JP6300302B2 - カイコのセリシン1変異系統 - Google Patents
カイコのセリシン1変異系統 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6300302B2 JP6300302B2 JP2013244477A JP2013244477A JP6300302B2 JP 6300302 B2 JP6300302 B2 JP 6300302B2 JP 2013244477 A JP2013244477 A JP 2013244477A JP 2013244477 A JP2013244477 A JP 2013244477A JP 6300302 B2 JP6300302 B2 JP 6300302B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ser1
- sericin
- silkworm
- mutant
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 title claims description 111
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 title claims description 65
- 229940039354 sericin 1 Drugs 0.000 title claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 89
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 61
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 46
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 46
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 68
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 37
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 30
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 19
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 15
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 12
- 238000009991 scouring Methods 0.000 description 11
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100533230 Caenorhabditis elegans ser-2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000614261 Citrus hongheensis Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 3
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 3
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 101710137377 Sericin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255794 Bombyx mandarina Species 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 101100478314 Caenorhabditis elegans sre-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001469893 Oxyzygonectes dovii Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000382353 Pupa Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000008144 egg development Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Description
(2)Ser1変異遺伝子が第2エクソンの3’末端領域に1〜15個の塩基の欠失、付加及び/又は置換の変異をさらに含む、(1)に記載のSer1変異系統。
(3)第2イントロンのドナー領域に含まれるドナー部位における1塩基の欠失、及び第2エクソンの3’末端を含む連続する3塩基の欠失を含む、(2)に記載のSer1変異系統。
(4)前記ドナー部位の1塩基の欠失がドナー部位を含む連続する3塩基の欠失及び当該欠失箇所への2塩基の付加に基づく、(3)に記載のSer1変異系統。
(5)配列番号5に示す塩基配列を有する第2エクソン及び配列番号6に示す塩基配列を有する第2イントロンを含むSer1変異遺伝子を有する、(4)に記載のSer1変異系統。
(6)第2イントロンのドナー部位2塩基の欠失、並びに第2エクソンの3’末端を含む6塩基の欠失を含む、(2)に記載のSer1変異系統。
(7)前記第2エクソンにおける6塩基の欠失が第2エクソンの3’末端を含む連続する12塩基の欠失及び当該欠失箇所への6塩基の付加に基づく、(6)に記載のSer1変異系統。
(8)配列番号7に示す塩基配列を有する第2エクソン及び配列番号8に示す塩基配列を有する第2イントロンを含むSer1変異遺伝子を有する、(7)に記載のSer1変異系統。
(9)Ser1変異遺伝子がホモ接合型である、(1)〜(8)のいずれかに記載のSer1変異系統。
(10)(9)に記載のカイコのSer1変異系統から得られる絹糸。
(11)(10)に記載の絹糸からセリシンを除いて得られる絹繊維。
1−1.概要
本発明の第1の態様は、カイコのSer1変異系統である。本発明のSer1変異系統は、野生型Ser1遺伝子の特定の部位に変異を有するカイコ変異系統で、Ser1の量が欠失、又は著しく減少した絹糸を吐糸することができる。それ故に、営繭可能であり、裸蛹や不吐糸蚕とならずに変異系統として継代することができる。
「Ser1変異系統」とは、カイコの野生型Ser1遺伝子の特定の部位に変異を含むSer1変異遺伝子をゲノム上に有するカイコの変異系統をいう。
