CN110331170A - 一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用，涉及gRNA基因工程技术领域，双重gRNA的基因表达元件包括如下结构：多克隆酶切位点I‑U6启动子‑gRNA特异性序列1‑结构序列‑中间连接序列‑U6启动子‑gRNA特异性序列2‑结构序列‑多克隆酶切位点III，设计的双重gRNA全套基因表达元件两端各有一处多克隆酶切位点，这些酶切位点方便之后与表达载体进行连接，且表达载体不受限制，因此可以将此双重gRNA全套基因表达元件直接连接到Cas9核酸酶表达载体中，以进一步提高转染效率与基因编辑的成功率，中间存在多克隆酶切位点，可利用这些酶切位点将双重gRNA系统“拆分成”两个单gRNA系统，由此构建各种动物模型。

Description

一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及gRNA基因工程技术领域，特别是指一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用。

背景技术

基因编辑是当今研究的热点之一。而其中CRISPR/Cas9更是因其操作简单、方便，时间和成本都很低的优势，迅速风靡世界。CRISPR/Cas9系统中，Cas9核酸酶需要在crRNA和tracrRNA的协助下才能识别目的序列，然后对目的序列进行剪切以形成断裂的双链，从而进行基因编辑。之后经过改造，将crRNA和tracrRNA融合成一个RNA分子，即gRNA。

而CRISPR/Cas9系统中，Cas9核酸酶可以在一个gRNA的协助下进行单位点的基因编辑，也可以在多个gRNA的协助下进行多位点的基因编辑。目前单点编辑最为普遍，但单点基因编辑仅能在特定位点引入双链DNA断裂，如要移除基因组上一定长度的DNA片段，则无法实现，需依赖多位点基因编辑；另外，在科研和疾病治疗中，有时需要同时对两个或更多的基因进行编辑，单点基因编辑则无法实现，需依赖多位点基因编辑。目前多位点基因编辑中以双位点基因编辑应用最为广泛，即同时利用两个gRNA引导Cas9核酸酶对同一基因组的两个位点进行编辑。

申请人对于双位点基因编辑现有的方式研究发现，常用的双位点基因编辑由于载体的限制，存在转染成功率低，表达水平不一致的问题，上述问题会带来筛选时间和精力的增加。同时由于需要合成多个较长片段，极大地增加成本。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种快速、高效并且低成本地生成不受载体限制的双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件及其构建方法与应用。

基于上述目的本发明提供的一种双重gRNA的基因表达元件，包括如下结构：多克隆酶切位点I-U6启动子-gRNA特异性序列1-结构序列-中间连接序列-U6启动子-gRNA特异性序列2-结构序列-多克隆酶切位点III。

可选的，所述结构序列包括骨架、框架及终止序列。

可选的，所述中间连接序列包括多克隆酶切位点II。

可选的，所述gRNA特异性序列1和gRNA特异性序列2均具有SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2的碱基序列。

一种双重gRNA的基因表达元件的构建方法，包括如下步骤，

设计、合成引物并纯化，所述引物包括正向引物F1、F4、F5、F8和Fa，分别依次具有SEQ ID NO.3～7的碱基序列，反向引物F2、F3、F6、F7和Fb，分别依次具有SEQ ID NO.8～12的碱基序列；

以pGEM-T/U6-gRNA-X为模板，以引物F1、F3和F4、F2，第一次PCR扩增出构成U6-gRNA-1的DNA片段A和B，引物F5、F7和F8、F6，第一次PCR扩增出U6-gRNA-2的DNA片段C和D，并采用重叠PCR扩增将DNA片段A和B融合成U6-gRNA-1，C和D融合成U6-gRNA-2；并向U6-gRNA-1融合体系中加入引物F1、F2，U6-gRNA-2融合体系中加入引物F5、F6后，进行第2次PCR扩增，得U6-gRNA-1和U6-gRNA-2；

采用第二次重叠PCR扩增将U6-gRNA-1和U6-gRNA-2融合成一个双位点基因编辑的双重gRNA表达体系，然后向双重gRNA表达体系中加入引物Fa和Fb进行第三次PCR扩增，得双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件。

