CN115364096B - 一种改善Wolfram综合征中胰岛β细胞凋亡情况的药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及茴香霉素在制备药物或试剂盒中的用途。本发明提供茴香霉素在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于：1）治疗WFS1基因异常相关疾病；或，2）治疗Wolfram综合征。本发明发明人通过一系列的实验验证了通过在人胚胎干细胞中敲除WFS1，可以在体外诱导分化体系中构建人Wolfram综合征体外细胞模型，并进一步验证了茴香霉素可以改善胰岛β细胞抵抗棕榈酸诱导的脂毒性凋亡能力以及抵抗高糖诱导的糖毒性凋亡，从而证明茴香霉素可以被用于WFS1基因异常相关疾病和/或Wolfram综合征的治疗。

Description

一种改善Wolfram综合征中胰岛β细胞凋亡情况的药物

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及茴香霉素在制备药物或试剂盒中的用途。

背景技术

Wolfram综合征又名DIDMOAD综合征(diabetes insipidus(尿崩症，DI)，diabetesmellitus(糖尿病，DM)，optic atrophy(视神经萎缩，OA)，deafness(耳聋，D))，属常染色体隐性遗传性神经变性疾病，1938年由Wolfram首先报道。该病的发病率约为1/10万，其发病年龄多在20岁以前，但亦有40岁以后发病者，常以1型糖尿病为首发症状，2至3年后陆续出现其他症状，患者平均寿命在30岁左右。该综合征的诊断目前主要依赖4个主要的临床线索。临床4主征表现为：

(1)胰岛素依赖型糖尿病：常为首发疾病，多在儿童期发病。

(2)眼部症状：多在6～7岁开始出现视力减退，常于糖尿病诊断后2～3年出现，98％伴有视神经萎缩，部分可伴有视野缺损、色盲、色素性视网膜炎、眼球震颤等，个别还可发生白内障。

(3)耳聋：以高频段为主，提示为神经性耳聋，发生率约为65％，青春期开始的听力损失会随着时间的推移而加重。

(4)尿崩症：多为中枢性尿崩症，发生率约为32％。

此外，WS的进行性发病还伴随其他症状，如内分泌系统中垂体性侏儒症、甲状腺功能减退、性发育迟缓等，神经系统中其他神经及精神系统表现，包括躁狂、抑郁、共济失调、器质性脑病综合征等，消化系统可见腹泻或便秘等症状。4主征表现均有者为完全型患者，不全有者为不完全型患者，以后者多见。WS病人的脑干萎缩通常导致继发中枢性呼吸暂停与死亡。

目前，全球尚无对Wolfram综合征的有效治疗措施，临床上主要的对症处理方式一般为：对糖尿病即予以胰岛素控制血糖，对于多尿症则使用醋酸去氨加压素改善多尿症状，对待耳聋则使佩戴助听器等。

近年来，有关Wolfram综合征病因学的研究逐渐增多，这是一种常染色体隐性遗传病，少见散发，研究表明大多数Wolfram综合征是由WFS1基因突变所致，患者为复杂突变杂合子或突变纯合子(近亲结婚)。WFS1基因共有8个外显子，编码蛋白Wolframin共有890个氨基酸，该蛋白是一种内质网上的跨膜糖蛋白，在人全身广泛表达，高表达与胰岛β细胞与神经元细胞中，与膜的运输、蛋白加工与胰岛β细胞的抑制凋亡机制有关。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供茴香霉素在制备药物或试剂盒中的用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供茴香霉素在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于：

1)治疗WFS1基因异常相关疾病；或，

2)治疗Wolfram综合征。

在本发明一些实施方式中，所述茴香霉素是单一有效成分。

在本发明一些实施方式中，所述WFS1基因异常为WFS1低表达。

在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于治疗胰岛β细胞损伤相关的WFS1基因异常相关疾病；

和/或，所述药物或试剂盒用于治疗胰岛β细胞损伤相关的Wolfram综合征。

在本发明一些实施方式中，所述胰岛β细胞损伤为脂毒性的胰岛β细胞损伤。

在本发明一些实施方式中，所述胰岛β细胞损伤为糖毒性的胰岛β细胞损伤。

在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于治疗胰岛素依赖型糖尿病相关的WFS1基因异常相关疾病；

和/或，所述药物或试剂盒用于治疗胰岛素依赖型糖尿病相关的Wolfram综合征。

在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于调节个体或组织中的胰岛β细胞的比例，优选的，所述药物或试剂盒用于提高个体或组织中的胰岛β细胞的比例。

在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于调节个体或组织中的胰岛β细胞凋亡水平，优选的，所述药物或试剂盒用于降低个体或组织中的胰岛β细胞凋亡水平。

在本发明一些实施方式中，所述药物或试剂盒用于调节个体或组织中的胰岛β细胞中的锌离子含量，优选的，所述药物或试剂盒用于降低个体或组织中的胰岛β细胞中的锌离子含量。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中ES中敲除WFS1以构建WS体外细胞模型的示意图。

图2显示为本发明实施例2中WS体外细胞模型中糖、脂毒性引发的细胞凋亡水平示意图。

图3显示为本发明实施例3中WS体外细胞模型中的Zinquin染色示意图。

图4显示为本发明实施例3中WS体外细胞模型中胰岛β细胞的比例示意图。

图5显示为本发明实施例3中WS体外细胞模型中胰岛β细胞的凋亡水平示意图。

图6显示为本发明实施例4中WS体外细胞模型中脂毒性诱导的胰岛β细胞凋亡示意图。

图7显示为本发明实施例4中WS体外细胞模型中糖毒性诱导的胰岛β细胞凋亡示意图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。

为了简便，本申请仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围，以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。

在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中“多种”的含义是两种以上。

本发明的上述发明内容并不意欲描述本发明中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施方式提供了指导，这些实施方式可以以各种组合形式使用。在各个实施方式中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。

本发明第一方面提供茴香霉素在制备药物或试剂盒中的用途，所述药物或试剂盒用于治疗WFS1基因异常相关疾病和/或Wolfram综合征。在人胚胎干细胞中敲除WFS1基因后，通过体外诱导分化将WFS1基因敲除的胚胎干细胞诱导分化为胰岛β细胞，分化获得的WFS1基因敲除的胰岛β细胞(约占细胞球中总细胞数40％左右)可以作为Wolfram综合症的体外细胞模型。对于WFS1基因敲除的胰岛β细胞，其在脂毒性条件下(例如，棕榈酸刺激的条件下等)、或糖毒性条件下(例如，高糖刺激的条件下)会更加倾向于凋亡，相对于野生型的胰岛β细胞凋亡数量明显增加，说明WFS1基因敲除的胰岛β细胞能够很好地反应Wolfram综合症病人的胰岛β细胞原发及在糖尿病条件下的受损情况。而本申请发明人发现，当向WFS1基因敲除的胰岛β细胞施用茴香霉素以后，相对于野生型的胰岛β细胞，WFS1基因敲除的胰岛β细胞中的锌离子含量明显降低，WFS1基因敲除的体外细胞模型中胰岛β细胞的比例明显更高，胰岛β细胞的本底凋亡水平明显降低，而在脂毒性条件下和/或糖毒性条件下，当向WFS1基因敲除的胰岛β细胞施用茴香霉素以后，相对于野生型的胰岛β细胞，WFS1基因敲除的体外细胞模型中胰岛β细胞的本底凋亡水平明显更低，说明茴香霉素可以被用于制备用于治疗WFS1基因异常相关疾病和/或Wolfram综合征的药物或试剂盒。

茴香霉素(CAS号：22862-76-6，分子式C14H19NO4，化学式)，是一种可以来源于灰色链霉菌的吡咯烷抗生素。

本发明所提供的药物或试剂盒中，茴香霉素可以是作为单一有效成分，也可以与其他活性组分进行组合，共同地用于治疗WFS1基因异常相关疾病和/或Wolfram综合征。

本发明所提供的药物或试剂盒中，WFS1基因异常通常为WFS1低表达。WFS1低表达可以是指WFS1表达的缺失、或WFS1的表达水平低于一定的标准，这一表达可以是分子水平上的，也可以是蛋白水平上的。例如，WFS1低表达可以是胰岛β细胞中无法检测出明显的WFS1的mRNA的表达，再例如，WFS1低表达也可以是胰岛β细胞中无法检测出明显的WFS1的蛋白的表达，再例如，WFS1低表达也可以是胰岛β细胞的WFS1的mRNA表达水平明显低于野生型的胰岛β细胞，再例如，WFS1低表达也可以是胰岛β细胞中的WFS1的蛋白的表达水平明显低于野生型的胰岛β细胞。

本发明所提供的药物或试剂盒中，茴香霉素在对胰岛β细胞具有很好的保护作用，能够有效调节(例如，提高)个体或组织中的胰岛β细胞的比例，调节(例如，降低)个体或组织中的胰岛β细胞凋亡水平，调节(例如，降低)个体或组织中的胰岛β细胞中的锌离子含量，尤其是在脂毒性条件下和/或糖毒性条件下，依然对胰岛β细胞具有很好的保护效果，说明茴香霉素可以帮助胰岛β细胞抵抗糖尿病环境下脂毒性诱导、或糖毒性诱导的细胞凋亡，有效减少脂毒性诱导、糖毒性诱导的胰岛β细胞的损伤，调节(例如，降低)脂毒性凋亡水平和/或糖毒性凋亡水平，从而可以被适用于与胰岛β细胞损伤相关的WFS1基因异常相关疾病和/或Wolfram综合征的治疗中。例如，胰岛β细胞损伤可以为脂毒性的胰岛β细胞损伤，胰岛β细胞损伤也可以为糖毒性的胰岛β细胞损伤。例如，可以是胰岛素依赖型糖尿病相关的WFS1基因异常相关疾病和/或Wolfram综合征等。