(1)Ser1遺伝子への変異導入
カイコの野生型Ser1遺伝子における第2イントロンのドナー領域や第2エクソンの3’末端領域への変異の導入は、当該分野で公知の遺伝子変異導入技術を用いることができる。
(1)でSer1変異遺伝子を導入したカイコでは、Ser1変異遺伝子がヘテロ接合型となっていることから、必要に応じて、Ser1変異遺伝子のホモ接合型個体を得てもよい。ホモ接合型個体は、同系交配又は兄妹交配を行い、指標となる形質に基づいて目的のホモ接合型個体を選抜すればよい。なお、本明細書において「同系交配」(sib mating)とは、対象とする変異遺伝子(ここではSer1変異遺伝子)が同一である個体間の交配をいう。また、「兄妹交配」とは、同腹の雌雄どうしで行う同系交配をいう。
本発明のカイコのSer1変異系統によれば、Ser1が欠失又はその量が著しく減少した絹糸を吐糸できる。それ故に、営繭が可能であり、また継代によって系統維持が可能なカイコ変異系統を提供することができる。
2−1.概要
本発明の第2の態様は、絹糸である。本発明の絹糸は、前記第1態様に記載のカイコのSer1変異系統におけるホモ接合型個体に由来する絹糸である。
本発明の絹糸は、前記カイコのSer1変異系統のホモ接合型個体が吐糸する絹糸である。
本明細書において「絹糸」とは、カイコが吐糸する繊維状のタンパク質複合体をいう。野生型の絹糸は、繊維成分であるフィブロインとそのフィブロインを被覆する水溶性の糊状成分であるセリシンから構成される。フィブロインは、フィブロインH鎖(Fib H)、フィブロインL鎖(Fib L)及びp25/FHX(p25)の3つのタンパク質がFib H:Fib L:p25=6:6:1の比率で複合体(silk fibroin elementary unit; SFEU複合体)を形成して構成される。セリシンは、現在Ser1、Ser2又はSer3の3種類が知られており、繭糸にはSer1及びSer3が、幼虫期の足場糸にはSer2が含まれる。
本発明の絹糸は、野生型カイコ系統の絹糸と比較して糊状成分であるセリシン1が欠失しているか、又はその量が著しく減少していることから、セリシンの溶解性が向上しており、煮繭条件を従来の条件よりも緩和することが可能となる。それによって、加熱に要するコストを低減し、また製糸作業の手間を軽減することができる。
3−1.概要
本発明の第3の態様は、絹繊維である。本発明の絹繊維は、前記第2態様における絹糸からセリシンを除いて得られる。
本発明の絹繊維は、第2態様の絹糸を処理して得られる絹繊維をいう。
本明細書において「絹繊維」とは、前記絹糸に対して精練処理等を行い、セリシンを除去した残りの成分をいう。この残りの成分の多くは、絹糸の繊維成分であるフィブロインである。本発明の絹繊維において、セリシンは完全に除去されていてもよいし、一部が残っていてもよい。
本発明の絹繊維によれば、遺伝子組み換え技術により付加的な機能を付与された機能性絹繊維を、その機能を失うことなく提供することができる。
(目的)
カイコゲノム上のSer1遺伝子における第2エクソンの3’末端領域及び第2イントロンのドナー領域にTALENを用いて変異導入し、本発明のカイコのSer1変異系統を作出する。
(1)カイコ系統及び飼育
カイコ系統には、茨城県農業生物資源研究所(日本)の遺伝子組換えカイコ研究開発ユニットで保存されている白眼非休眠系統(w1-pnd)を用いた。カイコの飼育には人工飼料
として、桑葉含有率の低いシルクメイトL4M(日本農産工業)又は桑葉含有率の高い原蚕種1〜3齢用(日本農産工業)、あるいは桑葉を用いた。
Ser1遺伝子(図2A)は9個のエクソンを有し、選択的スプライシングによって少なくとも5種類のスプライスバリアントを生じる(図2B)。Ser1の全てのスプライスバリアントに対して変異を生じさせ、かつ機能的な領域を除去するために、全てのスプライスバリアントに共通する第2エクソンの3’末端領域及び第2イントロンのドナー領域をTALENの標的部位とした(図3)。第2エクソンの3’末端領域認識側(図3のI)を認識するTALENのDNA塩基配列認識部位の塩基配列を配列番号9に、また第2イントロンのドナー領域認識側(図3のII)を認識するTALENのDNA塩基配列認識部位の塩基配列を配列番号10に示す。なお、標的部位周辺に位置する制限酵素AleIの認識配列(図3下線部)を変異導入の有無の判定に用いた。
得られた直鎖状TALEN発現用プラスミド1μgを鋳型DNAとして、mMESSAGE mMACHINE kit(life technologies)を用いてTALENのmRNAを調製した。mRNAの精製は、キットに添付の説明書に従って、LiCl沈殿法により行った。
得られたTALENのmRNAを0.5μg/μLとなるようインジェクションバッファー(5 M KCl, 0.5 mM リン酸緩衝液pH7.0)に溶解した後、産下後5〜8時間のカイコ受精卵にTamura et al.(上述)の方法に従って3-5 nLをインジェクションした。その後、25℃でインキュベートして孵化させた。幼虫は、人工飼料シルクメイト原蚕種1〜3齢用(日本農産工業)を用いて飼育した。
Ser1遺伝子のノックアウト効率の高い蛾区のみを選抜するために、以下の方法でサンプリングアッセイを実施した。まず、上記インジェクション後に飼育して得られたTALEN処理カイコG0(Generation 0)成虫どうしを交配させて、比較的産卵数の多い12蛾区を選択した。それぞれの蛾区から得られた孵化直前のG1卵(Generation 1)を採取し、そのうち50卵を用いてDNAzol(Life technologies)又はBlood and tissue genomic DNA extractionminiprep system(Viogene)を用いてゲノムDNAを抽出した。具体的な抽出方法については、それぞれに添付の説明書に従った。抽出したゲノムDNA 25ngを鋳型DNAとして、配列番号14及び配列番号15に示すプライマーセット及びKOD FX Neo(Toyobo)を用いて、Ser1における標的部位を含む435塩基の領域をPCRにより増幅した。得られた増幅産物を制限酵素AleIで処理した後、アガロースゲル(0.8% SeaKem GTG, 2.4% NuSieve GTG)電気泳動によりDNA断片を分析した。蛾区ごとのPCR増幅産物のAleIによる切断に基づいて、TALENによるSer1遺伝子への変異導入効率を検証した。
飼育したG1カイコに営繭させ、その繭形状を分類すると共に、繭を構成する絹糸に含まれるSre1量をSDS-PAGEで検証した。なお、G1段階では、各蛾区に複数の種類のSer1変異遺伝子および正常型遺伝子が混在している可能性があり、これらの遺伝子型についてホモ接合型個体及びヘテロ接合型個体が混在している。
