CN104593413A

CN104593413A - 利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法

Info

Publication number: CN104593413A
Application number: CN201410853601.7A
Authority: CN
Inventors: 钟伯雄; 钱秋杰; 叶露鹏; 尤征英; 车家倩; 王少华; 宋佳; 张玉玉
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2015-05-06

Abstract

本发明公开了一种利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法。先构建家蚕合成分泌人血清白蛋白的载体pBHSA质粒，再利用显微注射将质粒与辅助质粒导入到家蚕受精卵内，用piggyBac转座子使红色荧光蛋白基因和人血清白蛋白基因导入到家蚕基因组内，并稳定遗传和表达，制成转基因家蚕，自交使人血清白蛋白基因纯合，育成分泌人血清白蛋白的转基因家蚕。本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，利用该家蚕后部丝腺细胞特异地合成分泌人血清白蛋白，改善人血清白蛋白生产工艺，简化提纯方法，降低生产成本，为提高人血清白蛋白的生产效率、降低生产成本奠定基础，保证人血清白蛋白制品的生物安全性。

Description

利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种家蚕合成分泌外源蛋白的方法，尤其是涉及利用转基因技术的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法。

背景技术

成熟的人血清白蛋白分子由585个氨基酸残基组成，分子量为66.5KDa，是一种可溶性的非糖基化球蛋白。人血清白蛋白存在于人血清中，占血清总蛋白量的50％以上，具有维持人体血液胶体渗透压，以及运输代谢产物和化学药物的作用。人血清白蛋白在现代医学中是一个重要的生物制品，用于血容量扩充剂，补充人体蛋白质，维持正常的血液循环。对于因失血、创伤及烧伤等引起的休克，脑水肿及大脑损伤所致的脑压升高，防治低蛋白血症、肝硬化、肾病等有特殊的疗效。人血清白蛋白还具有解毒作用，参与脂类代谢、血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等。目前，全球白蛋白销售量高达600吨，每年销售额为30亿美元以上。中国市场1999年销售量为66吨，年销售额在30亿元人民币左右。国内目前人血清白蛋白的市场缺口约10亿元人民币。在1999年北京、天津、上海、南京、西安等10个地区98家医院的药品使用金额排行榜中，人血清白蛋白排列第二位，并根据动态统计被列为具有发展余地大、进口量比重大、进口额高的几十种药品的首位。

人血清白蛋白在人类的医疗过程中起着重要作用，但白蛋白药品市场的现状却令人担忧。目前人血清白蛋白的主要来源仍然是采用人血分离纯化获得，但献血人群中常常存在乙肝、丙肝、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)等血液传播性疾病患者，生产白蛋白的过程中不可避免地会把一些病原物质带入最后成品，而目前国内的技术手段还不能对产品进行多次提纯，市售的白蛋白纯度为95—97％，致使静脉滴注后过敏反应频繁发生。

家蚕饲养在我国有悠久的历史，技术非常深厚，发展和应用家蚕生物反应器生产广大群众用得起的生物药物非常符合我国国情。所以，将重要经济价值的基因导入家蚕基因组，利用丝腺器官具有高效合成蛋白质的能力，育成一批能够高效率大规模生产高附加值的外源蛋白，并依靠家蚕本身的繁殖续代能力维持家蚕种系，大幅度提升家蚕经济价值，开创蚕桑生产新局面，具有极大的经济效益和广阔的应用前景。

家蚕后部丝腺分泌合成的蚕丝蛋白占整个茧层重的70％-80％，表达效率高，并且具有组织特异性表达的特点。后部丝腺表达的可溶性人血清白蛋白可以直接用磷酸盐缓冲液提取，有利于人血清白蛋白保持生物活性，而且能够方便提纯。利用高效、优质、安全的转基因家蚕丝腺生物反应器生产人血清白蛋白，是利国利民的新举措。

发明内容

本发明的目的在于利用转基因家蚕技术将人血清白蛋白基因导入家蚕基因组内，并在家蚕后部丝腺细胞中特异表达，提供一种利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法，开发出能合成分泌人血清白蛋白的家蚕，通过家蚕后部丝腺细胞分泌的人血清白蛋白可以在茧层中用磷酸盐缓冲液直接提取，为提高人血清白蛋白的生产效率、降低生产成本奠定基础。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：

(1)采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌人血清白蛋白的质粒pBHSA，质粒pBHSA包含有作为外源基因的人血清白蛋白基因；

(2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBHSA质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用piggyBac转座子将人血清白蛋白基因插入到家蚕基因组内；

(3)蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；

(4)G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；

(5)G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；

(6)从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育，同蛾区蚕蛾交配，经连续3代同样方法的选择、交配，育成红眼基因和人血清白蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌人血清白蛋白的转基因家蚕；