本发明第二方面提供一种组合物，所述组合物包括茴香霉素，所述组合物用于：1)治疗WFS1基因异常相关疾病；或，2)治疗Wolfram综合征。

本发明第三方面提供一种调控方法，所述调控方法可以用于调节(例如，提高)个体或组织(例如，胰岛等)中的胰岛β细胞的比例；和/或，调节(例如，降低)个体或组织中的胰岛β细胞凋亡水平；和/或，调节(例如，降低)个体或组织中的胰岛β细胞中的锌离子含量。例如，可以是向个体或细胞施用有效量的茴香霉素、或本发明第二方面所提供的组合物。

本发明第四方面提供一种治疗方法，包括：向个体施用治疗有效量的茴香霉素、或本发明第二方面所提供的组合物。

本发明中，“个体”通常包括人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用所述制剂、试剂盒或联合制剂进行治疗而获益。

本发明中，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。

本发明发明人通过一系列的实验验证了通过在人胚胎干细胞中敲除WFS1，可以在体外诱导分化体系中构建人Wolfram综合征体外细胞模型，并进一步验证了茴香霉素可以改善胰岛β细胞抵抗棕榈酸诱导的脂毒性凋亡能力以及抵抗高糖诱导的糖毒性凋亡，从而证明茴香霉素可以被用于WFS1基因异常相关疾病和/或Wolfram综合征的治疗，具有良好的产业化前景。

下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1构建WFS1基因敲除的人胚胎干细胞系

1、质粒构建

(1)质粒设计及sgRNA筛选

ES中敲除WFS1基因以构建WS体外细胞模型的示意图如图1所示。

利用工具网站(http://crispr.mit.edu/)针对人WFS1基因靠近5’端外显子的上游和下游各设计一条19bp的sgRNA，并将其通过PCR与酶切连接的方式插入携带Cas9蛋白基因与嘌呤霉素抗性基因的载体中。根据sgRNA打靶率与脱靶率等综合评分，筛选出sgRNA序列如下：

sgRNA：ATTGAGTCGGGAACGCGCC(SEQ ID NO.1)

质粒序列如下：

aattgaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgATTGAGTCGGGAACGCGCCGTTTTagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgtccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagtgcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattctctagagatatcgctagcaccatggactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaagatggcccccaagaagaagaggaaggtgggcattcaccgcggggtacccatggacaagaagtactccattgggctcgatatcggcacaaacagcgtcggctgggccgtcattacggacgagtacaaggtgccgagcaaaaaattcaaagttctgggcaataccgatcgccacagcataaagaagaacctcattggcgccctcctgttcgactccggggagacggccgaagccacgcggctcaaaagaacagcacggcgcagatatacccgcagaaagaatcggatctgctacctgcaggagatctttagtaatgagatggctaaggtggatgactctttcttccataggctggaggagtcctttttggtggaggaggataaaaagcacgagcgccacccaatctttggcaatatcgtggacgaggtggcgtaccatgaaaagtacccaaccatatatcatctgaggaagaagcttgtagacagtactgataaggctgacttgcggttgatctatctcgcgctggcgcatatgatcaaatttcggggacacttcctcatcgagggggacctgaacccagacaacagcgatgtcgacaaactctttatccaactggttcagacttacaatcagcttttcgaagagaacccgatcaacgcatccggagttgacgccaaagcaatcctgagcgctaggctgtccaaatcccggcggctcgaaaacctcatcgcacagctccctggggagaagaagaacggcctgtttggtaatcttatcgccctgtcactcgggctgacccccaactttaaatctaacttcgacctggccgaagatgccaagcttcaactgagcaaagacacctacgatgatgatctcgacaatctgctggcccagatcggcgaccagtacgcagacctttttttggcggcaaagaacctgtcagacgccattctgctgagtgatattctgcgagtgaacacggagatcaccaaagctccgctgagcgctagtatgatcaagcgctatgatgagcaccaccaagacttgactttgctgaaggcccttgtcagacagcaactgcctgagaagtacaaggaaattttcttcgatcagtctaaaaatggctacgccggatacattgacggcggagcaagccaggaggaattttacaaatttattaagcccatcttggaaaaaatggacggcaccgaggagctgctggtaaagcttaacagagaagatctgttgcgcaaacagcgcactttcgacaatggaagcatcccccaccagattcacctgggcgaactgcacgctatcctcaggcggcaagaggatttctacccctttttgaaagataacagggaaaagattgagaaaatcctcacatttcggataccctactatgtaggccccctcgcccggggaaattccagattcgcgtggatgactcgcaaatcagaagagaccatcactccctggaacttcgaggaagtcgtggataagggggcctctgcccagtccttcatcgaaaggatgactaactttgataaaaatctgcctaacgaaaaggtgcttcctaaacactctctgctgtacgagtacttcacagtttataacgagctcaccaaggtcaaatacgtcacagaagggatgagaaagccagcattcctgtctggagagcagaagaaagctatcgtggacctcctcttcaagacgaaccggaaagttaccgtgaaacagctcaaagaagactatttcaaaaagattgaatgtttcgactctgttgaaatcagcggagtggaggatcgcttcaacgcatccctgggaacgtatcacgatctcctgaaaatcattaaagacaaggacttcctggacaatgaggagaacgaggacattcttgaggacattgtcctcacccttacgttgtttgaagatagggagatgattgaagaacgcttgaaaacttacgctcatctcttcgacgacaaagtcatgaaacagctcaagaggcgccgatatacaggatgggggcggctgtcaagaaaactgatcaatgggatccgagacaagcagagtggaaagacaatcctggattttcttaagtccgatggatttgccaaccggaacttcatgcagttgatccatgatgactctctcacctttaaggaggacatccagaaagcacaagtttctggccagggggacagtcttcacgagcacatcgctaatcttgcaggtagcccagctatcaaaaagggaatactgcagaccgttaaggtcgtggatgaactcgtcaaagtaatgggaaggcataagcccgagaatatcgttatcgagatggcccgagagaaccaaactacccagaagggacagaagaacagtagggaaaggatgaagaggattgaagagggtataaaagaactggggtcccaaatccttaaggaacacccagttgaaaacacccagcttcagaatgagaagctctacctgtactacctgcagaacggcagggacatgtacgtggatcaggaactggacatcaatcggctctccgactacgacgtggatcatatcgtgccccagtcttttctcaaagatgattctattgataataaagtgttgacaagatccgataaaaatagagggaagagtgataacgtcccctcagaagaagttgtcaagaaaatgaaaaattattggcggcagctgctgaacgccaaactgatcacacaacggaagttcgataatctgactaaggctgaacgaggtggcctgtctgagttggataaagccggcttcatcaaaaggc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ID NO.2)

