CN1295337C - 在大肠杆菌或芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体及其构建 - Google Patents
在大肠杆菌或芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体及其构建 Download PDFInfo
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Abstract
在大肠杆菌或芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体及其构建，属基因工程技术领域。本发明的表达载体pBL-WZX含有一个在大肠杆菌或芽孢杆菌中皆具有功能的启动子序列，含有一个在大肠杆菌或芽孢杆菌中皆具有功能的信号肽序列，含有一个供外源基因克隆的多克隆位点，含有一个人工转录终止序列，含有一个可在大肠杆菌或芽孢杆菌中进行克隆选择的遗传标记和含有一个供外源基因在芽孢杆菌的染色体DNA中进行整合和基因拷贝数扩增DNA序列。表达载体pBL-WZX具有引导外源基因转录和翻译并将基因产物分泌到细胞外的能力，在大肠杆菌中介导外源基因分泌表达的水平可达到1mg/mL以上，在芽孢杆菌中介导外源基因分泌表达的水平可达到3.1mg/mL以上。
Description
技术领域
在大肠杆菌或芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体及其构建，涉及一种基因表达载体的构建方法，属基因工程技术领域。
背景技术
大肠杆菌表达系统是基因工程中常用的工具。虽然它不能象真核系统一样进行翻译后加工，但由于其遗传背景清楚，使用安全，操作简便，周期短等优点，仍然是使用最广泛的外源基因表达系统之一。
芽孢杆菌作为基因克隆表达系统的一个主要优点，是它具有将蛋白质分泌到细胞外的能力。因而，对其载体-受体系统的研究日益受到重视。芽孢杆菌是一些重要工业酶制剂的生产菌。自1958年Spizizen等发现枯草杆菌168菌株能摄取外源基因后，枯草杆菌的遗传学研究工作不断深入和发展。美国俄亥俄州立大学芽孢杆菌遗传保藏中心(BGSC)2005年保藏的枯草杆菌168菌株的遗传突变株已有1390个，有11个芽孢杆菌的基因组已被解析。作为很有吸引力的外源基因表达宿主，芽孢杆菌有以下一些优点：1)属非致病的土壤微生物，严格在有氧条件下生长；2)很多噬菌体和质粒适合于用作芽孢杆菌的克隆载体；3)具有单层细胞膜组成的较简单的细胞外壳，当分泌蛋白跨过细胞膜后，就被加工和直接释放到培养基中；4)有良好的发酵基础和生产技术，能在相对简单的培养基中生长到很高的密度。因此，芽孢杆菌是一种值得高度重视的性能优越的外源蛋白分泌表达宿主。
由于蛋白质在表达过程中通常形成包涵体，克服此类问题的一个主要方式是以分泌表达形式，将蛋白质运送到外周质外膜甚至进入培养介质中。这需要在信号肽的帮助下来完成。通常情况下不同蛋白质需要不同的信号肽。枯草芽孢杆菌能向胞外分泌几十种蛋白质，利用其分泌系统大量生产外源基因产物具有潜在的商业价值。80年代以来国外开始从事分泌型表达载体的构建工作，Palva克隆了淀粉芽孢杆菌的淀粉酶基因并利用其启动子和信号肽序列构建分泌载体，在枯草杆菌中表达和分泌了大肠杆菌β-内酰胺酶基因及人干扰素基因。Yamane用枯草杆菌的α-淀粉酶基因5调控区构建载体表达小鼠的干扰素基因。
分泌表达也是对宿主有毒性的蛋白质的高表达的理性解决方法。芽孢杆菌是原核生物中最常用的分泌表达宿主，分泌表达的产物由于存在于培养液中，提取时可以省去破细胞这一成本较高的过程。因此，大部分工业酶制剂在构建基因工程菌时，分泌表达是必须的。嗜热古细菌来源的酶，由于在耐热性等方面有优越的性能，因此有很好的工业应用前景。嗜热古细菌需要适应的生长环境与嗜中温微生物不同，用嗜中温宿主表达嗜热古细菌的酶有很多的困难。Smith等详细研究了P.furiosus的β-葡萄糖苷酶基因在酵母α-因子引导下在酿酒酵母中的分泌表达，发现大部分的酶滞留在内质网中，不能分泌到细胞外，并初步确认，阻碍分泌的原因是酶的错误折叠，提高温度有利于酶的分泌。重组酶成功的分泌到细胞外，并保持了原宿主产生的酶的性质。上述两项研究均使用了基因自身的启动子和信号肽。有关古细菌来源的酶在外源启动子控制下在枯草杆菌中的分泌表达尚未见报道。相对于芽孢杆菌的蛋白质分泌表达而言，大肠杆菌中外源基因的分泌表达比较困难。目前设计的多种大肠杆菌分泌表达载体或系统多集中在将外源基因产物分泌到大肠杆菌的周质空间。
外源基因表达系统的核心是表达载体。一般说来一种好的表达载体应满足以下要求：(1)表达量高；(2)使用范围广；(3)表达产物易纯化；(4)稳定性好。目前已知的的表达载体有以下几种：非融合表达、融合表达、分泌表达、带伴侣蛋白的表达和表面呈现表达等载体。
发明内容
本发明的目的是构建一种在大肠杆菌或芽孢杆菌中能分泌表达外源基因的表达载体，最终能使外源基因在此载体相关元件的控制下，在大肠杆菌或芽孢杆菌中实现分泌表达。
本发明选用适用于大肠杆菌或芽孢杆菌的启动子和信号肽，通过表达载体的构建来达到分泌表达的目的。
本发明的技术方案：在大肠杆菌或芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体pBL-WZX，其核苷酸序列为：
agatccattg gtaactgtat ctcagcttga agaagtgaag aagcagagag gctattgaat 60
aaatgagtag aaagcgccat atcggcgctt ttcttttgga agaaaatata gggaaaatgg 120
tacttgttaa aaattcggaa tatttataca atatcatatg tttcacattg aaaggggagg 180
agaatcatga agcaacaaaa acggctttac gcccgattgc tgacgctgtt atttgcgctc 240
atcttcttgc tgcctcattc tgcagcagcg gcggcaaatc tagaattcga gctcccgggt 300
accatggcat gctaattaga tagagcagag aggacggatt tcctgaagga aatccgtttt 360
tttattttgc ccgtcttata agacaaggga aaacgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc 420
ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc 480
ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat 540
ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca agatctgatc aagagacagg 600
atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg 660
ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc 720
cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg 780
tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt 840
tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg 900
cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat 960
catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca 1020
ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca 1080
ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa 1140
ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa 1200
tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc 1260
ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga 1320
atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc 1380
cttctatcgc cttcttgacg agttcttcta ataaggggat cttgaagttc ctattccgaa 1440
gttcctattc tctagaaagt ataggaactt cgaagcagct ccagcctaca ctggtcttat 1500
gacttgggcg cgctggaaaa ctatttgaac aaaacaaatt ttaatcattc agtgtttgac 1560
gtgccgcttc attatcagtt ccatgctgca tcgacacagg gaggcggcta tgatatgagg 1620
aaattgctga acggtacggt cgtttccaag catccgttga aatcggttac atttgtcgat 1680
aaccatgata cacagccggg gcaatcgctt gagtcgactg tccaaacatg gtttaagccg 1740
cttgcttacg cttttattct cacaagggaa tctggatacc ctcaggtttt ctacggggat 1800
atgtacggga cgaaaggaga ctcccagcgc gaaattcctg ccttgaaaca caaaattgaa 1860
cagatctctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 1920
cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 1980
cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg 2040
gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 2100
gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc 2160
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 2220
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 2280
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 2340
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 2400
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 2460
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 2520
gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 2580
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 2640
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 2700
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 2760
cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 2820
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 2880
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 2940
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 3000
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 3060
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 3120
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 3180
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 3240