(7)通过家蚕后部丝腺细胞合成分泌人血清白蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。

如图1所示，所述的质粒pBHSA是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因以用于质粒的扩增和筛选，质粒pBHSA包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以用于目的片段转座以及两个转座臂PBL和PBR之间的两个功能表达框，一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3Promoter–DsRed-SV40，以用作转基因阳性家蚕的筛选标记；另一个功能表达框是包含蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六个组氨酸标签His-Tag、肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列、人血清白蛋白基因(HAS编码基因)和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Fibroin Lchain Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His tag-DDDDK-HSA-Fibroin Lchain PolyA，六个组氨酸标签His-Tag用于提纯外源蛋白，肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列用于去除六个组氨酸标签。

如图2所示，所述的辅助质粒pHA3PIG质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂PBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3Promoter-transposase-SV40。

所述的人血清白蛋白基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信号肽的作用下，分泌到后部丝腺腺腔，并依次进入中部丝腺和前部丝腺，直到蚕茧。

本发明是先构建家蚕合成分泌人血清白蛋白的载体pBHSA质粒，再利用显微注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使红色荧光蛋白基因和人血清白蛋白基因导入到家蚕基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种能够在家蚕后部丝腺细胞特异性合成分泌人血清白蛋白的转基因家蚕，自交使人血清白蛋白基因纯合，育成能分泌人血清白蛋白的转基因家蚕，然后利用该种家蚕合成分泌人血清白蛋白。

本发明具有的有益效果是：

本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕后部丝腺细胞特异地合成分泌人血清白蛋白，改善人血清白蛋白生产工艺，简化提纯方法，降低生产成本，提高企业的生产效率和经济效益，提高蚕农的经济效益，保证人血清白蛋白制品的生物安全性。

附图说明

图1是本发明pBHSA质粒结构图。

图2是能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒结构图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明的实施例如下：

实施例1：

A)pBHSA质粒构建方法和步骤如下：

根据人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)基因序列，设计包含肠激酶酶切位点的扩增人血清白蛋白的上游引物DDDDK-HAS-F如SEQ ID NO.17所示：5’-gatgatgatgataaggatgctcacaagagtgaggt-3’；下游引物HAS-R如SEQ ID NO.18所示：5’-ttagagacctaaggcagcttgactt-3’，采用PCR技术扩增HSA基因。HSA PCR反应体系如表1所示，HSA PCR反应条件如表2所示。

表1HSA PCR反应体系

名称	成分
		PrimeSTAR HS Polymerase	0.25ul
5×PrimeSTAR Buffer	2.5ul
		dNTP Mixture	2ul
上游引物DDDDK-HSA-F	1ul
		下游引物HSA-R	1ul
HSA质粒	0.1ul
		ddH₂O	up to 25

表2HSA PCR反应条件

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳回收后插入到PMD-19质粒中，并挑选阳性菌落测序，测序正确的质粒标记为pHSA-PMD19。p7801质粒为本实验室构建保存，该质粒包含piggyBac转座子的左右臂、3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因和丝素蛋白轻链基因启动子。pHSA-PMD19和p7801质粒用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切，琼脂糖电泳后回收目的片段进行连接，获得质粒pBH。人工合成一段DNA序列，该序列包括丝素蛋白轻链信号肽序列和His6标签序列，以及5’端3’端的BamHI和XbaI酶切位点，命名为pFLSP-His6质粒，该质粒序列如SEQ ID NO.19所示：ggatccatgaagcctatatttttggtattactcgtcgttacaagcgcctacgctgcaccacatcatcatcatcatcatcctctaga。将pBH和pFLSP-His6质粒用BamHI和XbaI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段并连接获得pBSP-H质粒。设计上游引物PA-F如SEQ ID NO.20所示：gtcgacataagaactgtaaataatgtatata和下游引物PA-R如SEQ ID NO.21所示：aagcttcttaaggtgtgactgcttcggactacattct，PCR扩增家蚕品种P50基因组丝素蛋白轻链基因3’polyA序列。丝素轻链Poly A PCR反应体系如表3所示，丝素轻链Poly A PCR反应条件如表4所示。

表3丝素轻链Poly A PCR反应体系

名称	成分
		PrimeSTAR HS Polymerase	0.25ul
5×PrimeSTAR Buffer	2.5ul
		dNTP Mixture	2ul
上游引物PA-F	1ul
		下游引物PA-R	1ul
Lan10基因组	0.5ul
		ddH₂O	up to 25ul

表4丝素轻链Poly A PCR反应条件

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后连接到PMD-19载体中，并挑选阳性菌落测序，测序结果正确的质粒命名为pFLPA质粒。将pBSP-H和pFLPA质粒用SalI和HindⅢ双酶切，酶切产物经电泳回收目的片段后连接，获得pBSP–H-PA质粒。将7801和pBSP–H-PA质粒用EcoRI和AflⅡ双酶切后电泳回收目的片段，连接获得最终质粒pBHSA，如SEQ ID NO.25所示。

B)将pBHSA质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4μg/μl，质粒溶解在pH＝7、0.5mM的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为10nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85％湿度条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代，是为G1代。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕1蛾，含有转基因阳性蚕4条，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代，是为G2。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使人血清白蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。