可选的，所述pGEM-T/U6-gRNA-X具有SEQ ID NO.13碱基序列。

可选的，所述第一次PCR扩增采用高保真的DNA聚合酶，配方如下：

可选的，所述重叠PCR扩增配方如下：

可选的，所述第二次重叠PCR扩增配方如下：

一种双重gRNA的基因表达元件的应用，所述双重gRNA的基因表达元件可以直接转染细胞，也可以利用其两端多个酶切位点接进载体中进而转染细胞，进行基因编辑。

从上面所述可以看出，本发明提供的一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用，双重gRNA的基因表达元件每一个gRNA都有各自的III型RNA聚合酶启动子-U6启动子，这可以高效的表达gRNA。同时也因为双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件中含有三处多克隆酶切位点，两端各有一处，中间连接序列含有一处，因此其可以高效地连接入载体质粒中，甚至可直接连接到Csa9核酸酶表达载体中，且无连接方向性的问题；中间的多克隆酶切位点也可以将其“拆分”成两个独立的单个gRNA表达系统，以用于只需要一个gRNA的情况；此方案提供的思路可扩展到三位点及以上的gRNA表达元件的构建，并且由于两个gRNA都在同一个表达载体中，那么只要转染成功的话，同一个细胞会同时转入两个gRNA，并且转入的这两个gRNA的拷贝数也一致，因此它们的表达水平也相同。除此之外，双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件因其具有自己独立的启动子，所以还可以直接在体外进行转录表达成成熟的gRNA，然后再利用显微注射等方式与Cas9核酸酶的mRNA或者蛋白同时导入到胚胎细胞中进行基因编辑，由此构建各种动物模型。

附图说明

图1为本发明实施例双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件的作用方式示意图；

图2为本发明实施例pGEM-T/U6-gRNA-X质粒图谱示意图；

图3为本发明实施例双位点基因编辑的双重gRNA的全套基因表达元件设计过程示意图；

图4为本发明实施例双位点基因编辑的双重gRNA的全套基因表达元件碱基序列示意图；

图5为本发明实施例双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件电泳结果示意图；

图6为本发明实施例U6-gRNA-1中基因特异性序列测序结果示意图；

图7为本发明实施例U6-gRNA-2中基因特异性序列结果示意图。

M-1kb plus ladder，1-PCR后A片段，2-PCR后B片段，3-PCR后C片段4-PCR后D片段，5-重叠PCR后U6-gRNA-1片段，6-重叠PCR后U6-gRNA-2片段，7-重叠PCR后双重U6-gRNA片段，箭头-目的条带。

具体实施方式

为下面通过对实施例的描述，本发明的具体实施方式如所涉及的制造工艺及操作使用方法等，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

需要说明的是，本发明实施例中所有使用“第一”和“第二”的表述均是为了区分两个相同名称非相同的实体或者非相同的参量，可见“第一”“第二”仅为了表述的方便，不应理解为对本发明实施例的限定，后续实施例对此不再一一说明。

对于双位点基因编辑，目前常用的策略有两种，第一种是将两个独立的gRNA和Cas9核酸酶这三个独立的表达载体一起转染细胞。第二种是利用特定的载体(如张峰实验室所设计的用于CRISPR/Cas9系统的多个gRNA表达载体)，合成多个较长片段进行连接以实现两个或多个gRNA表达载体的构建，然后再与Cas9核酸酶表达载体一起转染细胞。第一种方案，需要将三个载体同时转到同一个细胞中才可以实现双位点基因编辑。由于条件的苛刻会极大地降低转染的成功率，也会增加筛选的难度。同时gRNA分处两个不同载体，很难保证细胞内两种gRNA的表达水平一致，有可能导致两个位点基因编辑的效率的差异。

第二种方案，需要两个载体转染细胞，这也会降低转染的成功率，从而增加筛选的时间和精力。同时本方案需要合成多个较长片段，这会极大地增加成本。

为了解决上述双位点基因编辑的全部或者部分不足，本发明提供的一种双重gRNA的基因表达元件，包括如下结构：多克隆酶切位点I-U6启动子-gRNA特异性序列1-结构序列-中间连接序列-U6启动子-gRNA特异性序列2-结构序列-多克隆酶切位点III。

同时还提供的一种双重gRNA的基因表达元件的构建方法，包括如下步骤，

设计、合成引物并纯化，所述引物包括正向引物F1、F4、F5、F8和Fa，分别依次具有SEQ ID NO.3～7的碱基序列，反向引物F2、F3、F6、F7和Fb，分别依次具有SEQ ID NO.8～12的碱基序列；

以pGEM-T/U6-gRNA-X为模板，以引物F1、F3和F4、F2，第一次PCR扩增出构成U6-gRNA-1的DNA片段A和B，引物F5、F7和F8、F6，第一次PCR扩增出U6-gRNA-2的DNA片段C和D，并采用重叠PCR扩增将DNA片段A和B融合成U6-gRNA-1，C和D融合成U6-gRNA-2；并向U6-gRNA-1融合体系中加入引物F1、F2，U6-gRNA-2融合体系中加入引物F5、F6后，进行第2次PCR扩增，得U6-gRNA-1和U6-gRNA-2；

采用第二次重叠PCR扩增将U6-gRNA-1和U6-gRNA-2融合成一个双位点基因编辑的双重gRNA表达体系，然后向双重gRNA表达体系中加入引物Fa和Fb进行第三次PCR扩增，得双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件。

本发明实施例提供的同一载体中表达两个gRNA的构建方法解决了两个gRNA表达载体同时转染细胞而造成效率不高的问题。解决了因使用不同gRNA表达载体而造成的两个gRNA表达水平不一致的问题。本发明实施例提供的构建方法仅需合成数条引物序列，极大地降低了合成多条长DNA片段而带来的高成本。每一个gRNA都有各自的III型RNA聚合酶启动子-U6启动子，这可以高效的表达gRNA。同时也因为双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件中含有三处多克隆酶切位点，两端各有一处，中间连接序列含有一处，因此其可以高效地连接入载体质粒中，甚至可直接连接到Csa9核酸酶表达载体中，且无连接方向性的问题；中间的多克隆酶切位点也可以将其“拆分”成两个独立的单个gRNA表达系统，以用于只需要一个gRNA的情况；此方案提供的思路可扩展到三位点及以上的gRNA表达元件的构建，并且由于两个gRNA都在同一个表达载体中，那么只要转染成功的话，同一个细胞会同时转入两个gRNA，并且转入的这两个gRNA的拷贝数也一致，因此它们的表达水平也相同。除此之外，双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件因其具有自己独立的启动子，所以还可以直接在体外进行转录表达成成熟的gRNA，然后再利用显微注射等方式与Cas9核酸酶的mRNA或者蛋白同时导入到胚胎细胞中进行基因编辑，由此构建各种动物模型。

本设计方案以同时编辑人IDH1基因的两个位点的双重gRNA全套基因表达元件构建为例阐述整个技术方案。

一、前期的方案设计：

1、双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件的模板质粒

发明人已经通过基因序列合成和分子生物学等手段获得了针对小鼠X染色体上非编码序列的单个gRNA表达元件，并将其连接到了pGEM-T载体中，因此，在此申请文件中将此质粒记为“pGEM-T/U6-gRNA-X”，并作为之后构建其他gRNA表达元件的模板。pGEM-T/U6-gRNA-X质粒图谱见图2，并具有SEQ ID NO.13碱基序列。

2、设计双位点基因编辑的双重gRNA的全套基因表达元件

现在已经有单个gRNA表达元件的模板，发明人借此模板并通过重叠PCR的方法，将两个独立的单个gRNA表达系统“U6-gRNA”融合成一个双位点基因编辑双重gRNA表达系统，其结构为“多克隆酶切位点I-U6启动子-gRNA特异性序列1-结构序列，含骨架、框架及终止序列-中间连接序列，含多克隆酶切位点II-U6启动子-gRNA特异性序列2-结构序列，含骨架、框架及终止序列-多克隆酶切位点III”。设计的双位点基因编辑的双重gRNA的全套基因表达元件的设计过程示意图见图3所示，具体序列结构图见图4，整个双位点基因编辑的双重gRNA的全套基因表达元件的序列具有SEQ ID NO.14的碱基序列。

3、设计针对IDH1第四号外显子的两个gRNA中特异性序列

首先，在UCSC网站中找到人IDH1基因的序列，确定其第四号外显子的位置，并在其上下游序列中分别选择一段区域，再利用CRISPR Guide设计网站(如Benchling，https://www.benchling.com/crispr/)设计出所选的这两段区域的最适gRNA特异性序列。本次设计的两条gRNA特异性序列分别是5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACT-3’，5’-GTATCTACACCCATTAAGCA-3’，将这两条序列分别放在图3的“gRNA特异性序列”位置处，具体序列位置见图4。这两条特异性序列分别识别人的IDH1基因第四号外显子的上下游的特定区域，在Cas9核酸酶的帮助下，进行基因编辑，即在上游或下游的特定区域各“切”一次，这样就将IDH1基因的第四号外显子“切掉”了，由于缺少了第四号外显子，而无法表达出正常的IDH1蛋白，由此便实现了基因的敲除。此技术方案仅展现出双位点基因编辑的双重gRNA表达系统针对一个基因进行编辑，针对不同的目的，还可以稍作调整，以实现不同基因的基因编辑。

二、双位点基因编辑的双重gRNA的全套基因表达元件的构建方法

1、设计扩增双位点基因编辑的双重的gRNA全套基因表达元件所需的引物

如图4中所示，分别合成F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、Fa以及Fb十条引物，并进行PAGE纯化。其中F1、F4、F5、F8和Fa为正向引物，序列和图中所选区域一致，分别依次具有SEQID NO.3～7的碱基序列；F2、F3、F6、F7和Fb为反向引物，序列和图中所选区域反向互补，分别依次具有SEQ ID NO.8～12的碱基序列。F1、F2、F3和F4这四条引物用来合成U6-gRNA-1，F5、F6、F7、F8这四条引物用来合成U6-gRNA-2，而F2与F5存在反向互补序列，这是U6-gRNA-1与U6-gRNA-2的序列重叠部分，因此可以作为下一步的重叠PCR，即用Fa与Fb引物扩增得到最后的双重U6-gRNA。这些引物中，F3和F4含有设计的gRNA1序列、F7和F8含有设计的gRNA2序列，这四条引物需要根据基因编辑序列的不同每次合成，其他6条引物均为通用引物。

2、重叠PCR扩增双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件

(1)以具有SEQ ID NO.13碱基序列的pGEM-T/U6-gRNA-X为模板，利用设计合成的引物F1、F3和F4、F2，第一次PCR出构成U6-gRNA-1的各元件DNA片段A和B，用引物F5、F7和F8、F6，第一次PCR增出U6-gRNA-2的各元件DNA片段C和D。为了确保序列的正确性而不引入突变，本发明实施例采用高保真的DNA聚合酶(采用Phusion High-Fidelity PCR MasterMix)。配方如下：

将上述配制好的PCR反应体系放进PCR仪中进行循环扩增，循环步骤如下：

(2)将上述PCR反应后产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％)，之后进行胶回收，分别回收得到360bp的A片段，155bp的B片段，336bp的C片段和159bp的D片段。

(3)采用重叠PCR，将DNA片段A和B融合成U6-gRNA-1，C和D融合成U6-gRNA-2。配方如下：

将上述配制好的PCR反应体系放进PCR仪中进行循环扩增，循环步骤如下：

反应结束后，将体系从PCR仪中取出，并向融合片段A、B的体系中加入正向引物F1(10uM)和反向引物F2(10uM)各2.5uL；向融合片段C、D的体系中加入正向引物F5(10uM)和反向引物F6(10uM)各2.5uL。之后再放进PCR中，进行以下循环：

(4)将上述PCR反应后产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％)，之后进行胶回收，分别回收得到495bp的U6-gRNA-1和495bp的U6-gRNA-2。

