CN111500591B - 蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法。蜘蛛聚状腺丝蛋白基因为由络新妇蛛聚状腺丝1倍碱基重复单元以1‑8倍连续重复构成的基因序列，具有改良家蚕丝性能等应用；先构建家蚕合成分泌聚状腺丝蛋白的载体pBac‑ASG质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用转座子使荧光蛋白基因和聚状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛聚状腺丝蛋白的转基因家蚕；本发明发现了一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因的用途，并开发了一种新型家蚕蜘蛛仿生丝的改良家蚕丝性能的生产方法，降低生产成本，显著提高了蚕丝的机械性能。

Description

蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的 方法
技术领域
本发明涉及了一种基因的应用及其作用方法，尤其是涉及了一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因(ASG)改良家蚕丝性能的方法。
背景技术
蜘蛛丝是由蜘蛛丝腺分泌形成的蛋白聚合物，是一种多样化的材料家族，具有非凡的力学性能，如高拉伸强度和延展性。在自然界中，蜘蛛需要利用蛛丝来行使各种各样的功能，包括形成保护壳，支撑蛛网结构、繁殖后代和捕捉食物等。后纺亚目蜘蛛，又被称为圆网蜘蛛，这种蜘蛛占现存蜘蛛种类的93.9％，是最多样化的蜘蛛群，拥有七种分化形态的丝腺，包括大壶状腺、小壶状腺、鞭状腺、梨状腺、管状腺、葡状腺、聚状腺，每种丝腺体内可表达一种或多种独特的蛛丝蛋白基因，进而形成具有特定结构的蛛丝纤维或胶状物。
聚状腺丝(Aggregate silk glue)是由聚状腺分泌形成的含有长链糖蛋白的粘性液体，通常覆盖在捕获丝上，提高鞭状丝的韧性，协助捕捉猎物。与其他腺体相比，聚状腺的腺体要大很多，而且成对存在，是所有丝腺中最特殊的一类。研究报道，聚状腺丝素蛋白和其他类型蛛丝蛋白存在很大差异，基因序列中小片段基序(motif)结构多为NVNVN、QPGSG，这两种类型的motif是在其他蛛丝蛋白中未见报道。另有研究表明，当昆虫的表皮蜡质渗透到粘性胶中，可能由于范德华力和毛细管力的影响，猎物和粘性胶之间的粘附力比粘性胶和无蜡表面之间的粘附力强8倍，因此它被认为是最强的生物胶之一，即使在表面能很低的PTFE(聚四氟乙烯)上，也能保持很好的粘性。圆蛛科络新妇属蜘蛛络新妇(Nephilaclavipes)聚状腺丝蛋白(ASG)，由406个氨基酸组成，分子大小约45.2kDa，是目前已完整报道的唯一一类聚状腺丝蛋白。
由于蜘蛛具有异嗜行为，无法直接大规模获取天然蜘蛛丝，使得蜘蛛丝的广泛应用受到很大的限制。蚕丝是一种很有前途的生物降解材料，具有抗拉强度高、可生物降解性等特点，随着纺织领域和高新科技对蚕丝需求的增加，其应用层面不断扩大，促使研究人员致力于改变蚕丝纤维的性质，开发一种方便、可靠、具有较高强度和显著延展性的丝纤维材料。相比于在桑叶表面喷涂矿物质、强迫吐丝等费时费力的技术来说，家蚕生活周期短，饲养方便，丝素蛋白产量高，个体小，易饲养，易加工，特别是基于piggyBac的转基因家蚕品系发展越来越成熟，且家蚕吐丝特征与蜘蛛有很大的共通之处，这些优点使其非常有利于作为生物反应器来生产蛛丝蛋白。此外，家蚕饲养在我国有悠久的历史，技术非常深厚，发展和应用家蚕生物反应器生产有价值的蜘蛛丝非常符合我国国情。
现有技术中缺少了针对提高蚕丝性能的有效的转基因和处理方法和有效作用基因的发现。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于利用转基因家蚕技术将蜘蛛聚状腺丝(ASG)基因导入家蚕基因组内，并在家蚕后部丝腺细胞中特异表达，提供一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因来改良蚕丝性能的方法，开发出能合成分泌蜘蛛聚状腺丝蛋白的家蚕，通过家蚕丝腺细胞合成的蜘蛛聚状腺丝蛋白分泌到茧层中，直接获得蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料，为改良蚕丝力学性能提供新思路。
本发明发现并将重要应用价值的蛛丝基因导入家蚕基因组，利用丝腺器官具有高效合成蛋白质的能力，育成一批能够高效率大规模生产蛛丝蛋白，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系，大幅度提升蚕丝经济价值，开创蚕桑生产新局面，具有极大的经济效益和广阔的应用前景。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
一、一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用：
所述蜘蛛聚状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料的应用；所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白基因的碱基为由络新妇蛛聚状腺丝1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列。
络新妇蛛聚状腺丝(ASG)基因1倍碱基重复单元如SEQ ID NO.1，络新妇蛛聚状腺丝1倍碱基重复单元是从完整的络新妇蛛聚状腺丝(ASG)基因碱基序列中局部人工提取获得。
所述改良家蚕丝性能是提高蚕丝机械性能。
二、一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法：
该方法是构建改良家蚕丝力学性能的蜘蛛聚状腺丝蛋白(ASG)基因的表达框，表达框组成包含家蚕丝蛋白信号肽、蜘蛛聚状腺丝蛋白基因和丝蛋白polyA；然后构建带有表达框的质粒，然后将质粒导入到家蚕基因组中经多次培养续代培育成荧光基因和蜘蛛聚状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝蛋白的转基因家蚕，获得能够高效率大规模生产蜘蛛聚状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系；所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白(ASG)基因采用权利要求1所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白(ASG)基因。