在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增HSA基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是在Bm_scaf 10、第10号染色体3969832处，插入位点的左侧序列如SEQ ID NO.22所示：AAATGAAACGGACAATGAAATGAATGAATTAGGGTCATTATGAATATAATAGAATTGCACTTTTCTCGTGTTGGTTTAGATACGGACCAAAACTCACGGCCCGCTTAA--piggyBac，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。

从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，经连续3代选择、交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌人血清白蛋白的转基因家蚕新品种，定名为HSA1。

提取HSA1家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和His Tag标签抗体的Western blot技术分析转基因家蚕HSA蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，人血清白蛋白占蛋白溶液中总蛋白含量达29.1％，占茧层重的2.11％，即每克茧子中可获得21.1mg人血清白蛋白。

采用磷酸缓冲液提取蚕茧可溶性蛋白，利用His Tag的特性，用GE公司的AKTA Purifier蛋白纯化仪、Ni离子柱对血清白蛋白进行亲和层析纯化，在结合缓冲液为20mM磷酸缓冲液、500mM NaCl、pH＝8.0；洗脱缓冲液为20mM磷酸缓冲液、500mM NaCl、500mM咪唑、pH＝6.8；咪唑浓度梯度洗脱情况下，获得纯化的人血清白蛋白。

研究结果证明人血清白蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种HSA1基因组的第10染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌人血清白蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。蚕茧中的人血清白蛋白能够用磷酸缓冲液提取，用Ni离子柱亲和层析纯化。

实施例2：

A)pBHSA质粒构建方法和步骤如实施例1。

B)将pBHSA质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.5μg/μl，质粒溶解在pH＝7、含有5mM氯化钠的0.5mM磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后5小时以内的受精卵内，导入总体积为5nl。将显微注射的蚕卵在25℃，80％湿度，12h光照条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕杂交传代(G1代)。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕1蛾，含有转基因阳性蚕15条，将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代(G2)。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使人血清白蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。

在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增HSA基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是在Bm_scaf 31、第23号染色体6253515处，插入位点的左侧序列如SEQ ID NO.23所示：GATCTGACCGATAAAAGAGCAATGGACTTGACCACGGGAGATTCATGGCGAATTGACAACGCAAAGTTGATTCCTGTAACTAGTGTAGAAGCTTAGGAGTTAGTACGTACATTGTGTATTGCGATTTAA--piggyBac，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。

从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，经连续3代选择、交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌人血清白蛋白的转基因家蚕新品种，定名为HSA4。

提取HSA4家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和His Tag标签抗体的Western blot技术分析转基因家蚕HSA蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，人血清白蛋白占蛋白溶液中总蛋白含量达22.1％，占茧层重的1.33％，即每克茧子中可获得13.3mg人血清白蛋白。

研究结果证明人血清白蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种HSA4基因组的第23染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌人血清白蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。蚕茧中的人血清白蛋白能够用磷酸缓冲液提取，用Ni离子柱亲和层析纯化。

实施例3：

A)pBHSA质粒构建方法和步骤如实施例1。

B)将pBHSA质粒(图1)及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.45μg/μl，质粒溶解在pH＝7、含有4mM氯化钠的0.6mM磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后4小时以内的受精卵内，导入总体积为12nl。将显微注射的蚕卵在25℃，85％湿度，12h光照条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕交配续代(G1代)。在转基因实验的G1代卵转青期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达DsRed标志基因的转基因家蚕1蛾，含有转基因阳性蚕2条。将蚕饲养至成虫与非转基因家蚕杂交传代(G2)。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在卵期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达DsRed标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，同蛾区交配，使人血清白蛋白基因纯合，进而培育得到G3代、G4代。

在G3代时，取5龄第3天家蚕后部丝腺细胞基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增HSA基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示插入位点是在Bm_scaf 67、第12号染色体17505736处，插入位点的左侧序列如SEQ ID NO.24所示：GATCGGATTCAAGTGAAATCGAAGAGCGCCAAGCAAAGCGGGTCGGGTTTGATTACAAAAGCGAAAACATAACTGAGTTTGGTACGCTTTGACGTCATAGCTTCTCAATCGACCATCGTGAAATTGAAGTTTCACAGTGTCAAAGAGAAAAAGATATAGAGTAAACAAGGGCTCGAAAAAAAACTACTTCTGACGCAAATATAATATTTCACTTTAGTACCTTATCAGCTAGTACTTACTGTTTATCCAATAAATGCTCTTATTCAGAATTAATATGCCACTTAGGTATGTGTTTCTTTAGAATTAGAATTTAGGAATCTGTCAACAGGATTTGAGCACCAAGATATTTTAATTTTGAAGGAAATAAATATCTGCCTCATTAA--piggyBac，证明转座子已经插入到家蚕基因组内。

从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用同蛾区蚕蛾交配，经连续3代选择、交配，育成红眼基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌人血清白蛋白的转基因家蚕新品种，定名为HSA5。

提取HSA5家蚕的茧丝蛋白为材料，采用SDS-PAGE电泳和His Tag标签抗体的Western blot技术分析转基因家蚕HSA蛋白的表达情况，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。SDS-PAGE电泳条带灰度分析显示，人血清白蛋白占蛋白溶液中总蛋白含量达28.2％，占茧层重的1.79％，即每克茧子中可获得17.9mg人血清白蛋白。

