CN105969801A - 用于表达t4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其应用与方法 - Google Patents

用于表达t4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其应用与方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其应用与方法。质粒以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包含有作为外源基因的T4连接酶基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因的功能表达框，质粒用分子生物学方法构建，且DDDDK与丝素轻链基因polyA之间含有ApaI和NheI专一性的两个酶切位点，采用ApaI和NheI双酶切通用型质粒，与T4连接酶基因连接后，与辅助质粒共同注射到家蚕受精卵内，利用转座子特性使绿色荧光蛋白基因和T4连接酶基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，获得转基因家蚕。本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕丝腺细胞特异地合成分泌T4连接酶蛋白。

Description

用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其应用与方 法
技术领域
本发明涉及一种家蚕合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用转基因技术的一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其应用与方法。
背景技术
piggyBac转座子最初是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368细胞株的基因组中分离得到的，是目前发现的转座活性最高的DNA转座子。piggyBac转座系统是一种非病毒载体，转座效率较高。与sleeping beauty相比，piggyBac载体容量较大，可携带18kb，可以实现多基因的共表达，且转座片段被切除后不会在原位点留下印迹(footprint)，基因组可以实现切除后精确修复，在可逆转基因的应用中具有重要作用。
piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器的研究开展了十几年，世界各国的科学家致力于外源基因的表达，已经建成了以丝素蛋白轻链启动子(Fib-L Promoter)、丝素蛋白重链启动子(Fib-H Promoter)和丝胶蛋白1启动子(Ser1 Promoter)表达外源蛋白的转基因家蚕丝腺生物反应器。
由于PiggyBac载体多数含有两个表达框，具有较多的元件和相同的酶切位点，所以，每次表达不同的外源基因时，需要从头构建质粒，组装启动子、信号肽、外源基因、polyA等结构，费时费力，工作效率低下。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒及其应用与方法，利用转基因家蚕技术将T4连接酶基因导入家蚕基因组内，并在家蚕丝腺细胞中特异表达，开发出能合成分泌单一的T4连接酶的家蚕。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
一、一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒：
所述质粒为piggy-8716质粒，其碱基序列如SEQ ID NO.1，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个分别包含有作为外源基因的T4连接酶基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因的功能表达框。
一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝胶蛋白1基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点、T4连接酶基因和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Ser1 promoter-Fibroin L chain signalpeptide-His 6-DDDDK-T4 Ligase-Fibroin L chain PolyA。
所述的piggy-8716质粒是用丝胶基因1启动子驱动T4 Ligase基因在家蚕中部丝腺特异性表达。
二、一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒的制备方法，包括以下步骤：
1)以带有ApaI酶切位点序列的T4连接酶5’端序列和带有NheI酶切位点序列的T4连接酶3’端序列为引物，以包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝胶蛋白1基因启动子-T4 Ligase基因-SV40([A3-EGFP-SV40]-[Serpromoter-T4 Ligase-SV40])的piggy-10522质粒为模板，其碱基序列如SEQ IDNO.2，通过PCR扩增获得长度为1536bp的T4连接酶基因，其碱基序列如SEQID NO.3；
2)用ApaI和NheI双酶切piggy-7192质粒，piggy-7192质粒的碱基序列如SEQ ID NO.4，得到长度为7190bp的包含[A3-EGFP-SV40]-[Ser1 promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA]和Amp抗性基因的基因序列；
3)连接步骤1)得到的T4连接酶基因和步骤2)得到的基因序列，得到含有[A3-EGFP-SV40]-[Ser1 promoter-FLSP-His 6-DDDDK-T4 Ligase-FLPA]和Amp抗性基因的piggy-8716质粒，其碱基序列如SEQ ID NO.1。
三、本发明所述通用型质粒在T4连接酶表达的应用。
四、一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒表达T4连接酶的方法，步骤如下：
采用分子生物学方法构建包含[A3-EGFP-SV40]-[Ser1 promoter-FLSP-DDDDK-T4 Ligase-FLPA]两个阅读框的piggy-8716质粒(其碱基序列如SEQ ID NO.1)，作为在家蚕后部丝腺中表达的T4连接酶基因载体，该质粒以piggyBac转座子为基础包含有作为外源基因的T4连接酶基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因表达框；
(1)采用显微注射的方法，将piggy-8716质粒(其碱基序列如SEQ ID NO.1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用piggy-8716质粒中的piggyBac转座子将T4连接酶基因插入到家蚕基因组内；
(2)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代一龄第二天，通过荧光体视显微镜观察筛选出体色表达绿色荧光EGFP标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；
