JP2020125274A - 繭糸 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]セリシンおよびフィブロインを含む繭糸であって、前記セリシンが実質的にセリシン3からなる、繭糸。
[2]セリシンプロモーターと配列番号1の塩基配列とが作動可能に連結されたDNAを有する、遺伝子組換えカイコ。
[3][2]に記載の遺伝子組換えカイコを生育して、繭糸を分離する工程を含む、繭糸の製造方法。
以下に示す方法により、高フィブロイン繭を産生する遺伝子組換えカイコを作出した。
Ser1 F: AGCGGTCAGAAACCTTGTTAACC(配列番号3)
Ser1 R: GCTTTTACGCTGAGCGCAGCCAACGCAATC(配列番号4)
Ser1 F Kpn I: TTTGGTACCAGCGGTCAGAAACCTTGTTAACC(配列番号5)
Ser1 R BamHI: TTTGGATCCGTTGGCGGTCTTTGGATCGCTTG(配列番号6)
Ser 1F in fusion: GTATGGCTGACCTAGAGCGGTCAGAAACCTTGTTAACCAATAGAG(配列番号7)
polyA in fusion: GCCTAGTAGACCTAGCACGCGCTTGAAAGGAGTGTGTAAATGGAC(配列番号8)
piggyBack right ITR 1: GCGTGAGTCAAAAGACGCATGAT(配列番号9)
piggyBack right ITR 2: ATCAGTGACACTTACCGCATTGACA(配列番号10)
piggyBack left ITR 1: CCTCGATATACAGACCGATAAAACAC(配列番号11)
piggyBack left ITR 2: AACTTTTATGGCGCGCCATCGAAT(配列番号12)
プライマーSer1 Fと Ser1 RをDDBJのAB007831の配列を元に合成した。これらを用いて、カイコw1-pnd系統のゲノム配列を鋳型にPCR法を実施し、Ser 1の5’上流(AB007831翻訳開始コドンの1塩基目を塩基番号+1とした場合の-1196〜-1)までのDNA断片を増幅した。このDNA断片を鋳型に、プライマーSer1 F Kpn IとSer1 R BamHIを用いてPCR法を実施し、増幅したDNA断片を制限酵素Kpn IとBamHIで消化した。この断片を、非特許文献1に記載したpIZ-FibHPro-H1/P1A269/FLAG をKpnIとBamHIで消化して線状化したベクターに連結した。ベクターの中で連結されたSer1プロモーター(-1196〜-1)と、元のベクター由来のサイポウイルスH1およびC末端にFLAGをつけたピエリシン1A(P1A:アミノ酸番号2-269、この塩基配列は配列番号1)融合配列と、インビトロジェンpIZ/V5-His由来のpolyA付加シグナルの部分を、プライマーSer 1F in fusionとpolyA in fusionを用いてPCR増幅した。このDNA断片を、非特許文献1にて引用したpBacMCS[UAS-SV40, 3xP3-EGFP]のBln Iサイトにin fusion 法により挿入し、pBacMCS[Ser1pro-H1/P1A/FLAG, 3xP3-EGFP]を得た(図2)。
pBacMCS[Ser1pro-H1/P1A/FLAG, 3xP3-EGFP]をドナープラスミドとした。Tamuraらの方法(Tamura et al.,2007 JIBS)で産卵後3-8時間のw1-pndの卵の胚発生域に、200μg/μLのドナープラスミドとピギーバック発現用ヘルパープラスミドを含むリン酸緩衝液(pH7.0)を、フェムトジェット装置(エッペンドルフ社製)を用いて注入した(G0世代)。G0世代どうしの交配で得られるG1世代卵の中で、気管形成期以降に神経においてEGFPを発現している個体を選抜した。
選抜したEGFP陽性個体を交配し、得られる子孫の中で特に強いEGFP蛍光の形質を持ち、高フィブロイン繭を作る系統を選抜した(G2世代)。このG2系統の絹糸腺からゲノムDNAを抽出し、制限酵素Sau3AIにより一晩処理して得られるDNA断片をDNAリガーゼを用いて自己環状化させた。これを鋳型に、piggyBack right ITR 1: 5’とpiggyBack right ITR 2: 3’の組み合わせ、またはpiggyBack left ITR 1: 5’とpiggyBack left ITR 2: 3’の組み合わせでPCR法を行い、得られた断片の配列を決定することにより、それぞれ転移配列の5’ ITRおよび3’ ITR周辺のカイコ染色体由来配列を決定した。この結果、第22番染色体に確かに転移配列が挿入されていることを確認した。この系統について、マーカーのEGFP蛍光の強さからホモ系統を選抜して、以後同系交配を繰り返すことにより、高フィブロイン繭を作る遺伝子組換えカイコを作出した。