(2)质粒转化及测序

将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻，取10μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min，42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2min。加入900μL的LB液体培养基(不加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。将相应抗性的LB固体培养基平板在37℃培养箱中预热，5000rpm离心5min，弃上清，用剩余培养基将菌液重悬，用涂平板，37℃培养箱中倒置培养12h。挑取克隆送测序公司进行测序，挑选连接成功的质粒，并进行大规模质粒抽提。

2、胚胎干细胞培养条件：

(1)配制hES培养基，配方如下：

DMEM/F12(Invitrogen，#11330-082)

20％血清替代物(Invitrogen，#10828028)

1mM非必需氨基酸(Gibco，#11140-050)

1mM L-谷氨酰胺(Gibco，#25-005-CI)

0.05mMβ-巯基乙醇(Invitrogen，#21985023)

1X青霉素/链霉素(Gibco，#30-002-CI)

10ng/mL bFGF(R&D，#233-FB/CF)

(2)将1:6稀释的基质胶(Corning,#354230)铺在细胞培养皿上，37℃孵育30min以使胶凝固，帮助细胞贴壁；

(3)将小鼠滋养层细胞(P3)接种于步骤(2)基质胶包被好的细胞培养皿上，并在37℃，5％的CO₂培养箱中培养过夜；

(4)将0.3-0.5M人类胚胎干细胞系Mel-1(中科院实验室提供，INS::GFP,NKX6.1::mCherry)接种在小鼠滋养层细胞上，并在37℃，含5％的CO₂培养箱中进行细胞培养。细胞每3-4天进行传代。

3、质粒电转与细胞系筛选

(1)人胚胎干细胞培养至80％密度时，用TrypLE进行消化，并用40μm的细胞滤网过滤制备单细胞悬液；

(2)计数，量取约0.5M总量的细胞，使用电穿孔的方式转染携带sgRNA及Cas9蛋白基因的质粒进入细胞当中，并接种于6cm的细胞培养皿中培养过夜。

(3)第二天，加入含100ng/mL嘌呤霉素的hES进行筛选，隔天换新鲜的带嘌呤霉素的hES培养基。72h后，移除嘌呤霉素，每隔一天更换培养基直至克隆长至可挑选的大小(约5-7天)；

(4)挑取细胞单克隆，并将其转移至96孔板中扩大培养，每个孔取部分细胞用裂解液裂解提取细胞基因组，并进行测序检验WFS1基因是否被敲除；另一部分使用冻存液(配方：50％hES培养基、40％FBS、10％二甲基亚砜)冷冻保存。测序结果表明，WFS1的2号外显子(第一个编码外显子)有49bp被敲除，导致终止密码子提前，基因终止表达。

4、胚胎干细胞体外诱导分化为胰岛β细胞

在人胚胎干细胞中敲除WFS1基因后，通过体外诱导分化将野生型及WFS1基因敲除的胚胎干细胞诱导分化为胰岛β细胞。现有分化系统经定形内胚层细胞、胰腺前体细胞、胰腺内分泌前体细胞、胰岛β细胞4个主要阶段，采用2D与3D培养相结合的方式，可在培养皿中模拟人胰岛β细胞发育的过程，最终获得WFS1基因缺失的胰岛β细胞。