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 3300
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 3360
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt 3420
ggtgtcacge tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 3480
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 3540
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 3600
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 3660
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa 3720
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 3780
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 3840
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 3900
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 3960
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 4020
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 4080
acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 4140
gaggcccttt cgtcttcaag aattaattct catgtttgac agcttatcat cgataagctg 4200
actcatgttg gtattgtgaa atagacgcag atcgggaaca ctgaaaaata acagttatta 4260
ttcg 4264
表达载体pBL-WZX，其特征在于：含有一个在大肠杆菌或芽孢杆菌中皆具有功能的启动子序列PamyL，含有一个在大肠杆菌或芽孢杆菌中皆具有功能的信号肽序列SamyL，含有一个供外源基因克隆的多克隆位点，含有一个人工转录终止序列Tart，含有一个在大肠杆菌或芽孢杆菌中进行克隆选择的遗传标记KmR和含有一个供外源基因在芽孢杆菌的染色体DNA中进行整合和基因拷贝数扩增DNA序列3′amyL′；
启动子序列PamyL，从67位到186位，其核苷酸序列如下：
68 gtag aaagcgccat atcggcgctt ttcttttgga agaaaatata gg
gaaaatgg
tacttgttaa aaattcggaa tatttataca atatcatatg tttcacattg
186
其中，下划线区域为启动子的核心序列，123位c为经过点突变获得，153位a为转录起始位点，
为SD序列；
信号肽序列SamyL，从187位到282位，其核苷酸序列如下：
187 atga aacaacaaaa acggctttac gcccgattgc tgacgctgtt atttgcgctc
atcttcttgc tgcctcattc tgcagcagcg gcggcaaatc ta 282；
多克隆位点，从283位到308位，其中安排有EcoRI，SmaI，KpnI酶切位点，相对应的序列分别为gaattc、cccggg、ggtacc；
人工转录终止序列Tart，从313位到381位，其核苷酸序列如下：
313
taat
taga
tagagcagag
tttattttgc ccgtcttata a 381；
其中，单下划线核苷酸序列为终止密码子，双下划线和波浪线核苷酸序列为镜像互补序列；
克隆选择的遗传标记卡那霉素抗性KmR，从617位到1408位；
供外源基因在芽孢杆菌的染色体DNA中进行整合和基因拷贝数扩增的DNA序列3’amyL’，从1492位到1868位。
通过引物P1和引物P2以地衣芽孢杆菌ATCC14580染色体DNA为模板扩增出1.4kb包括地衣芽孢杆菌淀粉酶基因启动子和信号肽结构基因片段amyL并通过引物P1和P2引入BamHI酶切位点。将片段amyL克隆入pBlueScript II SK(-)的BamHI位点中，获得重组质粒pSK-amyL，通过引物P1-1定点突变改变启动子强度，获得重组质粒pSK-amyL’。再以重组质粒pSK-amyL’为模板用引物P1和P2-1扩增出amyL’并在amyL’两端分别引入BamHI和BglII位点；以pBR322为模板，P3和P4为引物，反向聚合酶链反应获得2.4kb的含有大肠杆菌的复制原点及氨苄青霉素抗性的DNA片段pBR322’，并在pBR322’两端设计有BglII酶切位点。上述amyL’和pBR322’两片段经BamHI或/和BglII酶切后，两片段连接转化大肠杆菌JM109，得到质粒pBR-amyL′。再以pBR-amyL′为模板，P5和P6为引物反向扩增出3.2kb的DNA片段，扩增的同时通过引物P5引入多克隆位点和转录终止序列Tart，扩增产物再与来自于pSKsym的卡那霉素抗性基因片段连接，连接物转化大肠杆菌JM109，获得在大肠杆菌或芽孢杆菌中能分泌表达的载体pBL-WZX。将外源基因(如甘露聚糖基因)的结构区读框内片段克隆入载体pBL-WZX的多克隆位点中，获得在大肠杆菌或芽孢杆菌中的高效分泌表达。
以上所述的各次扩增，扩增条件详见实施例1。
本发明的有益效果：
1.本发明的表达载体在大肠杆菌或芽孢杆菌中皆具有引导外源基因转录和翻译并将基因产物分泌到细胞外的能力。
2.本发明的表达载体在大肠杆菌中介导外源基因分泌表达的水平可达到1mg/mL以上，在芽孢杆菌中介导外源基因分泌表达的水平可达到3.1mg/mL以上。
附图说明
图1表达载体pBL-WZX的构建过程示意图。
图2表达载体pBL-WZX的物理图谱。
具体实施方式
实施例1载体pBL-WZX的构建
载体pBL-WZX的构建过程如图1所示。所使用的引物通过DNA合成仪化学合成获得，序列如下。
引物P1：aat
ggatccattggtaactgtatctcagc
引物P2：aac
ggatccgttcaattttgtgtttc