12蛾区のうち2蛾区(52-2及び52-4)を選択し、各蛾区で15頭のG1個体における営繭状態を確認した。営繭状態は、野生型カイコの繭と外見上の差異がほとんど見られない正常繭、野生型カイコの繭と比較して明らかに薄い薄皮繭、営繭せずに蛹化する裸蛹、及び吐糸できずに終齢幼虫のまま死亡する不吐糸蚕の4種に分類した。
前記繭形状による分類で正常繭又は薄皮繭を形成したカイコが実際にSer1を欠失又はその量を減少した絹糸を吐糸しているか否かを確認するために、SDS-PAGEを行った。まず、繭内の蛹を取り出して保管し、得られた繭の繭層切片約30 mgを80℃に熱した1% 2-メルカプトエタノール含有8 M尿素水溶液に浸漬した。2〜3分間撹拌しながらセリシンを絹糸から抽出する処理を行った。得られた抽出液を20,000×gで2分間遠心分離し、25μLの上清に25μLのサンプルバッファー(0.1 M Tris HCl pH6.8, 1% SDS, 0.05% BPB, 1% 2-メルカプトエタノール)を混合して99℃で5分間加熱して、SDS-PAGE用試料とした。対照用として野生型カイコから得られた繭層切片を用いて、上記と同じ処理を行った。SDS-PAGEは、Green, MR and Sambrook, J, (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法を参照した。泳動には5%の均一ゲルを用い、分子量マーカーとしてプレシジョン Plus プロテイン未着色スタンダード(Bio Rad)を使用した。泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。
上記(6)で分離したSer1変異体個体の蛹を羽化させて、得られたG1カイコ成虫におけるSer1変異遺伝子のTALENの標的部位における塩基配列を決定した。
上記(7)で得られた52-2蛾区由来のSer1変異遺伝子を有するG1カイコ成虫を野生型と交配し、Ser1変異遺伝子のヘテロ接合型G2カイコを得た。続いて、G2カイコどうしを交配して、G3カイコを得た。このG3カイコ集団には、52-2蛾区由来のSer1変異ホモ接合型個体が理論上25%含まれる。営繭したG3カイコから蛹を取り出して繭を保存し、羽化した複数のG3カイコ成虫から脚を1本採取して、(7)と同様の方法でゲノムDNAを抽出した後、Ser1変異遺伝子のTALENの標的部位における塩基配列をダイレクトシークエンスを行って確認した。Ser1変異遺伝子をホモ接合で有する個体を選抜し、実施例1と同様の方法で、繭を構成する絹糸中のSer1量をSDS-PAGEで分析した。
Claims (10)
- カイコの野生型セリシン1遺伝子の第2イントロンのドナー部位における少なくとも1塩基、及び第2エクソンの3’末端に欠失、付加及び/又は置換の変異を含むセリシン1変異遺伝子を有するカイコのセリシン1変異系統。
- セリシン1変異遺伝子が第2エクソンの3’末端領域に1〜15個の塩基の欠失、付加及び/又は置換の変異をさらに含む、請求項1に記載のセリシン1変異系統。
- 前記ドナー部位における1塩基の欠失、及び第2エクソンの3’末端を含む連続する3塩基の欠失を含む、請求項2に記載のセリシン1変異系統。
- 前記ドナー部位の1塩基の欠失がドナー部位を含む連続する3塩基の欠失及び当該欠失箇所への2塩基の付加に基づく、請求項3に記載のセリシン1変異系統。
- 配列番号5に示す塩基配列を有する第2エクソン及び配列番号6に示す塩基配列を有する第2イントロンを含むセリシン1変異遺伝子を有する、請求項4に記載のセリシン1変異系統。
- 第2イントロンのドナー部位2塩基の欠失、並びに第2エクソンの3’末端を含む6塩基の欠失を含む、請求項2に記載のセリシン1変異系統。
- 前記第2エクソンにおける6塩基の欠失が第2エクソンの3’末端を含む連続する12塩基の欠失及び当該欠失箇所への6塩基の付加に基づく、請求項6に記載のセリシン1変異系統。
- 配列番号7に示す塩基配列を有する第2エクソン及び配列番号8に示す塩基配列を有する第2イントロンを含むセリシン1変異遺伝子を有する、請求項7に記載のセリシン1変異系統。
- セリシン1変異遺伝子がホモ接合型である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のセリシン1変異系統。
- 請求項9に記載のカイコのセリシン1変異系統から得られる絹糸。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013244477A JP6300302B2 (ja) | 2013-11-27 | 2013-11-27 | カイコのセリシン1変異系統 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013244477A JP6300302B2 (ja) | 2013-11-27 | 2013-11-27 | カイコのセリシン1変異系統 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015100326A JP2015100326A (ja) | 2015-06-04 |
JP6300302B2 true JP6300302B2 (ja) | 2018-03-28 |
Family
ID=53376598
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013244477A Active JP6300302B2 (ja) | 2013-11-27 | 2013-11-27 | カイコのセリシン1変異系統 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6300302B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022016053A1 (en) * | 2020-07-17 | 2022-01-20 | Kraig Biocraft Laboratories, Inc. | Synthesis of non-native proteins in bombyx mori by modifying sericin expression |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020125274A (ja) * | 2019-02-06 | 2020-08-20 | 合同会社Tgs | 繭糸 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2002102845A1 (ja) * | 2001-06-14 | 2004-09-30 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | 絹フィブロイン由来機能性ポリペプチドの製造法及びその利用 |
