JP5997772B2 - カイコフィブロイン重鎖遺伝子の突然変異配列、及び突然変異を誘発する方法と応用 - Google Patents
カイコフィブロイン重鎖遺伝子の突然変異配列、及び突然変異を誘発する方法と応用 Download PDFInfo
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Description
NCBIデータベースからカイコフィブロイン重鎖遺伝子の配列(登録番号:AF226688)をダウンロードし、その配列構造を図1に示す。カイコフィブロイン重鎖遺伝子(+1〜+16788、そのうち、+1は転写開始サイトを表す)は、二つの長さがそれぞれ67bpと15750bpのエクソン、及び一つの長さが971bpのイントロンにより構成され、第1エクソンは、25bpの非翻訳領域(+1〜+25)と42bpのコード領域(+26〜+67)を含み、第2エクソンは、N末端の非反複領域(+1039〜+1449)、C末端の非反複領域(+16396〜+16788)、及び高度反複領域(+1450〜+16395、図1において灰色のボックスで示される)を含む。カイコフィブロイン重鎖遺伝子によってコーディングされるアミノ酸配列のN末端に、一つの長さが21アミノ酸残基のシグナルペプチド(図1で、下線の部分)を含んでいる。
カイコフィブロイン重鎖遺伝子の配列特徴、及びその異なるカイコ品種におけるSNP分布に基づき、更にジンクフィンガータンパク質がDNA配列を識別する際の特性を考慮した上で、CTGTTGCTCAAAGTTATGTTGCTGCTGATGCGGGAGCAをジンクフィンガーヌクレアーゼによって識別される標的サイトとして選出した。該標的サイトは、SEQ ID NO:1で示される配列の+1325〜+1362サイトに位置し、これに基づきジンクフィンガーヌクレアーゼを設計して合成した。したがって、カイコフィブロイン重鎖遺伝子の1325〜1362サイトがジンクフィンガーヌクレアーゼによって識別される標的サイトである。
人工合成或いは既存のジンクフィンガータンパク質ライブラリーから増幅して得られたジンクフィンガーヌクレアーゼの核酸配列(SEQ ID NO:119、及びSEQ ID NO:120で示される)を、制限酵素EcoRIとXhoI(TAKARA社から購入)で消化した後、同じ酵素で消化した原核細胞発現ベクターpET28aとライゲーションし、大腸菌に導入して陽性クローンを選別し、組換えベクターを取得した。酵素で消化する際の具体的な反応系は、以下のとおりである
多化性カイコ品種「N4」の処理方法:25℃の定温、相対湿度が75%の環境において孵化するまで催青し、桑葉で飼育して産んだカイコ卵を直接に微量注射に用いた。
羽化後に一斉で発蛾したオスとメスのカイコガを25℃、弱光の条件下で4時間かけて交配させてから割愛し、メスの蛾を糊付けなされた蚕卵紙に撒いて産卵させた。産卵後、すぐに総濃度が400ng/uLの、カイコ重鎖遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼmRNAをマイクロインジェクター(FemtoJet 5247マイクロインジェクター、Eppendorf社から購入)で数個のカイコ卵に注入し、各カイコ卵への注射量は、約10nLである。注射後のカイコ卵に対し、無毒の接着剤で注射口を封じ込み、更に35%のホルムアルデヒド蒸気中において5分間かけて消毒した後、温度が25℃、相対湿度が85%の高湿度環境において孵化するまで催青し、孵化されたG0世代の幼虫を集めて人工エサで発蛾するまで飼育した。
多化性品種「N4」と休眠性品種「大造」を原始材料とし、それぞれのカイコ卵195個と247個に微量注射を行い、孵化された93匹と124匹のG0世代の幼虫を集めて人工エサで発蛾するまで飼育した。それぞれ得られた81匹と106匹のG0世代のカイコガ同士で交配または戻し交配させ、38と51蛾輪のG1世代のカイコ卵を得た。38と51蛾輪を催青させ、更に単独でG1世代にまで飼育して上蔟したものを観察した。そのうち、29個と38個の蛾輪においてそれぞれ250匹と105匹の裸蛹または繭層の薄い「セリシン蚕」を得た。実験の具体的な統計結果を表4に示す。
表1:微量注射と突然変異の選別結果
実施例6から117個の表現型が全て裸蛹または「セリシン蚕」である突然変異個体を選出してゲノムを抽出し、カイコフィブロイン重鎖遺伝子の突然変異サイト付近の配列に基づきPCRプライマーとシーケンシングプライマーを設計した。そのうち、PCRプライマーは、Fib−H−F:5'−tgatgaggactattttgggag−3'、Fib−H−R:5'−tagtgctgaaatcgctcgt−3'であり、シーケンシングプライマーは、Fib−H−F:5'−tgatgaggactattttgggag−3'である。PCR反応系の組成は、下記のようなものである。