所述的方法具体如下：
(1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌聚状腺丝蛋白的质粒pBac-ASG，质粒pBac-ASG包含有作为外源基因的聚状腺丝蛋白基因(ASG)和标记基因荧光蛋白的基因；
(2)采用显微注射转基因家蚕的方法将pBac-ASG质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1-2：1的比例导入家蚕产卵后2-8小时内的受精卵中，利用piggyBac转座子将聚状腺丝蛋白插入到家蚕基因组内；
(3)蚕卵孵化后再经多次培养续代育成荧光基因和聚状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝蛋白的转基因家蚕；
(4)通过家蚕丝腺细胞合成分泌聚状腺丝蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
由此获得能够高效率大规模生产蜘蛛聚状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系。
所述的质粒pBac-ASG是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质粒pBac-ASG包括piggyBac转座子的两个转座臂pBL和pBR以及两个转座臂PBL和PBR之间的两个功能表达框；一个功能表达框是IE1启动子启动的荧光蛋白基因表达框，另一个功能表达框是包含家蚕丝蛋白基因启动子、家蚕丝蛋白基因信号肽、蜘蛛聚状腺丝蛋白基因和家蚕丝蛋白基因polyA的表达框。
所述的辅助质粒pHA3PIG包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂pBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3Promoter-transposase-SV40。
所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝蛋白信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并经前部丝腺直到蚕茧。
所述的荧光蛋白基因包括绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因。
所述的家蚕丝蛋白包括丝素蛋白重链、丝素蛋白轻链、丝素蛋白P25基因和和丝胶蛋白1基因。
本发明是先构建家蚕合成分泌聚状腺丝蛋白的载体pBac-ASG质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用转座子使荧光蛋白基因和聚状腺丝蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，育成分泌蜘蛛聚状腺丝素蛋白的转基因家蚕。
本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕丝腺细胞特异地合成分泌蜘蛛聚状腺丝蛋白，开发了一种新型蚕丝-蜘蛛丝生产系统，降低生产成本，同时保证了重组蚕丝具有比家蚕丝更高的机械性能。
本发明具有的有益效果是：
本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕丝腺细胞特异地合成分泌络新妇聚状腺丝蛋白，改良蚕丝性能，简化提纯方法，降低生产成本，提高企业的生产效率和经济效益，提高蚕农的经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
pBac-ASG-EGFP质粒构建方法和步骤如下：
采用络新妇蜘蛛聚状腺丝蛋白(ASG)基因序列的8倍重复序列为目的序列，按照家蚕重链密码子偏好性进行优化，人工合成基因并克隆到载体pUC57上，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切该质粒，并与包含piggyBac转座子的左右臂、IE1启动子启动的绿色荧光基因表达框和丝素蛋白重链基因启动子启动的表达框质粒连接，构建成最终质粒pBac-ASG8H-EGFP。
将pBac-ASG8H-EGFP质粒及能够提供piggyBac转座酶的pHA3PIG质粒按浓度比2：1比例混合，溶解在0.5mM的磷酸缓冲液(pH＝7)中，总浓度为400ng/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产卵后2小时内的受精卵中，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，得到G1代。待转基因实验的G1代蚁蚕孵化后，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因阳性蚕，将其饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G2代。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选EGFP标志基因表达量高的的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使聚状腺丝蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G2代时，以5龄第3天转基因家蚕后部丝腺基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增ASG基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点上在第4条染色体处，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择绿色荧光表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成绿色荧光蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝素蛋白的转基因家蚕新品种。
提取转基因家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕聚状腺丝蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。
对转基因蚕丝的机械性能测定结果显示(见下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，转基因蚕丝的机械性能较对照有显著提升。
实施例1转基因家蚕Bm-ASG1茧丝机械性能测定结果
Figure BDA0002486174010000051
研究结果证明聚状腺丝蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种基因组的第4号染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌聚状腺丝素蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，能有效提高重组蚕丝机械性能。
从上述实施例可以看出，利用本发明方法，可以在家蚕后部丝腺细胞高效合成络新妇聚状腺丝蛋白，聚状腺丝蛋白可以像丝素蛋白一样由后部丝腺分泌进入中部丝腺，并进一步经过前部丝腺而分泌到蚕茧中，且性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够通过家蚕正常的吐丝结茧大量生产蜘蛛聚状腺丝蛋白-蚕丝复合材料，降低生产成本，改良蚕丝性能，提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。
实施例2：
采用络新妇蛛聚状丝2倍碱基重复单元构成的2个重复片段为目的序列，按照家蚕丝素蛋白密码子偏好性进行优化，人工合成基因并克隆到载体pUC57上，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切质粒，将目的片段连接到包含piggyBac转座子的左右臂、IE1启动子启动的绿色荧光基因表达框和丝素蛋白轻链基因启动子启动的表达框的质粒上，构成最终质粒pBac-ASG2L-EGFP。
将pBac-ASG2L-EGFP质粒及能够提供piggyBac转座酶的pHA3PIG质粒按浓度比1：1比例混合，溶解在0.5mM的磷酸缓冲液(pH＝7)中，总浓度为400ng/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产卵后2小时内的受精卵中，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，得到G1代。待转基因实验的G1代蚁蚕孵化后，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因阳性蚕1区，将其饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G2代。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选EGFP标志基因表达量高的的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使聚状腺丝素蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G2代时，以5龄第3天转基因家蚕后部丝腺基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增ASG基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点在第14条染色体上，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择绿色荧光表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成绿色荧光蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝蛋白的转基因家蚕新品种。
提取转基因家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕聚状腺丝蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。
对转基因蚕丝的机械性能测定结果显示(见下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，转基因蚕丝的机械性能较对照有显著提升。
实施例2转基因家蚕Bm-ASG2茧丝机械性能测定结果
Figure BDA0002486174010000061
研究结果证明聚状腺丝素蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种基因组的第14号染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌聚状腺丝素蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，能有效提高重组蚕丝机械性能。
从上述实施例可以看出，利用本发明方法，可以在家蚕后部丝腺细胞高效合成络新妇聚状腺丝蛋白，聚状腺丝蛋白可以像丝素蛋白一样由后部丝腺分泌进入中部丝腺，并进一步经过前部丝腺而分泌到蚕茧中，且性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够通过家蚕正常的吐丝结茧大量生产蜘蛛聚状腺丝蛋白-蚕丝复合材料，降低生产成本，改良蚕丝性能，提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。
实施例3：
采用络新妇蛛聚状丝4倍碱基重复单元构成的片段为目的序列，按照家蚕丝素密码子偏好性进行优化，人工合成基因并克隆到载体pUC57上，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切质粒，将该片段连接到包含有piggyBac转座子的左右臂、IE1启动子启动的红色荧光基因表达框和丝素P25蛋白基因启动子启动的表达框的质粒上，获得最终转基因质粒pBac-ASG4P-DsRed。