JP5098039B2 (ja) * | 2007-03-30 | 2012-12-12 | 東レ株式会社 | 化合物の結合効率が向上した絹糸 |
AU2010275432A1 (en) * | 2009-07-24 | 2012-02-02 | Sigma-Aldrich Co. Llc. | Method for genome editing |
-
2013
- 2013-11-27 JP JP2013244477A patent/JP6300302B2/ja active Active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022016053A1 (en) * | 2020-07-17 | 2022-01-20 | Kraig Biocraft Laboratories, Inc. | Synthesis of non-native proteins in bombyx mori by modifying sericin expression |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2015100326A (ja) | 2015-06-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11089767B2 (en) | Transgenic silkworms expressing spider silk | |
CN108251452A (zh) | 一种表达Cas9基因的转基因斑马鱼及其构建方法和应用 | |
US20210400936A1 (en) | Methods, compositions and systems for production of recombinant spider silk polypeptides | |
EP3159414A1 (en) | Expression system | |
Gui et al. | First report on CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata | |
JP6497605B2 (ja) | 雌蚕致死カイコ系統 | |
Amsterdam et al. | Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish | |
Takasu et al. | Precise genome editing in the silkworm Bombyx mori using TALENs and ds-and ssDNA donors–A practical approach | |
JP2006109772A (ja) | カイコでの組換えタンパク質製造のためのポリヌクレオチド | |
JP5691052B2 (ja) | 組換え生物及び組換え生物により作られるタンパク質 | |
JP6300302B2 (ja) | カイコのセリシン1変異系統 | |
Takasu et al. | Fibroin heavy chain gene replacement with a highly ordered synthetic repeat sequence in Bombyx mori | |
JP5997772B2 (ja) | カイコフィブロイン重鎖遺伝子の突然変異配列、及び突然変異を誘発する方法と応用 | |
JP2011103816A (ja) | トランスジェニックカイコ | |
JP2008245623A (ja) | 改変フィブロインを生産する遺伝子改変カイコ | |
JP2006521802A (ja) | 鱗翅目の後部絹糸腺における有用ポリペプチド発現を指令する核酸およびその応用 | |
JP4544834B2 (ja) | 外来遺伝子発現を促進するポリヌクレオチド | |
CN110791528A (zh) | 一种提高蚕丝产量和优化家蚕品种的microRNA基因编辑方法 | |
CN115820736B (zh) | 家蚕丝胶蛋白Ser4在提高蚕丝性能中的应用及其方法 | |
WO2023190453A1 (ja) | キメラ絹糸を生産するゲノム改変カイコ | |
Shin et al. | Generation of floxed alleles for cell-specific knockout in zebrafish | |
CN117802107A (zh) | 家蚕BmEcKL1基因在高丝量家蚕品种选育中的应用 | |
JP2020125274A (ja) | 繭糸 | |
Yu et al. | TALEN-mediated homologous-recombination-based fibroin light chain in-fusion expression system in Bombyx mori | |
CN117025672A (zh) | 一种基于基因打靶家蚕制备蜘蛛家蚕复合丝纤维的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20160428 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160602 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20160824 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170523 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170703 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171205 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180112 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180206 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180222 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6300302 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |