotide consisting of a base sequence encoding a mark protein, also called a selectable marker.
  • Tag protein is a protein that can impart new traits not found in the host silkworm through the expression of a tag gene, and includes enzymes, fluorescent proteins, pigment synthesis proteins, luminescent proteins, and the like. Based on the activity of the labeled protein, it becomes possible to identify transformants carrying the introduced nucleic acid.
  • "based on activity” means based on the detection result of activity. Detection of activity may be performed by directly detecting the activity of the labeled protein itself, or indirectly through metabolites generated by protein activity. Detection may be chemical detection (including enzymatic detection), physical detection (including behavioral detection), or sensory detection of the detecting person (including detection by sight, touch, smell, hearing, or taste). It may be either.
  • the type of labeled protein is not particularly limited as long as its activity can be detected by a method known in the art.
  • a host carrying a transformant discrimination marker ie, a labeled protein that is less invasive to transformants, is used for detection.
  • Examples include fluorescent proteins, pigment synthesis proteins, luminescent proteins, externally secreted proteins, and proteins that control external morphology. Fluorescent proteins and pigment-synthesizing proteins can be visually detected under certain conditions without changing the external morphology of transformants, so they are extremely invasive to transformants and are easy to identify. It is particularly suitable because it is easy to select.
  • fluorescent protein refers to a protein that emits fluorescence at a specific wavelength when irradiated with excitation light at a specific wavelength. It may be either a natural type or a non-natural type. Furthermore, the excitation wavelength and fluorescence wavelength are not particularly limited. Specifically, examples include CFP, RFP, DsRed (including derivatives such as DsRed-monomer), YFP, PE, PerCP, APC, GFP (including derivatives such as EGFP), and the like.
  • pigment synthesis protein is a protein involved in pigment biosynthesis, and is usually an enzyme.
  • the “pigment” here refers to a low-molecular compound or peptide that can impart a pigment to a transformant, and its type is not limited. Preferably, it is a pigment that appears as an external color of an individual. Examples include melanin pigments (including dopamine melanin), ommochrome pigments, and pteridine pigments.
  • Genome insertion individual selection process is a process of selecting individuals in which another silkworm fibroin gene has been inserted (knocked in) into the desired position of the silkworm genome in the transformant.
  • the method for confirming that other silkworm fibroin genes have been accurately knocked in is not limited as long as it is a method known in the art.
  • the control silkworms into which the nucleic acid was not introduced in the nucleic acid introduction step, and other silkworm fibroin gene-specific base sequences Amplification of the region containing the insertion site (DSB site) on the genome by Southern hybridization method using a probe of Can be mentioned. Through this step, the desired genome-modified silkworm can be selected.
  • Genome-modified silkworm 3-1 The third aspect of the present invention is a genome-modified silkworm.
  • the genome-modified silkworm of the present invention includes a bagworm-derived fibroin H chain gene in its genome, and can produce the bagworm fibroin H chain protein within its silk gland.
  • chimeric silk containing chimeric fibroin protein of silkworm-derived fibroin protein and bagworm fibroin H chain protein can be spun.
  • the genome-modified silkworm of this embodiment is a silkworm obtained when the other silkworm fibroin contained in the donor vector is the m-bFib H gene in the method for producing a genome-modified silkworm according to the second embodiment.
  • This silkworm contains the m-bFib H gene in its genome, preferably as a chimeric Fib gene with the sFib gene.
  • the insertion position of the m-bFib H gene may be anywhere from the 5' end to the 3' end (excluding the stop codon) in the coding region of the sFib gene.
  • the sFib gene may be any of the sFib H gene, sFib L gene, or sp25 gene, but is preferably the sFib H gene or the sFib L gene.
  • the genome-modified silkworm of this embodiment can produce m-bFib H protein in the posterior silk gland during the larval stage, particularly in the late instar. At this time, it is preferable to produce a chimeric Fib protein with the sFib protein.
  • the genome-modified silkworm of this embodiment is capable of spinning chimeric silk containing chimeric Fib protein with m-bFib H protein, preferably sFib protein, during the larval stage, particularly in the late final instar.
  • the method for producing chimeric silk of m-bFib H protein and sFib protein from the genome-modified silkworm of this embodiment may be according to the conventional method for producing silk from silkworm.
  • genome-modified silkworms may be allowed to cocoon, and chimeric silk may be prepared from the cocoons.
  • chimera silk of bagworm silk and silkworm silk having the physical properties of bagworm silk can be mass-produced using silkworm silk production equipment or the like.
  • the method for producing chimeric silk thread includes a rearing process, a cocooning process, a cocooning process, and a reeling process as essential steps.
  • breeding process is a process of breeding the genome-modified silkworm of this embodiment.
  • Genome-modified silkworms may be reared in accordance with silkworm rearing techniques known in the art. For example, you may want to refer to ⁇ Overview of Silkworm Species; Written by Tsuyoshi Takami, Published by the National Silkworm Species Association.'' For feed, natural leaves of edible plant species such as Morus leaves may be used, or artificial feed such as Silkmate L4M or Silkworm Species for 1st to 3rd instars (Nippon Nosan Kogyo) may be used. It's okay. Artificial feed is preferable because it suppresses the occurrence of diseases, allows feeding of stable quality and quantity, and can be raised aseptically if necessary.
  • a simple method for raising genome-modified silkworms will be explained using an example.
  • Sweeping is performed using eggs laid by an appropriate number (for example, 4 to 10) of the same species of genome-modified female silkworms.
  • the hatched larvae are transferred from the spawning mount to a container lined with dry-proof paper (paraffin-treated paper), and fed with artificial feed such as Silkmate on the dry-proof paper.
  • feed should be replaced once each for 1st and 2nd instars, and 1 to 3 times for 3rd instars. If there is a lot of uneaten food, remove it to prevent spoilage.
  • the container may be covered with a lid made of dry-proof paper, acrylic, or mesh.
  • the breeding temperature is 25-28°C throughout all ages.
  • Cocooning process is a process in which the genome-modified silkworm of this embodiment is caused to cocoon.
  • Cocooning refers to the formation of a cocoon by the last (5th instar) silkworm in order to pupate.
  • This step can basically be performed using a known cocooning method for silkworms.
  • this step can be accomplished by collecting mature silkworms that are 6 to 8 days old and mulching them.
  • ⁇ Kamiho'' means transferring silkworms to maburushi. Cocooning can be done at 25-28°C. The genome-modified silkworm then forms a cocoon inside the moss.
  • Cocoon collection process is a process of scraping and collecting cocoons from the cocoon after the cocoon production process. This step includes removing the fluff attached around the cocoon. Cocoon collection should be carried out on the 6th to 8th day after harvesting. Although cocoon collection can be done manually, it is convenient to use a dedicated cocoon collection device. In addition to a fluff remover that removes only the fluff, a fully automatic cocoon collecting and fluff remover that scrapes the cocoons from the cocoon and removes the fluff can be used.
  • the "reeling process” is a process of reeling chimera silk thread from the cocoons collected in the cocoon gathering process.
  • “Reeling” refers to making raw silk from cocoons. The collected cocoons are boiled by submerging them in hot water at around 95°C to make them easier to unravel, and then the cocoon threads are pulled out from the surface layer of the cocoon in a tangled state using a cording broom. "I do. After that, ⁇ sho-o'' is performed, in which the correct thread is extracted from the cocoon, and the thread is manipulated. Although these steps can be performed manually, it is preferable to use an automatic reeling machine, which is a device exclusively for reeling. Through the above steps, chimeric silk can be produced as raw silk.
  • the fourth aspect of the invention is a chimeric silk thread.
  • the chimeric silk of this embodiment includes a chimeric Fib protein in which sFib H protein or sFib L protein and bFib H protein are linked.
  • the chimeric silk of this aspect can be obtained as silk spun by the genome-modified silkworm according to the third aspect.
  • the chimeric silk of the present invention is composed of Fib H protein, Fib L protein, and p25 protein, similar to ordinary silk thread, especially silkworm silk. After spinning and before scouring, the chimeric silk further contains sericin protein, but this protein is removed by the scouring process.
  • the chimeric silk thread of the present invention is characterized in that the Fib H protein and/or Fib L protein has a chimeric Fib protein structure in which m-bFib H protein is linked at an arbitrary position.
  • ⁇ Example 1 Preparation of donor vector> (the purpose) A donor vector included in the genome-edited silkworm production kit of the present invention is prepared. (Method) In Figure 2, based on the sequence information encoding the modified bagworm Fib H protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, the gene (sequence No. 28) was prepared.
  • the TALEN target sequence shown by SEQ ID NO: 29 (TAATGCTCAAAGATATATGCCAGCCAGGTGCACAAGCATTCACGTCTAAATACGAA) from the sFib L promoter sequence of the genome editing donor vector (pBac[3XP3-DsRed2afm]E1LLL-EGFP: obtained from the National Agriculture and Food Research Organization) to the EGFP gene and its 3' side
  • the donor vector pDVL-MMHX4 shown in FIG. 3 was constructed by replacing the above bagworm Fib H gene located in , and further replacing the DsRed2 gene with the EGFP gene.
  • Example 2 Production of genome-modified silkworm> (the purpose) A target genome-modified silkworm is produced based on the method for producing a genome-modified silkworm according to the second aspect of the present invention. (Method and results) The w1-pnd strain was used as the host silkworm. Silkworms were reared at 29°C until the 4th instar, and at 25°C during the 5th instar, with a photoperiod of 12 hours light/12 hours dark. Artificial feed (Silkmate silkworm type for 1st to 3rd instars: Nippon Nosan Kogyo Co., Ltd.) was given as food.
  • G1 eggs were left at 25°C (shipped) to start embryonic development. Screening for transformants was performed using eggs 5 to 7 days after shipment. Eggs with green fluorescence visible to the eye were selected as transformation-positive eggs.
  • the larvae that hatched from the transformation-positive eggs were reared, cocooned after 7 days, and the pupae were removed from the cocoon layer and emerged. At that time, in order to confirm the genome sequence, one leg for genome extraction was collected from the adult silkworm that had emerged, and each individual was managed by matching the moth and cocoon layers.
  • the adult silkworms were refrigerated in an unmated state until confirmation of knock-in by PCR and analysis of cocoon layer proteins by SDS-PAGE, which will be described below, were completed.
  • primers that specifically bind to the silkworm Fib gene and the donor vector on the 5' and 3' sides of the donor vector inserted into the genome. Amplified PCR was performed. One leg was collected from the legs collected above after adult silk moth emergence, and genomic DNA was extracted using DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) according to the attached protocol. Using the extracted genomic DNA as a template, PCR was performed using KOD FX Neo (TOYOBO) under normal conditions. The primers used are as follows.
  • BmFib-LF CAGACATATAAGAGCTACGA
  • MMFib-HR TGATATTCGTCAGTGTCTGCT
  • SEQ ID NO: 31 TGGTTTGTCCAAACTCATCA
  • BmFib-LR CACAATTTGCATAAAATGTC
  • the above antibody was labeled with HRP (horseradish peroxidase), and Amersham TM ECL TM Prime (Cytiva) was used for detection.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Amersham TM ECL TM Prime was used for detection.