将pBac-ASG4P-DsRed质粒及能够提供piggyBac转座酶的pHA3PIG质粒按浓度比2：1比例混合，溶解在0.5mM的磷酸缓冲液(pH＝7)中，总浓度为400ng/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产卵后2小时内的受精卵中，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，得到G1代。待转基因实验的G1代蚁蚕孵化后，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因阳性蚕，将其饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G2代。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选DsRed标志基因表达量高的的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使聚状腺丝素蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G2代时，以5龄第3天转基因家蚕后部丝腺基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增ASG基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点在第12条染色体上，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择红色荧光表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成红色荧光蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝蛋白的转基因家蚕新品种。
提取转基因家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕聚状腺丝蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。
对转基因蚕丝的机械性能测定结果显示(见下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，转基因蚕丝的机械性能较对照有显著提升。
实施例3转基因家蚕Bm-ASG3茧丝机械性能测定结果
Figure BDA0002486174010000081
研究结果证明聚状腺丝蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种基因组的第12号染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌聚状腺丝素蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，能有效提高重组蚕丝机械性能。
从上述实施例可以看出，利用本发明方法，可以在家蚕后部丝腺细胞高效合成络新妇聚状腺丝蛋白，聚状腺丝蛋白可以像丝素蛋白一样由后部丝腺分泌进入中部丝腺，并进一步经过前部丝腺而分泌到蚕茧中，且性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够通过家蚕正常的吐丝结茧大量生产蜘蛛聚状腺丝蛋白-蚕丝复合材料，降低生产成本，改良蚕丝性能，提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。
实施例4：
采用络新妇蛛聚状丝2倍碱基重复单元片段为目的序列，按照家蚕丝蛋白基因密码子偏好性进行优化，人工合成基因并克隆到载体pUC57上，用限制性内切酶AgeI和NheI双酶切质粒，将该片段连接到包含piggyBac转座子的左右臂、IE1启动子启动的绿色荧光基因表达框和丝胶蛋白1基因启动子启动的表达框的质粒上构建最终质粒pBac-ASG2S-EGFP。
将pBac-ASG2S-EGFP质粒及能够提供piggyBac转座酶的pHA3PIG质粒按浓度比1.5：1比例混合，溶解在0.5mM的磷酸缓冲液(pH＝7)中，总浓度为400ng/μl，然后采用显微注射方法导入野生型家蚕品种Lan10的家蚕产卵后2小时内的受精卵中，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，得到G1代。待转基因实验的G1代蚁蚕孵化后，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因阳性蚕1区，将其饲养至成虫，转基因家蚕自交传代，是为G2代。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选EGFP标志基因表达量高的的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使聚状腺丝素蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。
在G2代时，以5龄第3天转基因家蚕中部丝腺基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增ASG基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点在第10号染色体上，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。
从G4代开始选择绿色荧光表型纯一的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成绿色荧光蛋白基因纯合、中部丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝素蛋白的转基因家蚕新品种。
提取转基因家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和Western blot技术分析转基因家蚕聚状腺丝素蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。
