KR101203817B1 - 재조합 아데노바이러스를 위한 포장 세포 - Google Patents

Abstract

재조합 아데노바이러스 벡터 및 포장 세포의 게놈 사이의 실질적인 서열 중복의 부재시에, 헬퍼 의존성 E1-함유 입자(HDEP)는 낮은 빈도로 형성될 수 있다. 본 발명은 HDEP의 생성을 감소시키거나 방지하는 수단 및 방법을 제공한다. 이러한 목적으로, 신규한 포장 세포 및 이들을 제조하는 방법이 제공된다.

재조합, 중복

Description

재조합 아데노바이러스를 위한 포장 세포{PACKAGING CELLS FOR RECOMBINANT ADENOVIRUS}

본 발명은 분자 및 세포 생물학, 더 상세하게는 포장 세포(packaging cells) 및 재조합 아데노바이러스의 회분(batch)의 생성을 위한 그것의 용도에 관한 것이다.

복제 결핍 재조합 아데노바이러스는 예를 들어서 유전자 치료 및 예방접종 목적에 유용하다. 그것들은 보통 아데노바이러스의 E1-영역이 결여되어 있고, 따라서 E1 서열을 제공하는 상보 세포 상에서 증식된다. 포장 세포는 재조합 바이러스 입자를 형성하기 위해 세포 내에 포장된 벡터의 복제에 필요한 모든 정보를 제공한다. 포장 세포의 예로는 아데노바이러스 5 게놈(Louis et al, 1997)의 뉴클레오티드 1-4344를 함유하는 293 세포가 있고, 그것은 5` 역방위 말단반복(ITR), 포장 신호, E1A 및 E1B 코딩 서열 및 pIX 코딩 서열을 포함한다. 포장 세포 내 아데노바이러스 서열들과 벡터 사이의 중복은 이 서열들 간의 상동 재조합을 일으킬 수 있고, 복제능(replication competent) 아데노바이러스(RCA) (Lochmuller et al., 1994)의 생성을 가져온다. 이 문제는 그러한 중복된 서열을 결핍시킴으로써 서로에게 조화되는(Fallaux et al., 1998; 미국 특허 5,994,128), 세포주 및 벡터로 이루어진 포 장 시스템을 사용함으로써 해결되었다. 그러한 적용에서 특히 유용한 세포주의 한 예로는 PER.C6^® 세포주가 있다(미국 특허 5,994,128; Nichols et al, 2002).

최근에, PER.C6^®의 게놈에 E1 서열을 갖는 177 bp 서열 상동성을 여전히 함유한 벡터와 함께 PER.C6^® 세포를 사용할 때, 단일 교차 이벤트는 헬퍼 의존성 복제능 바이러스의 생성을 낮은 빈도로 가져올 수 있다는 것이 보고되었다. 생성된 비정형 RCA는 헬퍼-의존성 E1 함유 입자(HDEP)라고 불렸다. 예상된 것과 같이, PER.C6^® 세포의 게놈의 E1 서열과 서열 중복이 결여된 벡터가 사용될 때 이러한 유형의 입자의 출현은 회피되었다(Murakami et al, 2002).

하지만, 조화된(matched) 벡터 및 PER.C6^® 세포의 시스템을 사용하여, 재조합 아데노바이러스의 일부 회분이 E1 서열이 결여된 세포에서 세포병리학적 효과(CPE)를 일으킬 수 있는 입자로 매우 낮은 빈도로 오염되는 것이 예기치 않게 현재 나타난다. 입자는 헬퍼-의존성이고 E1-서열을 함유하며, 그러므로 또한 HDEP이다. 이 HDEP는 벡터와 포장 세포 간의 실질적인 상동성이 없는 때에 생성된다(Murakami et al, 2004 참조). RCA는 잠재적 문제로써 제어 당국에 의해 인식되고 임상적 사용을 위한 회분에서의 RCA의 검출은 필수적이지만(USDHHS, FDA, CBER. Guidance for Industry, Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy, March 1998), HDEP의 안전성 양상은 불분명하다. HDEP는 그것이 자율적 복제를 위해 필요한 바이러스 유전자가 없기 때문에 복제 결핍이고 따라서 HDEP는 숙주에 확산되지 않을 것이다. 하지만, 동일한 세포 내에서의 재조합 벡터 또는 야생-형 아데노바이러스의 존재가 HDEP의 구원 및 확산을 일으킬 수 있는 이론상의 가능성이 전혀 배제될 수는 없다. 그러므로, 재조합 아데노바이러스 입자 회분의 제조 중에 E1-함유 입자의 생성을 방지하는 수단 및 방법에 대한 최소한 잠재적인 필요성이 있다. 이러한 목적에, 본 발명은 무(free)-RCA 및 무-HDEP 재조합 아데노바이러스 벡터의 회분을 만들기 위해 신규한 세포주를 제조하는 방법, 및 그것의 용도를 제공한다.

본 발명은 아데노바이러스 E1A 및 E1B 서열을 포함하고 있는 포장 세포의 생성 방법을 기술하는데, 여기서 E1A 및 E1B 코딩 영역 중 하나 이상은 세포의 게놈에서 서로로부터 떨어져 있다. 3 이상의 구현예가 이러한 목적에 제공된다. 첫 번째 구현예에서, E1A 및 E1B는 시간 상 다른 순간에 전구체 세포에 도입될 수 있고, 그것은 E1A 및 E1B가 동일한 염색체 위치 상에 공-통합되는 가능성을 감소시킨다. 두 번째 구현예에서, 동일한 유전자자리로의 공-통합 가능성은 E1A 및 E1B 코딩 서열을, 이러한 서열 간의 상동 재조합을 일으킬 수 있는 중복 서열이 결여된 두 개의 다른 분자상의 전구체 세포로 도입함으로써 감소된다. 세 번째 구현예에서, E1A 및 E1B 코딩 영역 중 하나 이상은, 이러한 서열이 주어진 거리로 떨어져 있는 하나의 핵산 분자에 의해 도입된다. 세 번째 구현예에서, 단일 핵산 분자 대신에, 또한 E1A 및 E1B 코딩 영역 중 하나 이상이 주어진 거리로 떨어져 있는 기준을 충족시키는 2 이상의 핵산 분자가, 이러한 2 이상의 분자가 예를 들면 연결, 재조합 및 기타 다른 종류의 방법에 의해 하나의 분자를 형성한다면, 도입될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 그 결과의 포장 세포는 E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 영역이 서로로부터 거리를 두고 존재한다는 점을 특징으로 하고, 따라서 E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 서열이 함께 그러한 포장 세포 상에 증식된 재조합 아데노바이러스의 게놈으로 편입되는 가능성이 감소된다.

본 발명은 헬퍼 의존성 E1 함유 입자를 생성시키지 않고서 E1 결핍 아데노바이러스 벡터를 보충할 수 있는 세포를 제조하는 방법을 제공하는데, 하기의 단계를 포함한다: a) E1A 유전자 기능 및 E1B 유전자 기능, 또는 전구체 세포가 이미 E1A 또는 E1B 유전자 기능의 하나를 포함한다면, 나머지 E1A 또는 E1B 유전자 기능을 코딩하는 세포 핵산 서열(들)을 세포의 전구체(precursor) 또는 선구체(ancestor)로 도입하는 단계; 및 b) 세포들이 하나 이상의 E1 유전자 기능이 결여된 재조합 아데노바이러스 벡터를 보충하는데 사용될 때, 헬퍼 의존성 E1 함유 입자의 형성을 방지하는 염색체 배치로 얻어진 E1A 및 E1B를 갖는 세포들을 선택하거나 확인하는 단계, 상기 벡터는, 결여되지 않으면 상동 재조합을 일으킬 수 있는 염색체에 위치된 E1 서열과 실질적인 중복을 갖는 핵산 서열이 결여되어 있다.

하나의 양상에서, 본 발명은 그것의 게놈에 아데노바이러스 E1A 및 E1B-19K 및 E1B-55K 코딩 서열을 갖는 세포를 제조하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 서열을 포함하는 핵산 서열이 전구체 세포로 도입되고, 상기 방법은: a) 상기 서열을 함께 포함하는 2 이상의 핵산 분자가 전구체 세포로 도입되는데, 여기서 상기 E1A 및 E1B 코딩 서열 중 하나 이상은 다른 핵산 분자 상에 존재하고, 그것은 시간상 다른 순간에 전구체 세포로 도입되고, 여기서 상기 전구체 세포는 새끼 랫트 신장 세포는 아니고; 또는 b) E1A 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자 및 E1B 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자가 전구체 세포로 도입되는데, 여기서 상기 핵산 분자는 상기 2 이상의 분자 간의 상동 재조합을 일으킬 수 있는 실질적인 중복이 결여되어 있고; 또는 c) E1A 및 E1B 코딩 서열 중 하나 이상을 포함하는 상기 핵산 서열은 이들이 단일 핵산 분자를 형성할 때 단일 핵산 분자 상에서 또는 둘 이상의 핵산 분자 상에서 4kb 이상 떨어져 있는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 구현예 c)에서, 상기 서열은 10kb 이상, 더 바람직하게는 34.5kb 이상 떨어져 있다. 바람직하게는 분리시키는 서열은 무-E1 서열이어서, 단일 바이러스 게놈에서 E1A 및 E1B의 두 발현 카세트의 통합의 가능성이 매우 적거나 불가능하다. 대안으로, E1A 및 E1B 서열 중 하나 이상이 0-15kb로 떨어져 있을 때, 생성된 세포에서의 E1-서열의 역방위 반복의 부재에 대한 스크린(screen)이 세포의 선택에 사용될 수 있고, 여기서 생성된 세포에서의 재조합 아데노바이러스의 증식 시 HDEP를 생성시킬 가능성은 감소되거나 없다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 세포를 제공한다. 본 발명은 그것의 게놈에 아데노바이러스 E1A 및 E1B-55K 및 E1B-19K 코딩 서열을 포함하는 세포를 추가로 제공하는데, 상기 세포는 핵산 서열의 확장(stretches)이 결여되어 있다는 것을 특징으로 하는데, 여기서 상기 E1A 및 E1B 코딩 서열 둘 다는 상기 게놈에서 4kb 미만으로 떨어져 있다. 바람직하게는 상기 세포는 핵산 서열의 확장이 결여되어 있고, 여기서 상기 E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 서열은 상기 게놈에서 10kb 미만 떨어져 있고, 더 바람직하게는 상기 세포는 핵산 서열의 확장이 결여되어 있고, 여기서 상기 E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 서열은 상기 게놈에서 34.5kb 미만 떨어져 있다.

아데노바이러스 E1 서열을 포함하고 있는 세포를 제공하거나 생성시키는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또 하나의 양상인데, 여기서 상기 E1 서열은 E1A 및 E1B 코딩 서열을 포함하고, 상기 방법은 상기 E1 서열을 포함하고 있는 역방위 반복이 결여되어 있는 세포를 선택하는 단계를 포함한다는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 그것의 게놈에 아데노바이러스 E1 서열을 포함하는 세포를 추가로 제공하는데, 여기서 상기 E1 서열은 E1A 및 E1B 코딩 서열을 포함하고, 상기 E1 서열은 상기 게놈에 역방위 반복의 형태로 존재하지 않는다는 것을 특징으로 한다. 그것의 하나의 구현예에서, 상기 세포는 그것의 게놈에 상기 아데노바이러스 서열의 2 이상의 복사체를 포함하고, 복사체는 동일한 염색체 상에 있을 수 있다. 그것의 또 하나의 구현예에서, 상기 세포는 그것의 게놈에 상기 E1 서열의 하나의 복사체를 포함하고, 그것의 게놈에 아데노바이러스의 (기능성) pIX를 암호화하는 서열이 추가로 결여되어 있다.

E1 영역에 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스의 회분을 생성시키는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또 하나의 양상이고, 상기 방법은: a) 상기 재조합 아데노바이러스를 상기 재조합 아데노바이러스의 결실된 E1 서열을 보충할 수 있는 아데노바이러스의 E1 서열을 포함하는 세포로 도입하는 단계; b) 상기 세포를 배양하고 상기 재조합 아데노바이러스를 수확하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 상기 세포가 본 발명에 따른 세포라는 것을 특징으로 한다. 상기 재조합 아데노바이러스를 도입하는 대신에, 상기 재조합 아데노바이러스의 게놈을 형성할 수 있는 하나 이상의 핵산 단편을 사용함으로써 재조합 아데노바이러스의 생성을 시작하는 것이 또한 가능하다는 것이 당업자에게 분명할 것이고, 그것은 상기 세포에서 복제 및 포장 후에 상기 재조합 아데노바이러스를 형성할 것이다. 따라서, 이러한 구현예를 위해, 재조합 아데노바이러스는 또한 재조합 아데노바이러스의 게놈일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 재조합 아데노바이러스는 상동 재조합을 일으킬 수 있는, 상기 세포에 존재하는 E1 서열과 실질적인 서열 중복이 결여되어 있다. 게다가 또 하나의 구현예에서, 본 발명은 그것의 게놈에 E1 서열을 포함하고 있는 포장 세포 및 E1 영역에 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함하고 있는 포장 시스템을 제공하는데, 여기서 상기 벡터의 게놈은 상기 포장 세포의 게놈에서 E1 서열과 실질적인 중복이 결여되어 있고, 상기 포장 세포는 본 발명에 따른 세포라는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상세한 설명

복제능 아데노바이러스(RCA)는 헬퍼 아데노바이러스에 대한 필요가 없이 세포에서 복제할 수 있는 아데노바이러스 입자이다. 여기서 사용되는 것과 같은 'HDEP'(헬퍼 의존성 E1-함유 입자)는 아데노바이러스로부터 적어도 E1A 및 E1B-55K 코딩 서열을 포함하고 있는 바이러스 입자로써 정의되고, 상기 입자는 '헬퍼 바이러스'의 부재시에 기능 E1A 및/또는 E1B-55K가 없는 세포에서 복제할 수 없다. 헬퍼 바이러스는 야생형 또는 돌연변이 아데노바이러스일 수 있지만 또한 HDEP에서 잃어버린 기능을 제공하는 어떤 아데노바이러스 벡터일 수 있고, 따라서 포장 세포 상에서 증식된 (E1 결핍) 원하는 생성물 재조합 아데노바이러스에 의해 제공될 수 있다. E1A 및 E1B 55K 서열은 아데노바이러스의 증식을 위해 필요하다. HDEP는 보통 E1B-19K 코딩 서열을 추가로 함유한다. HDEP에 존재하는 E1 서열은 재조합 E1-결핍 아데노바이러스를 보충(complement)할 수 있어야 하고, 그것은 HDEP를 위한 헬퍼 바이러스로써 작용할 수 있다. HDEP는 포장 세포 및 벡터에서 E1 서열 간의 중복 상의 상동 재조합에 의해 생성될 수 있지만(Murakami et al, 2002), 지금 여러 연구에서 예상치 않게 나타나듯이, 그것은 또한 포장 세포 및 벡터에서 서열들 사이의 실질적인 상동성/중복의 부재시에, 즉, 여기서 비-상동 재조합으로써 부르는 방법에 의해 생성될 수 있다(HDEP의 가능한 구조에 대한 Murakami et al, 2004. 참조). 따라서 여기서 사용되듯이 '실질적 중복(substantial overlap)'은 상동 재조합에 대한 충분한 중복으로써 정의된다. 본 발명이 '실질적 중복의 부재'라고 부르는 구현예에서 어떤 경우에, 단지 50 뉴클레오티드(nt), 바람직하게는 40nt 미만, 더 바람직하게는 30nt 미만, 훨씬 더 바람직하게는 20nt 미만, 훨씬 더 바람직하게는 10nt 미만의 중복이 존재하거나, 가장 바람직하게는 전혀 중복이 결여되어 있다면 이러한 조건이 이행되었다고 간주된다. HDEP의 형성 메카니즘은 현재 완전히 이해되고 있지 않지만, 거기서 E1 서열이 포장 세포의 게놈에서 유래한다는 것은 분명하다. 재조합 아데노바이러스 회분에서 E1 서열의 존재는 불필요하고, 그것은 RCA 또는 HDEP의 형태이다. 본 발명은 HDEP를 생성시킬 가능성을 최소화시키는 방법 및 수단을 제공한다. 거기에, 세포 및 그 결과의 세포를 제조하는 방법이 제공되는데, 여기서 벡터 및 본 발명의 보충 세포의 염색체에 위치된 E1 서열 간의 실질적인 서열 중복의 부재시에, 상기 세포는 재조합 아데노바이러스로의 E1A 및 E1B 코딩 서열의 도입, 및 그래서 세포가 E1-결핍 재조합 아데노바이러스 벡터의 보충을 위해 사용될 때 HDEP의 형성을 방지하는 염색체 배치로 E1A 및 E1B를 가진다. 이러한 목적으로, 본 발명의 한 구현예에 따른 세포의 염색체의 구조는 E1A 및 E1B 코딩 영역 중 하나 이상이 신규한 세포의 게놈에서 떨어져 있다. 역방위 반복은 아데노바이러스 서열의 결실을 자극함으로써 HDEP의 형성에 기여한다고 믿어지므로, 또 하나의 구현예에서 본 발명은 E1A 및 E1B 코딩 서열을 포함하는 세포를 제공하는데, 여기서 E1 서열은 상기 포장 세포의 게놈에서 역방위 반복 구조에 존재하지 않는다.

본 발명의 세포는 그것들의 게놈에 아데노바이러스 E1A 및 E1B 코딩 서열을 포함하고, 바람직하게는 그것들은 그것들의 게놈에 모든 기능 E1A 및 둘 다의 E1B(E1B-55K 및 E1B-19K) 단백질에 대한 코딩 서열을 포함한다. E1A 및 하나 이상의 E1B 단백질은 본 발명에 따라 동일하거나 임의로 다른 혈청형(sorotype)일 수 있다.

바람직하게는 이러한 구현예들에서, 하나 이상의 E1A 및 E1B는 각각 E1A 및 E1B 프로모터와는 다른 프로모터에 의해 조절된다.

본 발명의 세포

재조합 아데노바이러스는 그것이 증식된 세포주로부터 >20kb의 DNA를 받아들일 수 있고, 효과적인 포장을 허용하는 아데노바이러스의 최대 게놈 길이는 대략 38kb이다(아데노바이러스 5형 기초 벡터에 대해; 이 특징은 혈청형에 다소 좌우될 수 있다). 이 특징은 본 발명에 따른 신규한 보충 세포를 제조하기 위해 사용되고, 상기 세포는 E1A 및 E1B 코딩 서열을 포함하고 상기 세포는 상기 E1A 및 하나 이상의 E1B 서열이 상기 게놈에서 4kb 이상, 바람직하게는 10kb 이상, 훨씬 더 바람직하게는 34.5kb 이상 떨어져 있다는 것을 특징으로 한다. 이는 그러한 세포의 게놈은 핵산 서열의 확장이 없다는 것을 의미하는데 여기서 상기 E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 서열들은 각각 4, 10 또는 34.5kb 미만으로 떨어져 있다(예를 들면, 도식적 표현을 위한 도 22 참조). 본 발명이 두 서열이 세포의 게놈에 주어진 거리 이상으로 떨어져 있다고 언급하는 곳 어디서나, 두 서열이 별도의 염색체에 존재할 때도 또한 이러한 조건이 충족되었다는 것이 명백할 것이다. 따라서, 두 서열이 다른 염색체에 있는 경우에 구현예는 여기서 사용되듯이 게놈에 'x kb 이상 떨어진' 또는 'x kb 이상으로 분리된'이라는 의미 내에 명백히 포함된다. 그러한 구현예는 당업자에게 알려진 방법, 예를 들면 형광 인시츄 혼성화(FISH)에 의해 쉽게 확인될 수 있고, 그것은 주어진 서열이 존재하는 경우에 염색체 및/또는 염색체 위치를 밝혀내도록 사용될 수 있다.

본 발명의 세포는 그것들의 게놈에 아데노바이러스 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 아데노바이러스 서열은 모든 E1 단백질을 암호화하지만 pIX를 암호화하는 서열, 또는 그것의 일부가 결여되어 있다 (즉, 그러한 세포들은 바람직하게는 pIX의 열린 판독틀로부터의 서열을 함유하지 않는다 (Ad5 E1 서열을 가진 세포들에 대해, 이것은 그것들이 바람직하게는 wt Ad5의 nt 3609-4031 또는 그것의 부분을 함유하지 않는다는 것을 의미한다), 그리고 더 바람직하게는 그것들은 또한 그 자신의 프로모터의 조절 하에 pIX를 가지는 아데노바이러스 벡터와의 상당한 중복을 방지하기 위해, pIX 프로모터에 결실을 가진다 (Ad5 E1 서열을 가진 세포들에 대해, 바람직하게는 nt 3550으로부터, 더 바람직하게는 3525로부터 pIX 프로모터 하류의 서열이 없음). 포장 세포의 게놈으로부터의 pIX 서열의 부재는 상기 게놈과 재조합 아데노바이러스 벡터 간의 중복을 방지하는데 도움을 준다 (미국 특허 5,994,128).

본 발명에 따른 세포는 A549, Hela 및 기타 같은 종류의 것과 같은 불멸화된 세포에서 유래될 수 있는데, 그런 경우에 선택 표지는 세포를 확립하는데 필요하다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 세포는 1차(primary) 세포로부터 유래되고, 그런 경우에 선택은 E1A 및 E1B 형질전환 활성에 의해 제공된다(실시예 참조). 바람직한 양상에서, 상기 세포는 망막 세포로부터 유래된다. 그것들은 인간 기원을 포함한, 어떤 기원의 세포일 수 있다. 인간 아데노바이러스의 증식을 위해서는, 인간 기원 세포가 바람직하다. 세포는 예를 들면 또한 재조합 소 아데노바이러스의 증식을 위해 소 기원일 수 있다 (미국 특허 6,379,944). 세포의 기원은 선택의 재조합 아데노바이러스와 양립(compatible)될 수 있도록 당업자에 의해 선택될 수 있다.

하나의 양상에서, 세포는 1차 인간 망막 세포에서 유래된다 (또한 HER 세포라고 불림). 아데노바이러스 E1 서열을 갖는 그런 세포의 불멸화는 예를 들면 US 특허 5,994,128, in byrk et al, 1982, 1988, and Gallimore et al, 1986에 기술되었다. 1차 HER 세포는 태아로부터 단리될 수 있다(Byrd et al, 1982, 1988). 다른 구현예에서, 세포는 1차 인간 배아 신장 세포에서 유래한다(예를 들면 Graham et al, 1977을 참조). 게다가 다른 구현예에서, 세포는 인간 1차 양수세포(amniocytes)와 같은, 1차 양수세포에서 유래한다(예를 들면, 아데노바이러스 E1 서열을 갖는 1차 양수세포를 불멸화시키는 방법에 대한 US 특허 6,558,948 참조).

세포의 생성

본 발명에 따른 세포는 아데노바이러스 E1A 및 E1B-55K 및 E1B-19K 코딩 서열을 전구체 또는 선구체 세포로 도입함으로써 생성될 수 있다 (따라서 세포는 E1 서열의 도입에 의해 전구체 또는 선구체 세포로부터 유래한다). 본 발명에 따라, 상기 E1A 및 E1B 코딩 서열 중 하나 이상은 비연결 방식으로 상기 전구체 세포로 도입된다. 이 함축에 사용되듯이 '비연결(unlinked)'은 아데노바이러스에서 발견되는 것과 같은 E1A 및 E1B의 자연적 배치와 다른 배치를 언급하는 것을 의미한다, 즉, 서로에 직접 인접해 있다 (예를 들면, 플라스미드 pIG.E1A.E1B에 존재하듯이 E1A 및 E1B의 자연적 -즉, '연결된'- 배치가 도시되는 도 14 참조). 본 발명에 이전에는 그것의 게놈에 아데노바이러스 E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 서열을 포함하고 있는 포장 세포를 얻고 싶어하는 당업자는 비연결 방식으로 E1A 및 하나 이상의 E1B 서열을 도입하는 것을 기도하지 않았을 것이라는 것이 유념되어야 한다. 왜냐하면 a)더 많은 작업이 있고 따라서 덜 편리하고, b) 둘 다의 E1A 및 E1B 서열이 불멸화를 위해 필요하기 때문이다. E1A 및 E1B 단백질의 형질전환 능력을 간파하기 위해 행해진 이전의 연구는, E1A 및 하나 이상의 E1B 코딩 서열의 도입이 확립된 클론을 일으킬 수 있다는 것을 증명했다 (van den Elsen et al., 1982; Gallimore et al., 1986; Jochemsen et al., 1987; Rao et al., 1992; Nevels et al., 2001). 하지만, 이들 플라스미드의 동시 도입, 및/또는 도입된 서열, 예를 들면 플라스미드 서열에서, 프로모터와 같은 조절 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호간의 중복, 및 E1B-55K 및 E1B-19K 중복 서열은 게놈에서 동일한 유전자자리에 E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 영역의 공-통합을 초래한다. 정말로 그러한 공-통합은 van den Elsen et al(1982)에 의해 관찰되었다. 하나의 경우에서(Jochemsen et al., 1987) 새끼 랫트 신장(BRK) 세포는 먼저 E1A로 트랜스펙션되었고 그 후에 채취된 클론은 E1A 발현에 대한 E1B 발현의 영향을 연구하기 위해 E1B 플라스미드로 트랜스펙션되었다. 명백히, 이 연구는 특정형의 세포에 대해 그리고 본 출원에 기술된 본 발명과 관련이 없는 이유에 대해 행해졌다. 본 발명 이전에는, 포장 세포를 생성시키기 위해 E1A 및 E1B 코딩 서열 중 하나 이상을 별도로 트랜스펙션할 이유가 없었다. 재조합 아데노바이러스의 게놈과 포장 세포 간의 실질적인 중복의 부재시에 HDEP의 형성은 지금까지는 기술되지 않았다. 더욱이, Gallimore et al. (1986)은 인간 세포가 E1A를 발현시킴으로써만 단지 드물게 형태학적으로 형질전환되었고 대부분의 클론은 본래 또는 단리 후 즉시 죽었다는 것을 기술했으므로, 당업자는 사실 예를 들면 인간 세포와 같은 BRK-유래 세포와는 다른 것을 얻기 위해 이 방법을 사용하는 것을 단념했을 것이다. Ad12(아집단 A) E1A 발현 플라스미드가 클론을 초래한 단 하나의 경우가 트랜스펙션 114일 후에 확인되었고 클론이 디쉬에서 과도성장된 후에 겨우 채취될 수 있었다. 명백히 당업자는 종래의 당업에 기초하여 시간상 별도의 순간에 E1A 및 하나 이상의 E1B 유전자를 전구체 세포로 도입하도록 동기를 부여받지 못할 것이다. 그것들의 게놈에서 떨어져 있는, E1A 및 하나 이상의 E1B 코딩 서열을 갖는 세포를 얻는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 장점이다. 어떤 양상에서는, 본 발명의 세포는 바람직하게는 새끼 랫트 신장(BRK) 세포가 아니다. 하나의 바람직한 양상에서 본 발명의 세포는 인간 세포이다. 바람직한 양상에서, 세포는 HER 세포 유래이다. E1 서열이 본 발명에 따라 도입된 세포는 바람직하게는 상기 도입전에는, 그것들의 게놈에 아데노바이러스 E1A 및 E1B 코딩 서열이 결여되어 있고, 서열의 도입시에만 그것들의 게놈에 E1 서열을 획득할 것이라는 것이 명백할 것이다. 이로써 불멸화되고 E1 영역에 결실이 있는 재조합 아데노바이러스를 포장할 수 있다. 예를 들면, WO 03/031633은 Ad11 E1B-55k의 293 세포로의 도입을 기술한다: 293에 이미 존재하는 것과 같은 E1 서열이 원래 배치로 남아 있고 E1A ORF와 4kb 미만으로 떨어져 있는 E1B ORF를 가질 것이므로, 이것은 본 발명의 장점을 분명히 이끌지 못할 것이다. 대조적으로, 본 발명은 그것들의 게놈에 E1A 및 E1B-19K 및 E1B-55K 코딩 서열을 갖는 세포를 생성하는 방법뿐만 아니라 상기 방법으로부터 세포를 제공하는데, 여기서 E1A 및 E1B 코딩 서열 중의 하나 이상을 포함하는 핵산 서열은 세포의 게놈으로부터 단일 아데노바이러스 입자의 게놈으로의 모든 E1A 및 E1B 서열의 동시 도입을 방지하도록 서로로부터 충분히 떨어져 있다.

본 발명의 세포를 생성시키기 위한 첫 번째 구현예에 따라, E1A 및 E1B 코딩 서열 중 하나 이상은 그것들을 시간상 다른 순간에 상기 세포로 도입되는 별도의 분자에 위치시킴으로써 상기 전구체 세포로 별도로 도입되고, 상기 전구체 세포는 BRK 세포가 아니다. 여기의 하나의 구현예에서, E1B-55K 코딩 서열은 시간상 나중 순간에 도입되는 반면, 먼저 E1A 및 E1B-21K 코딩 서열이 도입된다.

본 발명의 세포를 생성시키기 위한 두 번째 구현예에 따라, 상기 E1A 및 상기 E1B 코딩 서열을 함께 포함하는 2 이상의 핵산 분자가 상기 전구체 세포로 도입되고, 상기 2 이상의 핵산 분자는 실질적인 중복 서열이 결여되어 있다는 것을 특징으로 한다. 그러한 중복 서열의 존재는 상기 2 이상의 분자 사이의 최소한 어떤 방법의 상호작용과 상기 분자가 도입된 전구체 세포의 게놈의 동일한 유전자자리로의 상기 분자 상의 서열의 그 이후의 공-통합의 가능성을 향상시킨다고 믿어지는데, 이것을 회피하는 것이 본 발명의 목적이다. 이것의 한 구현예에서, E1A 및 E1B 코딩 영역 하나 이상이 프로모터와 폴리아데닐화 서열과 같은, 다른 이종 조절 서열의 조절 하에 놓여진다. 이것의 또 하나의 구현예에서, 중복된 E1B-55K 및 E1B-19K 서열은 떨어져 있고 당업자에게 알려진 방법에 따라, 이러한 코딩 서열 간의 모든 중복은 유전암호의 중복성 지식을 사용하여 유전공학에 의해 제거되고, 이로써 이러한 E1B 코딩 서열의 독립적으로 도입을 허용하고 서로로부터 비연결된다. 이 구현예에서 E1A 및 E1B 코딩 영역의 도입은 예를 들어서 상기 2 이상의 분자의 공-트랜스펙션에 의해 동시에 있을 수 있지만 분명히, 첫번째 및 두번째 구현예는 또한 즉, E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 서열을 함께 포함하고 있는 핵산 서열을 포함하는 2 이상의 분자의 도입과 같이, 조합될 수 있고, 여기서 상기 2 이상의 분자는 서로에 대하여 실질적 중복이 결여되어 있고, 여기서 상기 2 이상의 분자는 시간상 다른 순간에 전구체 세포로 도입된다.

세 번째 구현예에서, 서열 암호화 E1A와 E1B 코딩 서열의 하나 이상은 그것들을 단일 핵산 분자에 넣음으로써 비연결되는데, 여기서 상기 E1A 및 E1B 코딩 서열의 하나 이상은 (분명히 이것은 또한 둘 다의 E1B 코딩 서열일 수 있다) 여기서 '스페이서' 또는 '스터퍼' 핵산으로 불리는, 핵산의 4kb 이상, 바람직하게는 6kb 이상, 더 바람직하게는 8kb 이상, 훨씬 더 바람직하게는 10kb 이상, 훨씬 더 바람직하게는 15kb 이상, 가장 바람직하게는 34.5kb 이상 떨어져 있다. 스페이서 핵산 서열은 스페이서 핵산 서열에 대해 기술된 기반으로써의 특징을 유리하게 가질 수 있고, 특히 상기 서열은 E1A 및 E1B 코딩 서열이 없고 적어도 인트론 서열의 부분에 구축될 수 있고, E1A 및/또는 E1B 코딩 서열의 조절 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, (상동) 재조합 또는 연결 또는 말단-대-말단(end-to-end) 접합(join)에 의해, 상기 다른 핵산 분자가 단일 분자를 형성할 때 최소한 지시된 거리만큼 서열이 여전히 떨어져 있는 한, 세 번째 구현예의 동일한 변이체에서 상기 E1A 및 E1B 코딩 서열 중의 하나 이상은 하나의 분자 대신에 다른 핵산 분자들 상에 존재할 수 있다는 것이 즉시 명확할 것이다(예를 들면, 도 13 Ⅰ, Ⅱ, 및 예를 들어서 실시예 3 참조). 또한 그러한 경우에, E1A 및 하나 이상의 E1B 코딩 서열은 전구체 세포의 게놈으로 통합할 때(예를 들면, 실시예 3 및 도 21 참조), 4kb 이상, 바람직하게는 6kb 이상, 더 바람직하게는 8kb 이상, 훨씬 더 바람직하게는 10kb 이상, 훨씬 더 바람직하게는 15kb 이상, 가장 바람직하게는 34.5kb 이상으로 여전히 떨어져 있을 것이라고 생각된다. 다른 말로, 본 발명의 세 번째 구현예는 따라서 E1A 및 E1B-19K 및 E1B-55K 코딩 서열을 포함하는 단일 핵산 분자 ('분자 A')를 전구체 세포로 도입함으로써 수행될 수 있고, 이들 3 코딩 서열 중 둘 이상은 최소한 4kb으로 떨어져 있거나(구현예 3a); 또는 이것들이 단일 핵산 분자를 형성할 때 '분자 A'를 형성하는 2 이상의 핵산분자를 도입함으로써 동등하게 잘 떨어지게 된다(구현예 3b). 세 번째 구현예의 어떤 양상에서, 이러한 떨어지게 된 서열들 사이의 상호작용 및 가능한 상동 재조합의 가능성을 감소시키기 위해, E1A 및 E1B의 측면에 있는 스페이서 핵산들 사이에 또는 E1A 및 E1B 코딩 서열에 대한 조절 서열에는, 실질적으로 중복 서열이 결여되어 있다.

E1A 및 E1B 를 암호화하는 재조합 분자

하나의 양상에서, 본 발명은 아데노바이러스 E1A 단백질 및 하나 이상의 아데노바이러스 E1B 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 분자를 제공하고, E1A 단백질을 암호화하는 상기 핵산 서열 및 하나 이상의 E1B 단백질을 암호화하는 상기 핵산 서열은 4kb 이상, 바람직하게는 10kb 이상, 더 바람직하게는 34.5kb으로 떨어지게 되는 것을 특징으로 한다. 그러한 분자는 본 발명에 따른 세포를 생성시키도록 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있다. 그러한 분자는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, YAC, 등과 같은 종류의 형태와 같이, 당업자에게 알려진 다양한 형태를 취할 수 있다.

동등한 구현예에서, 상기 E1A 및 E1B 단백질 암호화 핵산을 초기에 별개 분자로써 존재하게 하는 것이 또한 가능하다. 그러한 분자는 임의로 상동 재조합, 연결, 부위-특이적 재조합, 말단-대-말단 접합, 및 기타 같은 종류의 방법에 의해 단일 분자를 형성할 수 있다. 그러므로 하기를 포함하는 2 이상의 핵산 분자의 세트(set)를 제공하는 것이 본 발명의 양상이다: a) 아데노바이러스의 E1A 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 상기 E1A 코딩 서열의 양쪽에 5kb 이상, 바람직하게는 17kb 이상의 스페이서 핵산 서열을 가지고, 상기 스페이서 핵산은 E1B 단백질을 암호화하지 않는다; 그리고 b) 아데노바이러스의 E1B 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 상기 E1B 코딩 서열의 양쪽에 5kb 이상, 바람직하게는 17kb 이상의 스페이서 핵산 서열을 가지고, 상기 스페이서 핵산은 E1A 단백질을 암호화하지 않는다. 상기 스페이서 핵산은 다른 핵산일 수 있고, 바람직하게는 그것이 불활성, 코딩 서열을 함유하지 않도록, 바람직하게는 알려진 조절 요소가 없도록, 염색체 불안정을 일으킬 수 있는 매우 반복된 영역, 등의 것이 없도록 선택된다. 바람직하게는, E1A 암호화 서열의 측면에 있는 상기 스페이서 핵산 서열은 E1B 단백질 암호화 서열의 측면에 있는 상기 스페이서 핵산 서열과 실질적인 상동성을 함유하지 않는다. 스페이서 단편은 이종 프로모터 및/또는 폴리아데닐화 부위와 같이, E1A 또는 E1B 발현 카세트의 조절 서열을 포함할 수 있다.

숙주에서 재조합 분자의 증식은 보통 상기 분자가 원형일 때 편리하게 수행될 수 있다. 어떤 양상에서, 본 발명의 재조합 분자는 선형이다. 이것은 선형 분자가 사용될 때 일반적으로 더 효과적인, 전구체 세포주의 트랜스펙션에 도움을 줄 수 있다. 선형화는 예를 들면 당업자에게 알려져 있듯이, 하나 이상의 편리한 제한 효소에 의한 재조합 분자의 소화에 의해 달성될 수 있다.

역방위 반복 배향에서 E1 서열이 결여되어 있는 세포주

포장 세포와 재조합 아데노바이러스 간의 실질적인 중복의 부재시에 HDEP를 생성시키는 메커니즘이 무엇이든 간에, 이 방법에서 첫 번째 단계는 포장 세포의 게놈으로부터 바이러스의 게놈으로의 E1 서열의 통합 이벤트인 것 같다. 이러한 여분의 서열에 대해 수용하기 위해, 바이러스는 그 후에 아데노바이러스 서열을 삭제해야 한다(Murakami et al, 2002). 이러한 단계는 역방위 반복이 존재할 때 더 효과적일 수 있다 (Steinwaerder et al, 1999). PER.C6^® 세포주는 그것의 게놈에 세포주의 생성을 위해 사용되었던 pIG.E1A.E1B 플라스미드의 여러 반복을 함유하고, 그러한 반복의 일부는 서로에 대하여 역방위 배향이다. 따라서, PER.C6^® 세포의 게놈에서 E1 영역의 역방위 반복의 존재는 HDEP를 생성시키는 빈도에 영향을 끼칠 수 있다. HDEP 입자의 형성은 또한 다른 아데노바이러스 포장 세포주에서 일어날 수 있지만 그러한 세포주에서 전통적인 RCA의 출현때문에 비검출된다는 것이 유념되어야 한다. 포장 세포주에서 역방위 반복 배향에서의 E1 서열의 부재는, 재조합 아데노바이러스가 그러한 포장 세포 상에서 증식될 때 아마도 더 낮은 빈도의 HDEP의 생성을 가져오거나 심지어는 완전한 부재까지도 초래할 것이다.

게놈에 E1 영역을 포함하고 있는 신규한 세포주가 생성되거나 선택될 때, 따라서 역방위 반복이 없지만 오히려 단지 직접 반복, 또는 심지어 E1 서열의 단일 통합을 가지는 클론을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 그러므로 아데노바이러스 E1 서열을 포함하고 있는 세포를 제공하거나 생성시키는 방법뿐만 아니라 세포를 제공하는 것이 본 발명의 양상이고, 상기 방법은 상기 E1 서열을 포함하고 있는 역방위 반복이 결여된 세포를 선택하는 단계를 포함한다는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 그것의 게놈에 아데노바이러스 E1 서열을 포함하는 세포를 제공하는데, 여기서 상기 E1 서열은 E1A 및 E1B-19K 및 E1B-55K 코딩 서열의 하나 이상의 기능 복사체를 포함하고, 상기 E1 서열 또는 그것의 일부가 상기 게놈에 역방위 반복의 형태로 존재하지 않는다는 것을 특징으로 한다. 이러한 구현예에서, 상기 세포는 293 세포 또는 그것의 유도체가 아니다. 역방위 반복이 존재하면, 바람직하게는 그러한 역방위 반복은 상기 세포에서 10kb 내로 존재하지 않고, 본 발명에서 무-E1 개재(intervening)서열의 10kb 이상을 가진 역방위 반복은 추가로 역방위 반복이라고 간주되지 않는다. 이론적 이유는 E1 서열의 하나의 복사체가 염색체 상의 어느 곳에 통합되고, 역방위 복사체가 동일한 염색체 상이지만 아데노바이러스 입자에 두 반복을 포함하고 있는 DNA의 전체 분절의 섭취를 방지하기에 충분히 큰 거리로 통합될 때는, 어떠한 문제도 직면되지 않는다는 것이다. 또한 거리가 단편의 섭취가 가능한 만큼일 때(즉 10kb) 역방위 반복 서열로부터 생긴 좌측 말단의 중첩은 너무 커서 포장될 수 없는 바이러스 게놈을 부여한다(도 13에 예시됨). 바이러스 게놈에서 E1 서열의 삽입 부위는 HEDP의 최종 전체 길이를 위해 중요하다. 삽입이 바이러스의 좌측 말단에 더 많을 때 E1-함유 게놈 단편의 병합이 포장할 수 있는 게놈을 초래할 가능성이 증가한다는 것은 분명하다. 삽입 부위가 최소 포장 신호로부터 바로 3'라면 그러면 삽입은 18.5kb만큼 클 수 있고 (E1A 및 E1B 및 역방위 반복 서열의 1 복사체를 포함함) 여전히 포장할 수 있게 남아 있다 (350bp ITR과 포장 신호를 포함하고 있는 좌측에서 우측 말단까지의 중첩을 가정함). 이것은 예를 들면 17kb의 삽입은 포장할 수 있는 크기의 바이러스를 여전히 초래하는 단편의 통합의 가능한 부위가 최소 포장 서열 바로 3' 1.5kb로 제한되므로, HDEPs를 쉽게 생성시킬것이라는 것을 의미하지는 않는다. 따라서, HDEP의 생성 빈도는 E1A 및 E1B 코딩 영역 간의 증가하는 거리로 감소할 것이고, 그 거리가 언급된 18.5kb보다 훨씬 더 작을 때 검출 하에 여전히 매우 잘 있을 수 있을 것이다.

동일한 논거가 역방위 반복 서열의 부재시에 E1A 및 E1B의 직접 삽입에 대해 유효하다. 그러한 경우에, 아데노바이러스의 게놈에 전체 삽입은 그것이 최소 포장 신호로부터 직접 3'로 삽입할 때에만, 37.5kb 보다 더 클 수 없다 (E1A 및 E1B 영역에 대해 약 3kb를 포함함). 그러므로, E1A 및 E1B 코딩 서열 중 하나 이상이 포장 세포의 게놈에서 34.5kb 이상으로 떨어져 있을 때, 이 서열들의 둘 다의 재조합 아데노바이러스로의 삽입이 방지된다. 더욱이, 그 후에 전체 아데노바이러스 게놈은 방법이 역방위 반복 서열의 부재 시에 추가로 훨씬 덜 효과적일 수 있는, 그 다음 단계에서 삭제되야 한다(Steinwaerder et al, 1999). 어떤 경우에, 게놈에서 역방위 E1 서열의 존재와는 관계없이, E1A 및 E1B 코딩 서열 중 하나 이상이 게놈에서 추가로 떨어져 있을 때, E1A 및 E1B 서열을 함유하고 있는 입자를 생성시킬 가능성은 감소된다. 따라서, 어떤 구현예에서, 상기 E1A 및 E1B 코딩 서열 중 하나 이상은 본 발명에 따른 세포의 게놈에서 4kb, 6kb, 8kb, 10kb, 12kb 이상으로 떨어지게 된다. 이러한 구현예에서, 바람직하게는 E1 서열은 역방위 반복의 형태로 존재하지 않는다. 바람직하게는, 상기 서열은 15kb 이상 떨어지게 되고 역방위 E1 서열은 존재하지 않고, 그것은 상기 세포주의 게놈으로부터 아데노바이러스로의 E1 서열의 도입에 의해 그러한 세포주에서 HDEP를 생성시킬 이론적 가능성은 0으로 실제로 감소된다는 것을 보증할 것이다(도 13 참조). 다른 구현예에서, 상기 E1A 및 하나 이상의 E1B 코딩 서열은 18kb, 20kb, 25kb, 30kb 이상 떨어지게 된다. 가장 바람직하게는, 상기 서열은 34.5kb 이상 떨어지게 된다. 이것은 세포의 게놈으로부터 유래된 E1A 및 E1B 둘 다의 단일 통합은 HDEP의 생성을 가져올 수 없다는 것을 보증할 것이다. 명백히, 상기에 나타나 있듯이, 어떤 동일한 구현예에서, 상기 E1A 및 하나 이상의 E1B 코딩 서열은 세포의 게놈의 다른 염색체 상에 존재한다.

E1 서열의 역방위 반복의 존재를 위해 생성된 클론을 스크린하는 방법은 당업자에게 알려져 있고, PCR, 서던 블로팅, 제한효소 분석, Fiber-FISH, 및 기타 같은 종류의 방법을 포함할 수 있다. pIG.E1A.E1B 플라스미드(미국 특허 5,994,128)와 같은 E1 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용하여 세포 클론을 생성시킬 때, 클론이 먼저 확립될 수 있고, 스크린 라운드에서, 상기 역방위 반복이 없는 클론들은 추가 용도를 위해 채취된다. 채취된 클론으로부터의 세포는 그 후에 재조합 아데노바이러스의 생성을 위해 적절하게 사용될 수 있고, 이러한 세포들에 대해 HDEP를 생성시키는 빈도는 상기 역방위 반복을 함유한 세포에서보다 상당히 더 낮을 것(또는 심지어 없을 것)이라는 것이 예상된다. 따라서 그것의 게놈에 아데노바이러스 E1A 및 E1B 코딩 서열을 포함한 세포를 제공하는 것이 본 발명의 또 하나의 양상이고, 상기 E1 서열은 상기 게놈에 역방위 반복의 형태로 존재하지 않는다는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 이러한 양상에 대해, 무-E1 서열의 10kb 이상 떨어진 서열은 역방위 반복으로써 간주되지 않을 것이다. 특정한 양상에서, 상기 E1A 및 E1B 서열은 게놈 당 2 이상의 복사체로 상기 게놈에 존재한다. 하나의 양상에서, 상기 2 이상의 복사체는 하나의 염색체 상에 존재하는 2 이상의 복사체를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 아데노바이러스 pIX를 암호화한 서열이 없는 반면에, 상기 세포는 그것들의 게놈에 E1A 및 E1B 코딩 영역의 하나의 복사체만을 포함한다. 물론, 그것의 게놈에 상기 E1 서열의 하나의 복사체만을 포함한 세포는 HDEP 생성의 더 낮은(또는 심지어 없는) 빈도를 가질 것이 예상되어야 한다.