上記で作出された遺伝子組換えカイコを人工飼料で生育し、熟蚕期に入った5齢幼虫を新聞紙に包み、室温で静置し、5日後に繭を回収して、実施例1の繭糸を得た。
実施例1の繭糸について、タンパク質をSDS-PAGE(5〜20%グラジエントゲル)で分離し、CBB染色液でゲルを染色した(図1)。図1の四角の白線枠内に検出されるタンパク質バンドのゲルを切り出した。ゲル断片の脱色・洗浄後トリプシン処理(35℃20時間)を行い、脱塩・濃縮後、LC-MS/MS分析を行った。HPLC(Easy-nLC 1200(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)による液体クロマトグラフィー)により分取されたペプチド試料を、質量分析装置(Q Exactive PLUS装置(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製))で分析した。この分析結果とNCBI ゲノムデータベースと対比させ、質量が該当するタンパク質を見出した。この結果、枠内のタンパク質として、セリシン3とフィブロイン重鎖が検出された。したがって、実施例1の繭糸は、フィブロインとセリシン3が含まれた繭であることが示された。
野生型(w1-pnd系統)と高フィブロイン繭産生カイコ系統の中部絹糸腺を各日齢に摘出し、トライゾル法でRNAを抽出した。これをインビトロジェン社のSuperscript III one step RT-PCR system with platinum taqの酵素反応により、セリシン1(Ser 1)、セリシン2(Ser 2)、及びセリシン3(Ser 3)のmRNAの発現を解析した。リボソーム RNA量を用いてサンプルの標準化を行った。結果を図3〜5に示す。図3〜5の各日付において、左側が野生型(w1-pnd系統)における発現量を示し、右側が高フィブロイン繭産生カイコ系統における発現量を示す。図3〜5から分かるように、高フィブロイン繭産生カイコ系統において、セリシン1及びセリシン2は産生されておらず、一方、セリシン3は、発現していることがわかった。
18S rRNA-1: CGATCCGCCGACGTTACTACA(配列番号13)
18S rRNA-2: GTCGGGCCTGGTGGTGAGATTT(配列番号14)
P1A269-1: CCATCTGGAAATGGTTTGG(配列番号15)
P1A269-2: TGTATGGTGGTGCAGGTGAG(配列番号16)
Ser1-F: CAAAGACCGCCAACATGCGT(配列番号17)
Ser1-R: CACTGCTAGCTGCATTGTACTTTCG(配列番号18)
Ser2-F: CGGCTGACTACCAAACCAAA(配列番号19)
Ser2-R: CCGAGAGTTGCTGCCCTTAC(配列番号20)
Ser3-F: CCAGAGCCAGTCATACAACAAAG(配列番号21)
Ser3-R: TGTCGTCGGAATTCTACACCA(配列番号22)
実施例1の繭糸と、野生型(w1-pnd系統)が産生した繭糸を生糸(丸練)にしたものについて、6M 塩酸中で110℃、22時間の処理で得られるアミノ酸を、Shom-pack Amino-Na(島津製作所社製)装置とISC-30/S0504 Na アンモニウムトラップカラム(島津製作所社製)によるHPLCで分離し、溶出されたアミノ酸をアミノ酸分析キットOPA試薬(島津製作所社製)と反応させた後、分光蛍光検出器(島津製作所社製)により分析した。結果を表1に示す。
Claims (3)
- セリシンおよびフィブロインを含む繭糸であって、前記セリシンが実質的にセリシン3からなる、繭糸。
- セリシンプロモーターと配列番号1の塩基配列とが作動可能に連結されたDNAを有する、遺伝子組換えカイコ。
- 請求項2に記載の遺伝子組換えカイコを生育して、繭糸を分離する工程を含む、繭糸の製造方法。
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