  • a band (arrow) was observed at the same position of the chimeric Fib protein as in the above SDS-PAGE.
  • a band (arrowhead) was detected in the cocoon layer proteins of the heterozygous and wild-type individuals at the position of Fib L in the wild-type silkworm. From the above, the silkworm strain obtained in this example was determined to be a genome-modified silkworm that produces chimeric silk.
  • Example 3 Physical property analysis of chimeric silk thread> (the purpose) The physical properties of chimeric silk spun by the genome-modified silkworm produced in Example 2 will be analyzed. (Method) The cocoons of the genome-modified silkworm produced in Example 2 were boiled in a conventional manner, and the silk was reeled using a multi-filament reeling machine (Harada Ltd.). The obtained raw silk was measured using a measuring machine every 30 windings (33.75 m), and left to stand for at least 24 hours in a room with a temperature of 20°C and a humidity of 65%, and then the fineness was determined from the weighed weight. I asked for it.
  • Toughness refers to the work (energy) required to break a material, and is given by the area of the stress-strain curve. Generally, the higher the number, the harder it is to cut.

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Abstract

ミノムシ絹糸の物性に近似したカイコ絹糸とのキメラ絹糸を生産することのできるカイコを作出し、そのカイコから目的のキメラ絹糸を繊維状態で得ることである。　ミノムシ由来のフィブロインタンパク質とカイコ由来のフィブロインタンパク質をコードする遺伝子断片と融合させた改変型ミノムシフィブロインタンパク質をコードする遺伝が挿入されたゲノム改変カイコを提供する。

Description

キメラ絹糸を生産するゲノム改変カイコ
　本発明は、キメラ絹糸を生産するゲノム改変カイコの作製方法及び作製キット、並びにそのゲノム改変カイコ及びそれから得られるキメラ絹糸に関する。
　ミノムシ（bagworm)は、チョウ目（Lepidoptera）ミノガ科（Psychidae）に属する蛾の幼虫の総称である。このミノムシが吐糸するミノムシ絹糸は、カイコが吐糸する絹糸よりも高い物性を有することから、近年、有用な新規動物性天然繊維として注目を集めている（特許文献１及び非特許文献１）。
　ミノムシ絹糸を繊維素材として実用化するには、いくつかの解決すべき課題が存在する。その一つが量産である。ミノムシ絹糸をミノムシから取得する場合、量産にはミノムシの大量飼育技術及びミノムシから絹糸を効率的に採取する技術が不可欠である。しかし、ミノムシ絹糸産業は黎明期を迎えたばかりのため、それらの技術の多くは開発途上段階にあり、量産化にはまだ時間を要する。
　ミノムシ絹糸の量産には、前記のようにミノムシから直接絹糸を取得する方法以外にも、遺伝子組換え技術等を用いてミノムシ絹糸の繊維成分であるフィブロインタンパク質（本明細書では、しばしば「Fibタンパク質」と表記する）を宿主内で生産する方法がある。クローニングしたフィブロイン遺伝子（本明細書では、しばしば「Fib遺伝子」と表記する）を宿主に導入して発現させることで、宿主細胞内で組換えミノムシFibタンパク質を大量生産することが可能となる。ところが、この技術もミノムシ絹糸の主要成分であるフィブロインH鎖タンパク質（本明細書では、しばしば「Fib Hタンパク質」と表記する）の全長遺伝子配列が十分に決定されていないという問題がある。これはFib Hタンパク質がグリシン残基とアラニン残基が多数繰り返されたアミノ酸配列を有することから、通常のクローニング技術では塩基配列決定が極めて難しいという理由による。また、宿主内で発現させたミノムシFibタンパク質（本明細書では、しばしば「bFibタンパク質」と表記する）は液状のため、繊維として利用する場合には、繊維状に加工しなければならない。しかし、この方法は手間と製造コストを要するという問題を伴う。さらにbFibタンパク質を従来の紡糸技術で繊維化することは困難であり、新たな紡糸技術の開発を必要とするという問題もあった。
　一方、絹糸を採取するための家畜昆虫として5000年以上にわたって飼育されてきたカイコでは、大量飼育及び大量採糸の技術や量産設備が確立している。さらに、近年では遺伝子組換え技術を用いて作出した遺伝子組換えカイコから様々な遺伝子組換え絹糸を生産させることも可能になっている。
　そこで、本発明者らは、前記ミノムシ絹糸の量産化における問題の早期解決策として、ミノムシのFib Hタンパク質（本明細書では、しばしば「bFib Hタンパク質」と表記する）をコードする遺伝子の部分塩基配列情報に基づいた改変フィブロイン遺伝子を構築し、それを導入した遺伝子組換えカイコを作出し、吐糸させることによって、カイコ絹糸にミノムシ絹糸の物性が付与されたキメラ絹糸を得ることに成功した（特許文献２）。しかし、得られたキメラ絹糸の物性はミノムシ絹糸の特徴の一部を有してはいるものの、ミノムシ絹糸に近い物性の絹糸を得るという点では課題が残されていた。
特開2018-197415 WO2018/074403
大崎茂芳, 2002, 繊維学会誌（繊維と工業）, 58: 74-78
　本発明の課題は、ミノムシ絹糸の含有率が高く、それによりミノムシ絹糸の物性に近似するカイコ絹糸とのキメラ絹糸を生産することのできるカイコを作出し、そのカイコから目的のキメラ絹糸を繊維状態で得ることである。
　特許文献２ではトランスポゾンを用いた方法により目的の遺伝子をカイコゲノム中に挿入して遺伝子組換えカイコを作出している。しかし、トランスポゾンにより挿入された外因性遺伝子の発現効率は、内因性遺伝子の発現効率に対して数％に留まる。本発明者らは、これが前記キメラ絹糸にミノムシ絹糸の物性を付与する阻害原因であると推定した。そこで、トランスポゾン法に替えて、TAL-PITCh法を用いたゲノム編集技術により目的の改変フィブロイン遺伝子をカイコゲノム中にノックインすることを試みた。その結果、ミノムシ改変フィブロイン遺伝子が挿入されたゲノム改変カイコの作出に成功した。得られたゲノム改変カイコは、カイコの絹糸腺でカイコとミノムシのキメラフィブロインタンパク質（本明細書では、しばしば「キメラFibタンパク質」と表記する）を生産できるだけでなく、カイコに吐糸させることでキメラFibタンパク質を絹糸の状態で得ることができた。本発明は、これらの開発結果に基づくものであって、以下を提供する。
　（１）カイコ由来のフィブロインタンパク質と1種又は複数種の他の絹糸虫由来のフィブロインタンパク質を含むキメラフィブロインタンパク質を生産するゲノム改変カイコの作製キットであって、前記作製キットは、Left-TALEN発現ベクター、Right-TALEN発現ベクター、及びドナーベクターを含み、前記Left-TALEN発現ベクターは、Left-TALENコード領域を含み、前記Left-TALENコード領域は、カイコフィブロイン遺伝子において、前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子挿入位置の5'側近傍に位置する5'側TALE結合領域の塩基配列を認識し結合するLeft-TALEドメイン、及びその下流のヌクレアーゼドメインをコードし、前記Right-TALEN発現ベクターは、Right-TALENコード領域を含み、前記Right-TALENコード領域は、カイコフィブロイン遺伝子において、前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子挿入位置の3'側近傍に位置する3'側TALE結合領域の塩基配列を認識し結合するRight-TALEドメイン、及びその下流のヌクレアーゼドメインをコードし、前記ドナーベクターは、5'側TALE対応領域、3'側TALE対応領域、5'側相同領域、3'側相同領域、及び前記他の絹糸虫由来のフィブロイン遺伝子を含む前記作製キット。
　（２）前記ドナーベクターが5'側から5'側TALE対応領域、3'側相同領域、5'側相同領域、及び3'側TALE対応領域の順で配置される（１）に記載の作製キット。
　（３）前記他の絹糸虫由来のフィブロインタンパク質がフィブロインH鎖タンパク質である、（１）又は（２）に記載の作製キット。
　（４）前記他の絹糸虫がミノムシである、（１）～（３）のいずれかに記載の作製キット。
　（５）ミノムシフィブロインH鎖タンパク質が、同一の及び／又は異なる反復ユニットを3個以上連結してなる改変フィブロインH鎖タンパク質であって、
　前記反復ユニットは、グリシン残基及びアラニン残基の2アミノ酸残基からなるG/A単位を30単位以上含み、そのN末端側に15～25個のアラニン残基を含むアラニンクラスターを含む、全長120個～178個のアミノ酸からなる、（４）に記載の作製キット。
　（６）前記アラニンクラスターは配列番号３又は４で示すアミノ酸配列からなる、（５）に記載の作製キット。
　（７）前記反復ユニットは配列番号８～１６で示すアミノ酸配列から選択されるいずれか一以上である、（５）又は（６）に記載の作製キット。
　（８）ミノムシフィブロインH鎖タンパク質をコードする遺伝子が配列番号１７～２５で示すいずれか一の塩基配列からなる、（４）～（７）のいずれかに記載の作製キット。
　（９）カイコ由来のフィブロインタンパク質と1種又は複数種の他の絹糸虫由来のフィブロインタンパク質を含むキメラフィブロインタンパク質を絹糸腺で生産するゲノム改変カイコの製造方法であって、Left-TALEN mRNA又はLeft-TALEN発現ベクター、Right-TALEN mRNA又はRight-TALEN発現ベクター、及びドナーベクターをカイコの卵に導入する核酸導入工程、前記核酸導入工程後のカイコから他の絹糸虫由来のフィブロイン遺伝子を含む形質転換体を選択する形質転換体選択工程、及び前記形質転換体から前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子がカイコゲノムの目的の位置に挿入されている個体を選択するゲノム挿入個体選択工程を含み、前記Left-TALEN mRNAはLeft-TALE領域及びヌクレアーゼドメインをコードする領域を含み、前記Left-TALE領域は、カイコフィブロイン遺伝子において、前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子挿入位置における5'側TALE結合領域の塩基配列を認識し結合するLeft-TALEドメインをコードし、前記Left-TALEN発現ベクターは、プロモーターとその発現制御下に配置された前記Left-TALE領域及びヌクレアーゼドメインをコードする領域を含み、前記Right-TALEN mRNAはRight-TALE領域及びヌクレアーゼドメインをコードする領域を含み、前記Right-TALE領域は、カイコフィブロイン遺伝子において、前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子の挿入位置における3'側TALE結合領域の塩基配列を認識し結合するRight-TALEドメインをコードし、前記Right-TALEN発現ベクターは、プロモーターとその発現制御下に配置された前記Right-TALE領域及びヌクレアーゼドメインをコードする領域を含み、前記ドナーベクターは、5'側TALE対応領域、3'側TALE対応領域、5'側相同領域、3'側相同領域、及び他の絹糸虫フィブロイン遺伝子を含む前記製造方法。
　（１０）前記ドナーベクターが前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子のセンス鎖方向を基準に5'側から5'側TALE対応領域、3'側相同領域、5'側相同領域、及び3'側TALE対応領域の順で配置される、（９）に記載の製造方法。
　（１１）前記他の絹糸虫由来のフィブロインタンパク質がフィブロインH鎖タンパク質である、（９）又は（１０）に記載の製造方法。
　（１２）前記他の絹糸虫がミノムシである、（９）～（１１）のいずれかに記載の製造方法。
　（１３）ミノムシフィブロインH鎖タンパク質が、同一の及び／又は異なる反復ユニットを3個以上連結してなる改変フィブロインH鎖タンパク質であって、前記反復ユニットは、グリシン残基及びアラニン残基の2アミノ酸からなるG/A単位を30単位以上含み、そのN末端側に15～25個のアラニン残基を含むアラニンクラスターを含む、全長120個～178個のアミノ酸からなる、（１２）に記載の製造方法。
　（１４）前記アラニンクラスターは配列番号３又は４で示すアミノ酸配列からなる、（１３）に記載の製造方法。
　（１５）前記反復ユニットは配列番号８～１６で示すアミノ酸配列から選択されるいずれか一以上である、（１３）又は（１４）に記載の製造方法。
　（１６）前記ミノムシフィブロインH鎖タンパク質をコードする遺伝子が配列番号１７～２５で示すいずれか一の塩基配列からなる、（１２）～（１５）のいずれか記載の製造方法。
　（１７）ミノムシ由来のフィブロインH鎖遺伝子をカイコゲノム内に包含し、そのフィブロインH鎖タンパク質を絹糸腺内で生産するゲノム改変カイコ。
　（１８）前記ミノムシ由来のフィブロインH鎖タンパク質がカイコ由来のフィブロインタンパク質とのキメラフィブロインタンパク質である、（１７）に記載のゲノム改変カイコ。
　（１９）カイコフィブロインH鎖タンパク質又はL鎖タンパク質の任意の位置に改変ミノムシフィブロインH鎖タンパク質が連結されたキメラフィブロインタンパク質を含むキメラ絹糸であって、前記改変ミノムシフィブロインH鎖タンパク質は同一の及び／又は異なる反復ユニットを3個以上連結してなり、前記反復ユニットは、グリシン残基及びアラニン残基の2アミノ酸残基からなるG/A単位を30単位以上含み、そのN末端側に15～25個のアラニン残基を含むアラニンクラスターを含む、全長120個～178個のアミノ酸からなる前記キメラ絹糸。
　（２０）前記アラニンクラスターは配列番号３又は４で示すアミノ酸配列からなる、（１９）に記載のキメラ絹糸。
　（２１）前記反復ユニットは配列番号８～１６で示すアミノ酸配列から選択されるいずれか一以上である、（１９）又は（２０）に記載のキメラ絹糸。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-056854号の開示内容を包含する。
本発明のゲノム改変カイコ作製キットを構成するLeft-TALEN発現ベクター（ａ）、Right-TALEN発現ベクター（ｂ）、及びドナーベクター（ｃ）の概念図を示す図である。 実施例１において本発明のキメラタンパク質構築の基礎としたWO2018/074403に記載の改変型ミノムシフィブロインタンパク質の構成を示す模式図（A）とそのアミノ酸配列（B)を示す図である。 実施例１において構築した本発明のドナーベクターpDVL-MMHX4の模式図である。 実施例２において作製した本発明のゲノム改変カイコが作るキメラタンパク質の構成を示す模式図（A）とそのアミノ酸配列（B、配列番号３４）を示す図である。このキメラタンパク質は、カイコL鎖フィブロイン（a）のC末端に融合した改変型ミノムシフィブロインタンパク質のN末端領域（b）、同フィブロインタンパク質の反復配列（c：一部反復ユニット＋反復ユニット×12）、及び6×ヒスチジンタグ（d）からなる。 実施例２で行ったキメラ絹糸由来の繭層タンパク質のウェスタンブロッティングを示す図である。図中、矢印は実施例１で作製したキメラL鎖の位置を示す。またヘテロ個体と対照個体からは野生型カイコL鎖の位置にバンド(矢頭)が見られた。
１．ゲノム改変カイコ作製キット
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、ゲノム改変カイコ作製キットである。本態様のキットは、ゲノム編集技術により、カイコ由来のFibタンパク質と他の絹糸虫、特にミノムシ由来のFibタンパク質を含むキメラFibタンパク質を生産するゲノム改変カイコの作製に必要な発現ベクター等を含む。本態様のキットによれば、前記キメラFibタンパク質を生産するゲノム改変カイコを簡便に作製することができる。
１－２．用語の定義
　本発明で頻用する以下の用語について定義する。
　本明細書において「絹糸虫」とは、絹糸腺を有し、絹糸を吐糸することのできる昆虫の総称である。具体的には、チョウ目（Lepidoptera）、ハチ目（Hymenoptera）、アミメカゲロウ目（Neuroptera）、トビケラ目（Trichoptera）等のうち主として幼虫期に営巣、営繭又は移動のために吐糸することのできる種類を指す。チョウ目（Lepidoptera）であれば、多量の絹糸を吐糸できるカイコガ科(Bombycidae)、ヤママユガ科（Saturniidae）、イボタガ科(Brahmaeidae)、オビガ科(Eupterotidae)、カレハガ科（Lasiocampidae）、ミノガ科（Psychidae）、ヒトリガ科（Archtiidae）、ヤガ科（Noctuidae）等が本明細書の絹糸虫として好ましい。
　本明細書において「他の絹糸虫」とは、カイコガ（Bombyx mori）以外の絹糸虫をいう。他の絹糸虫の種類は限定しない。また1種に限らず、複数種であってもよい。限定はしないが、他の絹糸虫として好ましくはミノガ（ミノムシ）である。なお、本明細書では特段の断りのない限りカイコガは、幼虫期の名称である「カイコ」を同義の用語として使用する。
　「ミノムシ」とは、ミノガ科（Psychidae）に属する蛾の幼虫の総称である。前記カイコと同様に、本明細書では特段の断りのない限りミノガも吐糸をする幼虫期の名称である「ミノムシ」をミノガと同義の用語として使用する。本明細書におけるミノムシの種類は特に限定しない。例えばAcanthopsyche、Anatolopsyche、Bacotia、Bambalina、Canephora、Chalioides、Dahlica、Diplodoma、Eumeta、Eumasia、Kozhantshikovia、Mahasena、Nipponopsyche、Paranarychia、Proutia、Psyche、Pteroma、Siederia、Striglocyrbasia、Taleporia、Theriodopteryx、Trigonodoma等のいずれの属に属する種であってもよい。本明細書において遺伝子クローニングを行ったFib遺伝子が、オオミノガ（Eumeta japonica）由来のFib H遺伝子であることから、好ましくはオオミノガやチャミノガ（Eumeta minuscula）のようなEumeta属の幼虫である。
　本明細書で「絹糸」とは、絹糸腺で生産される昆虫由来のタンパク質製の糸であって、昆虫の幼虫や成虫によって営巣、移動、固定、営繭、餌捕獲等の目的で吐糸される。絹糸は、通常、主要繊維成分であるフィブロイン（Fib）タンパク質とそれを被覆する糊状成分であるセリシンタンパク質で構成される。特段の断りのない限り本明細書で単に「絹糸」と表記した場合、絹糸虫が吐糸した絹糸、すなわちFibタンパク質及びセリシンタンパク質を含む「生糸」、及び精練処理を経て生糸からセリシンタンパク質が除去された糸状Fibタンパク質からなる「練絹」の両方を意味するものとする。また、絹糸は、原則として由来昆虫名を特定しない広く一般的な絹糸を意味し、特定の昆虫由来の絹糸を表す場合には、カイコ絹糸やミノムシ絹糸のように、その由来生物名を絹糸の前に付すものとする。
　「絹糸腺」とは、唾液腺の変化した管状器官であり、Fibタンパク質やセリシンタンパク質を産生し、その内腔にそれらを蓄積した後、分泌する機能を有する。一般に絹糸腺は、絹糸を吐糸することのできる昆虫の消化管に沿って左右一対で存在し、各絹糸腺は、前部、中部及び後部絹糸腺の3領域で構成されている。後部絹糸腺ではFibタンパク質を産生し、中部絹糸腺ではセリシンタンパク質を産生する。後部絹糸腺で生産されたFibタンパク質は、中部絹糸腺の内腔に移行し、多くの場合、セリシンタンパク質と共に前部絹糸腺に移行した後、頭部吐糸管より絹糸として吐出される。
　本明細書のゲノム改変カイコはキメラFibタンパク質を生産する。そのキメラFibタンパク質をコードするキメラFib遺伝子は、カイコの内因性Fib遺伝子との融合遺伝子であり、原則としてカイコのFib遺伝子と同じ発現制御を受ける。よって、本明細書でキメラFibタンパク質を生産する絹糸腺とは、特に断りのない限り後部絹糸腺を意味するものとする。
　「フィブロイン(Fib）タンパク質」とは、絹糸の繊維成分を構成するタンパク質をいう。通常は全長タンパク質をいうが、本明細書では、そのペプチド断片も含む。ここでいうペプチド断片はFibタンパク質の機能断片であることが好ましい。「機能断片」とは、フィブロインタンパク質としての機能を有するペプチドをいう。フィブロインタンパク質は、例えば、カイコではフィブロインH鎖（Fib H）タンパク質、フィブロインL鎖（Fib L）タンパク質、及びp25/FHX(本明細書では、しばしば単に「p25」と表記する)タンパク質の3つのタンパク質で構成されることが知られている。この中で、Fib Hタンパク質は、Fibタンパク質における主要構成タンパク質であり、絹糸の物性は主としてFib Hタンパク質によってもたらされる。本明細書で、カイコ由来のFibタンパク質は、前記3つの構成タンパク質のいずれであってもよい。
　なお、本明細書において、遺伝子又はタンパク質に限らず、「Fib」、「Fib H」、又は「Fib L」と表記した場合には、原則として由来昆虫は限定しないものとする。一方、特定の昆虫由来の遺伝子又はタンパク質を表す場合には、その由来生物名、若しくはその略称をFibの前に付すものとする。例えば、カイコ由来のFib遺伝子又はFibタンパク質であれば、カイコFib（silkworm Fib: sFib）遺伝子又はタンパク質のようになり、又はミノムシFib（bagworm Fib: bFib）遺伝子又はタンパク質のようになる。Fib H遺伝子又はタンパク質、あるいはFibL遺伝子又はタンパク質についても同様である。