세포의 용도

또 하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 세포에서 재조합 아데노바이러스를 생성시키는 방법을 제공한다. 이것은 당업계에 알려진 시스템 상에서 제조된 회분와 비교해서 HDEP의 상당히 감소된 빈도를 가지는, 바람직하게는 HDEP가 전혀 없는 재조합 아데노바이러스 회분을 생성시킬 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 재조합 아데노바이러스의 생성을 위해 사용된 벡터와 포장 세포는 실질적인 서열 중복이 결여되어 있고(즉 바람직하게는 10nt 미만, 또는 더 바람직하게는 전혀 중복이 결여되어 있다), 바람직하게는 중복이 결여되어 있고, 이에 의해 벡터와 포장 세포의 서열 간의 상동 재조합의 가능성을 최소화시키고, E1-함유 입자가 없는 바이러스 회분을 초래한다(HDEP, RCA).

본 발명에 따라 제공된 신규한 세포는 또한 이전에 기술되어 있듯이(WO 00/63403), 재조합 단백질의 제조를 위해 사용될 수 있고, 이전에 기술되어 있듯이(WO 01/38362) 다른(비-아데노바이러스) 바이러스를 제조하는데 사용될 수 있다는 것이 유념되어야 한다.

트랜스유전자(transgene)의 혈청형 또는 성질은 본 발명에 중요하지 않다는 것이 당업자에게는 분명할 것이다. 세포의 생성을 위해 사용된 아데노바이러스 E1 코딩 서열은 Ad5, Ad35, Ad11, Ad16, Ad49 등등, 또는 그것의 조합, 즉 하나의 혈청형으로부터의 E1A 및 또 다른 혈청형으로부터의 E1B 코딩 서열의 하나 이상(WO 02/40665 참조)과 같이, 세포상에서 증식될 아데노바이러스와 양립성이 있는 사용하기 좋은 혈청형으로부터 취해질 수 있다는 것이 예를 들면 즉각적으로 분명할 것이다. 많은 다른 양상에서 본 발명은 그것의 범위나 정신으로부터 벗어나지 않고서 변화될 수 있다는 것이 또한 분명할 것이다. 본 발명은 그것의 범위를 제한하는 것으로 해석되서는 안되는 하기 실시예에 의해 이제 설명될 것이다.

도1: pIG.E1A의 지도

도2: pIG.E1AB21의 지도

도3: pE1B의 지도

도4: pCC.E1A의 지도

도5: pCC.E1AB21의 지도

도6: pCC101의 지도

도7: pCC105의 지도

도8: pCC.55Kcol의 지도

도9: pIG.E1B의 지도

도10: pCC.E1Bcol의 지도

도11: pEC.E1B의 지도

도12: pSC.55K의 지도

도13: 1차 세포의 형질전환에 적절한 큰 분자 설계의 실시예.

Ⅰ: 스페이서 DNA에 의해 측면에 위치된 E1A 및 E1B 단백질 (각각 A 및 B)을 위한 코딩 영역을 갖는 단일 코스미드 벡터의 개략도. RE= 스페이서 DNA 또는 E1 서열에 존재하지 않는 제한 효소 인식 부위.

Ⅱ: 스페이서 DNA에 의해 측면에 위치된 E1A (A) 또는 E1B (B) 코딩 영역을 갖는 두 개의 별개의 핵산(예를 들면 플라스미드 또는 코스미드 벡터)의 개략도.

Ⅲ: Ⅰ로부터의 분자 또는 Ⅱ의 두 개의 분자를 갖는 1차 세포의 숙주 세포 게놈으로 형질 전환 또는 통합 후에 일어날 수 있는 상황. 숙주 게놈에서 삽입은 스페이서 DNA에 의해 떨어지게 된 E1A 영역 및 E1B 영역과 역방위 배향으로의 그 단편/ 그 단편들의 두 번째 복사체로 이루어진다. J:역방위 반복 간의 접합(junction). 이러한 서열들 중 일부(화살표로 표시됨)가 재조합 아데노바이러스에서 재조합되면 게놈은 너무 커서 포장될 수 없게 된다. ITR: 역방위 말단 반복, φ: 포장 신호, FI: 여기서 역방위 반복 서열을 포함하는, 재조합 바이러스로 삽입된 절편. 역방위 반복의 존재는 바이러스 게놈으로부터 다른 서열을 삭제시키는 그 이후에 필요한 단계에 도움이 될 수 있지만, 역방위 반복 서열의 존재는 바이러스 게놈의 복제 중에 재조합된 바이러스의 왼쪽 말단의 거울-상 복제를 초래하고 스페이서 DNA 때문에 너무 커서 다시 포장될 수 없는 게놈(복제된 단편, DF)을 생성시킨다.

도 14: pIG.E1A.E1B의 지도

도 15: pCC200의 지도

도 16: pCC205의 지도

도 17: pdys44의 지도

도 18: p44-1.ccE1A의 지도

도 19: 생성된 세포주로부터 단백질 용해질의 웨스턴 블럿. 레인(Lanes): 1: HER01-B-71, 2: HER01-H-86, 3: HER01-H-87, 4: HER01-H-88, 5: HER01-H-89, 6: HER01-B-90, 7: HER01 pn06 세포, 8: PER.C6 세포

도 20: 형질전환된 세포 클론으로 E1-결실된 아데노바이러스 벡터의 보충의 증명. -: 음의 대조구; MOF: 형광 평균; B-71 ,B-90, H-86, H-87, H-88, H-89: 생성된 형질전환된 세포주

도 21: 실시예 3에서 트랜스펙션을 위해 사용된 Ad5.E1 구성체의 개략도. 게놈 DNA를 소화하기 위해서 그리고 프로브 단편을 생성시키기 위해서 사용된 제한 부위가 표시된다. E1A 및 E1B DNA 단편은 E1A-함유 단편의 5' 말단에서 시작하는 뉴클레오티드 번호매기로와 가공으로 연결된다.

도 22: 본 발명의 몇몇 구현예의 개략도(확대되지 않음). 조절 서열(프로모터 및 폴리A 신호와 같은)이 묘사되지 않는다.

A. 아데노바이러스 게놈의 E1-영역의 자연적 배치: E1A는 E1B-19K 및 E1B-55K로 이루어진 E1B에 의해 뒤따라진다. E1A 및 E1B 사이에 스페이서 서열은 존재하지 않는다. 종래 당업계의 포장 세포는 이러한 배치에서 DNA를 도입함으로써 구성되었고, 따라서 또한 그것들의 게놈에 이러한 배치에서의 E1 영역을 갖는다.

B. 스페이서(또는 스터퍼)가 E1 영역에 존재하는 본 발명에 따른 가능한 배 치의 가장 단순한 두 가지.

1. E1A 및 E1B-19K 사이에 도입된 스터퍼(stuffer). 2. E1B-19K 및 E1B-55K 사이에 도입된 스터퍼. 근거는 단일 아데노바이러스 입자로 이러한 세 개의 열린 판독틀의 동시 섭취 가능성을 감소시키거나 완전히 방지하기 위하여(RCA 및 HDEP를 방지), 자연적 상황과 비교시 E1A, E1B-19K 및 E1B-55K 사이의 거리를 증가시키는 것이다. 스터퍼는 본 발명에 따른 세포주를 얻을 수 있도록 4kb 이상이어야 하고, 상기 세포는 아데노바이러스 E1A 및 E1B-55K 및 E1B-19K 코딩 서열을 그것의 게놈에 포함하고, 상기 세포는 핵산 서열의 확장이 결여되어 있고 여기서 상기 E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 서열은 상기 게놈에서 4kb 떨어진 것을 특징으로 한다. 열린 판독틀의 순서는 그것들이 모두 E1A, E1B-19K 및 E1B-55K의 발현이 있는 방식으로 게놈에 존재하는 한 중요하지 않다. 따라서 순서는 E1A-E1B/19k-E1B/55k, E1B/19k-E1B/55k-E1A, E1B/55k-E1B/19k-E1A, E1B/55k-E1A-E1B-19k 또는 E1B19k-E1A-E1B55k가 될 수 있다. E1B/19k 및 E1B/55k가 인접해 있으면, 그것들은 단일 전사 유니트 또는 별도의 전사 유니트로써 존재할 수 있고, 이것은 본 발명에 중요하지 않다. 둘 다의 배치 (1 및 2)는 본 발명의 이러한 스페이싱 기준을 충족시키는 세포주를 생성시킬 수 있을 것이다. 최소 6, 8, 10, 15 또는 34.5kb의 스터퍼 길이가 세 개의 열린 판독틀을 가지고 있지만 핵산 서열의 확장이 결여된 본 발명에 따른 세포를 생성시킬 수 있고, 여기서 상기 E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 서열은 그것들의 게놈에서 최소한 6, 8, 10, 15 또는 34.5kb로 떨어져 있다. 이것은, E1A + E1B-19K + E1B-55K를 함께 함유하고 있는 단일 단편이 생성된 세포의 게놈으로부터 생겨야 할 때, A의 상황과 대조적으로, 이러한 서열이 그러한 구성체로 생성된 포장 세포의 게놈의 단지 3kb의 단편에서 발견될 수 있는 경우에(E1A + E1B-19K + E1B-55K 열린 판독틀은 함께 약 3kb를 포함한다), 이 단편은 최소한 7kb(스터퍼 4kb), 9kb(스터퍼 6kb) 등등, 최소한 37.5kb(스터퍼 34.5kb)까지여야 한다는 것을 의미한다.

C. B의 원리의 연장: B에서 보여지는 것과 같이 단편들이 서로에게 인접하여 통합할 수 있으므로, 스터퍼는 또한 본 발명의 바람직한 구현예에서 E1A 앞에 및/또는 E1B 뒤에 놓인다 (첫 번째 반복의 E1B의 두 번째 반복의 E1A로의 가까운 근접을 방지한다). 그 결과의 포장 세포의 게놈이 보여지는데, 여기서 스터퍼 DNA가 제공된 E1 영역의 두 복사체는 앞뒤 일렬(tandem) 반복에서 서로에게 인접하여 통합될 때 보여진다. 본 발명의 이들 포장 세포는 그것들의 게놈에 E1A 및 E1B-19K 및 E1B-55K를 통합했지만, 그것들의 게놈에서 핵산의 확장을 함유하지 않고, 여기서 상기 E1A 및 둘 다의 E1B 코딩 서열은 4kb 미만 등등으로 떨어지게 되고, 스터퍼 길이에 의존한다 (이 실시예에서 E1A와 E1B-19K (no. 1) 사이 또는 E1B-19K와 E1B-55K 사이 (no. 2) 및 E1A의 2kb 이상의 상류 및 E1B-55K의 2kb의 하류(인접하여 통합될 때 함께 4kb)는 4kb 이상이어야 한다).

본 발명의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 종래의 기술을 이용할 것이고, 그것은 당업의 기술 내에 있다. 예를 들면, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al, eds, 1987; the series Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995 참조.

실시예 1. E1A 및 E1B 단백질을 암호화하는 별개의 핵산을 사용하여 보충 세포주의 생성.

아데노바이러스 E1 유전자에 의한 1차 세포의 완전한 형태적 형질전환은 E1A 및 E1B 영역에 의해 암호화된 단백질의 조합된 활성의 결과이다. 용균성(lytic) 감염과 형질전환에서의 다른 E1 단백질들의 역할이 광범위하게 연구되었다(Zantema van der Eb, 1995; white, 1995, 1996에서 재조사됨). 아데노바이러스 E1A 단백질은 1차 세포의 형질전환에 필수적이다. 다른 메커니즘에 의해서지만, 세포자멸사의 동시 유도는 E1B-19K 및 E1B-55K 둘 다에 의해 방해받는다. E1A 영역은 여러 단백질을 암호화하지만, 전체 영역은 대개 E1A 코딩 영역으로 불려지고, 모든 구현예에서 여기서 사용되듯이 'E1A 코딩 서열'은 모든 E1A 단백질을 암호화하는 서열을 일컫는다.

설치류 세포에서, E1B 단백질 둘 다의 발현이 두 배의 효율이지만, E1B-19K 또는 55K와 함께 E1A의 활성은 완전한 형질전환에 충분하다(Gallimore et al., 1985; Rao et al., 1992). 하지만, 인간 세포에서 E1B-55K 단백질의 활성은 E1B-55K가 불멸의, 형질전환된 세포주의 확립에 필요불가결하다는 주어진 관찰이 더 중요한 것 같다(Gallimore et al., 1986). 아데노바이러스 감염 및 바이러스 증식에 서, E1A 단백질은 TATA-결합 단백질과의 상호작용에 의해 E1B 및 다른 초기 영역을 포함하는 아데노바이러스 유전자의 활성에 작용한다(Zantema and van der Eb, 1995에서 리뷰됨). E1B-55K 발현은 숙주 단백질 합성 및 바이러스-암호화 단백질의 핵으로부터 세포질까지의 선택적 수송의 차단을 위해 감염의 후기상에서 중요하다 (Babiss et al., 1985; Pilder et al., 1986). E1B-55K에 대해 결실된 아데노바이러스는 비-보충 인간 세포주 상의 감소된 복제를 보여준다(Harada and Berk, 1999). 따라서 E1A- 및 E1B-55K-암호화된 단백질은 1차 인간 세포의 형질전환 및 인간 세포에서의 효과적인 바이러스 복제를 위해 필수적이다.

비-상동성 재조합은 포장 세포의 세포 게놈으로부터 재조합 아데노바이러스로 E1 서열의 병합을 가져올 수 있다. 최초의 재조합된 아데노바이러스로부터 최종적으로 생긴 헬퍼-의존성 E1-함유 입자는 비-보충 (인간) 세포 상에 복제-결핍 벡터의 복제를 보충할 수 있지만 자율적 복제를 할 수는 없다. 이러한 보충은 E1A 및 E1B-55K 및 가능하게는 E1B-19K 기능에 의해 중재된다. 따라서, 둘 다의 E1A 및 E1B-55K(및 바람직하게는 E1B-19K) 기능이 아데노바이러스 벡터에서 끝날 가능성이 제거되거나 감소된다면, 그러면 HDEP의 형성은 제거되거나 감소될 것이다.

여기에 우리는 서로로부터 떨어진 E1A 및 E1B-55k 영역을 가진 아데노바이러스 포장 세포주를 생성시키기 위해 사용된 E1A, E1A 및 E1B-19K, E1B (E1B-19K + E1B-55K) 또는 E1B-55K를 발현하는 기능 플라스미드의 실시예를 기술한다.

인간 포스포글리세레이트키나제(PGK) 프로모터 및 간염 B 바이러스 폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 연결된 Ad5-E1 영역(Ad5 게놈의 뉴클레오티드 459~3510(Genebank Acc. No. M73260))을 함유하고 있는 구성체 pIG.E1A.E1B (도 14; SEQ. ID. NO. 1)는 이전에 기술되었다(미국 특허 5,994,128).

구성체 pIG . E1A 의 생성

구성체 pIG.E1A는 제조자 지시에 따라 QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 겔로부터 그 결과의 5kb 단편의 정제가 뒤따르는 HincⅡ에 의한 pIG.E1A.E1B의 소화에 의해 만들어졌다. 단리된 단편의 재연결 및 STBL2 수용성 세포(Invitrogen)로의 형질전환이 pIG.E1A를 부여하였다(도 1). 이러한 구성체는 Ad5 게놈으로부터의 nt. 459~1578을 함유한다(Genbank Acc. No. M73260)

구성체 pIG . E1AB21 의 생성

구성체 pIG.E1A는 XbaⅠ 및 HpaⅠ으로 소화되었고 그 결과의 4.8kb 단편은 상기와 같이 겔로부터 단리되었다. 구성체 pIG.E1A.E1B는 BsrGI로 소화되었고 5' 돌출된 끝을 블런트화하기 위해 Klenow 효소(New England Biolabs)로 처리되었다. DNA는 그 후에 제조자 지시에 따라 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제되었고 그 후에 XbaI로 소화되었다. E1A의 3' 부분 및 E1B19K 코딩 서열을 함유하고 있는 그 결과의 913 bp 단편이 기술되어 있듯이 겔로부터 단리되었다. 두 단리된 단편의 연결 및 DH5α-T1^r 세포(Invitrogen)로의 형질전환이 구성체 pIG.E1AB21를 부여하였다(도 2). 따라서 이 구성체는 Ad5 게놈으로부터 nt. 459~2253을 함유하는데(Genbank Acc. No. M73260) 이로써 E1A 서열은 PGK 프로모터에 의해 구동되고 E1B 프로모터는 E1B-19K 유전자를 구동시킨다.

예견된 아미노산 서열이 20.6KD 단백질(예를 들면, 이 적용에서 여러 플라스미드와 프라이머는 이름의 일부로써 21K를 가진다)을 구성하기 때문에, Ad5 E1B-19K 유전자는 때때로 또한 Ad5 E1B-21K 유전자로써 불린다.

구성체 pCR5B 의 생성

Ad5-E1B 영역을 함유하고 있는 구성체는 그 후에 하기와 같이 생성되었다. 먼저 PCR 단편이 3% 최종 농도로 DMSO와 함께 제조자의 지시에 따라, 주형으로써 pIG.E1A.E1B DNA 및 Pwo DNA 폴리머라아제(Roche)를 사용하여, 프라이머 5E1Bfor-1: 5'- CGG AAT TCG GCG TGT TAA ATG GGG CG-3'(SEQ.ID.NO. 2) 및 5E1B-rev: 5'- TAG CAG GCG ATT CTT GTG TC-3'(SEQ.ID.NO. 3)로 생성되었다. 증폭 프로그램은 (30초간 94℃, 30초간 50℃ 및 1분간 72℃)의 30 순환이 뒤따르는 2분간 94℃였고 10분간 72℃로 끝났다. 그 결과의 481 bp 증폭된 단편은 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제되었고 제조자의 지시에 따라 SrfI 효소의 존재하에 PCR 클로닝 키트(Stratagene)로부터의 pCR-ScriptAmp 벡터로 연결되었다. (블런트) 연결은 벡터의 삽입의 두 배향을 부여했고 그 중에서 삽입의 (5') 말단의 EcoRI 부위와 벡터의 EcoRI 부위 사이의 가장 큰 단편을 가진 하나가 임의로 선택된다. 이것은 구성체 pCR5B를 가져왔다. 표적 서열(KpnI 및 EcoRI 부위 사이의)의 올바른 증폭은 서열분석에 의해 확인되었다.

구성체 pE1B 의 생성

pCR5B는 KpnI 및 EcoRI로 소화되었고 415 bp 단편은 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 겔로부터 단리되었다. 구성체 pIG.E1A.E1B는 그 후에 또한 EcoRI 및 KpnI로 소화되었고 그 결과의 5.2kb 벡터 단편은 상기와 같이 겔로부터 단리되었다. 단리된 단편의 연결과 DH5α-T1^r 세포(Invitrogen)로의 형질전환은 구성체 pE1B를 가져왔다(도 3). 이 구성체에서 E1B 서열은 Ad5 게놈으로부터의 nt. 1642~3510을 구성한다.

전체 길이 Ad5E1 발현 구성체와 비교하여 신규한 구성체의 형질전환 능력이 그 후에 시험되었다. 여기서, 초기 인간 배아 망막(HER) 세포는 단리되었고(예를 들면 Byrd et al, 1982, 1988 참조) 10% 열 비활성화 태아 소 혈청(FBS, Gibco BRL)으로 보충된 DMEM 배지(Gibco BRL)의 6cm 디쉬에 접종되었다. 6-70% 컨플루언시로 세포는 제조자 지시에 따라 CaPO₄ 공-침전 키트(Invitrogen)를 사용하여 총 20㎍ DNA/ 디쉬로 트랜스펙션되었다. 2주 후에 형질전환된 클론은 1차 세포의 단층에서 병소(foci)로써 볼 수 있었다. 병소의 세포는 1차 세포와 비교하여 분명히 다른 형태학을 보여주었다. 표 Ⅱ는 트랜스펙션 각각으로 얻어진 형질전환된 클론의 양을 묘사한다.

그 결과는 1차 세포가 Ad5-E1A 및 E1B19K 유전자(pIG.E1AB21)로 형질전환될 수 있다는 이전의 관찰을 확인한다. 이들 병소는 완전한 E1B 영역이 존재하는 경우에 트랜스펙션으로 얻어진 것보다 일반적으로 더 작다는 것이 유념되어야 한다. 또한, 구성체 pIC.E1AB21에 의한 트랜스펙션에서 생긴 병소를 취하고 96-웰 플레이트로 접종한 후에, 지속된 세포 성장이 얻어지지 못했고 모든 세포는 죽었다. 모든 다른 경우에 취해진 병소의 대부분은 생육가능한 세포 클론이 되었다.

pIG.E1AB21에 의한 트랜스펙션이 처음에 형질전환된 세포를 가져왔으므로, 예를 들면 첫 트랜스펙션 5-10일 후, E1B-55K 발현 구성체로 세포를 재-트랜스펙션하는 것이 가능하다. 이것은 게놈의 다른 유전자자리 상에 둘 다의 발현 카세트를 병합한 세포가 얻어지도록 보증한다.

이 실험은 E1A 및 E1B 유전자(pIG.E1A + pE1B)에 대한 두 개의 별도의 플라스미드를 사용함으로써 형질전환된 세포 클론을 생성시키고 확립하는 것이 가능하다는 것을 추가로 확인한다.

하지만, 둘 다의 플라스미드가 함께 트랜스펙션되었고 상당한 서열 중복(플라스미드 백본 및 프로모터/폴리A)을 함유하기 때문에, E1A 및 E1B의 통합이 게놈의 동일한 유전자자리에서 일어났다는 것이 가능하다.

이는 발현 카세트만(벡터 서열이 없음) 가지고 서열 중복이 없는 단편을 사용하여 회피될 수 있다. E1A 및 E1B 서열을 가진 두 발현 구성체에 대해 다른 조절 서열을 사용함으로써, 서열 중복은 프로모터와 폴리아데닐화(폴리A) 서열과 같은, 조절 요소로부터 제거될 수 있다. 바람직하게는 이 서열들은 상동 재조합 과정 중에 발견된 짝지워진 구조의 형성을 가져올 수 있는 중복을 방지할 정도로 충분히 분기되어 있다(divergent). 어떤 프로모터와 폴리A 서열이 사용될 수 있다. 바람직하게는 조절 서열은 이 세포들 상에서 증식될 재조합 아데노바이러스에서 트랜스유전자로부터의 것들과는 다르다. 분명히 이것은 주어진 재조합 아데노바이러스가 나중의 단계에서 이들 세포 상에서 증식될 때 단지 결정될 수 있고 특정한 재조합 아데노바이러스에 의존할 것이다. 따라서 그것들이 본 발명에 의해 확립된 세포에서 의 E1A 및 E1B 서열들의 것들과는 다르도록, 그러한 트랜스유전자의 조절 서열을 나중에 선택하는 것이 편리하다. 하지만, 많은 현재 이용가능한 재조합 아데노바이러스 벡터는 CMV 프로모터와 SV40 폴리A 서열에 의해 조절된 트랜스유전자를 지니므로, 여기 예시되어 있듯이 E1A 및 E1B 구성체에 대한 바람직한 조절 서열은 CMV 프로모터와 SV40 폴리A 서열과는 다르다. 조절 문제를 고려하여, 추가적인 이러한 조절 서열은 바람직하게는 바이러스 유래가 아니다.

이 때문에, 상기에 기술된 플라스미드는 하기에 기술된 것과 같이 추가로 변경된다.

구성체 pCC . E1A 및 pCC . E1AB21 의 생성

E1A 서열은 하기 프라이머로 증폭되었다:

5E1A-For: 5' - CCG AAT TCG ATC GTG TAG TG-3' (SEQ.ID.NO. 4) 및 5E1A-rev: 5' - CGG GAT CCA TTT AAC ACG CCA TGC AAG-3' (SEQ.ID.NO. 5). 반응은 제조자 지시에 따라 그러나 3% DMSO의 최종 농도로 Pwo DNA 폴리머라아제(Roche)를 사용하여 pIG.E1A.E1B 주형 DNA 상에서 행해졌다. PCR 프로그램은 2분간 94℃로 설정되었고 (30초간 94℃, 30초간 58℃ 및 120초간 72℃)의 30 순환이 뒤따랐고 8분간 72℃로 끝났다. 그 결과의 1.2kb 단편은 EcoRI (5') 및 BamHI (3') 부위가 측면에 위치된 Ad5로부터의(Genbank Acc. No. M73260에서와 같이 뉴클레오티드 459~1655) E1A 서열을 함유한다.

두 번째 PCR 단편은 동일한 조건을 사용하여, 역 프라이머: 5E1AB21-rev: 5' - CGG GAT CCT CAT TCC CGA GGG TCC AG-3' (SEQ.ID.NO. 6)와 함께 프라이머 5E1A- For를 사용하여 생성되었다.

그 결과의 1.8kb 단편은 EcoRI (5') 및 BamHI (3') 위치가 측면에 위치된 Ad5(Genbank Acc. No. M73260에서와 같이 뉴클레오티드 459~2244)로부터의 E1A 및 E1B-19K 서열을 함유한다. 둘 다의 PCR 단편은 아가로스 겔로부터 단리되고, QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트(Qiagen)로 정제되고 PCR 클로닝 벡터; pCR-TOPOblunt (Invitrogen)에서 클로닝되었고 서열은 확인되었다. 구성체는 그 후에 EcoRI 및 BamHI로 소화되고 삽입 단편은 상기에서와 같이 QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 겔로부터 단리되었다. 단리된 단편 각각은 그 후에 처음에 EcoRI 및 BamHI로 소화된 벡터 pCC101(하기 참조)로 연결되었고 상기와 같이 겔로부터 정제되었다. 전기 수용성(electro competent) DH10B 세포(Invitrogen)로의 형질전환은 구성체 pCC.E1A(도 4) 및 pCC.E1AB21(도 5)를 생성시켰다. 합성 폴리아데닐화 신호(SPA)는 이러한 플라스미드에 존재한다(WO02/40665에 기술된 것과 같이 구성체 pCC271에서 유래됨).

pCC101 의 생성

pCC100(하기 참조)은 XbaI로 소화되었고 그 결과의 선형 단편은 상기에서와 같이 QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트를 사용하여 겔로부터 정제되었다. 링커는 올리고뉴클레오티드 X-SM-2: 5' - CTAGCAATTGGTCGAC-3'(SEQ.ID.NO. 8)과 X-SM-1: 5' - CTAGGTCGACCAATTG-3'(SEQ.ID.NO. 7)을 어닐링(annealing)함으로써 제조되었다. 여기서, 각각의 올리고뉴클레오티드 1㎍은 2㎕ 10× NEB2 완충용액 (NEB) 및 밀리큐 H₂0와 20㎕의 최종 부피로 혼합되었다. 혼합물은 98℃로 놓여졌고 PCR 장치에서 4℃로 천천히 냉각되었다(2℃/분의 냉각속도). 어닐링된 링커는 그 후에 단편에 대해 4× 몰 여분의 링커를 사용하여 단리된 XbaI 소화된 단편으로 연결되었다. 제조자 지시에 따라 연결된 DNA는 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제되었고 자체-연결된 벡터 DNA를 제거하기 위해 XbaI로 소화되었다. XbaI 효소의 열-비활성화 후에, 혼합물은 그 후 pCC101을 초래하는 DH5α-T1^r 수용성 세포를 형질전환하도록 사용되었다(도 6).

pCC100 의 생성

구성체 pCC271(WO 02/40665에 기술됨)은 EcoRI 및 PstI로 소화되었고 3kb 벡터 단편은 상기에 기술되어 있듯이 겔로부터 단리되었다. 링커는 올리고뉴클레오티드 EcoPst-4: 5' - GGG ATC CAA GCT TAC GAG CTC GGC GAA TTC GAT ATC-3'(SEQ.ID.NO. 10)과 올리고뉴클레오티드 EcoPst-3: 5'- AAT TGA TAT CGA ATT CGC CGA GCT CGT AAG CTT GGA TCC CTG CA-3'(SEQ.ID.NO. 9)를 어닐링함으로써 제조되었다. 여기서, 올리고뉴클레오티드는 상기에 기술된 것과 같이 혼합되었고 2분간 98℃, 30분간 65℃ 및 2시간 동안 실온에서 배양함으로써 어닐링되었다. 단리된 벡터 단편은 그 후에 여분의(excess) 어닐링된 올리고에 연결되었고 구성체 pCC100을 초래하는 DH5α-T1^r 수용성 세포로 형질전환되었다.

pCC200 의 생성

플라스미드 pBR322(Genbank J01749.1)는 EcoRI로 소화되었고 그 후에 Klenow 효소로 블런트화되었고, QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)에 의한 정제가 뒤따랐다. NheI로 두 번째 소화 후에, 4150 bp 벡터 단편은 QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 단리되었다. 동시에, 구성체 pCC100이 BsaAI로 소화되었고, Klenow 효소로 블런트화되었고 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제되었으며, XbaI로 두 번째 소화 및 아가로오스 겔로부터의 350bp 단편의 단리가 뒤따랐다. 단편은 그 후에 연결되고 화학적 수용성 STBL-2 세포(Invitrogen)로 형질전환되어, pCC200을 초래한다(도 15).

pCC105 의 생성

구성체 pCC105는 인간 PGK 프로모터 및 인간 COL1A2 유전자에서 유래된 폴리아데닐화 서열을 함유한다. 먼저, COL1A2 폴리아데닐화 서열(Natalizio et al., 2002)이 재조합 Taq 폴리머라아제(Invitrogen) 및 프라이머 COL1A2F: 5' - CAG CTA GCC TGC AGG AAG TAT GCA GAT TAT TTG -3'(SEQ.ID.NO. 11) 및 COL1A2R-sal: 5' - ACA CGT CGA CGG CTG GTA GAG ATG C -3'(SEQ.ID.NO 12)를 사용하여 저술가에 의해 기술된 것과 같이 인간 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다.