胚胎干细胞诱导分化获得的胰岛β细胞基本为细胞球状态，每个细胞球大约含3000～5000个细胞，利用流式细胞术，对各批次培养获得的细胞进行检测，取胰岛β细胞含量≥40％的细胞球用于后续实验，以作为Wolfram综合症的体外细胞模型。

实施例2 Wolfram综合征模型中胰岛β细胞凋亡水平提升的研究

WS病人的最早、最显著的表征为胰岛素依赖性糖尿病，病人的胰岛β细胞的凋亡水平显著上升。将实施例1诱导分化成熟的胰岛β细胞作为WFS1基因敲除组(WFS1^-/-)，并将其与未进行基因编辑的野生对照组(WT)β细胞对比。

1、体外培养ES诱导胰岛β细胞培养条件：

(1)配制胰岛β细胞培养基，配方如下：

MCDB131(Invitrogen，#10372019)

2％FAF-BSA(Proline，#68700)

20mM D-葡萄糖(Sigma，#D7021)

1.5g/l碳酸氢钠(Sigma，#S6297)

1mM L-谷氨酰胺(Gibco，#25-005-CI)

10μM硫酸锌(Sigma，#Z0251)

10μg/ml肝素(Sigma，#H3149-500KU-9)

1:200 ITS-X(Invitrogen，#51500056)

10mM烟酰胺(Sigma，#D0636)

1X青霉素/链霉素(Gibco，#30-002-CI)

1μM T3(Sigma，#T6397)

10μM ALK5iII(EnzoLifeSciences，#ALX-270-445)

1mM N-Cys(Sigma，#A9165)

2μM R428(SelleckChem，#S2841)

10μM Trolox(MP，#648471)

(2)在37℃，5％的CO₂培养箱中震荡培养，摇床转速90RPM；

(3)胰岛β细胞需要隔天换液。

2、体外模拟棕榈酸诱导的脂毒性β细胞凋亡

将野生型(WT)及WFS1基因敲除组(WFS1^-/-)分为未处理对照组(Control，Ct)、加1mM棕榈酸溶液组(PA)，其中未处理对照组均加入等计量棕榈酸溶剂(5％BSA+0.1M NaOH)。每组10个细胞球，经48小时震荡培养后取出细胞球，用AnnxV-647进行活细胞染色，用荧光显微镜拍摄后计算每个细胞球的AnnxV平均荧光强度，即得到每个球的凋亡情况。如图2所示，结果显示，WS细胞模型在棕榈酸刺激下的β细胞凋亡数量较未处理对照组增加明显，且较野生组凋亡水平更高。

3、体外模拟高糖诱导的糖毒性β细胞凋亡

将野生型(WT)及WFS1基因敲除组(WFS1^-/-)分为未处理对照组(Control，Ct)、加35mM D-Glucose组(G)，其中未处理对照组均加入等计量D-葡萄糖溶剂(DPBS)。每组10个细胞球，经48小时震荡培养后取出细胞球，用AnnxV-647进行活细胞染色，用荧光显微镜拍摄后计算每个细胞球的AnnxV平均荧光强度，即得到每个球的凋亡情况。如图2所示，结果显示，WS细胞模型在高糖刺激下的β细胞凋亡数量较未处理对照组增加明显，且较野生组凋亡水平更高。

以上结果表明，WFS1敲除的WS细胞模型中，胰岛β细胞的本底凋亡水平、脂毒性引发细胞凋亡水平和糖毒性引发细胞凋亡水平均高于野生型，即此模型可以很好地反映WS病人的胰岛β细胞原发及在糖尿病条件下的受损情况。

实施例3茴香霉素抵抗Wolfram综合征细胞模型中胰岛β细胞凋亡水平提升的研究

1、茴香霉素降低WS细胞模型中锌离子含量

将WFS1基因敲除组分为对照组(Control，CT)与用药组(Anisomycin，ANI)，对用药组加入25nM茴香霉素，对照组加入等量溶剂(二甲基亚砜)，每组10个细胞球，分别振荡培养48小时(培养条件参照实施例2，下同)，48小时后取出细胞球，按照1:500的比例使用Zinquin染色，孵育30分钟后取出染好的细胞球，用共聚焦显微镜进行拍摄，结果如图3所示。

由图3可知，以WFS1基因敲除的WS体外细胞模型中锌离子的含量(以Zinquin标记)为指标，茴香霉素(Anisomycin，ANI)可降低WS体外细胞模型中的Zinc含量。

2、茴香霉素提高WS细胞模型中胰岛β细胞比例

将WFS1基因敲除组分为对照组(Control，CT)与用药组(Anisomycin，ANI)，对用药组加入25nM茴香霉素，对照组加入等量溶剂(二甲基亚砜)，每组30个细胞球，分别振荡培养48小时，48小时后取出细胞球，用0.25％胰酶消化为单细胞，流式细胞仪上机检测WS细胞模型中报告基因(INS::GFP，NKX6.1::mCherry)的表达情况，检测WS细胞模型中双阳性细胞的比例，结果如图4所示。