研究结果证明人血清白蛋白基因已插入到转基因家蚕新品种HSA5基因组的第12染色体内，并能够在后部丝腺细胞合成分泌人血清白蛋白，该蛋白能够随吐丝结茧行为进入蚕茧，此性状已稳定遗传和表达。蚕茧中的人血清白蛋白能够用磷酸缓冲液提取，用Ni离子柱亲和层析纯化。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

从上述3个实施例可以看出，利用本发明方法，可以在家蚕后部丝腺细胞高效合成人血清白蛋白，人血清白蛋白可以像蚕丝一样由后部丝腺分泌进入中部丝腺，并进一步经过前部丝腺而吐出蚕体，可以采用磷酸缓冲液提取，采用AKTAPurifier蛋白纯化仪纯化。该性状已能够稳定表达并遗传。采用本方法能够明显改善人血清白蛋白生产工艺，简化提纯方法，降低生产成本，保证人血清白蛋白制品的生物安全性。能够提高蚕桑经济效益，提高蚕农收入。

本发明上述涉及的基因和氨基酸序列具体如下：

piggyBac转座子的左转座臂(PBL)碱基序列如SEQ ID NO.1所示，piggyBac转座子的右转座臂(PBR)碱基序列如SEQ ID NO.2所示；3×P3启动子碱基序列如SEQ ID NO.3所示；DsRed红色荧光蛋白编码基因的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；SV40Poly A碱基序列如SEQ IDNO.6所示，家蚕丝素蛋白轻链基因(FL)启动子碱基序列如SEQ ID NO.7所示；六个组氨酸标签(His-Tag)的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQID NO.9所示；肠激酶酶切位点(DDDDK)的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQID NO.10和SEQ ID NO.11所示；丝素蛋白轻链基因(FL)信号肽的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，HAS编码基因的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，家蚕丝素蛋白轻链基因(FL)3’末端序列如SEQ ID NO.16所示；上游引物DDDDK-HAS-F如SEQ ID NO.17所示，下游引物HAS-R如SEQ ID NO.18所示，pFLSP-His6质粒如SEQ ID NO.19所示，上游引物PA-F如SEQ ID NO.20所示，下游引物PA-R如SEQ ID NO.21所示，pBHSA质粒碱基序列如SEQ ID NO.25所示；实施例1的HSA基因插入位点的左侧序列如SEQ ID NO.22所示，实施例2的HSA基因插入位点的左侧序列如SEQ ID NO.23所示，实施例3的HSA基因插入位点的左侧序列如SEQ ID NO.24所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法

<130> 123456

<160> 25

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 379

<212> DNA

<213> piggyBac转座子的左转座臂

<400> 1

ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60

tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt ttgcaattta ggacatctca gtcgccgctt 120

ggagctcggc tgaggcgtgc ttgtcaatgc ggtaagtgtc actgattttg aactataacg 180

accgcgtgag tcaaaatgac gcatgattat cttttacgtg acttttaaga tttaactcat 240

acgataatta atattgttat ttcatgttct acttacgtga taacttatta tatatatatt 300

ttcttgttat agatatcgtg actaatatat aataaaatgg gatgttcttt agacgatgag 360

catatcctct ctgctcagc 379

<210> 2

<211> 239

<212> DNA

<213> piggyBac转座子的右转座臂

<400> 2

aaagttttgt tactttagaa gaaattttga gtttttgttt ttttttaata aataaataaa 60

cataaataaa ttgtttgttg aatttattat tagtatgtaa gtgtaaatat aataaaactt 120

aatatctatt caaattaata aataaacctc gatatacaga ccgataaaaa cacatgcgtc 180

aattttacgc atgattatct ttaacgtacg tcacaatatg attatctttc tagggttaa 239

<210> 3

<211> 263

<212> DNA

<213> 3×P3启动子

<400> 3

gcccggggat ctaattcaat tagagactaa ttcaattaga gctaattcaa ttaggatcca 60

agcttatcga tttcgaaccc tcgaccgccg gagtataaat agaggcgctt cgtctacgga 120

gcgacaattc aattcaaaca agcaaagtga acacgtcgct aagcgaaagc taagcaaata 180

aacaagcgca gctgaacaag ctaaacaatc ggggtaccgc tagagtcgac ggtaccgcgg 240

gcccgggatc caccggtcgc cac 263

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<211> 681

<212> DNA

<213> 红色荧光蛋白编码基因

<400> 4

atggtgcgct cctccaagaa cgtcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 60

ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 120

ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 180

atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg tgaagcaccc cgccgacatc 240

cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 300

gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccaa gactcctccc tgcaggacgg ctgcttcatc 360

tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag 420

accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc 480

gagatccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagtcc 540

atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact actacgtgga ctccaagctg 600

gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg caccgagggc 660

cgccaccacc tgttcctgta g 681

<210> 5

<211> 226

<212> PRT

<213> 红色荧光蛋白编码基因

<400> 5

Met Val Arg Ser Ser Lys Asn Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys

1 5 10 15

Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys

35 40 45

Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro

50 55 60

Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile

65 70 75 80

Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

85 90 95

Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser

100 105 110

Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val

115 120 125

Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp

130 135 140

Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly

145 150 155 160

Glu Ile His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val

165 170 175

Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly

180 185 190

Tyr Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp

195 200 205

Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu

210 215 220

Phe Leu

225

<210> 6

<211> 229

<212> DNA

<213> SV40的3'序列

<400> 6

agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac 60

acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg 120

cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 180

tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatctta 229

<210> 7

<211> 692

<212> DNA

<213> 家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因启动子

<400> 7

cgcatattgg acatcccttt tcttgacatc gtataaattc ggtaattctc ggtacggttc 60

ggaaagtgca cctgcggcta tattcagact cgccaagtta cgtcagtcgt attgtaatga 120

gcgatttagt gggcaacttc attctgttaa ttttgtgtca cggtgcgcgc gcatcgtaaa 180

atttcactct catagatttt tcataacgtg cctaaagaag tataacttca ataatttaaa 240

ttaaaaaaaa aaacatgcat agaataatta tatgaattat ttaaaatgtc atttaccgac 300

attgacataa cagacgacgt taacactaca aaacatttta attccacatt gttacatatt 360

caacagttaa atttgcgtta attctcgatg cgaacaaata taagaacaat cggatcaatt 420

agatcgcttt gtttcgagca acacttagtt taactagagg cgtacacctc aagaaatcat 480

cttcattaga aactaaacct taaaatcgca ataataaagc atagtcaatt ttaactgaaa 540

tgcaaaatct tttgaacgtt agatgctgtc agcgttcgtt ggtacagttg tttgatattt 600

attttaattg tctttttata tataaatagt ggaacattaa tcacggaatc ctgtatagta 660

tataccgatt ggtcacataa cagaccacta aa 692

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 六个组氨酸

<400> 8

catcatcatc atcatcat 18

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 六个组氨酸

<400> 9

His His His His His His

1 5

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 肠激酶酶切位点

<400> 10

gatgatgatg ataag 15

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 肠激酶酶切位点

<400> 11

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因信号肽

<400> 12

atgaagccta tatttttggt attactcgtc gttacaagcg cctacgctgc acca 54

<210> 13

<211> 18

<212> PRT

<213> 家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因信号肽

<400> 13

Met Lys Pro Ile Phe Leu Val Leu Leu Val Val Thr Ser Ala Tyr Ala

1 5 10 15

Ala Pro

<210> 14

<211> 1758

<212> DNA

<213> 人血清白蛋白

<400> 14

gatgctcaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60

gcattggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gctccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540

aagctcgatg aacttcggga tgaaggtaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600

gcaagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcagacctt 780

gctaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct tgagaagtgc 1080

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gctaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200

tacaaattcc agaatgcact attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500

gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gaactcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740