이로써 공개된 서열은 SbfI 제한 서열에 의해 5'-말단 및 SalI 제한 서열에 의해 3'-말단에서 연장된다. 그 결과의 PCR 단편은 pCR-TOPO4 TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 pCR-TOPO-TA로 클로닝된다. 서열 분석에 의한 삽입의 확인 후에, 277bp 삽입은 SbfI 및 SalI의 소화에 의해 TOPO 벡터로부터 단리되었고, QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제되었다. 동시에, 플라스미드 pCC101은 또한 SbfI 및 SalI로 소화되었고, 겔 전기영동이 뒤따랐다. 2965 bp 벡터 단편은 제조자 지시에 따라 GeneClean 키트(Bio101)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 단리되었다. 이 벡터 단편은 같은 몰량으로 정제된 COL1A2pA 단편에 연결되었고 화학적 수용성 STBL-2 세포(Invitrogen)로 형질전환되었다. 이것은 플라스미드 pCC105(도 7)를 부여했다.

pCC205 의 생성

구성체 pCC205는 SalI 및 EcoRI로 pCC200의 소화에 의해 만들어졌고, QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여, 아가로오스 겔로부터 4225 nt 벡터 단편의 정제가 뒤따랐다. 동시에, 310 nt COL1A2 폴리A는 EcoRI 및 SalI의 소화에 의해 구성체 pCC105로부터 단리되었고, QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트를 사용하여 단편의 겔 전기영동 및 정제가 뒤따랐다. 두 단편이 그 후에 같은 몰량으로 연결되었고 DH5α-T1r로 형질전환되어, pCC205가 생겼다(도 16).

pCC .55 Kcol 의 클로닝

벡터 pCC205는 Ad5 E1B-55k 단백질을 발현하는 플라스미드의 구성을 위해 사용된다. 이것에 관하여, PCR 생성물은 하기 프라이머를 사용하여 생성된다: 55KforE: 5' -GGA ATT CGC CAC CAT GGA GCG AAG AAA CCC ATC TGA-3'(SEQ.ID.NO. 13) 및 55KrevB: 5' -gga tcc TCA ATC TGT ATC TTC ATC GCT AGA GCC-3'(SEQ.ID.NO. 14). PCR은 제조자 프로토콜에 따라 3% DMSO의 존재시에 Pwo DNA 폴리머라제로 수행된다. pIG.E1A.E1B에 대해 증폭이 행해졌고 프로그램은 2분간 94℃로 설정되고 (30초간 94℃, 30초간 60℃ 및 90초간 72℃)의 30 순환이 뒤따랐고 8분간 72℃로 끝났다. 그 결과의 1510bp 증폭된 단편은 Ad5 서열로부터 E1B-55K 서열 nt 2019~3510까지를 함유한다. 단편은 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제되고, EcoRI 및 BamHI로 소화되고 분할된 말단의 제거를 위해 겔 전기영동이 뒤따랐다. 이 단편은 그 후에 GeneCleanⅡ 키트(Bio101)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 정제되고 pCC205로 연결되며, 그것은 또한 EcoRI 및 BamHI로 소화되고 상기에 기술되어 있듯이 아가로오스 겔로부터 단리된다. 연결 혼합물은 화학적 수용성 STBL2 세포(Invitrogen)로 형질전환되어, 구성체 pCC.55Kcol이 생긴다(도 8).

pIG . E1B 의 클로닝

PCR 단편은 제조자의 지시에 따라 3% DMSO의 존재시에 Pwo DNA 폴리머라아제(Roche)로 생성되었다. 하기 프라이머가 증폭 반응에서 사용되었다: 5E1Bstart: 5' -GGA ATT CCT CAT GGA GGC TTG GG-3'(SEQ.ID.NO. 15) 및 5E1Brev2: 5'-GTG TCT CAC AAC CGC TCT C -3'(SEQ.ID.NO. 16). 증폭은 pIG.E1A.E1B에 대해 행해졌고 프로그램은 2분간 94℃로 설정되었고 (30초간 94℃, 30초간 56℃ 및 60초간 72℃)의 5 순환이 뒤따랐고 이 순환은 그 후에 (30초간 94℃, 30초간 60℃ 및 60초간 72℃)의 35 순환이 뒤따랐고 8분간 68℃로 끝났다. 390 nt PCR 단편이 그 후에 QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 단리된 347 nt 단편에서 생긴 KpnI 및 EcoRI로 소화되었다.

이러한 단편은 그 후에 KpnI 및 부분적으로는 EcoRI로 소화, 그 후에 겔로부터의 단리에서 생긴 5713 bp pIG.E1A.E1B 벡터에 연결되었고, QIAEX Ⅱ 추출 키트(Qiagen)로 추출되었다. 연결 후에, 혼합물은 화학적으로 수용성 STBL-2 세포로 형질전환되어, 플라스미드 pIG.E1B가 되었다(도 9). pIG.E1B는 Ad5 게놈으로부터 nt 2019~3510을 함유한다.

pCC . E1Bcol 의 클로닝

둘 다의 19K 및 55K Ad5 E1B 코딩 서열을 지니는 플라스미드의 구성을 위해, 플라스미드 pCC.55Kcol이 EcoRI 및 KpnI로 소화된다. 5970nt 벡터 단편은 겔 전기영동에 의해 단리되고 상기에서와 같이 GeneClean 키트Ⅱ(Bio101)에 의해 아가로오스 겔로부터 정제된다. 구성체 pIG.E1B는 그 후에 또한 KpnI 및 EcoRI로 소화되고 347 nt 단편은 겔로부터 단리되고 QIAquick 겔 추출 키트(Qiagen)로 정제된다. 이러한 삽입의 연결 및 단리된 pCC.55Kcol 벡터 단편 및 STBL2 세포로의 형질전환은 구성체 pCC.E1Bcol을 부여한다(도 10). 이러한 구성체는 Ad5 게놈 서열로부터 nt 1711~3510을 함유한다.

pEC . E1B 의 클로닝

인간 연장 인자 1-α 프로모터(EF1-α)는 EcoRI 및 PmlI에 의한 소화에 의해 플라스미드 pEF/myc/nuc(Invitrogen)으로부터 단리된다. 소화 후에 단편은 Klenow 효소로 블런트화되고 1183 nt EF1-α 프로모터 단편은 그 후에 겔 전기영동에 의해 단리되고 GeneClean 키트(Bio101)에 의해 정제된다. 동시에, 벡터 pCC.E1Bcol은 BstXI로 소화되고, 말단을 블런트로 만드는 T4 DNA 폴리머라아제 처리가 뒤따르고 PCR 정제 컬럼(Qiagen)으로 정제된다. 그 후에 두 번째 소화가 EcoRV로 수행되고, 겔 전기영동이 뒤따른다. 5827 nt 벡터 단편은 그 후에 GeneCleanⅡ 키트(Bio101)에 의해 정제된다. EF1-α 단편 및 벡터 단편 둘 다가 같은 몰량으로 함께 연결되고 화학적 수용성 STBL-2 세포(Invitrogen)로 형질전환되고, 그것은 플라스미드 pCC.E1Bcol에서와 동일한 Ad5-E1B 서열을 함유한 플라스미드 pEC.E1B가 된다(도 11).

pSC .55K의 클로닝

SV40 프로모터는 재조합 Taq DNA 폴리머라아제(Invitrogen) 및 하기 프라이머: SV40.forS: 5' -CAA CTA GTA CAT GTG GAA TGT GTG TCA GTT AGG-3' (SEQ.ID.NO. 17) 및 SV40.RevERI: 5' -GGA ATT CAG CTT TTT GCA AAA GCC TAG G-3' (SEQ.IC.NO. 18)를 사용함으로써 pEF/myc/nuc 플라스미드 DNA(Invitrogen)로부터 증폭되었다. 증폭 프로그램은 2분간 94℃로 설정되었고 (30초간 94℃, 30초간 48℃ 및 45초간 72℃)의 5 순환과 그 후에 (30초간 94℃, 30초간 58℃ 및 45초간 72℃)의 추가 25 순환이 뒤따랐고 8분간 68℃로써 끝났다. 그 결과의 357bp 증폭된 단편(SV40 서열 GenBank Acc. No. J02400으로부터 뉴클레오티드 266~ -71까지의)은 QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트(Qiagen)에 의해 아가로오스 겔로부터 단리되었다. 이러한 단편은 그 후에 PCR TOPO4blunt 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여, PCR-TOPO로 클로닝되었다. 서열 확인 후에, 357bp 삽입은 EcoRI 및 SpeI에 의한 소화에 의해 TOPO 벡터로부터 단리되었고, QIAEX Ⅱ 겔 추출 키트(Qiagen)에 의해 아가로오스 겔로부터 단리되었다. 동시에, 플라스미드 pCC.55Kcol(pBR322-백본을 가짐)이 AvrⅡ 및 EcoRI에 의해 소화되었고, 겔 전기영동이 뒤따랐다. 5508 nt 벡터 단편은 상기에 기술된 것과 같이 겔로부터 단리되고 소화된 PCR 단편에 같은 몰량으로 연결된다. 연결 혼합물은 화학적 수용성 STBL-2 세포로 형질전환되어 pCC.55Kcol에서와 동일한 Ad5 E1B-55K 서열을 함유한 플라스미드 pSC.55K(도 12)가 된다.

1차 HER 세포로부터 형질전환된 클론을 생성시키기 위해, 적절한 발현 카세트를 함유하고 있는 DNA 단편은 겔로부터 단리된다. (중복) 벡터 서열의 제거는 공-통합의 가능성을 감소시킨다고 믿어진다. 여기에, pCC.E1A 및 pCC.E1AB21은 BsaAI 및 AFlⅢ로 소화되고 삽입 단편은 제조사 지시에 따라 ELU-Trap 기구(Schleier and Schuell)를 사용하여 겔로부터 정제된다. 이 기구는 대량의 DNA 단편의 단리를 가능하게 한다. 구성체 pEC.E1B 및 pSC.55K는 AatⅡ/HincⅡ 및 AflⅢ/HincⅡ로 각각 소화되고 삽입 단편은 상기에서와 같이 단리된다. 1차 HER 세포는 배양되고 상기에 기술된 것과 같이 트랜스펙션된다. pCC.E1A 및 pEC.E1B로부터 단리된 단편은 트랜스펙션을 위해 조합된다. pCC.E1AB21로부터 단리된 DNA 단편은 pSC.55K로 조합되거나 홀로 트랜스펙션된다. 후자의 배양물은 그 후에 관찰된 클론의 크기에 의존하는 첫 번째 트랜스펙션 후 7-10일에 pSC.55K로부터 단리된 DNA 단편으로 재-트랜스펙션된다. 트랜스펙션 하루 전에 E1AB21로만 트랜스펙션된 디쉬의 절반은 10cm 디쉬에 전달되고 그 후에 재-트랜스펙션되고, 디쉬의 다른 절반은 이전의 전달 없이 재-트랜스펙션된다.

이러한 트랜스펙션으로부터 생긴 형질전환된 클론이 채취되고 96-웰 플레이트 및 그 후에 더 큰 형식(format)으로 추가로 확장된다. 단편의 통합 부위 및 복사체 수는 삽입이 가까운 인접부에서 일어났는지를 밝히기 위해 서던 블럿 및 PCR에 의해 조사된다. E1A 및 E1B 55K가 단일 복사체로 존재하거나 1 이상의 복사체로 존재하거나, 트랜스펙션된 세포의 게놈에 이러한 서열의 역방위 반복 구조 없이 하나 이상의 복사체로 존재하거나, 또는 여기서 E1A 및 E1B 코딩 서열의 1 이상(이 경우에 E1B-55K)은 4kb 이상, 바람직하게는 10kb 이상, 더 바람직하게는 34.5kb로 떨어져 있는 경우에, 클론은 바람직하게는 추가로 사용된다.

실시예 2. 큰 스페이서 서열에 의해 분리된 E1A 및 E1B 영역을 가지는 핵산을 사용하여 보충 세포주의 생성.

상기 실시예에서 기술한 것과 같이, E1A 및 E1B에 대해 분리된 플라스미드를 사용하여 1차 세포로부터 안정하게 트랜스펙션된 세포 클론을 생성시키는 것이 가능하다. 하지만 DNA 단편이 함께 트랜스펙션되면, 트랜스펙션된 단편이 서로의 가까운 근접부에서 끝난다는 가능성이, 이러한 가능성은 상당한 서열 중복의 부재시에 감소되지만, 여전히 있다. 염색체에서 사이에 30kb 미만의 무-E1 서열을 가진 E1A 및 E1B 발현 카세트 통합의 가능성은 무-(E1-)코딩 DNA 서열(소위 '스페이서' 단편)의 큰 조각을 가진 다른 E1 발현 카세트를 측면에 위치시킴으로써 회피될 수 있다. E1A-함유 단편은 생성된 포장 세포의 게놈에서 E1B-함유 단편의 옆에 통합되면, 큰 측면에 위치한 서열은 상기 포장 세포에서 재조합 아데노바이러스 벡터의 증식시에 E1A 및 E1B 암호화 서열이 동일한 재조합 벡터 분자로 재조합되는 가능성을 제거하기에 충분한 거리를 만들어 내야 한다. 사용될 수 있는 큰 스페이서 DNA 단편의 비-제한적 실시예는 예를 들면 인간 디스트로핀 유전자 또는 인간 Apo-E1 유전자에서 유래된 큰 서열이다. 다른 스페이싱 분자는 또한 심지어는 비-인간 공급원으로부터 사용될 수 있다. 바람직하게는, 측면에 위치한 서열은 기능 단백질을 위한 코딩 영역을 함유하지 않고 따라서 인트론 서열에서 유래될 수 있다. 또한 E1A 및 E1B 서열은 다른 분자상에 있을 필요는 없지만 코스미드와 같이, 동일한 큰 분자 상에 위치될 수 있다. 이들 E1A 및 E1B 함유 분자의 실시예는 도 13에 주어져 있다. 바람직한 구현예에서, E1A 및 E1B 코딩 영역 사이의 거리는 그 후에 두 영역의 바이러스로의 공-삽입이 너무 커서 포장될 수 없는 게놈이 되기 때문에 >34.5kb이다. 예를 들면 대략 중앙에 발현 카세트를 대략 가지고 있는 대략 40kb의 두 분리된 코스미드 단편이 사용되면, 이러한 상황에 도달될 것이다. 하지만, 역방위 반복 구조의 형태의 E1이 HDEP 생성의 빈도에 기여한다고 가정하면, 그러면 E1A 및 E1B 카세트가 대략 22kb(도 13Ⅰ에서와 같이)의 전체 길이의 단일 코스미드 단편 상에 위치되는 경우에 구성체는 두 번째 복사체가 첫 번째의 옆의 역방위 배향으로 세포의 게놈에 위치될 때조차도 만족시킨다. 거울-상 구조의 완전한 통합은 또한 그 후에 >38kb의 단편을 포함할 것이다. 또한, 역방위 반복의 존재가 HDEP 형성의 빈도를 증가시키면, 그러면 E1A 및 EAB의 2개의 완전한 복사체를 포함하는 DNA 단편이 ≤20kb의 길이를 가질 때조차, 다중 복사체가 직접 반복으로써 통합되는 경우의 상황은 문제라고 덜 여겨진다. 재조합 바이러스(즉, 재조합 바이러스의 38kb 마이너스 실제 게놈 길이)에 남겨진 공간보다 더 큰 E1-함유 단편의 재조합 바이러스로의 통합은 그것이 포장 및 따라서 증식을 보증하도록 순차적인 단계로써 필수적인 바이러스 서열의 부분을 삭제하도록 한다. 상동 재조합(Murakami et al., 2002)에 의해 생긴 첫 번째 HDEP 게놈의 분석은 바이러스 서열의 결실이 가능하다는 것을 보여주었다.