　本明細書において「改変フィブロインH鎖（modified Fib H)タンパク質」（本明細書では、しばしば「m-Fib Hタンパク質」と表記する）とは、野生型Fib Hタンパク質を人為的に改変したFib Hタンパク質をいう。m-Fib Hには、例えば、野生型Fib Hタンパク質のアミノ酸配列に1個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失、及び/又は置換を人為的に導入した変異型Fib Hタンパク質や、2種以上の異なる昆虫由来の野生型Fib Hタンパク質のアミノ酸配列を融合した融合Fib Hタンパク質等が挙げられる。なお、本明細書において、「n（個の）アミノ酸」（nは整数）と表記する場合、特段の断りのない限り「n（個の）アミノ酸残基」と同義とする。
　本明細書において「キメラFibタンパク質」とは、2種以上の異なるFibタンパク質の全長及び／又はその一部を直接、又は間接的に連結したFibタンパク質をいう。例えば、一方の種のFib Lタンパク質の全長又はその一部の任意の場所に、他方の種のFib Hタンパク質の全長又はその一部を、全体で1つのポリペプチド鎖となるように、直接的に、又は介在ペプチドを介して間接的に連結したFibタンパク質や、一方の種のFib Hタンパク質のアミノ酸配列内の適当な位置に、他方の種のFib Hタンパク質の全長又はその一部のアミノ酸配列を挿入したFibタンパク質が挙げられる。特に、本明細書でキメラFibタンパク質と表記した場合には、カイコ由来のFibタンパク質と他の絹糸虫由来のFibタンパク質を含むキメラFibタンパク質、特にカイコ由来のFibタンパク質とミノムシ由来のFibタンパク質を含むキメラFibタンパク質（本明細書では、しばしば「カイコ-ミノムシキメラFibタンパク質（s/bFibタンパク質）」と表記する）を意味するものとする。なお、ここでのミノムシ由来のFibタンパク質は限定しないが、好ましくはm-bFib Hタンパク質である。またカイコ由来のFibタンパク質も限定しない。sFib Lタンパク質、sFib Hタンパク質、又はp25タンパク質のいずれであってもよい。
　本明細書において「フィブロイン（Fib)遺伝子」とは、前記Fibタンパク質をコードする遺伝子をいう。前記Fibタンパク質が全長ではなく、そのペプチド断片であった場合には、そのペプチド断片をコードする遺伝子断片を意味するものとする。また、「Fib H遺伝子」、「Fib L遺伝子」、及び「p25遺伝子」とは、それぞれFib H、Fib L、及びp25をコードする遺伝子をいう。
　本明細書において「改変フィブロインH鎖（modified Fib H)遺伝子」（本明細書では、しばしば「m-Fib H遺伝子」と表記する）とは、m-Fib Hをコードする遺伝子をいう。したがって、「m-bFib H遺伝子」とは、ミノムシ由来のFib Hにおける改変型Fib Hをコードする遺伝子である。本態様では、このm-bFib H遺伝子が対象となる。前記タンパク質と同様に「Fib H遺伝子」のように表記した場合、本明細書においては原則として由来昆虫は問わない。一方、特定の昆虫由来のFib H遺伝子を表す場合、カイコFib H（sFib H）遺伝子やミノムシFib H（bFib H）遺伝子のように、その由来生物名をFib Hの前に付すものとする。
　本明細書において「キメラFib遺伝子」とは、前記キメラFibタンパクをコードする遺伝子をいう。本発明のゲノム改変カイコは、ゲノム中にこのキメラFib遺伝子を包含している。
　本明細書において「キメラ絹糸」とは、前記キメラFib遺伝子を包含するゲノム改変カイコが吐糸する絹糸をいう。キメラ絹糸は、前記キメラFibタンパク質以外、全てカイコ由来の絹糸成分で構成されている。例えば、前記キメラFib遺伝子がsFib L遺伝子とm-bFib H遺伝子を融合してなる遺伝子の場合、そのキメラFib遺伝子を包含するゲノム改変カイコの吐糸するキメラ絹糸は、前記キメラFib遺伝子由来のキメラFibタンパク質、カイコ由来のsFib H、p25及びセリシンからなるハイブリッド絹糸である。キメラ絹糸は、カイコ絹糸の繊維成分であるFibタンパク質の一部がm-bFib Hタンパク質で構成されている。カイコが吐糸する絹糸であっても改変型ミノムシFib Hを含有することで、ミノムシ絹糸の物性が付与される。
　本明細書において「発現ベクター」とは、遺伝子を発現可能な状態で包含し、その発現を制御できる発現システムをいう。本明細書で「発現可能な状態」とは、ベクターに内包される遺伝子が宿主細胞内で発現できるように発現ベクター内に組み込まれていることを意味する。具体的には、内包された遺伝子が発現ベクター内のプロモーター制御下に配置されていることをいう。
　本明細書において「ゲノム改変カイコ」とは、ゲノム編集技術によって作製されたカイコをいう。本明細書では、特にミノムシ由来のFib遺伝子、好ましくはm-bFib H遺伝子をゲノム編集技術によってカイコゲノムに挿入（ノックイン）したカイコをいう。
　「ゲノム編集技術」とは、人工DNA切断酵素がゲノム上の特定の配列を認識してDNAを二本鎖切断（double strand break：本明細書では「DSB」と表記する)することによって、上記特定の位置への外来遺伝子の挿入（ノックイン）や標的遺伝子の破壊（ノックアウト）を行う遺伝子ターゲティング技術である。ゲノム編集技術には、TALEN法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）法、及びCRISPR-Cas9法等が知られるが、本明細書でゲノム編集技術と表記する場合、特段の断りのない限りTALEN法を指すものとする。
　「TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）法」は、植物病原細菌であるXanthomonas属菌由来のTALエフェクター（TALE）タンパク質を利用した人工DNA切断酵素によるゲノム編集技術である（Cermak T, et al., 2011, Nucleic Acids Res 39: e82）。TALENタンパク質は、配列番号１で例示する約34アミノ酸残基（LTPDQVVAIASXXGGKQALETVQRLLPVLCQDHG）からなるDNA結合ユニットの繰り返しを持つ特殊なTALEドメインとヌクレアーゼドメインからなるタンパク質である。このうち、DNAを切断する酵素活性を持つヌクレアーゼドメインは二量体で機能するため、TALENタンパク質も、標的とする遺伝子について、二本鎖切断（DSB）部位の上流側（5'側）近傍のセンス鎖DNA配列を認識する「Left-TALENタンパク質」とDSB部位の下流側（3'側）近傍のアンチセンス鎖DNA配列を認識する「Right-TALENタンパク質」からなる二量体で機能する。前記TALEドメインを構成するDNA結合ユニットは、配列番号１においてN末端側から12位及び13位のアミノ酸残基が可変であり、2アミノ酸一組で、DNAを構成する4種の塩基（A：アデニン、G：グアニン、C：シトシン、T：チミン）のそれぞれを特異的に認識することができる。例えば、12-13位のアミノ酸残基がそれぞれ、N-Iのときはアデニンを、N-Nのときはグアニン又はアデニンを、H-Dのときはシトシンを、そしてN-Gのときはチミンを認識する。DNA結合ユニットの繰り返し数は、標的塩基配列の塩基長に応じて変動することができる。ゲノム上の5'から3'方向に並ぶ任意のDNA配列に合わせて、それぞれの塩基を認識する結合ユニットを連結してTALEドメインを作製し、これにヌクレアーゼドメインを融合することで、ゲノム上の任意のDNA配列に結合するヌクレアーゼ単量体（Left-TALENタンパク質）となる。この5'側TALEN結合領域から3'側に適切な間隔（15～30塩基）を空けたゲノムの相補鎖に結合するTALENを同様に作製し、それを他方のヌクレアーゼ単量体（Right-TALENタンパク質）とする。これらを二量体として同時に働かせることで、任意のDNA配列を標的として切断する遺伝子ターゲティングが可能となる。
　「PITCh（Precise Integration into Target Chromosome）法」は、マイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ：Microhomology-Mediated End Joining；本明細書では、「MMEJ」と表記する）を利用したノックイン技術である（Nakade S., et al., 2014, Nature Comm., 5, 5560）。MMEJは、DSBによって生じる両側の末端に共通して存在する5～25bpの短い相同配列（Microhomology）の連結によってDNA修復が行われるDNA修復経路である。一般に、外来遺伝子のノックインは姉妹染色分体を鋳型として修復する相同組換え(Homologous recombination :HR)のメカニズムを利用したHR法によって行われる。しかし、HR法による外来遺伝子のノックインでは、800～数千bpと非常に長い配列が必要であり、また発生頻度が生物種によって著しく異なるため効率的にノックインできる生物種が限定されていた。MMEJを利用したPITCh法は、使用する生物種を選ばず、従来のHRを利用した技術よりも高い効率でノックインが可能な方法である。
　本明細書において「TAL-PITCh法」（又はTALEN-PITCh法）とは、PITCh法におけるゲノム編集ツールとしてTALENを用いる方法である。
　本明細書において「プロモーター」とは、その制御下に配置された遺伝子（対象遺伝子）の発現を制御することのできる遺伝子発現調節領域である。
１－３．構成
　本態様のゲノム改変カイコ作製キットは、Left-TALEN発現ベクター、Right-TALEN発現ベクター、及びドナーベクターを必須の構成要素として含む。原則として前記3つ1組で使用される。
　前記ゲノム改変カイコ作製キットに含まれる前記各ベクターは、それぞれの構成要素を包含していれば別個のベクターである必要はない。2つ又は3つのベクターを1つのベクターに組み合わせた構成であってもよい。例えば、Left-TALEN発現ベクターとRight-TALEN発現ベクターを1つにまとめたLeft/Right-TALEN発現ベクターのような構成、及び3つのベクターの構成を1つのベクターに全て包含する構成が挙げられる。
　以下、各ベクターにおける構成について具体的に説明をする。
１－３－１．Left-TALEN発現ベクター
　本明細書において「Left-TALEN発現ベクター」は、Left-TALEN領域及びプロモーターを必須の構成要素として含む発現ベクターをいう。本発明のゲノム改変カイコ作製キットにおいて、Left-TALEN発現ベクターは、ゲノム編集を行うカイコ細胞に導入し、in vivoでLeft-TALENタンパク質を発現させてもよいし、in vitro転写に用いてLeft-TALEN mRNAを調製してもよい。
（構成）
　以下、Left-TALEN発現ベクターの各構成要素について説明をする。
　（１）Left-TALEN領域
　本明細書において「Left-TALEN領域」は、Left-TALEドメイン及びその下流に配置されたヌクレアーゼドメインをコードする領域で、前述のLeft-TALENタンパク質をコードする。以下、Left-TALEN領域の構成要素であるLeft-TALEドメイン、及びヌクレアーゼドメインについて説明をする。
　（１－１）Left-TALEドメイン
　本明細書において「Left-TALEドメイン」は、TALENにおけるDNA結合ドメインであって、前述の配列番号１で示す34アミノ酸からなるDNA結合ユニットの繰り返し配列を含むアミノ酸配列で構成されている。繰り返しの数は、sFib遺伝子における5'側TALE結合領域の塩基数に一致する。例えば、5'側TALE結合領域の塩基数が15塩基の場合、DNA結合ユニットの繰り返し数は15となる。Left-TALEドメインをコードする塩基配列の5'末端側にはN末端ドメインを、また3'末端側にはC末端ドメインを含んでいてもよい。前記5'側TALE結合領域の5'側にはチミン（T）を含み得る。
