CN111793645B - 一种家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统含有目的基因表达框，所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子3；用于表达蛋白后在丝腺及茧丝中的存在位置相同的结果，均存在于丝素层。结果表明C端截短后只要包含后20个氨基酸(倒数第20个是与丝素轻链形成二硫键的半胱氨酸Cys)就不会对成丝有影响。丝素C端的解析为蚕丝的成丝机理提供了实验及理论基础，有利于创造真正实用的家蚕丝腺生物反应器，保持蚕丝产业可持续发展，促进我国蚕学和昆虫学科的长远发展。

Description

一种家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种家蚕丝心蛋白重链表达系统，还涉及该系统的制备方法和应用。
背景技术
家蚕茧丝的主要组成是丝素(fibroin)和丝胶(sericin)两种蛋白，其中丝素是茧丝的主要成分，约占茧丝重的82％。丝素由家蚕的后部丝腺(PSG)细胞合成，丝胶由中部丝腺(MSG)细胞合成，它们都在中部丝腺聚集，最后经过前部丝腺(ASG)被榨丝后而吐丝结茧。丝素由350-kDa的重链蛋白(H-chain)，26-kDa的轻链蛋白(L-chain)和30-kDa的fibrohexamerin/P25(fhx)三种蛋白构成。这些蛋白在后部丝腺细胞内首先按照一定的比例(H-chain：L-chain：fhx＝6：6：1)形成丝素基本单元，然后丝素基本单位被分泌到丝腺腔。其中丝素基本单位由6个通过二硫键结合的重链、轻链(H-L)二聚体和1个P25糖蛋白分子组成。H-L二聚体在Fib-L的Cys-172和Fib-H的Cys-c20之间形成二硫键。一个P25糖蛋白和六个H-L二聚体通过与重链的N端结构域(NTD)的非共价相互作用在内质网上形成丝素基本单元。在丝素基本单位中重链蛋白是最主要的成分，达92％，并且是茧丝具有优良机械性能的原因所在，而轻链蛋白只占约7％，fhx约占1％。而丝素重链是由中间的12个结晶区域、11个非结晶区域和两端保守亲水的N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)组成。
自从家蚕基因组框架图由中国家蚕基因组计划研究小组领导的率先完成后，它不但确立了我国家蚕功能基因组研究在国际上的地位，而且也为蚕丝业和昆虫学科的发展提供了新的契机。功能基因组时期的主要工作包括：主要功能基因的鉴定克隆，重要生物学性状的分子机理的阐明，最终实现重要经济性状的人为调节和创造。家蚕最重要的性状是家蚕的丝腺能在短时间高效地大量合成绢丝蛋白。利用家蚕丝腺的这一特点，在丝腺中高效表达外源蛋白一直是许多蚕学和生物学科技工作者追求的目标。而目前对于成丝机理的研究仍有很多细节需要科研工作者去解析，特别是在茧丝中占比最大且主要负责蚕丝机械性能的丝素重链其各元件在丝形成过程中发挥着怎样的作用更加需要进一步探究。
利用鳞翅目来源的转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因技术最初在日本取得成功，而经过科研工作者的努力，我们也建立了系统而完善的家蚕胚胎显微注射转基因技术，为本研究的工作开展打下了良好的基础。在利用转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因技术的研究报道中，已有关于丝素重链完整N端及完整C端(LBS)的报道，而有关利用家蚕丝素重链表达系统(N端完整，C端含截短LBS)表达外源蛋白的方法未见报道，这也将进一步探究了丝素重链元件之一C端的作用，为蚕丝成丝机理的研究提供实验及理论基础。其中截短LBS(LBS(s))：截短的轻链结合位点，包含丝素重链的c端20个氨基酸和多聚腺苷酸信号序列(poly(A))。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种家蚕丝心蛋白重链表达系统；本发明的目的之二在于提供含有所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体；本发明的目的之三在于提供所述重组载体的制备方法；本发明的目的之四在于提供所述家蚕丝心蛋白重链表达系统或所述重组载体在丝素层表达活性蛋白中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种家蚕丝心蛋白重链表达系统，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统含有目的基因表达框，所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子3Fib-H P3；3’端为截短轻链结合位点LBS(s)；所述丝心蛋白重链启动子3Fib-H P3的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述截断轻链结合位点LBS(s)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、含有所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体。
优选的，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框通过BamHI和HindⅢ酶切位点连入pSLfa1180fa载体而得。
优选的，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框连入pBac[3×P3DsRedaf]载体AscI和FseI酶切位点而得。
3、所述重组载体的制备方法，所述重组载体由含有目的基因表达框连入pSLfa1180fa载体的BamHI和HindⅢ酶切位点处而得。