세포의 게놈으로 통합하는 DNA 서열은 염색질-관련 억제때문에 전사인자를 활성화시키기 위해 늘 접근이 쉬운 것은 아니다. 특히 이러한 서열로 변환될 세포 에서 일반적으로 활성이 아닌 게놈 영역에서 유래한 인트론 DNA의 큰 단편이 사용되면, 유전자 발현은 비활성 염색질때문에 차단(shut-off)될 수 있다. 최근에, 이러한 억제를 제지할 수 있는 서열이 확인되었다. 예로는 격리물(insulator) 서열로써 기능하는 닭 β-글로빈 HS4 요소(미국 특허 5,610,053), Drosophila scs 또는 scs' 요소(Kellum et al, 1991; Farkas et al, 1992), 및 항-억제자 요소(Kwaks et al., 2003; WO 03/004704)에 대한 특이적 스크린으로써 확인된 인간 게놈(소위 항-억제자 요소 또는 STAR 요소)에서의 일련의 서열이 있다. E1A 및 E1B 발현 구성체에서 그러한 서열의 병합(서열은 E1A 및/또는 E1B 유전자의 위치상의 침묵화(silencing)를 방지함)은 또한 불멸화된 클론의 양을 향상시킨다. 그러므로, 본 발명의 어떤 구현예에서, 하나 이상의 STAR-요소, 예를 들면 STAR 7(Genbank accession number AY190751) 또는 STAR 40(Genbank accession number AY190756)은 E1A 및/또는 E1B 발현 구성체의 하나 이상에 존재한다. 바람직하게는 상기 요소는 E1A 및/또는 E1B 코딩 서열의 양쪽의 측면에 위치하고 있다 즉, 발현 구성체는 5'에서 3'까지를 포함할 수 있다: STAR 요소 - 발현 조절 서열(예를 들면 프로모터) - E1A 코딩 서열; 또는 E1A + 하나의 E1B 코딩 서열; 또는 하나의 E1B 코딩 서열; 또는 E1B 코딩 서열 둘 다 - 폴리아데닐화 서열 - STAR 요소.

실시예 3 분리된 구성체 상에 E1A 및 E1B 를 가지고 있고 스터퍼 DNA 에 의해 측면에 위치된 세포주의 생성

이 실시예는 큰 스터퍼 DNA에 의해 측면에 위치된 E1A 발현 카세트를 가지고 있는 첫 번째 DNA 단편 및 플라스미드 DNA에 의해 측면에 위치된 E1B 발현 카세트 를 가지고 있는 두 번째 DNA 단편의 공-트랜스펙션에 의한 본 발명에 따른 신규한 세포주의 생성을 기술한다.

코스미드 벡터 백본(pdys44; 도 17)에서 클로닝된 인간 디스트로핀 인트론 44 서열(Genbank Acc. No. M86524)이 E1A 발현 플라스미드를 둘러싸고 있는 스터퍼 DNA로써 이 실시예에서 취해졌다.

구성체 pCC.E1A(실시예 1에 기술됨; 도 4)는 AflⅢ 및 AvrⅡ(New England Biolabs)로 소화되었고 돌출된 말단은 Klenow 효소(New England Biolabs)로 블런트로 만들어졌다. 소화된 단편은 0.5% TAE 아가로오스 겔 상에서 분리되었고 PGK-E1A 발현 카세트에 해당하는 2kb 단편은 제조자 지시에 따라 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제되었다.

구성체 pdys44(도 17)는 BglⅡ(New England Biolabs)로 소화되었고 돌출된 말단은 Klenow 효소로 블런트로 만들어졌다. 단편은 0.5% TAE 아가로오스 겔 및 백본 플라스미드를 함유하고 있는 27kb 단편 상에서 분리되었고 디스트로핀 인트론의 부분이 절제되었다. 겔 슬라이스는 그 후에 작은 유리솜을 함유하고 있는 시린지에 넣어졌고, 플런저(plunger)를 사용하여, DNA를 함유하고 있는 완충용액은 에펜도르프 튜브에 밀어 넣어졌다. 그에 따라 얻어진 DNA 용액은 대략 5ng/㎕를 함유했고 정제된 2kb PGK-E1A 단편과 연결 반응에서 직접 사용되었다. DH5αT1 수용성 세포로의 형질전환은 구성체 p44-1.ccE1A(도 18)가 되었다. 구성체는 인간 PGK 프로모터 및 합성 폴리A 신호의 조절 하에 E1A를 함유한다.

구성체 pE1B(실시예 1에서 기술됨; 도 3)는 E1B 발현 플라스미드와 같이 이 실시예에서 사용되었다. 플라스미드는 그 자신의 프로모터 및 간염 B 바이러스(HBV) 폴리A 신호의 조절 하에 E1B를 함유한다.

구성체 p44-1.ccE1A는 XhoⅠ 및 PmeⅠ로 소화되었고 소화된 DNA는 에탄올 침전이 뒤따르는 페놀/클로로포름(1:1) 추출에 의해 정제되었다(E1A 코딩 서열의 약 11.6kb 상류(PGK 프로모터를 포함함) 및 약 6.5kb 하류(합성 폴리A 신호를 포함함)의 스터퍼에 의해 측면에 위치된 E1A 코딩 서열이 생김). DNA는 그 후에 펠렛화되었고, 70% 에탄올로 세척되었고 무균 무-내독소 TE에서 무균으로 용해되었다. 플라스미드 pE1B는 ScaI로 소화되었고 상기와 같이 정제되었다(E1B 코딩 서열의 약 1.4kb 상류 및 2.3kb 이상의 하류의 스터퍼에 의해 측면에 위치된 E1B 코딩 서열이 생김, 다운스트림 스터퍼는 HBV 폴리A 서열을 포함함).

1차 인간 HER 세포는 배양되었고 일련의 트랜스펙션에서 계대(passage) 번호 6(PN6)상에서 그리고 두 번째 일련의 트랜스펙션에서 PN9 상에서 트랜스펙션되었다. HER 세포 배양 및 트랜스펙션은 실시예 1에서 기술된 방법에 따라 행해졌다. 상기에서 제조된 E1A 및 E1B를 함유하고 있는 DNA들은 별도의 트랜스펙션에서 다른 비율로 혼합되었다(둘 다의 단편들은 벡터 서열 또는 조절 서열에서 유래된, 서로에 대하여 상당한 중복이 없고, 이로써 두 단편들 사이의 상동 재조합의 가능성을 감소시킨다; 둘 다의 단편이 단일 핵산 분자를 형성하고(예를 들면, 말단-대-말단 접합 또는 연결에 의해, 이론상의 가능성), 그 이후 단일 유니트로써 게놈으로 통합되면, 그 결과의 세포에서 E1A 및 E1B 코딩 서열은 4kb 이상의 스터퍼 서열(6.5kb 이상(하류 E1A) + 1.4kb(상류 E1B) = E1A 및 E1B 코딩 서열 사이에서, 7.9kb 이상, 이론상)로 떨어져 있을 것이다. 총 8의 디쉬가 둘 다의 구성체들(17㎍ E1A 및 3㎍ E1B 플라스미드)의 대략 같은 몰 비율로 트랜스펙션되었고 3 디쉬가 각각의 단편의 10㎍으로 트랜스펙션되었다. 병소는 두 일련의 트랜스펙션에서 관찰되었지만 각 구성체의 10㎍의 경우에 상대적으로 더 많은 병소가 얻어졌다. AseI 및 BglI로 소화된 구성체 pIG.E1A.E1B는 별도의 디쉬에 양성 대조구(20㎍ DNA/접시)로써 사용되었다. 예상되었듯이, 병소 형성의 효율은 두 별도의 단편(p44-1.ccE1A 및 pE1B로부터)에 의해서보다 (단일) 양성(positive) 대조구 플라스미드에 의해서가 더 높았다. pIG.E1A.E1B 플라스미드는 대략 10x 더 효율적이었다. 여전히, 채취된 형질전환 세포 클론의 약 80-90%에 대한 양성 대조구 플라스미드 및 2-단편 트랜스펙션이 생육가능하다는 것이 밝혀졌고 세포주로써 확립되었다.

이들 실험은 별도의 DNA 단편 상의 그리고 (비-중복) 스터퍼 DNA에 의해 측면에 위치된 E1A 및 E1B 유전자에 의한 공-트랜스펙션에 의해 1차 세포를 형질전환시키는 것이 가능하다는 것을 분명히 보여주었다. 총 6의 클론 HER01-B-71(2004년 10월 1일 European Collection of Cell Cultures(ECACC)에 번호 04100101하에 기탁됨), HER01-H-87(2004년 10월 1일 ECACC에 번호 04100102하에 기탁됨), HER01-H-86, HER01-H-88, HER01-H-89 및 HER01-B-90이 추가로 분석되었다.

E1 유전자의 발현은 웨스턴 블럿 상에서 E1 단백질에 대한 특이 항체를 사용하여 분석되었다. 생성된 세포 클론의 용해질로부터의 10㎍ 단백질의 총량이 웨스턴 블럿 분석에 사용되었다. 1/4 부피 NuPage 샘플 완충용액(Invitrogen)의 첨가 후에, 샘플은 15분간 70℃로 변성되었다. 양성의 대조구로써, PER.C6^® 세포 용해질이 사용되었다. 트랜스펙션되지 않은 1차 HER 세포 용해질(계대 번호 6)은 음성 대조구로써 작용했다. 샘플은 Seeblue plus2 예비-염색된 마커(Invitrogen)와 함께 10% BisTris SDS 페이지 겔(Invitrogen) 상에서 가동되었다. 웨스턴 블럿은 겔로부터 제조되었다. 하기 항체가 사용되었다: 1) E1A: 마우스 항-인간 Ad2.E1A(1:400, Santa Cruz), 또는 2) E1B.19K: 랫트 항-인간 E1B 21K 모노클로날(1:500, Oncogene), 또는 3) E1B.55K: 마우스 항-인간 55Kda(Dr. R. Hoeben, LUMC, Leiden으로부터 얻어진 하이브리도마 세포주 C9A1C6으로부터 수집됨). 하기 항체가 두 번째 항체로써 사용되었다: 1) E1A: 염소-항 마우스 IgG-HRP(Biorad), 2) E1B.19K: 염소-항 랫트 IgG-HRP(Epcam), 3)E1B.55K: μl 염소-항 마우스 IgG-HRP(Biorad). 단백질은 ECL+ 분석(Amersham)의 사용에 의해 시각화되었다. 이러한 실험으로부터 모든 시험된 클론은 E1A 및 E1B 단백질을 발현하고 수준은 PER.C6^® 세포(도 19)의 것과 비교될 수 있다는 것이 분명하다(도 19). 이것은 1차 세포의 형질전환이 자연적 이벤트의 결과가 아니라 Ad5 E1 발현에 의해 정말로 유발된 것이라는 것을 확인한다.

이러한 세포주에서 Ad5 E1 유전자의 기능 발현은 또한 세포가 E1-결실된 Ad5 바이러스를 보충할 수 있다는 것을 보여줌으로써 시험될 수 있다. 그러므로, 6개의 다른 세포 클론이 Ad5.eGFP 벡터, E1-결실된(Ad5 서열의 nt. 455-3510의 삭제), 녹색 형광 단백질을 발현하고 있는, Ad5-기초 아데노바이러스 벡터의 복제를 위해 시 험되었다. 여기서, 세포는 1×10⁶ 세포/웰의 밀도로 접종되었고 5 바이러스 입자(VP)/세포의 감염 다중도(MOI)로 하루 후에 감염되었다. 양성 대조구로써 PER.C6^® 세포는 또한 접종되었고 5의 MOI로 감염되었다. 5일 후에 완전한 세포변성현상(cytopathogenic effect)(CPE)이 모든 웰에서 보여졌다. 세포와 배지는 수집되었고, 3회 냉동/해동되었고 세포 조직파편을 제거하기 위해 원심분리되었다. 상청(원 용해질)이 그 후에 A549 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 여기서, 5×10⁵ A549 세포는 24-웰 플레이트에 접종되었고 하루 후에 50㎕의 원 용해질로 감염되었다. 2일 후에 A549 세포는 수집되었고 GFP 발현에 대해 FACS에 의해 분석되었다. 결과는 모든 클론이 Ad5.eGFP 벡터(도 20)를 보충할 수 있다는 것을 보여준다. 특히, 아데노바이러스 벡터(E1-결실됨, nt 455-3510이 없다)는 세포주(Ad5 nt 459-3510)에 존재하는 E1 서열과 중복이 없고, 그러므로 이 실시예에서 신규 세포주와 아데노바이러스 벡터의 조합은 본 발명에 따른 포장 시스템에 해당하고, 이 실시예에서 재조합 아데노바이러스의 생성은 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스의 회분을 생성시키는 방법에 해당한다.

E1A 및 E1B 프로브를 사용하여, E1A 및 E1B 코딩 서열이 세포의 게놈에서 4kb 이상 떨어져 있다는 것을 증명하기 위해, 생성된 세포주로부터의 게놈 DNA는 서던 블롯상에서 시험된다. 여기서, 게놈 DNA는 제한 엔도뉴클레아제 EcoRV 및 BglⅡ(도 21)로 소화된다. 소화된 DNA는 겔 전기영동에 의해 분리된 크기이고(예를 들면 큰 DNA 단편의 분리를 가능하게 해주는 장 전도(field inversed) 겔 전기영동, FIGE를 사용함), 그 후에 모세관 블로팅에 의해 나일론 막으로 옮겨진다. 세 개의 다른 프로브는 블롯의 혼성화를 위해 방사성표지가 달려진다. 하나의 Ad5.E1A 프로브는 Ad5.E1A 유전자의 EcoRV 부위로부터 3'에 위치된 EcoRV-SalⅠ 제한 단편(1330 bp; 도 21 참조)으로부터 생성된다. 두 Ad5.E1B 프로브가 생성된다; 각각 Ad5.E1B 유전자에 BglII 부위의 5' 쪽 및 3' 쪽에 위치된, BssHII-BglII 단편(1354 bp) 및 Ad5.E1B(3')으로부터, BglII-BsrGI 단편(652 bp)으로부터, Ad5.E1B(3'). 생성된 세포주의 소화된 게놈 DNA를 함유하고 있는 동일한 블롯이 제조되거나, 대안으로, 블롯은 첫 번째 프로브의 혼성화 후에 제거되고 그 후에 두 번째와 혼성화된다. 어느 한 쪽의 방법은 E1A 및 E1B 프로브로 얻어진 신호의 오버레이를 허용해야 한다. 만약, 형질전환된 세포주의 생성 중에 트랜스펙션 및 통합 후에, E1A 단편이 E1B-함유 단편의 옆에 통합되면 E1A 및 E1B에 대한 프로브는 블롯 상의 동일 띠를 검출하고, 상기 띠의 크기는 두 유전자 사이의 거리를 확인해준다. 서로에 대하여 E1A 및 E1B 단편의 배향이 알려져 있지 않으므로, BglII 제한 부위의 단편 5' 또는 3'에 혼성화를 가능하게 하는 두 E1B 프로브는 별도로 사용된다. E1A 단편이 또 하나의 E1A 단편 옆에 통합되면 그러면 EcoRV 소화에서 생긴 띠는 E1B 프로브에 의해 인식되지 않을 것이다. 또한 단일 통합체 또는 말단 단편들은 둘 다의 프로브에 의해 인식되지 않는 띠를 생성시킬 것이다.