　本明細書において「5'側TALE結合領域」とは、カイコゲノム上のsFib遺伝子における特定の塩基配列からなる領域で、本発明のLeft-TALENタンパク質がLeft-TALEドメインを介して特異的に認識し、結合する標的領域である。5'側TALE結合領域を構成する塩基配列や塩基長は、カイコゲノム上のsFib遺伝子において、bFib遺伝子を挿入すべき所望の位置、すなわちDSB部位から上流5～55塩基の配列内で選択される11塩基～31塩基、12塩基～30塩基、13塩基～28塩基、14塩基～26塩基、又は15塩基～25塩基の任意の塩基配列からなる。したがって、5'側TALE結合領域の塩基配列は、DSB部位に応じて適宜設計すればよい。
　（１－２）ヌクレアーゼドメイン
　本明細書において「ヌクレアーゼドメイン」はLeft-TALEドメイン又は後述するRight-TALEドメインの下流に連結されたエンドヌクレアーゼ又はその活性ドメインからなるドメインである。Left-TALEドメイン又はRight-TALEドメインを介して、カイコFib遺伝子上の5'側TALE結合領域及び3'側TALE結合領域にそれぞれ結合したLeft-TALENタンパク質及びRight-TALENタンパク質は、それぞれのヌクレアーゼドメインが有するエンドヌクレアーゼ活性によって目的のDSB部位を切断する。エンドヌクレアーゼの種類は、特定の認識配列を有さず、任意の配列に対してDSB活性を有していれば特に限定はしない。例えば、FokIから塩基配列認識ドメインを除いたものが挙げられる。
　（２）プロモーター
　本明細書において「プロモーター」は、下流の遺伝子発現を制御する転写調節領域をいう。本発明で使用するプロモーターは、下流の遺伝子を転写させる環境下で作動可能なプロモーターである限り、いずれの遺伝子由来であってもよい。ここでいう「作動可能」とは、プロモーターとしての機能を発揮し、対象遺伝子等を転写できることをいう。
　プロモーターの種類は問わない。例えば、絹糸虫の細胞内での転写であれば、ハウスキーピング遺伝子の発現を制御するユビキタスに発現可能な恒常発現型プロモーター、構成的活性型プロモーター、時期特異的活性型プロモーター、部位特異的プロモーター又は発現誘導型プロモーター等が挙げられる。限定はしないが、恒常発現型プロモーター、又は時期特異活性型プロモーターが好ましい。恒常発現型プロモーターの例として、アクチンプロモーターが挙げられる。また、発現誘導型プロモーターの例として、hsp70プロモーターが挙げられる。一方、バクテリオファージ特異的RNAポリメラーゼ等を利用したin vitro転写用プロモーターとしては、SP6プロモーター、T3プロモーター、及びT7プロモーター等が挙げられる。
　絹糸虫由来のin vivo用プロモーターの塩基配列の具体的な例として、配列番号２で示される塩基配列を含むカイコ由来のアクチンプロモーターが挙げられる。
１－３－２．Right-TALEN発現ベクター
　本明細書において「Right-TALEN発現ベクター」は、前記Left-TALEN発現ベクターとペアで機能する発現ベクターであり、Right-TALEN領域及びプロモーターを必須の構成要素として含む発現ベクターをいう。したがって、基本構成はLeft-TALEN発現ベクターに準ずる。本発明のゲノム改変カイコ作製キットでは、Right-TALEN発現ベクターもゲノム編集を行うカイコ細胞に導入し、in vivoでRight-TALENタンパク質を発現させてもよいし、in vitro転写に用いてRight-TALEN mRNAを調製してもよい。
（構成）
　以下、Right-TALEN発現ベクターの各構成要素について説明をする。
　（１）Right-TALEN領域
　本明細書において「Right-TALEN領域」は、Right-TALEドメイン及びその下流に配置されたヌクレアーゼドメインをコードする領域で、前述のRight-TALENタンパク質をコードする。基本的な構成は前記Left-TALEN発現ベクターにおけるLeft-TALEN領域の構成に準ずる。したがって、ここではLeft-TALEN領域と共通する構成の説明は省略し、異なる構成を中心に説明をする。
　（１－１）Right-TALEドメイン
　本明細書において「Right-TALEドメイン」は、TALENにおけるDNA結合ドメインであって、前述の配列番号１で示す34アミノ酸からなるDNA結合ユニットの繰り返し配列で構成されている。基本構成は前記Left-TALEドメインに準ずるが、Right-TALEドメインはsFib遺伝子における3'側TALE結合領域を標的とし、繰り返しの数は、sFib遺伝子における3'側TALE結合領域の塩基数に一致する。Right-TALEドメインが認識する3'側TALE結合領域の5'側にも、Left-TALEドメインが認識する5'側TALE結合領域の5'側と同様に、通常、チミン（T）が配置されている。ただし、このチミンは必ずしも配置されていなくてもよい。
　本明細書において「3'側TALE結合領域」とは、カイコゲノム上のFib遺伝子の特定の塩基配列からなる領域で、本発明のRight-TALENタンパク質がRight-TALEドメインを介して特異的に認識し、結合する標的領域をいう。3'側TALE結合領域を構成する塩基配列や塩基長は、カイコゲノム上のsFib遺伝子において、bFib遺伝子を挿入すべき所望の位置、すなわちDSB部位から下流に5～55塩基の配列内で選択される11塩基～31塩基、12塩基～30塩基、13塩基～28塩基、14塩基～26塩基、又は15塩基～25塩基の任意の塩基配列からなる。したがって、3'側TALE結合領域の塩基配列は、DSB部位に応じて適宜設計すればよい。前記5'側TALE結合領域とはDSB部位を挟み、2領域1組で機能するが、5'側TALE結合領域とはその塩基配列及び／又は塩基長は同一であってもよいし、異なっていてもよい。
　（１－２）ヌクレアーゼドメイン
　ヌクレアーゼドメインの構成は、Left-TALEN発現ベクターにおけるヌクレアーゼドメインの構成に準ずる。Right-TALEN発現ベクターにおけるヌクレアーゼドメインは、Left-TALEN発現ベクターのそれと同一であっても、又は異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。原則として、ヌクレアーゼの種類は、Left-TALEN発現ベクターにおけるヌクレアーゼと同一種とする。
　（２）プロモーター
　プロモーターの構成は、Left-TALEN発現ベクターにおけるプロモーターの構成に準ずる。Right-TALEN発現ベクターにおけるプロモーターは、Left-TALEN発現ベクターのそれと同一であっても、又は異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
１－３－３．ドナーベクター
　本明細書において「ドナーベクター」は、ゲノム編集技術によって宿主であるカイコゲノムに挿入されることにより他の絹糸虫由来のFib H遺伝子を発現するベクターである。
（構成）
　ドナーベクターは、5'側TALE対応領域、3'側TALE対応領域、5'側相同領域、3'側相同領域、及び他の絹糸虫フィブロイン遺伝子を構成要素として含む。以下、各構成要素について説明をする。
　（１）5'側TALE対応領域
　本明細書において、「5'側TALE対応領域」とは、TALENタンパク質がTALEドメインを介して特異的に認識し、結合する標的領域である。ドナーベクターは、その全部又は一部がゲノム編集技術によってカイコゲノムにノックインされるためには、挿入時に直鎖状になる必要がある。5'側TALE対応領域は、実質的にはゲノム上のTALE結合領域と同等の機能を担い、ドナーベクター上のDSB部位を挟んで対をなすTALE対応領域のうち、ノックインすべき他の絹糸虫のフィブロイン遺伝子の挿入方向に対して上流側に位置するものとする。したがって、5'側TALE対応領域は、ゲノム側の5'側TALE結合領域と同一の塩基配列とは限らない。例えば、Left-TALENタンパク質によって認識される5'側TALE結合領域と異なり、5'側TALE対応領域は、Left-TALENタンパク質又はRight-TALENタンパク質のいずれかで認識される配列を有していればよい。なお、5'側TALE対応領域が、カイコに発現させようとするタンパク質のコード配列、又は選択的要素として挿入したプロモーター等の制御配列上に位置する場合は、その配列の制約を受ける。
　5'側TALE対応領域を構成する塩基配列の塩基長は、11塩基～31塩基、12塩基～30塩基、13塩基～28塩基、14塩基～26塩基、又は15塩基～25塩基であればよい。
　（２）3'側TALE対応領域
　本明細書において、「3'側TALE対応領域」とは、前記5'側TALE対応領域と同様に、TALENタンパク質がTALEドメインを介して特異的に認識し、結合する標的領域である。3'側TALE対応領域もゲノム上のTALE結合領域と同等の機能を担い、ドナーベクター上のDSB部位を挟んで対をなすTALE対応領域のうち、ノックインすべき他の絹糸虫のフィブロイン遺伝子の挿入方向に対して下流側に位置するものとする。したがって、3'側TALE対応領域は、ゲノム側の3'側TALE結合領域と同一の塩基配列とは限らない。例えば、Right-TALENタンパク質によって認識される3'側TALE結合領域と異なり、3'側TALE対応領域は、Left-TALENタンパク質又はRight-TALENタンパク質のいずれかで認識される配列を有していればよい。
　3'側TALE対応領域を構成する塩基配列の塩基長は、11塩基～31塩基、12塩基～30塩基、13塩基～28塩基、14塩基～26塩基、又は15塩基～25塩基であればよい。
　ドナーベクターにおいて3'側TALE対応領域は、前記5'側TALE対応領域と2領域1組で機能する。
　（３）5'側相同領域
　本明細書において「5'側相同領域」とは、ドナーベクターにおけるbFib H遺伝子を、カイコゲノムの所定の位置にノックインするために必要となる領域で、カイコゲノム上の挿入位置、すなわちDSB部位の5'側塩基配列と同一又は相同な塩基配列からなる。5'側相同領域の塩基配列の長さは限定しないが、5'側TAL対応領域又は3'側TALE対応領域に結合したLeft-TALENタンパク質及び／又はRight-TALENタンパク質による二量体のヌクレアーゼ活性が及び得る範囲内である。5'側相同領域の塩基長は使用するTALENによって異なるが、例えば、5～15塩基、6～14塩基、7～13塩基、8～12塩基、又は9～11塩基であればよい。好ましくは8～10塩基である。後述する3'側相同領域の塩基長も原則として対応する5'側相同領域と同一又は同等の塩基長からなるため、5'側及び3'側TALEN対応領域間を構成する5'側相同領域と3'側相同領域からなるスペーサー配列の塩基長は、5'側相同領域の倍の長さ、例えば、10～30塩基、12～28塩基、14～26塩基、16～24塩基、又は18～22塩基となる。好ましくは16～20塩基である。
　ドナーベクターの全部又は一部は、5'側相同領域及び次述の3'側相同領域を介して、相同性指向修復（HDR：homology-directed repair）（マイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ）又はゲノムとドナーのDSB末端同士の非相同末端結合（NHEJ）によってカイコゲノム内にノックインされる。
　（４）3'側相同領域