优选的，所述重组载体的制备方法如下：先将截断轻链结合位点LBS(s)通过BamHI和SalI酶切位点连入pSLfa1180fa载体获得pSL-LBS(s)质粒，再将目的基因通过XbaI和BamHI连入pSL-LBS(s)质粒获得含目的基因的过渡载体，最后将丝心蛋白重链启动子3Fib-HP3通过BamHI和HindⅢ连入含目的基因的过渡载体获得家蚕丝心蛋白重链表达系统pSL-LBS(s)-目的基因-Fib-H P3。
优选的，所述丝心蛋白重链启动子3Fib-H P3由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。
优选的，所述截断轻链结合位点LBS(s)由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物，含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。
优选的，将所获得的重组载体利用限制性酶AscI和FseI插入到piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]载体内形成最终的注射载体。
4、所述家蚕丝心蛋白重链表达系统或所述重组载体在丝素层表达活性目的蛋白中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了家蚕丝素重链表达系统，该系统5’端为丝心蛋白重链启动子3；3’端为截短轻链结合位点(N端完整，C端含LBS(s))，表达目的蛋白后，通过对转基因家蚕的鉴定及检测分析发现，表达的蛋白在丝腺及茧丝中的存在位置相同的结果，均存在于丝素层。表明不管C端截短后只要包含后20个氨基酸(倒数第20个是与丝素轻链形成二硫键的半胱氨酸Cys)就不会对成丝有影响。丝素C端的解析为蚕丝的成丝机理提供了实验及理论基础，有利于创造真正实用的家蚕丝腺生物反应器，保持蚕丝产业可持续发展，促进我国蚕学和昆虫学科的长远发展。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为转基因载体结构图(A：含有多克隆位点的穿梭载体pSLfa1180fa；B：piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]；C：获得的最终注射载体pBac[3×P3-DsRed-SV40-LBS(s)-EGFP-Fib-H P3])
图2为获得的转基因家蚕荧光筛选(A：野生型和转基因家蚕复眼在白光和红色荧光下观察结果，a为野生型白光，b为野生型红色荧光，c为转基因家蚕白光，d为转基因家蚕红光；B：野生型和转基因家蚕蚕茧在白光和绿色荧光下观察，a为野生型白光，b为转基因家蚕白光，c为野生型绿色荧光，d为转基因家蚕绿色荧光；WT：野生型；TS-H-NGC：转基因家蚕；White light：白光；RFP-fluorescent：红色荧光；GFP-fluorescent：绿色荧光；GFP std：绿色荧光蛋白标品)。
图3为目的基因EGFP的SDS-PAGE电泳图及Western blotting图(A：SDS-PAGE电泳；B：Western blotting图)。
图4为五龄家蚕2天丝腺整体荧光图(a：野生型丝腺白光图；b：转基因丝腺白光图；c：野生型丝腺绿色荧光图；d：转基因丝腺绿色荧光图；e：转基因丝腺绿色荧光放大图)。
图5为五龄五天丝腺及茧丝冷冻切片图(A：丝腺冷冻切片图；a为野生型丝腺白光图；b为转基因丝腺白光图；c为野生型丝腺绿色荧光图；d为转基因丝腺绿色荧光图；B：茧丝冷冻切片图；a为野生型丝腺白光图；b为转基因丝腺白光图；c为野生型丝腺绿色荧光图；d为转基因丝腺绿色荧光图)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明将家蚕胚胎显微注射技术，荧光检测与分子生物操作技术相结合，构建了一个在家蚕丝腺中特异表达的家蚕丝素重链表达系统(N端完整，C端含LBS(s))，N端序列长度为2304bp，其核酸序列是：
aagcttgttgtacaaaactgccacacgcatttttttctccactgtaggttgtagttacgcgaaaacaaaatcgttctgtgaaaattcaaacaaaaatattttttcgtaaaaacacttatcaatgagtaaagtaacaattcatgaataatttcatgtaaaaaaaaaatactagaaaaggaatttttcattacgagatgcttaaaaatctgtttcaaggtagagatttttcgatatttcggaaaattttgtaaaactgtaaatccgtaaaattttgctaaacatatattgtgttgttttggtaagtattgacccaagctatcacctcctgcagtatgtcgtgctaattactggacacattgtataacagttccactgtattgacaataataaaacctcttcattgacttgagaatgtctggacagatttggctttgtatttttgatttacaaatgtttttttggtgatttacccatccaaggcattctccaggatggttgtggcatcacgccgattggcaaacaaaaactaaaatgaaactaaaaagaaacagtttccgctgtcccgttcctctagtgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaaaattgaacgatattataaaattctttaaaatattaaaagtaagaacaataagatcaattaaatcataattaatcacattgttcatgatcacaatttaatttacttcatacgttgtattgttatgttaaataaaaagattaatttctatgtaattgtatctgtacaatacaatgtgtagatgtttattctatcgaaagtaaatacgtcaaaactcgaaaattttcagtataaaaaggttcaactttttcaaatcagcatcagttcggttccaactctcaagatgagagtcaaaacctttgtgatcttgtgctgcgctctgcaggtgagttaattattttactattatttcagaaggtggccagacgatatcacgggccacctgataataagtggtcgccaaaacgcacagatatcgtaaattgtgccatttgatttgtcacgcccgggggggctacggaataaactacatttatttatttaaaaaatgaaccttagattatgtaacttgtgatttatttgcgtcaaaagtaggcaagatgaatctatgtaaatacctgggcagacttgcaatatcctatttcaccggtaaatcagcattgcaatatgcaatgcatattcaacaatatgtaaaacaattcgtaaagcatcattagaaaatagacgaaagaaattgcataaaattataaccgcattattaatttattatgatatctattaacaattgctattgcctttttttcgcaaattataatcattttcataacctcgaggtagcattctgttacattttaatacattggtatgtgattataacacgagctgcccactgagtttctcgccagatcttctcagtgggtcgcgttaccgatcacgtgatagattctatgaagcactgctcttgttagggctagtgttagcaaattctttcaggttgagtctgagagctcacctacccatcggagcgtagctggaataggctaccagctaataggtagggaaaacaaagctcgaaacaagctcaagtaataacaacataatgtgaccataaaatctcgtggtgtatgagatacaattatgtactttcccacaaatgtttacataattagaatgttgttcaacttgcctaacgccccagctagaacattcaattattactattaccactactaaggcagtatgtcctaactcgttccagatcagcgctaacttcgattgaatgtgcgaaatttatagctcaatattttagcacttatcgtattgatttaagaaaaaattgttaacattttgtttcagtatgtcgcttatacaaatgcaaacatcaatgattttgatgaggactattttgggagtgatgtcactgtccaaagtagtaatacaacagatgaaataattagagatgcatctggggcagttatcgaagaacaaattacaactaaaaaaatgcaacggaaaaataaaaaccatggaatacttggaaaaaatgaaaaaatgatcaagacgttcgttataaccacggattccgacggtaacgagtccattgtagaggaagatgtgctcatgaagacactttccgatggtactgttgctcaaagttatgttgctgctgatgcgggagcatattctcagagcgggccatacgtatcaaacagtggatacagcactcatcaaggatatacgagcgatttcagc(SEQ ID NO.1)；
LBS(s)序列长度222bp，其核酸序列是：
tgtggaattcctagaagacaactagttgttaaattcagagcactgccttgtgtgaattgctaatttttaatataaaataacccttgtttcttacttcgtcctggatacatctatgttttttttttcgttaataaatgagagcatttaagttattgtttttaattacttttttttagaaaacagatttcggattttttgtatgcattttatttgaatgtacta(SEQ ID NO.2)。
本发明利用家蚕丝素重链表达系统(N端完整，C端含LBS(s))表达外源蛋白的方法，具体步骤见实施例。
实施例1、载体的构建
利用前期获得的piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]作为注射转座子载体，重组pBac[3×P3DsRedaf]注射转座子载体是利用pSLfa1180fa克隆穿梭载体采用两步克隆法构建的。首先，复杂的构建都在含有所有可能识别6个碱基的限制性内切酶的多克隆位点的pSLfa1180fa(图1，A)克隆穿梭载体中完成，然后，构建好的重组pSLfa1180fa克隆穿梭载体用识别10个碱基的限制性内切酶AscI和FseI消化，得到的重组目的基因部分最后被克隆到piggyBac衍生载体pBac[3×P3-DsRedaf](图1，B)(通过限制性酶切位点AscI和FseI插入)形成目的重组注射载体。
启动子元件的PCR扩增是用含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体(BAC)克隆(下面简称H-chain BAC)为模板(DDBJ/EMBL/GenBank的序列号为：AF226688)，EGFP基因是从pBS-A3EGFP质粒的中扩增得到，具体构建如下：