由图4可知，茴香霉素可以有效提高WS体外细胞模型中胰岛β细胞的比例。

3、茴香霉素抵抗WS细胞模型中胰岛β细胞的凋亡检测

将WFS1基因敲除组分为对照组(Control，CT)与用药组(Anisomycin，ANI)，对用药组加入25nM茴香霉素，对照组加入等量溶剂(二甲基亚砜)，分别振荡培养48小时，48小时后取出细胞球，用0.25％胰酶消化为单细胞，再用AnnxV进行活细胞染色，利用流式细胞仪上机检测胰岛β细胞凋亡水平，结果如图5所示。

由图5可知，茴香霉素可以改善WS体外细胞模型中胰岛β细胞的凋亡水平。

以上结果表明，25nM的茴香霉素可使WFS1敲除的WS细胞模型中胰岛β细胞的分化效率提升，即总胰岛β细胞的比例提升。且，25nM的茴香霉素可使WFS1敲除的WS细胞模型中胰岛β细胞的本底凋亡水平下降，即改善了此WS细胞模型中凋亡情况。

实施例4茴香霉素抵抗Wolfram综合征细胞模型中糖尿病发病的研究

将实施例1诱导分化成熟的WFS1基因敲除组与野生对照组的胰岛β细胞，通过以下方法研究茴香霉素对Wolfram综合征细胞模型抵抗糖尿病发病的机制。

1、体外模拟棕榈酸诱导的脂毒性β细胞凋亡

将WFS1基因敲除组分为未处理对照组(Control，Ct)、加1mM棕榈酸溶液组(PA)和1mM棕榈酸溶液与25nM茴香霉素处理组(PA+ANI)，其中未处理对照组与处理组均加入等计量棕榈酸溶剂，未处理对照组与棕榈酸溶液组均加入等量二甲基亚砜。经48小时震荡培养后取出细胞球，用0.25％胰酶消化为单细胞，再用AnnxV进行活细胞染色，利用流式细胞仪上机检测胰岛β细胞凋亡水平。

如图6所示，结果显示，在棕榈酸刺激下，棕榈酸溶液组的β细胞凋亡数量较未处理对照组增加明显，但茴香霉素处理组的β细胞凋亡细胞数量则下降明显。

2、体外模拟高糖诱导的糖毒性β细胞凋亡

将WFS1基因敲除组分为未处理对照组(Control，Ct)、加35mM D-葡萄糖溶液组(G)和35mM葡萄糖溶液与25nM茴香霉素处理组(G+ANI)，其中未处理对照组与处理组均加入等计量葡萄糖溶剂，未处理对照组与棕榈酸溶液组均加入等量二甲基亚砜。经48小时震荡培养后取出细胞球，用0.25％胰酶消化为单细胞，再用AnnxV进行活细胞染色，利用流式细胞仪上机检测胰岛β细胞凋亡水平。

如图7所示，结果显示，在高糖刺激下，D-葡萄糖溶液组的β细胞凋亡数量较未处理对照组增加明显，但茴香霉素处理组的β细胞凋亡细胞数量则下降明显。

由上述实验结果可证实，25nM的茴香霉素可使WFS1敲除的WS细胞模型中胰岛β细胞的在糖、脂毒性诱导的凋亡水平下降，即可抵抗WS细胞模型中糖尿病环境下脂、糖毒性诱导的细胞凋亡。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 同济大学

<120> 一种改善Wolfram综合征中胰岛β细胞凋亡情况的药物

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attgagtcgg gaacgcgcc 19

<210> 2

<211> 9585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aattgaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac 60

gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag 120

tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat 180

gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt 240

tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg attgagtcgg gaacgcgccg ttttagagct 300

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 360

ggtgcttttt ttacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg 420

gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc 480

ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 540

atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact 600

gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat 660

gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact 720

tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg gtcgaggtga gccccacgtt 780

ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt 840

ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg 900

ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg 960

gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc 1020

gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgt tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgcgccg 1080

cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg 1140

acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctc gtttcttttc 1200

tgtggctgcg tgaaagcctt aaagggctcc gggagggccc tttgtgcggg ggggagcggc 1260

tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggccc gcgctgcccg 1320

gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcgtg tgcgcgaggg 1380

gagcgcggcc gggggcggtg ccccgcggtg cgggggggct gcgaggggaa caaaggctgc 1440

gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcggcggt cgggctgtaa 1500

cccccccctg cacccccctc cccgagttgc tgagcacggc ccggcttcgg gtgcggggct 1560

ccgtacgggg cgtggcgcgg ggctcgccgt gccgggcggg gggtggcggc aggtgggggt 1620

gccgggcggg gcggggccgc ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc gcggcggccc 1680

ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc 1740

gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc ccaaatctgt gcggagccga aatctgggag 1800

gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga 1860

aatgggcggg gagggccttc gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc 1920

tcggggctgt ccgcaggggg acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg 1980

cttctggcgt gtgaccggcg gctctagtgc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt 2040

tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga 2100

attctctaga gatatcgcta gcaccatgga ctacaaagac catgacggtg attataaaga 2160

tcatgacatc gattacaagg atgacgatga caagatggcc cccaagaaga agaggaaggt 2220

gggcattcac cgcggggtac ccatggacaa gaagtactcc attgggctcg atatcggcac 2280

aaacagcgtc ggctgggccg tcattacgga cgagtacaag gtgccgagca aaaaattcaa 2340

agttctgggc aataccgatc gccacagcat aaagaagaac ctcattggcg ccctcctgtt 2400

cgactccggg gagacggccg aagccacgcg gctcaaaaga acagcacggc gcagatatac 2460

ccgcagaaag aatcggatct gctacctgca ggagatcttt agtaatgaga tggctaaggt 2520

ggatgactct ttcttccata ggctggagga gtcctttttg gtggaggagg ataaaaagca 2580

cgagcgccac ccaatctttg gcaatatcgt ggacgaggtg gcgtaccatg aaaagtaccc 2640

aaccatatat catctgagga agaagcttgt agacagtact gataaggctg acttgcggtt 2700

gatctatctc gcgctggcgc atatgatcaa atttcgggga cacttcctca tcgaggggga 2760

cctgaaccca gacaacagcg atgtcgacaa actctttatc caactggttc agacttacaa 2820

tcagcttttc gaagagaacc cgatcaacgc atccggagtt gacgccaaag caatcctgag 2880

cgctaggctg tccaaatccc ggcggctcga aaacctcatc gcacagctcc ctggggagaa 2940

gaagaacggc ctgtttggta atcttatcgc cctgtcactc gggctgaccc ccaactttaa 3000

atctaacttc gacctggccg aagatgccaa gcttcaactg agcaaagaca cctacgatga 3060

tgatctcgac aatctgctgg cccagatcgg cgaccagtac gcagaccttt ttttggcggc 3120

aaagaacctg tcagacgcca ttctgctgag tgatattctg cgagtgaaca cggagatcac 3180

caaagctccg ctgagcgcta gtatgatcaa gcgctatgat gagcaccacc aagacttgac 3240

tttgctgaag gcccttgtca gacagcaact gcctgagaag tacaaggaaa ttttcttcga 3300

tcagtctaaa aatggctacg ccggatacat tgacggcgga gcaagccagg aggaatttta 3360

caaatttatt aagcccatct tggaaaaaat ggacggcacc gaggagctgc tggtaaagct 3420

taacagagaa gatctgttgc gcaaacagcg cactttcgac aatggaagca tcccccacca 3480

gattcacctg ggcgaactgc acgctatcct caggcggcaa gaggatttct accccttttt 3540

gaaagataac agggaaaaga ttgagaaaat cctcacattt cggataccct actatgtagg 3600

ccccctcgcc cggggaaatt ccagattcgc gtggatgact cgcaaatcag aagagaccat 3660

cactccctgg aacttcgagg aagtcgtgga taagggggcc tctgcccagt ccttcatcga 3720

aaggatgact aactttgata aaaatctgcc taacgaaaag gtgcttccta aacactctct 3780

gctgtacgag tacttcacag tttataacga gctcaccaag gtcaaatacg tcacagaagg 3840

gatgagaaag ccagcattcc tgtctggaga gcagaagaaa gctatcgtgg acctcctctt 3900

caagacgaac cggaaagtta ccgtgaaaca gctcaaagaa gactatttca aaaagattga 3960

atgtttcgac tctgttgaaa tcagcggagt ggaggatcgc ttcaacgcat ccctgggaac 4020

gtatcacgat ctcctgaaaa tcattaaaga caaggacttc ctggacaatg aggagaacga 4080

ggacattctt gaggacattg tcctcaccct tacgttgttt gaagataggg agatgattga 4140

agaacgcttg aaaacttacg ctcatctctt cgacgacaaa gtcatgaaac agctcaagag 4200

gcgccgatat acaggatggg ggcggctgtc aagaaaactg atcaatggga tccgagacaa 4260

gcagagtgga aagacaatcc tggattttct taagtccgat ggatttgcca accggaactt 4320

catgcagttg atccatgatg actctctcac ctttaaggag gacatccaga aagcacaagt 4380

ttctggccag ggggacagtc ttcacgagca catcgctaat cttgcaggta gcccagctat 4440

caaaaaggga atactgcaga ccgttaaggt cgtggatgaa ctcgtcaaag taatgggaag 4500

gcataagccc gagaatatcg ttatcgagat ggcccgagag aaccaaacta cccagaaggg 4560

acagaagaac agtagggaaa ggatgaagag gattgaagag ggtataaaag aactggggtc 4620

ccaaatcctt aaggaacacc cagttgaaaa cacccagctt cagaatgaga agctctacct 4680

gtactacctg cagaacggca gggacatgta cgtggatcag gaactggaca tcaatcggct 4740

ctccgactac gacgtggatc atatcgtgcc ccagtctttt ctcaaagatg attctattga 4800

taataaagtg ttgacaagat ccgataaaaa tagagggaag agtgataacg tcccctcaga 4860

agaagttgtc aagaaaatga aaaattattg gcggcagctg ctgaacgcca aactgatcac 4920

acaacggaag ttcgataatc tgactaaggc tgaacgaggt ggcctgtctg agttggataa 4980

agccggcttc atcaaaaggc agcttgttga gacacgccag atcaccaagc acgtggccca 5040

aattctcgat tcacgcatga acaccaagta cgatgaaaat gacaaactga ttcgagaggt 5100

gaaagttatt actctgaagt ctaagctggt ctcagatttc agaaaggact ttcagtttta 5160

taaggtgaga gagatcaaca attaccacca tgcgcatgat gcctacctga atgcagtggt 5220

aggcactgca cttatcaaaa aatatcccaa gcttgaatct gaatttgttt acggagacta 5280

taaagtgtac gatgttagga aaatgatcgc aaagtctgag caggaaatag gcaaggccac 5340

cgctaagtac ttcttttaca gcaatattat gaattttttc aagaccgaga ttacactggc 5400

caatggagag attcggaagc gaccacttat cgaaacaaac ggagaaacag gagaaatcgt 5460

gtgggacaag ggtagggatt tcgcgacagt ccggaaggtc ctgtccatgc cgcaggtgaa 5520

catcgttaaa aagaccgaag tacagaccgg aggcttctcc aaggaaagta tcctcccgaa 5580

aaggaacagc gacaagctga tcgcacgcaa aaaagattgg gaccccaaga aatacggcgg 5640

attcgattct cctacagtcg cttacagtgt actggttgtg gccaaagtgg agaaagggaa 5700