　本明細書において「3'側相同領域」とは、ドナーベクターにおけるbFib H遺伝子を、カイコゲノムの所定の位置にノックインするために必要となる領域で、前記5'側相同領域とペアで機能する。カイコゲノム上の挿入位置、すなわちDSB部位の3'側に隣接した塩基配列と同一又は相同な塩基配列からなる。3'側相同領域の塩基配列の長さは限定しないが、5'側TALE対応領域及び3'側TALE対応領域に結合したLeft-TALENタンパク質及び/又はRight-TALENタンパク質による二量体のヌクレアーゼ活性が及び得る範囲内である。例えば、5～15塩基、6～14塩基、7～13塩基、8～12塩基、又は9～11塩基であればよい。好ましくは8～10塩基である。
　（５）他の絹糸虫のフィブロイン遺伝子
　「他の絹糸虫のフィブロイン遺伝子」は、カイコ以外の絹糸虫のFibタンパク質をコードする遺伝子である。単一種のFib遺伝子の全長又は一部であってもよいし、複数種のFib遺伝子の全長塩基配列どうし、全長塩基配列と一部塩基配列、又は一部塩基配列どうしを連結したFib遺伝子のいずれであってもよい。また、他の絹糸虫のFib遺伝子は、Fib H遺伝子、Fib L遺伝子、及びp25遺伝子のいずれであってもよい。好ましくはFib H遺伝子である。また、他の絹糸虫の種類は限定しないが、好ましくはミノムシである。したがって、限定はしないが、ミノムシフィブロインH鎖遺伝子は、他の絹糸虫のFib遺伝子として、特に好ましい。
　「ミノムシフィブロインH鎖遺伝子（bFib H遺伝子）」は、ミノムシフィブロインH鎖タンパク質をコードする遺伝子である。以下、ミノムシフィブロインH鎖タンパク質の構成について説明をする。
　「ミノムシフィブロインH鎖タンパク質（bFib Hタンパク質）」は、野生型フィブロインH鎖タンパク質、又は改変フィブロインH鎖タンパク質のいずれであってもよい。好ましくは改変フィブロインH鎖タンパク質である。
　本明細書の「改変ミノムシフィブロインH鎖タンパク質（m-bFib Hタンパク質）」は、次世代DNAシーケンサーによるトランスクリプトーム解析によって明らかにされたオオミノガ（E. japonica）のFib Hタンパク質の一部のアミノ酸配列に基づき、アミノ酸配列情報の不足した箇所を対応するカイコFib Hのアミノ酸配列情報を参照に、補完されたm-Fib Hを含む。
　本明細書におけるm-bFib Hタンパク質の構成は、限定はしない。例えば、図２Aで示すような、基本構成成分としてN末端側から順にN末端領域、中央領域、及びC末端領域を含む構成が挙げられる。
　本明細書において「N末端領域」とは、m-bFib Hタンパク質を構成するアミノ酸配列において、次述の中央領域のN末端側に位置する選択的アミノ酸領域をいう。
　本明細書において「C末端領域」とは、m-bFib Hタンパク質を構成するアミノ酸配列において、次述の中央領域のC末端側に位置する選択的アミノ酸領域をいう。
　本明細書において「中央領域」とは、m-bFib Hタンパク質の物性を示す領域で、同一の及び／又は異なる反復ユニットを3個以上連結して構成される。
　本明細書において「反復ユニット」とは、全長120個～178個のアミノ酸からなり、複数個のG/A単位と1個のアラニンクラスターを含むユニットである。
　「G/A単位」とは、グリシン（Gly：G）残基とアラニン（Ala：A）残基の2アミノ酸残基からなる単位で、グリシン残基-アラニン残基（GA）又はアラニン残基-グリシン残基（AG）で構成される。反復ユニットの大部分はG/A単位で構成されており、1ユニットあたりG/A単位を30単位以上、35単位以上、若しくは40単位以上、又は60単位以下、55単位以下、若しくは50単位以下含んでいる。
　「アラニンクラスター」（本明細書では、しばしば「Alaクラスター」と表記する）は、アラニン（Ala）残基が連続するサブユニットで、反復ユニットのN末端側に含まれる。1つのAlaクラスターには15～25個のアラニン残基が含まれ、アラニン残基以外にもAlaクラスター中央部（例えばAlaクラスターのN末端側から10位の位置）にグルタミン酸又はグルタミンを1個含み得る。m-bFib Hタンパク質におけるAlaクラスターの具体的な例として、配列番号３又は４で示すアミノ酸配列（それぞれ、AAAAAAAAAEAAAAAAAAAAAA、及びAAAAAAAAAQAAAAAAAAAが挙げられる。
　さらに、反復ユニットは、グリシン残基及びアラニン残基以外の5～7アミノ酸からなるアミノ酸残基を含む非G/A部分を含んでいてもよい。非G/A部分のアミノ酸配列は限定しない。非G/A部分の、具体的なアミノ酸配列の例として、セリン（Ser：S）残基、バリン（Val：V）残基、及びチロシン(Tyr：Y)残基からなる、配列番号５（YGSALNS）、配列番号６（SALNS）、及び配列番号７（TSVVYV）で示すアミノ酸配列が挙げられる。
　本明細書のm-bFib Hタンパク質の反復ユニットを構成するアミノ酸配列は、上記各構成要素の条件を満たす限り特に限定はしない。具体例として、限定はしないが、表１に記載の配列番号８～１６で示すアミノ酸配列が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　m-bFib Hタンパク質において、各反復ユニットは、互いに直接的に、又は他の1～30アミノ酸、1～20アミノ酸、若しくは1～10アミノ酸からなる任意のリンカー配列を介して、連結している。
　上記m-bFib Hタンパク質の反復ユニットをコードする改変ミノムシフィブロインH鎖遺伝子の塩基配列の具体例として表１に記載の反復ユニットNo.1～9をそれぞれコードする、以下の表２に示す配列番号１７～２５で示す塩基配列が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
(配置順)
　ドナーベクターにおいて、各構成要素の配置順序は、ドナーベクターに含まれる他の絹糸虫フィブロイン遺伝子のセンス鎖における5'～3'方向を基準にした場合、2つのTALE対応領域間で5'側相同領域及び3'側相同領域がDSB部位を挟んで互いに隣接して配置される。その順序は5'側から3'側相同領域－5'側相同領域の順で配置される。2つのTALE対応領域は、前記5'～3'方向を基準に5'側TALE対応領域と3'側TALE対応領域の順で配置され、それぞれLeft-TALENタンパク質又はRight-TALENタンパク質のいずれかで認識される配列を有していればよい。具体的には、前記5'～3'方向を基準に、5'側TALE対応領域、3'側相同領域、5'側相同領域、及び3'側TAL対応E領域の順となり、（i）5'側TALE対応領域及び3'側TALE対応領域をLeft-TALENタンパク質が認識する場合、（ii）5'側TALE対応領域をLeft-TALENタンパク質が認識し、3'側相同領域をRight-TALENタンパク質が認識する場合、（iii）5'側TALE対応領域をRight-TALENタンパク質が認識し、3'側相同領域をLeft-TALENタンパク質が認識する場合、及び（vi）5'側TALE対応領域及び3'側TALE対応領域をRight-TALENタンパク質が認識する場合が挙げられる。
２．ゲノム改変カイコの製造方法
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、ゲノム改変カイコの製造方法である。本態様の製造方法では、ミノムシ由来のフィブロインタンパク質とカイコ由来のフィブロインタンパク質を含むキメラFibタンパク質を絹糸腺で生産するゲノム編集カイコを製造することができる。
２－２．方法
　本発明のゲノム改変カイコの製造方法は、核酸導入工程、形質転換体選択工程、及びゲノム挿入個体選択工程を必須工程として含む。以下、各工程について説明をする。
２－２－１．核酸導入工程
　「核酸導入工程」は、Left-TALEN mRNA又はLeft-TALEN発現ベクター、Right-TALEN mRNA又はRight-TALEN発現ベクター、及びドナーベクターをカイコの卵に導入する工程である。
　Left-TALEN発現ベクター及びRight-TALEN発現ベクターの構成は、それぞれ第１態様に記載のLeft-TALEN発現ベクター及びRight-TALEN発現ベクターの構成に準ずる。ただし、本態様のLeft-TALEN発現ベクター及びRight-TALEN発現ベクターは、初期胚で発現するプロモーターを含んでいる。したがって、これらの発現ベクターは、初期胚においてLeft-TALENタンパク質及びRight-TALENタンパク質を発現する。
　「Left-TALEN mRNA」及び「Right-TALEN mRNA」は、それぞれLeft-TALEN領域及びRight-TALEN領域を含むmRNAである。Left-TALEN領域及びRight-TALEN領域の構成は、第１態様に記載のLeft-TALEN領域及びRight-TALEN領域の構成に準ずる。
　Left-TALEN mRNA又はLeft-TALEN発現ベクター、及びRight-TALEN mRNA又はRight-TALEN発現ベクターをカイコ卵に導入する場合の組み合わせは限定しない。4種全てを導入してもよいし、任意に選択した3種を導入してもよい。またはLeft/Right-TALEN mRNAの組合せ、Left/Right-TALEN発現ベクターの組合せ、Left-TALEN mRNA/Right-TALEN発現ベクターの組合せ、又はLeft-TALEN発現ベクター/Right-TALEN mRNAの組合せであってもよい。
　ドナーベクターの構成は、第１態様に記載のドナーベクターの構成に準ずる。
　発現ベクター及び／又はmRNAをカイコの卵に導入する方法は、当該分野で公知の方法によって行えばよい。例えば、Tamuraらの方法（Tamura T. et al., 2000, Nature Biotechnology, 18, 81-84）を利用することができる。具体的には、発現ベクター又はmRNAが適当な濃度となるように水やバッファー等の溶媒で希釈し、投与溶液を調製する。
　核酸の導入は、産下直後から6時間以内のカイコ受精卵に対してマイクロインジェクションによって行う。インジェクションは、限定はしないが、一般には空気圧を利用した特殊な注射装置を用いて行う。例えば、特許1654050号、又はTamuraらの方法（Tamura T, et al., 2007, J Insect Biotechnol Sericol, 76: 155-159）を利用すればよい。導入する核酸の量は、特に限定しない。核酸の種類、性質、目的に応じて適宜定めればよい。通常は1nL～5nLである。
２－２－２．形質転換体選択工程
　「形質転換体選択工程」は、前記核酸導入工程後のカイコからドナーベクターを含む形質転換体を選択する工程である。形質転換体の選択方法は、当該分野に公知の方法であれば限定はしない。例えば、ドナーベクターが標識遺伝子を含む場合には、その標識遺伝子の発現に基づいて目的の形質転換体を容易に選択することができる。
　「標識遺伝子」とは、選抜マーカーとも呼ばれる標識タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
　「標識タンパク質」とは、標識遺伝子の発現により宿主カイコにない新たな形質を付与し得るタンパク質で、酵素、蛍光タンパク質、色素合成タンパク質又は発光タンパク質等が含まれる。標識タンパク質の活性に基づいて、導入した核酸を保有している形質転換体の判別が可能となる。ここで「活性に基づいて」とは、活性の検出結果に基づいて、という意味である。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出するものであってもよいし、タンパク質の活性によって発生する代謝物を介して間接的に検出するものであってもよい。検出は、化学的検出（酵素反応的検出を含む）、物理的検出（行動分析的検出を含む）、又は検出者の感覚的検出（視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む）のいずれであってもよい。