gctgccttag gtctctaa 1758

<210> 15

<211> 585

<212> PRT

<213> 人血清白蛋白

<400> 15

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 16

<211> 606

<212> DNA

<213> 家蚕P50品种的丝素蛋白轻链基因

<400> 16

ataagaactg taaataatgt atatatataa ttatataaaa gatatatata aaccatatac 60

aaacatatat atatcattat aagacaatct acctatataa aaacagacta aaattaataa 120

ttatgtatac tttaattgtg tttaggacat tttatgcaaa ttgtgtttgc gttaggattt 180

tttttggaag ttttttagat tatttatgaa tatataaata aatatacgtt aatataatat 240

atattatata aatcaacgac acggcttttc attttggtga tgatcaatct tattgttctt 300

ctaattgatt tttttgtaca ataaagatgt atccagtttt ccagataaag aatttagttt 360

gttatttctg gccccattaa aataagtacg gtattcgata ataccatata ccatacggca 420

tatacaatgg atttcggtgc tgttgtcaat tgctttccaa ctggagagac tgtatgcgat 480

ttttttcatg tattcggaga ttaagctgcg aaacatacaa aaatgtacct tattttttca 540

tcgcattagg cacaattcac tttaataaag cccctataac gagaatgtag tccgaagcag 600

tcacac 606

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 上游引物DDDDK-HAS-F

<400> 17

gatgatgatg ataaggatgc tcacaagagt gaggt 35

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 下游引物HAS-R

<400> 18

ttagagacct aaggcagctt gactt 25

<210> 19

<211> 86

<212> DNA

<213> pFLSP-His6质粒

<400> 19

ggatccatga agcctatatt tttggtatta ctcgtcgtta caagcgccta cgctgcacca 60

catcatcatc atcatcatcc tctaga 86

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 上游引物PA-F

<400> 20

gtcgacataa gaactgtaaa taatgtatat a 31

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 下游引物PA-R

<400> 21

aagcttctta aggtgtgact gcttcggact acattct 37

<210> 22

<211> 108

<212> DNA

<213> 实施例1的HSA基因插入位点的左侧序列

<400> 22

aaatgaaacg gacaatgaaa tgaatgaatt agggtcatta tgaatataat agaattgcac 60

ttttctcgtg ttggtttaga tacggaccaa aactcacggc ccgcttaa 108

<210> 23

<211> 129

<212> DNA

<213> 实施例2的HSA基因插入位点的左侧序列

<400> 23

gatctgaccg ataaaagagc aatggacttg accacgggag attcatggcg aattgacaac 60

gcaaagttga ttcctgtaac tagtgtagaa gcttaggagt tagtacgtac attgtgtatt 120

gcgatttaa 129

<210> 24

<211> 383

<212> DNA

<213> 实施例3的HSA基因插入位点的左侧序列

<400> 24

gatcggattc aagtgaaatc gaagagcgcc aagcaaagcg ggtcgggttt gattacaaaa 60

gcgaaaacat aactgagttt ggtacgcttt gacgtcatag cttctcaatc gaccatcgtg 120

aaattgaagt ttcacagtgt caaagagaaa aagatataga gtaaacaagg gctcgaaaaa 180

aaactacttc tgacgcaaat ataatatttc actttagtac cttatcagct agtacttact 240

gtttatccaa taaatgctct tattcagaat taatatgcca cttaggtatg tgtttcttta 300

gaattagaat ttaggaatct gtcaacagga tttgagcacc aagatatttt aattttgaag 360

gaaataaata tctgcctcat taa 383

<210> 25

<211> 8448

<212> DNA

<213> pBHSA质粒碱基序列

<400> 25

gatctgagct cgcccgggga tctaattcaa ttagagacta attcaattag agctaattca 60

attaggatcc aagcttatcg atttcgaacc ctcgaccgcc ggagtataaa tagaggcgct 120

tcgtctacgg agcgacaatt caattcaaac aagcaaagtg aacacgtcgc taagcgaaag 180

ctaagcaaat aaacaagcgc agctgaacaa gctaaacaat cggggtaccg ctagagtcga 240

cggtaccgcg ggcccgggat ccaccggtcg ccaccatggt gcgctcctcc aagaacgtca 300

tcaaggagtt catgcgcttc aaggtgcgca tggagggcac cgtgaacggc cacgagttcg 360

agatcgaggg cgagggcgag ggccgcccct acgagggcca caacaccgtg aagctgaagg 420

tgaccaaggg cggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtccccccag ttccagtacg 480

gctccaaggt gtacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacaagaag ctgtccttcc 540

ccgagggctt caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gtgaccgtga 600

cccaagactc ctccctgcag gacggctgct tcatctacaa ggtgaagttc atcggcgtga 660

acttcccctc cgacggcccc gtaatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctccaccg 720