gtctaaaaaa ctcaaaagcg tcaaggaact gctgggcatc acaatcatgg agcgatcaag 5760

cttcgaaaaa aaccccatcg actttctcga ggcgaaagga tataaagagg tcaaaaaaga 5820

cctcatcatt aagcttccca agtactctct ctttgagctt gaaaacggcc ggaaacgaat 5880

gctcgctagt gcgggcgagc tgcagaaagg taacgagctg gcactgccct ctaaatacgt 5940

taatttcttg tatctggcca gccactatga aaagctcaaa gggtctcccg aagataatga 6000

gcagaagcag ctgttcgtgg aacaacacaa acactacctt gatgagatca tcgagcaaat 6060

aagcgaattc tccaaaagag tgatcctcgc cgacgctaac ctcgataagg tgctttctgc 6120

ttacaataag cacagggata agcccatcag ggagcaggca gaaaacatta tccacttgtt 6180

tactctgacc aacttgggcg cgcctgcagc cttcaagtac ttcgacacca ccatagacag 6240

aaagcggtac acctctacaa aggaggtcct ggacgccaca ctgattcatc agtcaattac 6300

ggggctctat gaaacaagaa tcgacctctc tcagctcggt ggagacagca gggctgaccc 6360

caagaagaag aggaaggtga ccggtgcaac aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga 6420

tgtcgaagag aatcctggac cgaccgagta caagcccacg gtgcgcctcg ccacccgcga 6480

cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc gccgactacc ccgccacgcg 6540

ccacaccgtc gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct 6600

cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg gacgacggcg ccgcggtggc 6660

ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg 6720

catggccgag ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc 6780

gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggagtct cgcccgacca 6840

ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc 6900

cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac ctccccttct acgagcggct 6960

cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac 7020

ccgcaagccc ggtgcctgat gtacaagtaa ctgcagcgcg gggatctcat gctggagttc 7080

ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc 7140

acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc 7200

atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca 7260

tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 7320

gccggaagca taaagtgtaa agcctagggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 7380

gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 7440

atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 7500

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 7560

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 7620

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 7680

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 7740

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 7800

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 7860

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 7920

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 7980

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 8040

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 8100

agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 8160

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 8220

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 8280

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 8340

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 8400

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 8460

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 8520

cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 8580

gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 8640

gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 8700

tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 8760

tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 8820

tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 8880

aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 8940

atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 9000

tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 9060

catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 9120

aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 9180

tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 9240

gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 9300

tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 9360

tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 9420

gacggatcgg gagatcgatc tcccgatccc ctagggtcga ctctcagtac aatctgctct 9480

gatgccgcat agttaagcca gtatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag 9540

tgcgcgagca aaatttaagc tacaacaagg caaggcttga ccgac 9585

Claims (7)

1.茴香霉素在制备药物中的用途，所述药物用于：

治疗WFS1低表达导致的胰岛β细胞损伤相关的胰岛素依赖型糖尿病。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述茴香霉素是单一有效成分。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胰岛β细胞损伤为脂毒性的胰岛β细胞损伤。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胰岛β细胞损伤为糖毒性的胰岛β细胞损伤。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于提高个体或组织中的胰岛β细胞的比例。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于降低个体或组织中的胰岛β细胞凋亡水平。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于降低个体或组织中的胰岛β细胞中的锌离子含量。