　標識タンパク質の種類は、当該分野で公知の方法によってその活性を検出可能な限り、特に限定はしない。好ましくは検出に際して形質転換体判別マーカーを保有する宿主、すなわち形質転換体に対する侵襲性の低い標識タンパク質である。例えば、蛍光タンパク質、色素合成タンパク質、発光タンパク質、外部分泌タンパク質、外部形態を制御するタンパク質等が挙げられる。蛍光タンパク質、色素合成タンパク質は、形質転換体の外部形態を変化させることなく特定の条件下で視覚的に検出可能なことから、形質転換体に対する侵襲性が非常に低く、また形質転換体の判別及び選抜が容易なことから特に好適である。
　本明細書において「蛍光タンパク質」は、特定波長の励起光を照射したときに特定波長の蛍光を発するタンパク質をいう。天然型及び非天然型のいずれであってもよい。また、励起波長、蛍光波長も特に限定はしない。具体的には、例えば、CFP、RFP、DsRed（DsRed-monomerのような派生物を含む）、YFP、PE、PerCP、APC、GFP（EGFP等の派生物を含む）等が挙げられる。
　本明細書において「色素合成タンパク質」は、色素の生合成に関与するタンパク質であり、通常は酵素である。ここでいう「色素」とは、形質転換体に色素を付与することができる低分子化合物又はペプチドで、その種類は問わない。好ましくは個体の外部色彩として表れる色素である。例えば、メラニン系色素（ドーパミンメラニンを含む）、オモクローム系色素、又はプテリジン系色素が挙げられる。
２－２－３．ゲノム挿入個体選択工程
　「ゲノム挿入個体選択工程」は、前記形質転換体において他の絹糸虫フィブロイン遺伝子がカイコゲノムの目的の位置に挿入（ノックイン）されている個体を選択する工程である。他の絹糸虫フィブロイン遺伝子が正確にノックインされていることを確認する方法は、当該分野に公知の方法であれば限定はしない。例えば、前記形質転換体選択工程で得られた形質転換体と、核酸導入工程で核酸を導入しない対照用カイコのそれぞれから調製されたゲノムDNAと、他の絹糸虫フィブロイン遺伝子特異的な塩基配列からなるプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション法、核酸増幅法によるゲノム上の挿入位置（DSB部位）を含む領域の増幅と、得られた核酸断片の塩基配列決定による挿入位置や挿入方向などの確認等が挙げられる。本工程により目的とするゲノム改変カイコを選抜することができる。
３．ゲノム改変カイコ
３－１．概要
　本発明の第３の態様はゲノム改変カイコである。本発明のゲノム改変カイコは、ミノムシ由来のフィブロインH鎖遺伝子をカイコゲノム内に包含し、そのミノムシフィブロインH鎖タンパク質を絹糸腺内で生産することができる。本発明のゲノム改変カイコによれば、カイコ由来のフィブロインタンパク質とミノムシフィブロインH鎖タンパク質のキメラフィブロインタンパク質を含むキメラ絹糸を吐糸させることができる。
３－２．構成
　本態様のゲノム改変カイコは、前記第２態様に記載のゲノム改変カイコの製造方法において、ドナーベクターに含まれる他の絹糸虫フィブロインがm-bFib H遺伝子のときに得られるカイコである。このカイコは、ゲノム中にm-bFib H遺伝子を、好ましくはsFib遺伝子とのキメラFib遺伝子として包含する。前記キメラFib遺伝子の場合、m-bFib H遺伝子の挿入位置はsFib遺伝子のコード領域における5'末端から3'末端（終止コドンを除く）の範囲でどこであってもよい。なお、sFib遺伝子は、sFib H遺伝子、sFib L遺伝子、又はsp25遺伝子のいずれであってもよいが、好ましくは、sFib H遺伝子又はsFib L遺伝子である。
　本態様のゲノム改変カイコは、幼虫期、特に終齢後期に後部絹糸腺内でm-bFib Hタンパク質を生産することができる。この時sFibタンパク質とのキメラFibタンパク質を生産することが好ましい。
　本態様のゲノム改変カイコは、幼虫期、特に終齢後期にm-bFib Hタンパク質、好ましくはsFibタンパク質とのキメラFibタンパク質を含むキメラ絹糸を吐糸することができる。
　本態様のゲノム改変カイコからm-bFib Hタンパク質とsFibタンパク質とのキメラ絹糸を生産する方法は、カイコから絹糸を生産する従来の方法に準ずればよい。例えば、ゲノム改変カイコに営繭させ、繭からキメラ絹糸を調製すればよい。本発明の生産方法によれば、カイコ絹糸の生産設備等を用いて、ミノムシ絹糸の物性を有するミノムシ絹糸とカイコ絹糸とのキメラ絹糸を量産することができる。
　キメラ絹糸の生産方法は、飼育工程、営繭工程、収繭工程、繰糸工程を必須の工程として含む。
（１）飼育工程
　「飼育工程」とは、本態様のゲノム改変カイコを飼育する工程である。ゲノム改変カイコの飼育方法は、当該分野で公知のカイコの飼育技術に従って飼育すればよい。例えば、「蚕種総論；高見丈夫著、全国蚕種協会刊」を参照するとよい。飼料には、クワ属（Morus）の葉のような食草樹種の天然葉を用いてもよいし、シルクメイトL4M若しくは原蚕種1－3齢用（日本農産工業）のような人工飼料を用いてもよい。病気の発生を抑え、安定した質及び量の給餌が可能であり、また必要に応じて無菌的に飼育できる点から、人工飼料が好ましい。以下、ゲノム改変カイコの簡単な飼育方法について、一例を挙げて説明する。
　掃立ては、適当な頭数（例えば、4～10頭）の同系のゲノム改変カイコの雌が産卵した卵で行う。孵化した幼虫は、産卵台紙から蚕座である防乾紙（パラフィン加工紙）を敷いた容器内に移し、シルクメイト等の人工飼料を防乾紙上に並べて給餌する。餌の交換は、原則として1～2齢では各1回、3齢では1～3回行う。古い餌は食べ残しが多い場合には腐敗防止のため除去する。4～5齢の壮蚕時の飼育には、大型容器に移し、容器あたりの頭数を適宜調整する。湿度や容器内の状態により、容器に防乾紙、アクリル、又はメッシュ製のフタをしてもよい。飼育温度は、全齢を通して25～28℃で飼育する。
（２）営繭工程
　「営繭工程」は、本態様のゲノム改変カイコに営繭させる工程である。「営繭（えいけん）」とは、終齢（5齢）カイコが蛹化のために繭を形成することをいう。
　本工程は、基本的にカイコにおける公知の営繭方法を行えばよい。例えば、終齢6～8日目の熟蚕を回収し、上蔟（じょうぞく）することで本工程を達成し得る。「上蔟」とは、カイコを蔟（まぶし）に移すことである。営繭は25～28℃下で行えばよい。その後、ゲノム改変カイコは蔟の中で繭を形成する。
（３）収繭工程
　「収繭（しゅうけん）工程」は、営繭工程後、蔟から繭を掻き取り、回収する工程である。本工程は繭周辺に付着した毛羽の除去までを包含する。収繭は、上蔟後6～8日目に行えばよい。収繭は、手作業で行うこともできるが、収繭専用装置を用いると便利である。毛羽のみを除去する毛羽取機の他、蔟からの繭の掻き取り及び毛羽の除去までを行う全自動収繭毛羽取機を利用することができる。
（４）繰糸工程
　「繰糸工程」は、収繭工程で回収した繭からキメラ絹糸を繰糸する工程である。「繰糸」とは、繭から生糸を作ることをいう。回収された繭は、95℃前後の湯に水没させて繭をほぐれやすくする「煮繭」を行った後、索緒箒を用いて繭の表層部より繭糸をもつれた状態で引き出す「索緒」を行う。その後、索緒された繭から1本の正しい糸口を取り出す「抄緒」を行い、操糸を行う。これらの工程は、手作業で行うこともできるが、繰糸専用装置である自動繰糸機を用いることが好ましい。以上の工程によって、キメラ絹糸を生糸として生産することができる。
４．キメラ絹糸
４－１．概要
　本発明の第４の態様はキメラ絹糸である。本態様のキメラ絹糸は、sFib Hタンパク質又はsFib Lタンパク質とbFib Hタンパク質が連結されたキメラFibタンパク質を含む。本態様のキメラ絹糸は、前記第３態様に記載のゲノム改変カイコが吐糸する絹糸として得ることができる。
４－２．構成
　本発明のキメラ絹糸は、通常の絹糸、特にカイコ絹糸と同様に、Fib Hタンパク質、Fib Lタンパク質、及びp25タンパク質で構成される。吐糸後、精練前のキメラ絹糸は、さらにセリシンタンパク質を含むが、このタンパク質は精練処理によって除去される。
　本発明のキメラ絹糸では、前記Fib Hタンパク質、及び／又はFib Lタンパク質が、任意の位置にm-bFib Hタンパク質を連結したキメラFibタンパク質の構成を有することを特徴とする。
＜実施例１：ドナーベクターの調製＞
（目的）
　本発明のゲノム編集カイコ作製キットに含まれるドナーベクターを調製する。
（方法）
　図２において、配列番号２６で示すアミノ酸配列からなる改変型ミノムシFib Hタンパク質をコードする配列情報に基づいて、12の反復ユニットを持つミノムシのFib Hタンパク質（配列番号２７）をコードする遺伝子（配列番号２８）を調製した。また、ゲノム編集用ドナーベクター（pBac[3XP3-DsRed2afm]E1LLL-EGFP：農研機構より入手）のsFib Lプロモーター配列からEGFP遺伝子までを配列番号２９（TAATGCTCAAAGATATATGCCAGCCAGGTGCACAAGCATTCACGTCTAAATACGAA）で示すTALEN標的配列及びその3’側に配置した上記ミノムシFib H遺伝子で置き換え、さらにDsRed2遺伝子をEGFP遺伝子に置き換えることにより、図３に示すドナーベクターpDVL-MMHX4を構築した。
＜実施例２：ゲノム改変カイコの作製＞
（目的）
　本発明の第２態様のゲノム改変カイコの製造方法に基づいて目的のゲノム改変カイコを作製する。
（方法と結果）
　宿主カイコにはw1-pnd系統を用いた。カイコの飼育は4齢までは29℃、5齢は25℃で、明期12時間／暗期12時間の光周期で飼育した。餌は人工飼料（シルクメイト原蚕種1－3齢用：日本農産工業社）を与えた。
　インジェクションには産卵6時間以内の卵を用いた。インジェクションは、ドナーベクター500ng/μL、TALEN mRNA各25ng/μLとなるように調製した溶液を使用して、従来の方法で行なった。インジェクション後の卵は孵化まで25℃で静置した。孵化した卵は上記と同様の方法で成虫になるまで飼育した。得られた成虫をG0（インジェクション世代）とした。G0は兄妹交配し、残ったG0個体はインジェクションに用いた親系統(w1-pnd)と交配した。交配後の雌個体に産卵させ、得られたG1(インジェクション後、第1世代）の卵は25℃に静置した後、翌々日に5℃で保護した。
　孵化予定日の11日前にG1の卵を25℃に静置し(出庫)、胚発生を開始させた。形質転換体のスクリーニングは、出庫後5～7日目の卵で行なった。眼で緑色蛍光が見られる卵を形質転換陽性卵として選別した。
　前記形質転換陽性卵から孵化した幼虫を飼育し、上蔟7日後に収繭し、蛹を繭層から取り出し羽化させた。その際、ゲノム配列の確認のために羽化したカイコ成虫からゲノム抽出用の脚を１本採取し、蛾と繭層を対応させながら個体ごとに管理した。前記カイコ成虫は、以下に述べるPCRによるノックインの確認とSDS-PAGEによる繭層タンパク質の分析が完了するまで未交尾状態で冷蔵した。
　ノックインが成功した個体を判別するために、ゲノムに挿入されたドナーベクターの5'側と3'側について、カイコFib遺伝子とドナーベクターにそれぞれ特異的に結合するプライマーを使用し、ノックイン個体のみで増幅されるPCRを行なった。前記採取した脚から成虫（カイコガ）羽化後に脚を１本採取し、DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN社)を用いて、添付のプロトコルに従ってゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型として使用し、KOD FX Neo (TOYOBO社)を用いて、通常条件でPCRを行った。用いたプライマーは以下の通り。