(3)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达绿色荧光EGFP标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
(4)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达绿色荧光EGFP标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；
(5)从G4代开始并经连续3代采用绿色荧光体色的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成绿色荧光基因和T4 Ligase基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌T4 Ligase的转基因家蚕；
(6)通过家蚕丝腺细胞合成分泌T4 Ligase，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
所述的制备方法中的piggy-8716质粒是用丝胶蛋白1基因启动子驱动T4Ligase基因在家蚕中部丝腺特异性表达。
所述步骤(6)的T4连接酶基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并随吐丝行为分泌到蚕茧。
本发明是先构建家蚕合成分泌T4连接酶基因的载体piggy-8716，再利用显微注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒(如图2所示)一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使绿色荧光蛋白基因和T4连接酶基因导入到家蚕基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种能够在家蚕丝腺细胞特异性合成分泌T4连接酶的转基因家蚕，自交使T4连接酶基因纯合，育成能分泌T4连接酶的转基因家蚕，然后利用该种家蚕合成分泌T4连接酶。
本发明具有的有益效果是：
本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕丝腺细胞特异地合成分泌T4连接酶，T4连接酶具有功能活性。本发明开发了一种新型的T4连接酶生产工艺，为大量生产T4连接酶奠定了基础。
附图说明
图1是本发明的piggy-8716质粒结构图。
图2是能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒结构图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明的实施例如下：
A)制备本发明质粒：
以带有ApaI酶切位点序列的T4连接酶5’端序列和带有NheI酶切位点序列的T4连接酶T4连接酶3’端序列为引物，以含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝胶蛋白1基因启动子-T4 Ligase基因-SV40([A3-EGFP-SV40]-[Ser promoter-T4 Ligase-SV40])piggy-10522质粒(其碱基序列如SEQ ID NO.2)为模板，获得长度为1536bp的T4连接酶基因(其碱基序列如SEQ ID NO.3)，且该序列5’端含有ApaI酶切位点，3’端含有NheI酶切位点。
用ApaI和NheI双酶切piggy-7192(其碱基序列如SEQ ID NO.4)，得到含[A3-EGFP-SV40]-[Ser1 promoter--FLSP-His6-DDDDK-FLPA]和Amp抗性基因的7190bp的序列；连接上述两个获得的目的片段，得到含有[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter--FLSP-His6-DDDDK-T4 Ligase-FLPA]和Amp抗性基因的piggy-8716质粒(其碱基序列如SEQ ID NO.1)。
B)表达T4连接酶：
将上述构建的piggy-8716质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10μl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代一龄第二天，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察共获取表达EGFP标志基因的转基因阳性家蚕5个蛾区。
将转基因阳性家蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在一龄期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，进而培育得到G3代、G4代，使T4连接酶基因纯合。
在G4代时，随机取3个蛾区的5龄第3天家蚕各1条，提取后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增piggy-8716质粒在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示，T4连接酶基因分别插入到第5号染色体12517989处、第7号染色体13732041处和第19号染色体516550处，都是插入在基因间隔区，证明转座子已经插入到每一个转基因家蚕家系的基因组内。
表1 转基因阳性家蚕外源基因插入位点分析结果
从G5代开始选择EGFP基因型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，育成EGFP基因纯合、中部丝腺细胞能够合成分泌T4连接酶的转基因家蚕新品种。
提取上述测定插入位点的3个家系的家蚕茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和His6抗体的Western blot技术分析证明转基因家蚕能够表达T4连接酶。
综上可以看出，利用本发明方法可以用家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒快速、方便地构建转基因家蚕外源基因表达质粒，能够在家蚕丝腺细胞高效合成T4连接酶，T4连接酶可以像蚕丝一样由丝腺分泌进入腺腔，并进一步吐出蚕体。该性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够大量生产T4连接酶，能够提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其特征在于：
所述质粒为piggy-8716质粒，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR，以及两个转座臂之间的两个分别包含有作为外源基因的T4连接酶基因和作为标记基因的绿色荧光EGFP基因的功能表达框。
2.根据权利要求1所述的一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其特征在于：