对转基因蚕丝的机械性能测定结果显示(见下表)，与用于对照的未导入任何质粒和辅助质粒的野生型家蚕品种Lan10相比，转基因蚕丝的机械性能较对照有显著提升。
实施例4转基因家蚕Bm-ASG4茧丝机械性能测定结果
Figure BDA0002486174010000091
研究结果证明聚状腺丝素蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种基因组的第10号染色体内，并能够在中部丝腺细胞合成分泌聚状腺丝蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达，能有效提高重组蚕丝机械性能。
从上述实施例可以看出，利用本发明方法，可以在家蚕中部丝腺细胞高效合成络新妇聚状腺丝蛋白，聚状腺丝蛋白可以像丝素蛋白一样由中部丝腺分泌并进一步经过前部丝腺而分泌到蚕茧中，且性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够通过家蚕正常的吐丝结茧大量生产蜘蛛聚状腺丝蛋白-蚕丝复合材料，降低生产成本，改良蚕丝性能，提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。
本发明涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1：络新妇蛛聚状腺丝1倍碱基重复单元
来源：人工合成
ATGTATACACATTATTTTAGCATTTTTATAGTCATCTTTACAGCTACTTTGATTGGTGTAGAAAGTACGGGTAAAACTGATGACAGCAGCACAAATGAAGTACAAAACATCGTTATAGAGAATGGATCCAGAGGTTGGCCATGGGACAAAGAAAAATCCAATTTTGTCTGCCCTTTACCTTTTGGGGTGTTTTCTGATGTAACAGATTGCTCTCGTTTTTACCTTTGTGTCGCGGGTGTAGCCAGTCGCAAAAAATGCCAGCGTGCGCAGCAGTTTGATAAATATAGAAAGAAATGTTTGCCCTTTATTATTGCTGTATGTGACAAAGGTGACGATGGTTCTTCTTCAACAGCCCCAACGACTACAACAAAAAAAGATGGCGACGACGAGAAATTTACATGCCCAAGTCTTATTGGTTTGTTCATGCATCCCAAAGACTGCTCAAAATATTATTCTTGCACCCTTTATATACCAACCTTGAAGTCGTGTCCTGACCTGCAATTATTTGATGGTGTCAAGTTGTCTTGTAAACCAGCGAAAGATGTTCATTGTGGAAACCGAAAAAGACCAGATGAATTAACTACTCCTGATGAAACAACAGCAGAAATTATACCTACTGAAGAACCCGAAACACCGAGTCCAGAAACAGAAGAACCCGAAACACCAAGTCCAGAAACAGAAGAACCCGAAACACCGAGTCCAGAAACAGAAGAACCCGAAACACCGAGTCCAGAAACAGAAGAACCCGAAACACCGAGTCCAGAAACAGAAGAACCAGAAACACCGAGTCCCGAAACACCGAGTCCGGAAACAGAAGAACCCGAAACACCGAGTCCAGAAACAGAAGAACCCGAAACACCGAGTCCAGAAACTGAAGAACCTGAAACACCGAGCCCAGAAACTGAAGAACCCGAAACACCGAGCCCAGAAACAGAAGAACCCGAAACACCGAGTCCAGAAACGGAAGAACCAACAACTACACCAAAACCCCGTGTAACAGCTCCAGAAACAGATTGTGATGAAAATGATGTAGATTGCATCATCGACGATTTGGGAATAACCCCTGACTGGTTCAAATGTCCTGAAGATATAGGAAGTTATCCTCACCCAAGTAGCAAAAAATTATTCATCTTTTGCCTCAACTGGAAGCCATCGGTGAAAAAGTGCGGACAAGATTTGATATTTTCTGAGGAACTGATGGCATGTGATCGACCTTATTAG
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用及其改良家蚕丝性能的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtatacac attattttag catttttata gtcatcttta cagctacttt gattggtgta 60
gaaagtacgg gtaaaactga tgacagcagc acaaatgaag tacaaaacat cgttatagag 120
aatggatcca gaggttggcc atgggacaaa gaaaaatcca attttgtctg ccctttacct 180
tttggggtgt tttctgatgt aacagattgc tctcgttttt acctttgtgt cgcgggtgta 240
gccagtcgca aaaaatgcca gcgtgcgcag cagtttgata aatatagaaa gaaatgtttg 300
ccctttatta ttgctgtatg tgacaaaggt gacgatggtt cttcttcaac agccccaacg 360
actacaacaa aaaaagatgg cgacgacgag aaatttacat gcccaagtct tattggtttg 420
ttcatgcatc ccaaagactg ctcaaaatat tattcttgca ccctttatat accaaccttg 480
aagtcgtgtc ctgacctgca attatttgat ggtgtcaagt tgtcttgtaa accagcgaaa 540
gatgttcatt gtggaaaccg aaaaagacca gatgaattaa ctactcctga tgaaacaaca 600