首先是不同元件片段的获得：包含完整N端的丝素重链启动子3(简称为Fib-H P3)由丝素重链基因5’-上游序列，外显子1，内含子1和外显子2的5’端非重复序列组成，它是用Fib-H-P-f(61547-61564)：5'-aagcttgttgtacaaaactgcc-3'(SEQ ID NO.3)和Fib-H-P-r(63846-63823)(5'-gctatctagagctgaaatcgctcgtatatccttg-3'(SEQ ID NO.4)引物对从H-chain BAC扩增获得；C端含LBS(s)(轻链结合位点)由包含C-端的倒数20个氨基酸(包含Cys-c20)的丝素重链基因的3’端和包含重链基因多聚腺嘌呤化信号序列的3’端下游序列组成，它是用含有一个BamHI位点的LBS(s)-f(79138-79156)：5'-gtacggatccatgtggaattcctagaagac-3'(SEQ ID NO.5)和含有一个SalI位点的LBS(s)-r(79359-79335)：5'-gcgcgtcgactagtacattcaaataaaatgcatac-3'(SEQ ID NO.6)从H-chainBAC扩增获得；EGFP基因是用含有一个XbaI位点的EGFP-f：5'-ctagtctagaatggtgagcaagggcgagg-3'(SEQ ID NO.7)和含有一个BamHI位点的EGFP-r：5'-cagtggatccttgtacagctcgtccatgccg-3'(SEQ ID NO.8)从pBS-A3EGFP质粒扩增获得。PCR扩增条件是94℃预变性5分钟，5个94℃变性1分钟，50℃退火1分钟和72℃延伸1分30秒的循环，然后是25个94℃变性1分钟，55℃退火1分钟；和72℃延伸1分30秒的循环，接下来是72℃延伸7分钟和4℃保存；
然后是这些扩增元件按照下面的方法克隆到pSLfa1180fa(下面简称为pSL)穿梭载体(图1，A)：①克隆LBS(s)片段通过BamHI和SalI连入pSL穿梭载体获得pSL-LBS(s)质粒；②克隆EGFP片段通过XbaI和BamHI进pSL-LBS(s)质粒获得pSL-LBS(s)-EGFP质粒；③克隆Fib-HP3片段通过XbaI和HindⅢ pSL-LBS(s)-EGFP质粒获得pSL-LBS(s)-EGFP-Fib-H P3质粒；
最后，把获得的pSL-LBS(s)-EGFP-Fib-H P3质粒的重组目的基因表达框克隆进pBac[3×P3DsRedaf](图1，B)载体，获得重组注射载体pBac[3×P3-DsRed-SV40-LBS(s)-EGFP-Fib-H P3](图1，C)。
实施例2、转基因家蚕的获得(转基因家蚕命名为TS-H-NGC)
pHA3PIG(Tamura et al.,2000)被用作辅助质粒产生转位酶，用QIAGEN PlasmidMidi kit(Qiagen)试剂盒纯化注射质粒DNA，参照Kanda&Tamura(1991)描述的方法进行家蚕胚胎显微注射，注射后的蚕卵用无毒胶封口，在25℃条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体；最后，获得的转基因个体饲养、传代，并进行EGFP表达的检测和荧光观察，结果如图2所示。结果显示，TS-H-NGC的蚕蛾在红色荧光下眼睛显示红色，蚕茧在绿色荧光条件下显示绿色。结果表明，转基因阳性家蚕TS-H-NGC成功获得。
启动子特异表达的检测和外源蛋白存在部位的观察如下：
获得的转基因家蚕进行基因组PCR、反向PCR、Western blotting以及荧光观察分析。
①基因组PCR分析：用酚-氯仿法从G1代的蛾或G2代7天的蛹抽提转基因家蚕及野生型的基因组DNA。利用引物对EGFP-f和EGFP-r对其进行PCR分析，后进行琼脂糖凝胶电泳分析检测。结果显示，TS-H-NGC相对于对照野生型有清晰单一的条带。
②反向PCR分析：利用逆转录聚合酶链反应(reverse PCR)技术测定了piggyBac载体在染色体上的插入位点。10μg基因组DNA经HaeIII在37℃消化过夜，16℃过夜连接环状。以转座子特异性引物PLF/PLR(piggyBac左臂)和PRF/PRR(piggyBac右臂)扩增连接产物。PCR片段克隆并测序。利用SilkMap应用程序(www.silkdb.org/silksoft/silkmap.html)完成了piggyBac载体的蚕基因组插入位点的定位。结果显示，转基因成功插入到家蚕基因组内且拷贝数单一。
③Western blotting分析：去掉乱丝的茧碎片溶解于60％的LiSCN溶液中(按照约0.025g的茧片/1ml的60％LiSCN比例进行溶解和处理)，然后离心取上清液，并用Tris缓冲液(10mM Tris-HCl pH＝7.0,2％SDS,5％β-巯基乙醇)稀释5倍后作为实验分析的样品。这些样品与5×加样缓冲液混合并在100℃变性5分钟后上样于12％SDS-聚丙稀酰胺胶并进行Western blotting分析。Western blotting分析的抗体是GFP Rabbit MonoclonalAntibody(Beyotime,C.H.N.)，GFP的标准样品是Recombinant A.Victoria GFP protein(abcam,U.K.)，结果如图3所示。结果显示，转基因家蚕能够检测到GFP蛋白的表达。
④将G2代5龄幼虫第2天的转基因家蚕丝腺解剖，置于载玻片上，使用OlympusMacroViewMVX10-AUTO荧光立体显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)，检测并观察EGFP表达及存在位置，结果如图4所示。结果显示，转基因家蚕丝腺内能观察到绿色荧光。
⑤冷冻切片的组织学检查：取G2代五龄五天的丝腺放于10vol.％福尔马林中固定，后与茧丝分别包埋于Tissue-Tek O.C.T.化合物(Sakura Finetechnical Co.,Ltd.)中并切成10μm厚薄片，利用荧光立体显微镜和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM或LSCM)对蚕丝和蚕丝单丝的冷冻切片进行EGFF的检测及存在位置的观察，结果如图5所示。结果显示，在丝腺和茧丝中均表达于丝素层中。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 重庆西蚕生物技术研究院有限公司；西南大学