一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝胶蛋白1基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点、T4连接酶基因和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Ser1promoter-Fibroin L chain signalpeptide-His 6-DDDDK-T4Ligase-Fibroin L chain PolyA。
3.根据权利要求2所述的一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒，其特征在于：所述的piggy-8716质粒是用丝胶基因1启动子驱动T4Ligase基因在家蚕中部丝腺特异性表达。
4.权利要求1～3任一所述的一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)以带有ApaI酶切位点序列的T4连接酶5’端序列和带有NheI酶切位点序列的T4连接酶3’端序列为引物，以包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝胶蛋白1基因启动子-T4Ligase基因-SV40的piggy-10522质粒为模板，其碱基序列如SEQ ID NO.2，获得长度为1536bp的T4连接酶基因；
2)用ApaI和NheI双酶切piggy-7192质粒，piggy-7192质粒的碱基序列如SEQ ID NO.4，得到长度为7190bp的包含[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-FLSP-His6-DDDDK-FLPA]和Amp抗性基因的基因序列；
3)连接步骤1)得到的T4连接酶基因和步骤2)得到的基因序列，得到含有[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-FLSP-His6-DDDDK-T4Ligase-FLPA]和Amp抗性基因的piggy-8716质粒。
5.根据权利要求1～3任一所述通用型质粒的应用，其特征在于：用于T4连接酶表达的应用。
6.一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒表达T4连接酶的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
(1)采用显微注射的方法，将piggy-8716质粒(其碱基序列如SEQ ID NO.1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用piggy-8716质粒中的piggyBac转座子将T4连接酶基因插入到家蚕基因组内；
(2)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代一龄第二天，通过荧光体视显微镜观察筛选出体色表达绿色荧光EGFP标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；
(3)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达绿色荧光EGFP标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；
(4)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达绿色荧光EGFP标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；
(5)从G4代开始并经连续3代采用绿色荧光体色的蛾区饲养、单蛾育和同蛾区蚕蛾交配的相同方法进行选择和交配，育成绿色荧光基因和T4Ligase基因纯合、丝腺细胞能够合成分泌T4Ligase的转基因家蚕；
(6)通过家蚕丝腺细胞合成分泌T4Ligase，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。
7.根据权利要求6所述的一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒表达T4连接酶的方法，其特征在于：所述的piggy-8716质粒是用丝胶蛋白1基因启动子驱动T4Ligase基因在家蚕中部丝腺特异性表达。
8.根据权利要求6所述的一种用于表达T4连接酶的家蚕中部丝腺生物反应器通用型质粒表达T4连接酶的方法，其特征在于：所述步骤(6)的T4连接酶基因在家蚕丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信号肽的作用下分泌到丝腺腺腔，并随吐丝行为分泌到蚕茧。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534542A (zh) * 2020-05-07 2020-08-14 西南大学 piggyBac转座子系统介导的真核生物转基因细胞系及构建方法
CN114480500A (zh) * 2022-03-04 2022-05-13 西南大学 一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102226202A (zh) * 2011-05-13 2011-10-26 浙江大学 家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法
CN104593413A (zh) * 2014-12-31 2015-05-06 浙江大学 利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法
CN104846011A (zh) * 2015-03-18 2015-08-19 浙江大学 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102226202A (zh) * 2011-05-13 2011-10-26 浙江大学 家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法
CN104593413A (zh) * 2014-12-31 2015-05-06 浙江大学 利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法
CN104846011A (zh) * 2015-03-18 2015-08-19 浙江大学 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
钟伯雄等: "piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展", 《中国农业科学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111534542A (zh) * 2020-05-07 2020-08-14 西南大学 piggyBac转座子系统介导的真核生物转基因细胞系及构建方法
CN114480500A (zh) * 2022-03-04 2022-05-13 西南大学 一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法
CN114480500B (zh) * 2022-03-04 2023-09-08 西南大学 一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法

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