gcagaaatta tacctactga agaacccgaa acaccgagtc cagaaacaga agaacccgaa 660
acaccaagtc cagaaacaga agaacccgaa acaccgagtc cagaaacaga agaacccgaa 720
acaccgagtc cagaaacaga agaacccgaa acaccgagtc cagaaacaga agaaccagaa 780
acaccgagtc ccgaaacacc gagtccggaa acagaagaac ccgaaacacc gagtccagaa 840
acagaagaac ccgaaacacc gagtccagaa actgaagaac ctgaaacacc gagcccagaa 900
actgaagaac ccgaaacacc gagcccagaa acagaagaac ccgaaacacc gagtccagaa 960
acggaagaac caacaactac accaaaaccc cgtgtaacag ctccagaaac agattgtgat 1020
gaaaatgatg tagattgcat catcgacgat ttgggaataa cccctgactg gttcaaatgt 1080
cctgaagata taggaagtta tcctcaccca agtagcaaaa aattattcat cttttgcctc 1140
aactggaagc catcggtgaa aaagtgcgga caagatttga tattttctga ggaactgatg 1200
gcatgtgatc gaccttatta g 1221

Claims (6)

1.一种蜘蛛聚状腺丝蛋白基因序列的应用，其特征在于：
所述蜘蛛聚状腺丝蛋白基因在改良家蚕丝性能、家蚕转基因培养、利用家蚕合成分泌生产蜘蛛丝-蚕丝新型复合材料中的应用；所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白基因的序列为由络新妇蛛聚状腺丝基因1倍碱基重复单元以1-8倍连续重复构成的基因序列；所述络新妇蛛聚状腺丝基因1倍碱基重复单元如SEQ ID NO.1所示；
所述改良家蚕丝性能是提高蚕丝机械性能。
2.一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：
该方法是构建改良家蚕丝力学性能的蜘蛛聚状腺丝蛋白ASG基因的表达框，表达框组成包含家蚕丝蛋白信号肽、蜘蛛聚状腺丝蛋白基因和丝蛋白polyA；然后构建带有表达框的质粒，然后将质粒导入到家蚕基因组中经多次培养续代培育成荧光基因和蜘蛛聚状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝蛋白的转基因家蚕，获得能够生产蜘蛛聚状腺丝蛋白的家蚕品种，进而提高蚕丝的机械性能，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系；所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白ASG基因采用权利要求1中所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白基因。
3.根据权利要求2所述的一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白基因 在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝蛋白信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并经前部丝腺直到蚕茧。
4.根据权利要求2所述的一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的荧光基因为绿色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因。
5.一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的方法具体如下：
（1）采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌聚状腺丝蛋白的质粒pBac-ASG；所述的质粒pBac-ASG是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质粒pBac-ASG包括piggyBac转座子的两个转座臂pBL和pBR以及两个转座臂PBL和PBR之间的两个功能表达框；一个功能表达框是IE1启动子启动的荧光蛋白基因表达框，另一个功能表达框是包含家蚕丝蛋白基因启动子、家蚕丝蛋白基因信号肽、蜘蛛聚状腺丝蛋白ASG基因和家蚕丝蛋白基因polyA的表达框；所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白ASG基因采用权利要求1中所述的蜘蛛聚状腺丝蛋白基因；
（2）采用显微注射转基因家蚕的方法将pBac-ASG质粒及能够提供piggyBac 转座酶的辅助质粒pHA3PIG按浓度比1-2：1的比例导入家蚕产卵后2-8小时内的受精卵中，利用piggyBac转座子将聚状腺丝蛋白插入到家蚕基因组内；所述的辅助质粒pHA3PIG包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂pBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3 Promoter-transposase- SV40；
（3）蚕卵孵化后再经多次培养续代育成荧光基因和聚状腺丝蛋白基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌聚状腺丝蛋白的转基因家蚕；
（4）通过家蚕丝腺细胞合成分泌聚状腺丝蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
6.根据权利要求5所述的一种利用蜘蛛聚状腺丝蛋白基因改良家蚕丝性能的方法，其特征在于：所述的家蚕丝蛋白基因为丝素蛋白重链、丝素蛋白轻链、丝素蛋白P25基因或丝胶蛋白1基因。
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