引物P1-1：tatagggaaaatggtacttgttaaaaattc
引物P2-1：aac
agatctgttcaattttgtgtttc
引物P3：aac
agatctctgcctcgcgcgtttcggtgat
引物P4：tcg
agatctcgaataataactgttatttttca
引物P5：ttataagacg ggcaaaataa aaaaacggat ttccttcagg aaatccgtcctctctgctct atctaattag catgccatgg tacccgggag ctcgaattct agatttgccgccgctgctgc
引物P6：tggtcttatgacttgggcgcgct
下划线部分为人工引入的限制性酶切位点。
载体pBL-WZX的构建过程是：通过引物P1和P2以地衣芽孢杆菌ATCC14580染色体DNA为模板，PCR扩增出长度为1.4kb的包括地衣芽孢杆菌淀粉酶基因启动子和信号肽及结构基因片段amyL并通过引物P1和P2引入BamHI酶切位点。PCR扩增条件是1×(95℃5min)；35×(94℃30s，56℃30s，72℃1min30s)；1×(72℃10min)。将片段amyL克隆入pBlueScript II SK(-)的BamHI位点中，获得重组质粒pSK-amyL，通过引物P1-1定点突变改变启动子强度，获得重组质粒pSK-amyL’。再以重组质粒pSK-amyL’为模板用引物P1和P2-1扩增出amyL’，扩增条件是1×(95℃5min)；35×(94℃30s，56℃30s，72℃1min30s)；1×(72℃10min)；并在amyL’两端分别引入BamHI和BglII位点。以pBR322为模板，以P3和P4为引物反向聚合酶链反应，扩增条件是1×(95℃5min)；35×(94℃30s，58℃30s，72℃3min30s)；1×(72℃10min)，获得2.4kb的含有大肠杆菌复制原点及氨苄青霉素抗性的DNA片段pBR322’，并在pBR322’两端设计有BglII酶切位点，上述amyL’和pBR322’两片段经BamHI或/和BglII酶切后，两片段连接转化大肠杆菌JM109，得到质粒pBR-amyL′。再以pBR-amyL′为模板，P5和P6为引物反向扩增，扩增条件是1×(95℃5min)；35×(94℃30s，58℃1min30s，68℃5min)；1×(68℃10min)，扩增出3.2kb的DNA片段，扩增的同时通过引物P5引入多克隆位点和转录终止序列Tart，扩增产物再与来自于质粒pSKsym卡那霉素抗性基因片段连接，连接物转化大肠杆菌JM109，获得在大肠杆菌或芽孢杆菌中能分泌表达的载体pBL-WZX(图1)。
实施例2载体pBL-WZX在大肠杆菌中应用性评价
BLi-man1为上游引物，其序列为acg
gaattcacaccgtttctccggtgaacc，BLi-man2为下游引物，其序列为cccgggcctcttatcggcggattggctt，以BLi-man1和BLi-man2为引物从地衣芽孢杆菌ATCC14580菌株的染色体DNA中扩增出编码β-甘露聚糖酶成熟肽的结构基因序列，PCR产物纯化后用EcoRI酶切。同时用EcoRI和SmaI线性化表达载体pBL-WZX。在T4连接酶的作用下将两者连接并转化大肠杆菌DE，在含有氨苄青霉素和卡那霉素的平板上筛选获得重组表达质粒pBL-man和重组菌DE(MAN)。重组菌DE(MAN)在LB培养基(0.5％酵母膏，1％蛋白胨，1％氯化钠；pH 7.0)中，在37℃，220r/min条件下培养24-72h。随着培养时间的延长，重组β-甘露聚糖酶在培养基中的积累达到1mg/mL以上。
实施例3载体pBL-WZX在芽孢杆菌中应用性评价
以实施例2中获得的重组表达质粒pBL-man电转化地衣芽孢杆菌CICIMB03036，在含卡那霉素的LB平板上获得重组菌BL(MAN)。重组菌BL(MAN)在发酵培养基(乳糖100g/L，豆饼粉50g/L，硫酸铵1g/L；pH 7.0)中于37℃和220r/min条件下培养168h，培养基中的重组β-甘露聚糖酶在培养基中的积累达到3.1mg/mL以上。
Claims (3)
1.一种在大肠杆菌或芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体pBL-WZX，其核苷酸序列为：
agatccattg gtaactgtat ctcagcttga agaagtgaag aagcagagag gctattgaat 60
aaatgagtag aaagcgccat atcggcgctt ttcttttgga agaaaatata gggaaaatgg 120
tacttgttaa aaattcggaa tatttataca atatcatatg tttcacattg aaaggggagg 180
agaatcatga aacaacaaaa acggctttac gcccgattgc tgacgctgtt atttgcgctc 240
atcttcttgc tgcctcattc tgcagcagcg gcggcaaatc tagaattcga gctcccgggt 300
accatggcat gctaattaga tagagcagag aggacggatt tcctgaagga aatccgtttt 360
tttattttgc ccgtcttata agacaaggga aaacgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc 420
ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc 480
ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat 540
ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca agatctgatc aagagacagg 600
atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg 660
ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc 720
cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg 780
tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt 840
tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg 900
cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat 960
catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca 1020
ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca 1080
ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa 1140
ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa 1200
tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc 1260
ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga 1320
atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc 1380
cttctatcgc cttcttgacg agttcttcta ataaggggat cttgaagttc ctattccgaa 1440
gttcctattc tctagaaagt ataggaactt cgaagcagct ccagcctaca ctggtcttat 1500
gacttgggcg cgctggaaaa ctatttgaac aaaacaaatt ttaatcattc agtgtttgac 1560
gtgccgcttc attatcagtt ccatgctgca tcgacacagg gaggcggcta tgatatgagg 1620
aaattgctga acggtacggt cgtttccaag catccgttga aatcggttac atttgtcgat 1680
aaccatgata cacagccggg gcaatcgctt gagtcgactg tccaaacatg gtttaagccg 1740
cttgcttacg cttttattct cacaagggaa tctggatacc ctcaggtttt ctacggggat 1800
atgtacggga cgaaaggaga ctcccagcgc gaaattcctg ccttgaaaca caaaattgaa 1860
cagatctctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 1920
cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 1980
cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg 2040
gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 2100
gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc 2160
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 2220
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 2280
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 2340
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 2400
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 2460
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 2520
gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 2580
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 2640
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 2700
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 2760
cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 2820
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 2880
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 2940
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 3000
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 3060
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 3120
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 3180
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 3240
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 3300
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 3360
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt 3420
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 3480
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 3540
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 3600
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 3660