<120> 一种家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2304
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori Linnaeus)
<400> 1
aagcttgttg tacaaaactg ccacacgcat ttttttctcc actgtaggtt gtagttacgc 60
gaaaacaaaa tcgttctgtg aaaattcaaa caaaaatatt ttttcgtaaa aacacttatc 120
aatgagtaaa gtaacaattc atgaataatt tcatgtaaaa aaaaaatact agaaaaggaa 180
tttttcatta cgagatgctt aaaaatctgt ttcaaggtag agatttttcg atatttcgga 240
aaattttgta aaactgtaaa tccgtaaaat tttgctaaac atatattgtg ttgttttggt 300
aagtattgac ccaagctatc acctcctgca gtatgtcgtg ctaattactg gacacattgt 360
ataacagttc cactgtattg acaataataa aacctcttca ttgacttgag aatgtctgga 420
cagatttggc tttgtatttt tgatttacaa atgttttttt ggtgatttac ccatccaagg 480
cattctccag gatggttgtg gcatcacgcc gattggcaaa caaaaactaa aatgaaacta 540
aaaagaaaca gtttccgctg tcccgttcct ctagtgggag aaagcatgaa gtaagttctt 600
taaatattac aaaaaaattg aacgatatta taaaattctt taaaatatta aaagtaagaa 660
caataagatc aattaaatca taattaatca cattgttcat gatcacaatt taatttactt 720
catacgttgt attgttatgt taaataaaaa gattaatttc tatgtaattg tatctgtaca 780
atacaatgtg tagatgttta ttctatcgaa agtaaatacg tcaaaactcg aaaattttca 840
gtataaaaag gttcaacttt ttcaaatcag catcagttcg gttccaactc tcaagatgag 900
agtcaaaacc tttgtgatct tgtgctgcgc tctgcaggtg agttaattat tttactatta 960
tttcagaagg tggccagacg atatcacggg ccacctgata ataagtggtc gccaaaacgc 1020
acagatatcg taaattgtgc catttgattt gtcacgcccg ggggggctac ggaataaact 1080
acatttattt atttaaaaaa tgaaccttag attatgtaac ttgtgattta tttgcgtcaa 1140
aagtaggcaa gatgaatcta tgtaaatacc tgggcagact tgcaatatcc tatttcaccg 1200
gtaaatcagc attgcaatat gcaatgcata ttcaacaata tgtaaaacaa ttcgtaaagc 1260
atcattagaa aatagacgaa agaaattgca taaaattata accgcattat taatttatta 1320
tgatatctat taacaattgc tattgccttt ttttcgcaaa ttataatcat tttcataacc 1380
tcgaggtagc attctgttac attttaatac attggtatgt gattataaca cgagctgccc 1440
actgagtttc tcgccagatc ttctcagtgg gtcgcgttac cgatcacgtg atagattcta 1500
tgaagcactg ctcttgttag ggctagtgtt agcaaattct ttcaggttga gtctgagagc 1560
tcacctaccc atcggagcgt agctggaata ggctaccagc taataggtag ggaaaacaaa 1620
gctcgaaaca agctcaagta ataacaacat aatgtgacca taaaatctcg tggtgtatga 1680
gatacaatta tgtactttcc cacaaatgtt tacataatta gaatgttgtt caacttgcct 1740
aacgccccag ctagaacatt caattattac tattaccact actaaggcag tatgtcctaa 1800
ctcgttccag atcagcgcta acttcgattg aatgtgcgaa atttatagct caatatttta 1860
gcacttatcg tattgattta agaaaaaatt gttaacattt tgtttcagta tgtcgcttat 1920
acaaatgcaa acatcaatga ttttgatgag gactattttg ggagtgatgt cactgtccaa 1980