EX Taq緩衝液:2.5μl
Mg2+:2.0μl
dNTP:2.0μl
Ex Taq:0.15μl
プライマーFib−H−F:0.5μl
プライマーFib−H−F:0.5μl
脱イオン水:総量が25μlになるまで補充
野生型カイコ品種の大造、及び117個の突然変異体カイコ品種について、各品種ごとに3匹取って通常の解剖手法でその絹糸腺を取り出して顕微鏡下で観察を行った。結果は、図4に示されたとおりで、突然変異個体の絹糸腺が明らかに野生型個体より小さく、更に突然変異個体の後部絹糸腺で発生奇形の現象が観察された。
緑色蛍光タンパク質遺伝子を含有するプラスミドを鋳型とし、緑色蛍光タンパク質のコーディング配列を増幅し、更にカイコフィブロイン重鎖遺伝子の非反複領域と融合させて遺伝子改変ベクター(構築に係わる方法と操作は、Aichun Zhao等、Transgenic Research、DOI10.1007/s11248〜009〜9295〜7を参照することができる)を構築した。保存されていた突然変異体カイコ品種(突然変異の配列は、SEQ.ID NO:11に示される)を用いて母体材料とし、正常な飼育条件で得られたカイコ卵に対し通常のとおりにして人工による孵化処理を施した後、15℃の定温、相対湿度が75%、完全遮光の環境において孵化するまで催青させた。その後、25℃の定温、相対湿度が75%の環境において飼育し、更に種繭の保護を行った。羽化後に一斉で発蛾したオスとメスのカイコを、温度が25℃、弱光の条件下で4時間交配させてから割愛し、更にメスの蛾を糊付けなされた蚕卵紙に撒き、暗い環境において産卵させた。0.5時間ごとにカイコ卵を一回掃き集め、集めたカイコ卵を25℃の環境において保護した。産卵後に3時間経てからEppendorf製マイクロインジェクターを用いて10〜15nLの、総濃度が400ng/uLの構築済みの遺伝子改変ベクターを150個のカイコ卵に注入し、更に無毒の接着剤で注射口を封じ込み、35%のホルムアルデヒド蒸気中において5分間かけて消毒を行った。その後、温度が25℃、相対湿度が85%の高湿度環境において孵化するまで催青し、孵化された69匹のG0世代の幼虫を集めて発蛾するまで桑葉で飼育し、更に同士で交配または戻し交配させることで併せて11蛾輪のG1世代のカイコ卵を得た。Olympus?電動式のマクロ撮影モード付き蛍光顕微鏡で41蛾輪のG1世代のカイコ卵について観察と選別を行い、1個の陽性蛾輪で併せて11匹の遺伝子改変カイコを得た。遺伝子改変カイコの絹糸腺と繭層について観察と解析を行った結果、図7と図8に示されたように、緑色蛍光タンパク質融合タンパク質の含有量が、ヘテロ突然変異体カイコとホモ突然変異体カイコを母体材料とする遺伝子改変カイコの絹糸腺と繭層において野生型カイコを母体材料とする遺伝子改変カイコに比べて顕著に高まっているのが確認できた。同様に、他の116個の突然変異体カイコ品種(突然変異の配列は、SEQ.ID NO:2〜10、SEQ.ID NO:12〜118に示される)を母体材料とする遺伝子改変カイコの絹糸腺と繭層においても、緑色蛍光タンパク質融合タンパク質の含有量が野生型カイコを母体材料とする遺伝子改変カイコに比べて顕著に高まっているのが確認できた。以上のことは、上述のカイコフィブロイン重鎖突然変異遺伝子が外来タンパク質の製造に適用することのできることを実証したものでもある。
Claims (3)
- SEQ.ID NO:119とSEQ.ID NO:120に示されるジンクフィンガーヌクレアーゼ配列を、T7:5'−taatacgactcactataggg−3'またはSP6:5'−atttaggtgacactatag−3'プロモーターを含む原核細胞発現ベクターに挿入して組換えベクターを取得し、組換えベクターについてインビトロ転写反応を行うことでジンクフィンガーヌクレアーゼ配列をコードするmRNAを取得し、更にジンクフィンガーヌクレアーゼ配列をコードするmRNAを、ctgttgctcaaagttatgttgctgctgatgcgggagcaであるジンクフィンガーヌクレアーゼによって識別される標的サイトに作用させ、セリシン蚕になる突然変異遺伝子及び外因性タンパク質の含有量が高い表現型の突然変異遺伝子の少なくともいずれか一方を選別し、カイコフィブロイン重鎖突然変異遺伝子を取得することを特徴とするカイコフィブロイン重鎖遺伝子の突然変異誘発方法。
- 前記カイコフィブロイン重鎖突然変異遺伝子は、SEQ.ID NO:11に示される配列を有することを特徴とする請求項1に記載のカイコフィブロイン重鎖突然変異遺伝子の突然変異誘発方法。
- カイコ突然変異体の前記カイコフィブロイン重鎖突然変異遺伝子はSEQ.ID NO:11に示される配列を有することを特徴とする請求項1に記載のカイコフィブロイン重鎖突然変異遺伝子の突然変異誘発方法。
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