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa 3720
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 3780
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 3840
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 3900
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 3960
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 4020
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 4080
acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 4140
gaggcccttt cgtcttcaag aattaattct catgtttgac agcttatcat cgataagctg 4200
actcatgttg gtattgtgaa atagacgcag atcgggaaca ctgaaaaata acagttatta 4260
ttcg。 4264
2.根据权利要求1所述的表达载体pBL-WZX，其特征在于：含有一个在大肠杆菌或芽孢杆菌中皆具有功能的启动子序列PamyL，含有一个在大肠杆菌或芽孢杆菌中皆具有功能的信号肽序列SamyL，含有一个供外源基因克隆的多克隆位点，含有一个人工转录终止序列Tart，含有一个在大肠杆菌或芽孢杆菌中进行克隆选择的遗传标记KmR和含有一个供外源基因在芽孢杆菌的染色体DNA中进行整合和基因拷贝数扩增DNA序列3′amyL′；
启动子序列PamyL，从67位到186位，其核苷酸序列如下：
67 gtag aaagcgccat atcggcgctt ttcttttgga agaaaatata gg
gaaaatgg
tacttgttaa aaattcggaa tatttataca atatcatatg tttcacattg aaaggg
gaatc 186
其中，下划线区域为启动子的核心序列，123位c为经过点突变获得，153位a为转录起始位点，
为SD序列；
信号肽序列SamyL，从187位到282位，其核苷酸序列如下：
187 atga aacaacaaaa acggctttac gcccgattgc tgacgctgtt atttgcgctc
atcttcttgc tgcctcattc tgcagcagcg gcggcaaatc ta 282；
多克隆位点，从283位到308位，其中安排有EcoRI，SmaI，KpnI酶切位点，相对应的序列分别为gaattc、cccggg、ggtacc；
人工转录终止序列Tart，从313位到381位，其核苷酸序列如下：
313
taat
taga
tagagcagag agg
ga
tttt tttattttgc ccgtcttata a 381；
其中，单下划线核苷酸序列为终止密码子，双下划线和波浪线核苷酸序列为镜像互补序列；
克隆选择的遗传标记卡那霉素抗性KmR，从617位到1408位；
供外源基因在芽孢杆菌的染色体DNA中进行整合和基因拷贝数扩增的DNA序列3’amyL’，从1492位到1868位。
3.权利要求1或2所述的表达载体pBL-WZX的构建方法，其特征是
A)所使用的引物序列如下
引物P1：aat
ggatccattggtaactgtatctcagc
引物P2：aac
ggatccgttcaattttgtgtttc
引物P1-1：tatagggaaaatggtacttgttaaaaattc
引物P2-1：aac
agatctgttcaattttgtgtttc
引物P3：aac
agatctctgcctcgcgcgtttcggtgat
引物P4：tcg
agatctcgaataataactgttatttttca
引物P5：ttataagacg ggcaaaataa aaaaacggat ttccttcagg aaatccgtcc tctctgctct
atctaattag catgccatgg tacccgggag ctcgaattct agatttgccg ccgctgctgc
引物P6：tggtcttatgacttgggcgcgct
下划线部分为人工引入的限制性酶切位点；
B)通过引物P1和引物P2，以地衣芽孢杆菌ATCC14580染色体DNA为模板，PCR扩增出1.4kb的DNA片段，包括amyL基因启动子、信号肽序列及结构基因片段，在两侧引入BamHI酶切位点，其PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min30s 35次循环；72℃10min；
C)将片段amyL克隆入pBlueScript II SK(-)的BamHI位点中，获得重组质粒pSK-amyL；
D)通过引物P1-1定点突变改变启动子强度，获得重组质粒pSK-amyL’；
E)通过引物P1和P2-1，以重组质粒pSK-amyL’为模板，PCR扩增出amyL’，并在amyL’两端分别引入BamHI和BglII位点，其PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min 30s 35次循环；72℃10min；
F)以pBR322为模板，P3和P4为引物，反向聚合酶链反应扩增得到2.4kb的DNA片段pBR322’，pBR322’PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃3min 30s 35次循环；72℃10min；pBR322’含有大肠杆菌的复制原点及氨苄青霉素抗性，并在其两端设计有BglII的酶切位点；
G)两片段amyL’和pBR322’经BamHI或/和BglII酶切后，两片段连接转化大肠杆菌JM109，得到重组质粒pBR-amyL′；
H)以pBR-amyL′为模板，P5和P6为引物反向扩增出3.2kb的DNA片段，同时通过引物P5引入多克隆位点和转录终止序列Tart；其PCR扩增条件是95℃5min；94℃30s，58℃1min 30s，68℃5min 35次循环；68℃10min；
I)步骤H)得到的扩增产物再与来自于质粒pSKsym的卡那霉素抗性基因片段连接，连接物转化大肠杆菌JM109，获得在大肠杆菌或芽孢杆菌中能分泌表达的载体pBL-WZX。
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