（挿入5'側）
　　BmFib-LF：CAGACATATAAGAGCTACGA（配列番号３０）
　　MMFib-HR：TGATATTCGTCAGTGTCTGCT（配列番号３１）
（挿入3'側）
　　SV40F：TGGTTTGTCCAAACTCATCA（配列番号３２）
　　BmFib-LR：CACAATTTGCATAAAATGTC（配列番号３３）
　得られたPCR産物については、ドナーベクターがカイコFib遺伝子の正確な位置に正しく挿入されていることを確認するため、塩基配列を決定した。
　上記塩基配列より、ドナーベクターが正しく挿入されたと思われた個体について、繭層の一部を9M臭化リチウムに溶解し、絹糸タンパク質のSDS-PAGEを行なったところ、カイコとミノムシのキメラFibタンパク質として予想されるサイズのタンパク質が観察された。これらの個体を交配、及び系統化した後、さらにウェスタンブロッティングによるノックインの確認を行った。ゲノムにドナーベクターを2コピー持つホモ個体、1コピー持つヘテロ個体、及びドナーベクターを持たない野生型個体について、それぞれの繭層タンパク質を上記SDS-PAGEと同様に分離し、カイコFib Lタンパク質のN末端領域に結合する抗Fib-L抗体と反応させた。上記抗体にはHRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識したものを用い、検出にはAmershamTMECLTM Prime（Cytiva社）を使用した。ホモ個体とヘテロ個体の繭層タンパク質では、上記SDS-PAGEと同じキメラFibタンパク質の位置にバンド(矢印)が見られた。一方、ヘテロ個体と野生型個体の繭層タンパク質では野生型カイコのFib Lの位置にバンド(矢頭)が検出された。以上より、本実施例で得たカイコ系統を、キメラ絹糸を生産するゲノム改変カイコと判定した。
＜実施例３：キメラ絹糸の物性解析＞
（目的）
　実施例２で作製したゲノム改変カイコが吐糸したキメラ絹糸の物性を解析する。
（方法）
　実施例２で作製したゲノム改変カイコの繭を常法により煮繭し、多条繰糸機（有限会社ハラダ）を用いて繰糸を行った。得られた生糸は検尺機を用いて、巻き取り回数30回（33.75 m）ごとに測り取り、温度20℃、湿度65％の部屋に24時間以上静置した後、秤量した重量から繊度を求めた。得られたキメラ絹糸のタフネスの解析には繰製した生糸のうち、対照区の平均繊度に最も近い試料を用いた。対照には、同条件で調製したカイコ絹糸を用いた。テンシロン万能材料試験機（RTG-1210、株式会社エー・アンド・デイ）を用いて1試験あたり50回、破断強度、及び破断伸度の測定を行い、キメラ絹糸とカイコ絹糸のSSカーブの面積からタフネスを求めた。タフネスとは、破断に至るまでに必要な仕事（エネルギー）を意味し、応力ひずみ曲線の面積で与えられる。一般に数値が大きいほど切れにくいことを意味する。
（結果）
　その結果、キメラ絹糸のタフネスは、対照のカイコ絹糸のそれと比較して1.16倍向上していることが明らかになった。これは、本願発明で作製したゲノム改変カイコが吐糸するミノムシ絹糸とカイコ絹糸のキメラ絹糸が、通常のカイコ絹糸と比較して切れにくいことを示している。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (21)

  1. 　カイコ由来のフィブロインタンパク質と1種又は複数種の他の絹糸虫由来のフィブロインタンパク質を含むキメラフィブロインタンパク質を生産するゲノム改変カイコの作製キットであって、
    　前記作製キットは、Left-TALEN発現ベクター、Right-TALEN発現ベクター、及びドナーベクターを含み、
    　　前記Left-TALEN発現ベクターは、Left-TALENコード領域を含み、
    　　　前記Left-TALENコード領域は、カイコフィブロイン遺伝子において、前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子挿入位置の5'側近傍に位置する5'側TALE結合領域の塩基配列を認識し結合するLeft-TALEドメイン、及びその下流のヌクレアーゼドメインをコードし、
    　　前記Right-TALEN発現ベクターは、Right-TALENコード領域を含み、
    　　　前記Right-TALENコード領域は、カイコフィブロイン遺伝子において、前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子挿入位置の3'側近傍に位置する3'側TALE結合領域の塩基配列を認識し結合するRight-TALEドメイン、及びその下流のヌクレアーゼドメインをコードし、
    　　前記ドナーベクターは、5'側TALE対応領域、3'側TALE対応領域、5'側相同領域、3'側相同領域、及び前記他の絹糸虫由来のフィブロイン遺伝子を含む
    前記作製キット。
  2. 　前記ドナーベクターが5'側から5'側TALE対応領域、3'側相同領域、5'側相同領域、及び3'側TALE対応領域、請求項１に記載の作製キット。
  3. 　前記他の絹糸虫由来のフィブロインタンパク質がフィブロインH鎖タンパク質である、請求項１又は２に記載の作製キット。
  4. 　前記他の絹糸虫がミノムシである、請求項１～３のいずれか一項に記載の作製キット。
  5. 　ミノムシフィブロインH鎖タンパク質が、同一の及び／又は異なる反復ユニットを3個以上連結してなる改変フィブロインH鎖タンパク質であって、
    　前記反復ユニットは、グリシン残基及びアラニン残基の2アミノ酸残基からなるG/A単位を30単位以上含み、そのN末端側に15～25個のアラニン残基を含むアラニンクラスターを含む、全長120個～178個のアミノ酸からなる、
    請求項４に記載の作製キット。
  6. 　前記アラニンクラスターは配列番号３又は４で示すアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の作製キット。
  7. 　前記反復ユニットは配列番号８～１６で示すアミノ酸配列から選択されるいずれか一以上である、請求項５又は６に記載の作製キット。
  8. 　ミノムシフィブロインH鎖タンパク質をコードする遺伝子が配列番号１７～２５で示すいずれか一の塩基配列からなる、請求項４～７のいずれか一項に記載の作製キット。
  9. 　カイコ由来のフィブロインタンパク質と1種又は複数種の他の絹糸虫由来のフィブロインタンパク質を含むキメラフィブロインタンパク質を生産するゲノム改変カイコの製造方法であって、
    　Left-TALEN mRNA又はLeft-TALEN発現ベクター、Right-TALEN mRNA又はRight-TALEN発現ベクター、及びドナーベクターをカイコの卵に導入する核酸導入工程、
    　前記核酸導入工程後のカイコから他の絹糸虫由来のフィブロイン遺伝子を含む形質転換体を選択する形質転換体選択工程、及び
    　前記形質転換体から前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子がカイコゲノムの目的の位置に挿入されている個体を選択するゲノム挿入個体選択工程
    を含み、
    　前記Left-TALEN mRNAはLeft-TALE領域を含み、
    　　前記Left-TALE領域は、カイコフィブロイン遺伝子において、前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子挿入位置の5'側TAL結合領域の塩基配列を認識し結合するLeft-TALドメイン、及びその下流のヌクレアーゼドメインをコードし、
    　前記Left-TALEN発現ベクターは、プロモーター、及びその発現制御下に配置された前記Left-TALE領域を含み、
    　前記Right-TALEN mRNAはRight-TALE領域を含み、
    　　前記Right-TALE領域は、カイコフィブロイン遺伝子において、前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子の挿入位置における3'側TAL結合領域の塩基配列を認識し結合するRight-TALドメイン及びその下流のヌクレアーゼドメインをコードし、
    　前記Right-TALEN発現ベクターは、プロモーター及びその発現制御下に配置された前記Right-TALE領域を含み、
    　前記ドナーベクターは、5'側TAL対応領域、3'側TAL対応領域、5'側相同領域、3'側相同領域、及び他の絹糸虫フィブロイン遺伝子を含む
    前記製造方法。
  10. 　前記ドナーベクターが前記他の絹糸虫フィブロイン遺伝子のセンス鎖方向を基準に5'側から5'側TALE対応領域、3'側相同領域、5'側相同領域、及び3'側TALE対応領域の順で配置される、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　前記他の絹糸虫由来のフィブロインタンパク質がフィブロインH鎖タンパク質である、請求項９又は１０に記載の製造方法。
  12. 　前記他の絹糸虫がミノムシである、請求項９～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
  13. 　ミノムシフィブロインH鎖タンパク質が、同一の及び／又は異なる反復ユニットを3個以上連結してなる改変フィブロインH鎖タンパク質であって、
    　前記反復ユニットは、グリシン残基及びアラニン残基の2アミノ酸からなるG/A単位を30単位以上含み、そのN末端側に15～25個のアラニン残基を含むアラニンクラスターを含む、全長120個～178個のアミノ酸からなる、
    請求項１２に記載の製造方法。
  14. 　前記アラニンクラスターは配列番号３又は４で示すアミノ酸配列からなる、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 　前記反復ユニットは配列番号８～１６で示すアミノ酸配列から選択されるいずれか一以上である、請求項１３又は１４に記載の製造方法。
  16. 　前記ミノムシフィブロインH鎖タンパク質をコードする遺伝子が配列番号１７～２５で示すいずれか一の塩基配列からなる、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の製造方法。
  17. 　ミノムシ由来のフィブロインH鎖遺伝子をカイコゲノム内に包含し、そのフィブロインH鎖タンパク質を絹糸腺内で生産するゲノム改変カイコ。
  18. 　前記ミノムシ由来のフィブロインH鎖タンパク質がカイコ由来のフィブロインタンパク質とのキメラフィブロインタンパク質である、請求項１７に記載のゲノム改変カイコ。
  19. 　カイコフィブロインH鎖タンパク質又はL鎖タンパク質の任意の位置に改変ミノムシフィブロインH鎖タンパク質が連結されたキメラフィブロインタンパク質を含むキメラ絹糸であって、
    　前記改変ミノムシフィブロインH鎖タンパク質は同一の及び／又は異なる反復ユニットを3個以上連結してなり、
    　前記反復ユニットは、グリシン残基及びアラニン残基の2アミノ酸残基からなるG/A単位を30単位以上含み、そのN末端側に15～25個のアラニン残基を含むアラニンクラスターを含む、全長120個～178個のアミノ酸からなる
    前記キメラ絹糸。
  20. 　前記アラニンクラスターは配列番号３又は４で示すアミノ酸配列からなる、請求項１９に記載のキメラ絹糸。
  21. 　前記反復ユニットは配列番号８～１６で示すアミノ酸配列から選択されるいずれか一以上である、請求項１９又は２０に記載のキメラ絹糸。
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