전체적으로 보아, 이 실시예에서 실험은 별도의 플라스미드들에 의한 1차 인간 세포의 공-트랜스펙션은(큰 스터퍼 영역에 의해 측면에 위치된 E1A를 함유한 하나와 백본 서열에 의해 측면에 위치된 E1B를 함유하고 있는 하나) 형질전환된 세포 주를 초래한다. 더욱이, 이들 세포주는 E1-결실된 Ad5 벡터의 효과적인 보충에 충분한 양으로 E1 단백질을 발현한다.

대안의 구현예에서, E1A 및 E1B 서열은 이러한 서열들 사이에 스터퍼 단편을 가진, 단일 구성체로 클로닝되고, 그 후에 세포주는 단일 구성체를 사용하여 만들어진다.

분명히, E1A 및 E1B 사이의 더 넓은 거리가 원하여지면, E1B 코딩 서열은 또한 더 긴 스터퍼 핵산에 의해 측면에 위치될 수 있고, 그리고/또는 E1A 및 E1B 코딩 서열의 측면에 위치한 스터퍼의 길이는 본 개시의 가르침을 따르는, 표준 상용 분자 생물학 기술에 의해, 증가될 수 있었다. 그러므로 분명히, 이 실시예는 실제로 수행된 실험으로 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안되며 오히려 본 발명의 개념의 실례로써 해석되어야 한다.

표

표 Ⅱ: Ad5-E1 발현 구성체로 1차 HER 세포의 형질전환.

참조

SEQUENCE LISTING <110> CRUCELL HOLLAND B.V. Vogels, Ronald Havenga, Menzo J.E. Zuijdgeest, David A.T.M. <120> Packaging cells for recombinant adenovirus <130> 0095 WO 00 ORD <160> 18 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 7315 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> plasmid pIG.E1A.E1B <220> <221> human phosphoglycerate kinase promoter <222> (17)..(504) <220> <221> E1 region of human adenovirus type 5 genome <222> (513)..(3564) <220> <221> hepatitis B virus polyadenylation sequence <222> (3588)..(4205) <400> 1 gaattcgata attccacggg gttggggttg cgccttttcc aaggcagccc tgggtttgcg 60 cagggacgcg gctgctctgg gcgtggttcc gggaaacgca gcggcgccga ccctgggtct 120 cgcacattct tcacgtccgt tcgcagcgtc acccggatct tcgccgctac ccttgtgggc 180 cccccggcga cgcttcctgc tccgccccta agtcgggaag gttccttgcg gttcgcggcg 240 tgccggacgt gacaaacgga agccgcacgt ctcactagta ccctcgcaga cggacagcgc 300 cagggagcaa tggcagcgcg ccgaccgcga tgggctgtgg ccaatagcgg ctgctcagca 360 gggcgcgccg agagcagcgg ccgggaaggg gcggtgcggg aggcggggtg tggggcggta 420 gtgtgggccc tgttcctgcc cgcgcggtgt tccgcattct gcaagcctcc ggagcgcacg 480 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caagacctac ccgccgtcct aaaatggcgc ctgctatcct gagacgcccg 1380 acatcacctg tgtctagaga atgcaatagt agtacggata gctgtgactc cggtccttct 1440 aacacacctc ctgagataca cccggtggtc ccgctgtgcc ccattaaacc agttgccgtg 1500 agagttggtg ggcgtcgcca ggctgtggaa tgtatcgagg acttgcttaa cgagcctggg 1560 caacctttgg acttgagctg taaacgcccc aggccataag gtgtaaacct gtgattgcgt 1620 gtgtggttaa cgcctttgtt tgctgaatga gttgatgtaa gtttaataaa gggtgagata 1680 atgtttaact tgcatggcgt gttaaatggg gcggggctta aagggtatat aatgcgccgt 1740 gggctaatct tggttacatc tgacctcatg gaggcttggg agtgtttgga agatttttct 1800 gctgtgcgta acttgctgga acagagctct aacagtacct cttggttttg gaggtttctg 1860 tggggctcat cccaggcaaa gttagtctgc agaattaagg aggattacaa gtgggaattt 1920 gaagagcttt tgaaatcctg tggtgagctg tttgattctt tgaatctggg tcaccaggcg 1980 cttttccaag agaaggtcat caagactttg gatttttcca caccggggcg cgctgcggct 2040 gctgttgctt ttttgagttt tataaaggat aaatggagcg aagaaaccca tctgagcggg 2100 gggtacctgc tggattttct ggccatgcat ctgtggagag cggttgtgag acacaagaat 2160 cgcctgctac tgttgtcttc cgtccgcccg gcgataatac cgacggagga gcagcagcag 2220 cagcaggagg aagccaggcg gcggcggcag gagcagagcc catggaaccc gagagccggc 2280 ctggaccctc gggaatgaat gttgtacagg tggctgaact gtatccagaa ctgagacgca 2340 ttttgacaat tacagaggat gggcaggggc taaagggggt aaagagggag cggggggctt 2400 gtgaggctac agaggaggct aggaatctag cttttagctt aatgaccaga caccgtcctg 2460 agtgtattac ttttcaacag atcaaggata attgcgctaa tgagcttgat ctgctggcgc 2520 agaagtattc catagagcag ctgaccactt actggctgca gccaggggat gattttgagg 2580 aggctattag ggtatatgca aaggtggcac ttaggccaga ttgcaagtac aagatcagca 2640 aacttgtaaa tatcaggaat tgttgctaca tttctgggaa cggggccgag gtggagatag 2700 atacggagga tagggtggcc tttagatgta gcatgataaa tatgtggccg ggggtgcttg 2760 gcatggacgg ggtggttatt atgaatgtaa ggtttactgg ccccaatttt agcggtacgg 2820 ttttcctggc caataccaac cttatcctac acggtgtaag cttctatggg tttaacaata 2880 cctgtgtgga agcctggacc gatgtaaggg ttcggggctg tgccttttac tgctgctgga 2940 agggggtggt gtgtcgcccc aaaagcaggg cttcaattaa gaaatgcctc tttgaaaggt 3000 gtaccttggg tatcctgtct gagggtaact ccagggtgcg ccacaatgtg gcctccgact 3060 gtggttgctt catgctagtg aaaagcgtgg ctgtgattaa gcataacatg gtatgtggca 3120 actgcgagga cagggcctct cagatgctga cctgctcgga cggcaactgt cacctgctga 3180 agaccattca cgtagccagc cactctcgca aggcctggcc agtgtttgag cataacatac 3240 tgacccgctg ttccttgcat ttgggtaaca ggaggggggt gttcctacct taccaatgca 3300 atttgagtca cactaagata ttgcttgagc ccgagagcat gtccaaggtg aacctgaacg 3360 gggtgtttga catgaccatg aagatctgga aggtgctgag gtacgatgag acccgcacca 3420 ggtgcagacc ctgcgagtgt ggcggtaaac atattaggaa ccagcctgtg atgctggatg 3480 tgaccgagga gctgaggccc gatcacttgg tgctggcctg cacccgcgct gagtttggct 3540 ctagcgatga agatacagat tgagctcgac ctgcaggcat gcaagctgat ccttcgcggg 3600 acgtcctttg tttacgtccc gtcggcgctg aatcccgcgg acgacccctc gcggggccgc 3660 ttgggactct ctcgtcccct tctccgtctg ccgttccagc cgaccacggg gcgcacctct 3720 ctttacgcgg tctccccgtc tgtgccttct catctgccgg tccgtgtgca cttcgcttca 3780 cctctgcacg ttgcatggag accaccgtga acgcccatca gatcctgccc aaggtcttac 3840 ataagaggac tcttggactc ccagcaatgt caacgaccga ccttgaggcc tacttcaaag 3900 actgtgtgtt taaggactgg gaggagctgg gggaggagat taggttaaag gtctttgtat 3960 taggaggctg taggcataaa ttggtctgcg caccagcact atgcaacttt ttcacctctg 4020 cctaatcatc tcttgtacat gtcccactgt tcaagcctcc aagctgtgcc ttgggtggct 4080 ttggggcatg gacattgacc cttataaaga atttggagct actgtggagt tactctcgtt 4140 tttgccttct gacttctttc cttccgtcag agatcctgca gagcttggtg gaaggcagtg 4200 gaattagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 4260 caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 4320 tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 4380 cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 4440 gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 4500 tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 4560 agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 4620 cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 4680 ggtggcgaaa 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acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 5580 ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 5640 gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 5700 caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 5760 gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 5820 ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 5880 tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 5940 caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 6000 tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 6060 cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 6120 ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 6180 aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 6240 tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 6300 gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 6360 gaaaagtgcc 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tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 7260 aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagt 7315 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5E1Bfor-1 <400> 2 cggaattcgg cgtgttaaat ggggcg 26 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5E1B-rev <400> 3 tagcaggcga ttcttgtgtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5E1A-For <400> 4 ccgaattcga tcgtgtagtg 20 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5E1A-rev <400> 5 cgggatccat ttaacacgcc atgcaag 27 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5E1AB21-rev <400> 6 cgggatcctc attcccgagg gtccag 26 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide X-SM-1 <400> 7 ctaggtcgac caattg 16 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide X-SM-2 <400> 8 ctagcaattg gtcgac 16 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide EcoPst-3 <400> 9 aattgatatc gaattcgccg agctcgtaag cttggatccc tgca 44 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide EcoPst-4 <400> 10 gggatccaag cttacgagct cggcgaattc gatatc 36 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer COL1A2F <400> 11 cagctagcct gcaggaagta tgcagattat ttg 33 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer COL1A2R-sal <400> 12 acacgtcgac ggctggtaga gatgc 25 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 55KforE <400> 13 ggaattcgcc accatggagc gaagaaaccc atctga 36 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 55KrevB <400> 14 ggatcctcaa tctgtatctt catcgctaga gcc 33 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5E1Bstart <400> 15 ggaattcctc atggaggctt ggg 23 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 5E1Brev2 <400> 16 gtgtctcaca accgctctc 19 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer SV40.forS <400> 17 caactagtac atgtggaatg tgtgtcagtt agg 33 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer SV40.RevERI <400> 18 ggaattcagc tttttgcaaa agcctagg 28

Claims (28)

1. 아데노바이러스 E1A 코딩 서열, E1B-19K 코딩 서열 및 E1B-55K 코딩 서열이 게놈으로 통합되어 있는 세포를 제조하는 방법으로, 상기 방법은

   b1) E1A 코딩 서열, E1B-19K 코딩 서열 및 E1B-55K 코딩 서열을 포함하고 있는 단일 핵산 분자, 여기서 상기 E1A 코딩 서열과 상기 E1B 코딩 서열들 중에서 적어도 하나는 8kb 이상 떨어져 있고, 또는

   b2) 단일 핵산 분자를 형성할 때 상기 b1)에 따른 단일 핵산 분자를 형성하는 2 이상의 핵산 분자들을

   전구체 세포로 도입하는 단계를 포함하는 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 E1A 코딩 서열과 상기 E1B 코딩 서열들 중에서 적어도 하나는 10kb 이상 떨어져 있는 것인 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 E1A 코딩 서열과 상기 E1B 코딩 서열들 중에서 적어도 하나는 34.5kb 이상 떨어져 있는 것인 방법.
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8. 단일 핵산 분자를 형성할 때 재조합 분자를 형성하는 2 이상의 핵산 분자의 세트로,

   상기 재조합 분자는 아데노바이러스 E1A 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 아데노바이러스 E1B 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 E1A 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 상기 적어도 하나의 E1B 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 8kb 이상 떨어져 있는 것을 특징으로 하는 2 이상의 핵산 분자의 세트.
9. 제 8항에 있어서, 상기 E1A 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 상기 적어도 하나의 E1B 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 10kb 이상 떨어져 있는 것인 2 이상의 핵산 분자의 세트.
10. 제 9항에 있어서, 상기 E1A 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 상기 적어도 하나의 E1B 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 34.5kb 이상 떨어져 있는 것인 2 이상의 핵산 분자의 세트.
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12. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2 이상의 핵산 분자는 선형인 것인 2 이상의 핵산 분자의 세트.
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19. 아데노바이러스 E1A 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 적어도 하나의 아데노바이러스 E1B 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 E1A 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 상기 적어도 하나의 E1B 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 8kb 이상 떨어져 있는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
20. 제 19항에 있어서, 상기 E1A 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 상기 적어도 하나의 E1B 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 10kb 이상 떨어져 있는 것인 재조합 분자.
21. 제 20항에 있어서, 상기 E1A 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 상기 적어도 하나의 E1B 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 34.5kb 이상 떨어져 있는 것인 재조합 분자.
22. 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자는 선형인 것인 재조합 분자.
23. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 2 이상의 핵산 분자의 세트 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 재조합 분자가 게놈으로 통합되어 있는 세포.
24. 제 23항에 있어서, 게놈에 아데노바이러스 E1A 코딩 서열, E1B-55K 코딩 서열 및 E1B-19K 코딩 서열을 포함하고, 상기 게놈에서 상기 E1A 코딩 서열 및 상기 E1B 코딩 서열들 중 적어도 하나의 복사체를 위하여 상기 E1A 코딩 서열과 상기 E1B 코딩 서열들 중에서 적어도 하나는 8kb 이상 떨어져 있는 것인 세포.
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26. 제 24항에 있어서, 상기 E1A 코딩 서열과 상기 E1B 코딩 서열 중에서 적어도 하나는 상기 게놈에서 상기 E1A 및 E1B 코딩 사열들의 복사체를 위하여 10kb 이상 떨어져 있는 것인 세포.
27. 제 26항에 있어서, 상기 E1A 코딩서열 및 상기 E1B 코딩 서열 중에서 적어도 하나는 상기 게놈에서 상기 E1A 및 E1B 코딩 서열들의 복사체를 위하여 34.5kb 이상 떨어져 있는 것인 세포.
28. E1 영역에 결실을 가지고 있는 재조합 아데노바이러스의 회분(batch)을 생성하는 방법으로,

    a) 상기 재조합 아데노바이러스의 결실된 E1 서열을 보충할 수 있는 아데노바이러스의 E1 서열을 포함하고 있는 세포로 상기 E1 영역에 결실을 가지고 있는 재조합 아데노바이러스 또는 그것의 게놈을 도입하는 단계;

    b) 상기 세포를 배양하고 상기 재조합 아데노바이러스를 수확하는 단계

    를 포함하고, 상기 세포는 제23항에 따른 세포인 것인 방법.

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