agtagtaata caacagatga aataattaga gatgcatctg gggcagttat cgaagaacaa 2040
attacaacta aaaaaatgca acggaaaaat aaaaaccatg gaatacttgg aaaaaatgaa 2100
aaaatgatca agacgttcgt tataaccacg gattccgacg gtaacgagtc cattgtagag 2160
gaagatgtgc tcatgaagac actttccgat ggtactgttg ctcaaagtta tgttgctgct 2220
gatgcgggag catattctca gagcgggcca tacgtatcaa acagtggata cagcactcat 2280
caaggatata cgagcgattt cagc 2304
<210> 2
<211> 222
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori Linnaeus)
<400> 2
tgtggaattc ctagaagaca actagttgtt aaattcagag cactgccttg tgtgaattgc 60
taatttttaa tataaaataa cccttgtttc ttacttcgtc ctggatacat ctatgttttt 120
tttttcgtta ataaatgaga gcatttaagt tattgttttt aattactttt ttttagaaaa 180
cagatttcgg attttttgta tgcattttat ttgaatgtac ta 222
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagcttgttg tacaaaactg cc 22
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctatctaga gctgaaatcg ctcgtatatc cttg 34
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtacggatcc atgtggaatt cctagaagac 30
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgcgtcgac tagtacattc aaataaaatg catac 35
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctagtctaga atggtgagca agggcgagg 29
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtggatcc ttgtacagct cgtccatgcc g 31

Claims (8)

1.家蚕丝心蛋白重链表达系统或含有家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体在丝素层表达活性目的蛋白中的应用，其特征在于：所述家蚕丝心蛋白重链表达系统含有目的基因表达框，所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子3Fib-H P3；3’端为截短轻链结合位点LBS(s)；所述丝心蛋白重链启动子3Fib-H P3的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述截断轻链结合位点LBS(s)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框通过SalI和HindⅢ酶切位点连入pSLfa1180fa载体而得。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框连入pBac[3×P3DsRedaf]载体AscⅠ和FseⅠ酶切位点而得。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述重组载体由含有目的基因表达框连入pSLfa1180fa载体的SalI和HindⅢ酶切位点处而得。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表达系统制备方法如下：先将截断轻链结合位点LBS(s)通过BamHI和SalI酶切位点连入pSLfa1180fa载体获得pSL-LBS(s)质粒，再将目的基因通过XbaI和BamHI连入pSL-LBS(s)质粒获得含目的基因的过渡载体，最后将丝心蛋白重链启动子3Fib-H P3通过XbaI和HindⅢ连入含目的基因的过渡载体获得家蚕丝心蛋白重链表达系统pSL-LBS(s)-目的基因-Fib-H P3。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述丝心蛋白重链启动子3Fib-H P3由SEQID NO.3和SEQ ID NO.4为引物，含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述截断轻链结合位点LBS(s)由SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物，含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组载体制备方法如下：将权利要求2所述表达系统利用限制性酶AscⅠ和FseⅠ插入到piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]载体内形成最终的注射载体。
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