agcgcctgta cccccgcgac ggcgtgctga agggcgagat ccacaaggcc ctgaagctga 780

aggacggcgg ccactacctg gtggagttca agtccatcta catggccaag aagcccgtgc 840

agctgcccgg ctactactac gtggactcca agctggacat cacctcccac aacgaggact 900

acaccatcgt ggagcagtac gagcgcaccg agggccgcca ccacctgttc ctgtagcggc 960

cgcgactcta gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 1020

acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 1080

tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 1140

aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttaaa 1200

gcttatcgat acgcgtacgg cgcgccaagc ttaaggtgtg actgcttcgg actacattct 1260

cgttataggg gctttattaa agtgaattgt gcctaatgcg atgaaaaaat aaggtacatt 1320

tttgtatgtt tcgcagctta atctccgaat acatgaaaaa aatcgcatac agtctctcca 1380

gttggaaagc aattgacaac agcaccgaaa tccattgtat atgccgtatg gtatatggta 1440

ttatcgaata ccgtacttat tttaatgggg ccagaaataa caaactaaat tctttatctg 1500

gaaaactgga tacatcttta ttgtacaaaa aaatcaatta gaagaacaat aagattgatc 1560

atcaccaaaa tgaaaagccg tgtcgttgat ttatataata tatattatat taacgtatat 1620

ttatttatat attcataaat aatctaaaaa acttccaaaa aaaatcctaa cgcaaacaca 1680

atttgcataa aatgtcctaa acacaattaa agtatacata attattaatt ttagtctgtt 1740

tttatatagg tagattgtct tataatgata tatatatgtt tgtatatggt ttatatatat 1800

cttttatata attatatata tacattattt acagttctta tgtcgacgat tttagagacc 1860

taaggcagct tgacttgcag caacaagttt tttaccctcc tcggcaaagc aggtctcctt 1920

atcgtcagcc ttgcagcact tctctacaaa agctgcgaaa tcatccataa cagctttcag 1980

ttgctctttt gttgccttgg gcttgtgttt cacgagttca acaagtgcag tttgtttctt 2040

gatttgtctc tccttctcag aaagtgtgca tatatctgca tggaaggtga atgtttcagc 2100

attaaactct ttgggaacgt atgtttcatc gacttccaga gctgaaaagc atggtcgcct 2160

gttcaccaag gattctgtgc agcatttggt gactctgtca cttactggcg ttttctcatg 2220

caacacacat aactggttca ggaccacgga tagatagtct tctgcacagg gcattctttt 2280

tgcttcagga tgtttacaac atttgctgcc cacttttcct aggtttcttg agacctctac 2340

aagagttgga gttgacactt ggggtacttt cttggtgtaa cgaactaata gtgcattctg 2400

gaatttgtac tctccaagct gctcaaaaag ctcacaattt tgtttgatta aattctgagg 2460

ctcttccaca agaggtttaa attcatcgaa cactttagca tagcattcat gaggatctgc 2520

agcggcacag cacttctcaa gagtggtttc atatgtcttg gcaagtctca gcagcagcac 2580

gacagagtaa tcaggatgcc ttcttgcata ttcatacaaa aacatgccca ggaagacatc 2640

ctttgcctca gcatagtttt tgcaaacatc cttactttca acaaaatcag cagctaatga 2700

aggcaagtca gcaggcatct catcattttc cacttcggca atgcagtggg atttttccaa 2760

cagaggtttt tcacagcatt ccttcagttt actggagatc gaatcttgat tttcacagat 2820

atacttagca aggtctgccc tgtcatcagc acattcaagc agatctccat ggcagcattc 2880

cgtgtggact ttggtaagat ctgtcactaa cttggaaact tctgcaaact cagctttggg 2940

aaatctctgg ctcaggcgag ctactgccca tgctttgaaa gctctttctc caaatttttg 3000

gagacttgca cacttgagtc tctgtttggc agacgaagcc ttaccttcat cccgaagttc 3060

atcgagcttt ggcaacaggc aggcagcttt atcagcagct tggcaacatt ctgtaaaagc 3120

agctttatac cttttagcaa agaaaaggag ttccggagca taaaagtaag gatgtcttct 3180

ggcaatttca tataagtatt ttttcaaaaa tgtctcttca ttgtcatgaa aagcagtgca 3240

catcacatca acctctggtc tcaccaatcg ggggaggttt gggttgtcat ctttgtgttg 3300

caagaagcat tcatttctct caggttcttg ttttgcacag cagtcagcca tttcaccata 3360

ggtttcacga agagttgcaa ctgtgcataa tttgtctcca aaaagggtat gaagtgattt 3420

gtcacaattt tcagctgact catcagcaac acatgttttt gcaaattcag ttacttcatt 3480

cactaatttt acatgatctt caaatggaca ctgctgaaga tactgagcaa aggcaatcaa 3540

caccaatgct ttgaaatttt cttctcccaa atctttaaac cgatgagcaa cctcactctt 3600

gtgagcatcc ttatcatcat catcatctct agaggatgat gatgatgatg atgtggtgca 3660

gcgtaggcgc ttgtaacgac gagtaatacc aaaaatatag gcttcatgga tcctttagtg 3720

gtctgttatg tgaccaatcg gtatatacta tacaggattc cgtgattaat gttccactat 3780

ttatatataa aaagacaatt aaaataaata tcaaacaact gtaccaacga acgctgacag 3840

catctaacgt tcaaaagatt ttgcatttca gttaaaattg actatgcttt attattgcga 3900

ttttaaggtt tagtttctaa tgaagatgat ttcttgaggt gtacgcctct agttaaacta 3960

agtgttgctc gaaacaaagc gatctaattg atccgattgt tcttatattt gttcgcatcg 4020

agaattaacg caaatttaac tgttgaatat gtaacaatgt ggaattaaaa tgttttgtag 4080

tgttaacgtc gtctgttatg tcaatgtcgg taaatgacat tttaaataat tcatataatt 4140

attctatgca tgtttttttt tttaatttaa attattgaag ttatacttct ttaggcacgt 4200

tatgaaaaat ctatgagagt gaaattttac gatgcgcgcg caccgtgaca caaaattaac 4260

agaatgaagt tgcccactaa atcgctcatt acaatacgac tgacgtaact tggcgagtct 4320

gaatatagcc gcaggtgcac tttccgaacc gtaccgagaa ttaccgaatt tatacgatgt 4380

caagaaaagg gatgtccaat atgcgctcga gctgagcaga gaggatatgc tcatcgtcta 4440

aagaacatcc cattttatta tatattagtc acgatatcta taacaagaaa atatatatat 4500

aataagttat cacgtaagta gaacatgaaa taacaatatt aattatcgta tgagttaaat 4560

cttaaaagtc acgtaaaaga taatcatgcg tcattttgac tcacgcggtc gttatagttc 4620

aaaatcagtg acacttaccg cattgacaag cacgcctcag ccgagctcca agcggcgact 4680

gagatgtcct aaattgcaaa cagcgacgga ttcgcgctat ttagaaagag agagcaatat 4740

ttcaagaatg catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc tagggttaaa aaagatttgc 4800

gctttacatc gacctaaact ttaaaacagt catagaatct tcgtttgaca aaaaccacat 4860

tgtggccaag ctgtgtggaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 4920

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 4980

gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 5040

ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 5100

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 5160

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 5220

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 5280

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 5340

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 5400

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 5460

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 5520

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 5580

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 5640

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 5700

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 5760

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 5820

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 5880

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 5940

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 6000

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 6060

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 6120

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 6180

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 6240

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 6300

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 6360

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 6420

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 6480

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 6540

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 6600

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 6660

ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 6720

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 6780

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 6840

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 6900

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 6960

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 7020

acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 7080

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aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 7200

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac 7260

tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac 7320

agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt 7380

tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 7440

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 7500

acggccagtg ccaagctttg tttaaaaata taacaaaatt gtgatcccac aaaataaagt 7560

ggggcaaaat taaataatta atagtgtctg taaacttgtt ggtcttcaac tttttgagaa 7620

acacgttgga cggcaaatct gtgactataa cacaagttga tttgataatt ttagccaaca 7680

cgtcgggctg cgtgtttttc accgacgcgt ctgtgtacac gttgattaat tggtcgatta 7740

aactgttgaa ataatttaat ttttggttct tctttaaatc tgtgatgaaa ttttttaaaa 7800

taactttaaa ttcttcattg gtaaaaaatg ccacgttttg caacttgtga gggtctaata 7860

tgaggtcaaa ctcagtagga gttttatcca aaaaagaaaa catgattacg tctgtacacg 7920

aacgcgtatt aacgcagagt gcaaagtata agagggttaa aaaatatatt ttacgcacca 7980

tatacgcatc gggttgatat agttaatatg gatcaatttg aacagttgat taacgtgtct 8040

ctgctcaagt cgttgatcaa aacgcaaatc gacgaaaatg tgtcggacaa tatcaagtcg 8100

atgagcgaaa aactaaaaag gctagaatac gacaatctca cagacagcgt tgagatatac 8160

ggtattcacg acagcaggct gaataataaa aaaattagaa actattattt aaccctagaa 8220

agataatcat attgtgacgt acgttaaaga taatcatgcg taaaattgac gcatgtgttt 8280

ttatcggtct gtatatcgag gtttatttat taatttgaat agatattaag ttttattata 8340

tttacactta catactaata ataaattcaa caaacaattt atttatgttt atttatttat 8400

taaaaaaaaa caaaaactca aaatttcttc taaagtaaca aaacttta 8448

Claims

1. 一种利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法，其特征在于该方法的步骤如下：

（1）采用分子生物学方法构建家蚕合成分泌人血清白蛋白的质粒pBHSA，质粒pBHSA包含有作为外源基因的人血清白蛋白基因；

（2）采用显微注射转基因家蚕方法将pBHSA质粒及能够提供piggyBac转座酶的辅助质粒pHA3PIG质粒按浓度比1：1的比例导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，利用piggyBac转座子将人血清白蛋白基因插入到家蚕基因组内；

（3）蚕卵孵化后饲养至成虫，然后与非转基因家蚕交配制种续代，此代为G1代，在G1代蚕卵的转青期，通过荧光体视显微镜观察筛选出单眼表达红色荧光DsRed标记基因的转基因家蚕，饲养至成虫再与非转基因家蚕交配制种续代成为G2代；

（4）G2代家蚕采用单蛾育，筛选出荧光体视显微镜下表达红色荧光DsRed标记基因的家蚕，采用同蛾区蚕蛾相互交配制成G3代；

（5）G3代家蚕采用单蛾育，同蛾区表达红色荧光DsRed标记基因的蚕蛾相互交配，制成G4代；

（6）从G4代开始选择红眼表型纯合的蛾区饲养，采用单蛾育，同蛾区蚕蛾交配，经连续3代同样方法的选择、交配，育成红眼基因和人血清白蛋白基因纯合、后部丝腺细胞能够合成分泌人血清白蛋白的转基因家蚕；

（7）通过家蚕后部丝腺细胞合成分泌人血清白蛋白，并随家蚕吐丝结茧行为进入蚕茧。

2. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法，其特征在于：所述的质粒pBHSA是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，质粒pBHSA包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂PBL和PBR之间的两个功能表达框；一个功能表达框是3×P3启动子启动的红色荧光蛋白基因表达框，即3×P3 Promoter –DsRed-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六个组氨酸标签His-Tag、肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列、人血清白蛋白基因和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-Fibroin L chain signal peptide-His tag-DDDDK-HSA- Fibroin L chain PolyA，六个组氨酸标签His-Tag用于提纯外源蛋白，肠激酶酶切位点DDDDK氨基酸序列用于去除六个组氨酸标签。

3. 根据权利要求1所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法，其特征在于：所述的辅助质粒pHA3PIG质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的一个转座臂PBR、A3启动子启动的piggyBac转座酶的表达框，即A3 Promoter-transposase- SV40。

4. 根据权利要求1～3任一所述的一种利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法，其特征在于：所述的人血清白蛋白基因在家蚕后部丝腺细胞特异表达，在家蚕丝素蛋白轻链信号肽的作用下分泌到后部丝腺腺腔，并依次进入中部丝腺、前部丝腺直到蚕茧。