(5)采用第二次重叠PCR扩增，将两个独立的单个gRNA表达系统U6-gRNA-1和U6-gRNA-2融合成一个双位点基因编辑的双重gRNA表达系统。配方如下：

将上述配制好的PCR反应体系放进PCR仪中进行循环扩增，循环步骤如下：

反应结束后，将体系从PCR仪中取出，并向其中加入正向引物Fa(10uM)和反向引物Fb(10uM)各2.5uL。之后再放进PCR中，进行以下循环：

(6)将上述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％)，之后进行胶回收，然后回收得到972bp的双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件。

(7)对(6)中胶回收得到的双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件进行测序鉴定，测序引物为Fa和Fb，测序结果见图6和图7所示。

(8)步骤(7)中测序正确的双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件可以直接转染细胞，也可以利用其两端多个酶切位点接进载体中进而转染细胞，进行基因编辑，本发明实施例双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件的作用方式示意图如图1所示。

上述构建双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件时，gRNA特异性序列1和gRNA特异性序列2均具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的碱基序列，gRNA特异性序列1和gRNA特异性序列2对应的碱基序列的是任意随机的。

本发明实施例的设计思路理论上可以指导构建出所有的单个、两个或多个gRNA的全套基因表达元件。所得的双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件中的两个gRNA均有各自的启动子，可确保这两个gRNA的高效表达，并且它们的表达水平一致。且仅仅需要设计合成四条引物，其余引物及模板质粒均可通用，这极大降低成本。

本发明实施例所设计的双重gRNA全套基因表达元件两端各有一处多克隆酶切位点，这些酶切位点方便之后与表达载体进行连接，且表达载体不受限制。因此可以将此双重gRNA全套基因表达元件直接连接到Cas9核酸酶表达载体中，以进一步提高转染效率与基因编辑的成功率。所设计的中间存在多克隆酶切位点，可利用这些酶切位点将双重gRNA系统“拆分成”两个单gRNA系统。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽师范大学

<120> 一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用

<130> 2019/07/04

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 特异性序列(gRNA)

<400> 1

ggtgtgccag tgctaaaact 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 特异性序列（gRNA)

<400> 2

gtatctacac ccattaagca 20

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 正向引物（F1）

<400> 3

ggggctcgag gaattcacgc gttgtacaaa aaagcaggct ttaaa 45

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 正向引物（F4）

<400> 4

ggtgtgccag tgctaaaact gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 正向引物（F5）

<400> 5

gttaacgata tcccatggtg tacaaaaaag caggctttaa a 41

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 正向引物（F8)

<400> 6

gtatctacac ccattaagca gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 正向引物（Fa)

<400> 7

ggggctcgag gaattcacg 19

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 反向引物（F2）

<400> 8

ccatgggata tcgttaacta atgccaactt tgtacaagaa a 41

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 反向引物（F3)

<400> 9

agttttagca ctggcacacc ggtgtttcgt cctttccaca 40

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 反向引物（F6）

<400> 10

aagcggccgc aagcttacgc gttaatgcca actttgtaca agaaa 45

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 反向引物（F7）

<400> 11

tgcttaatgg gtgtagatac ggtgtttcgt cctttccaca 40

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 反向引物（Fb)

<400> 12

aagcggccgc aagcttac 18

<210> 13

<211> 3472

<212> DNA

<213> 质粒模板（pGEM-T/U6-gRNA-X）

<400> 13

gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat 60

ttgtacaaaa aagcaggctt taaaggaacc aattcagtcg actggatccg gtaccaaggt 120

cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 180

tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 240

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 300

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 360

gtggaaagga cgaaacaccg gaccttatgg tggtcctgtg ttttagagct agaaatagca 420

agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 480

ttctagaccc agctttcttg tacaaagttg gcattaaatc actagtgaat tcgcggccgc 540

ctgcaggtcg accatatggg agagctccca acgcgttgga tgcatagctt gagtattcta 600

tagtgtcacc taaatagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 660

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 720

gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 780

ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 840

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 900

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 960

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 1020

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1080

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1140

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1200

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1260

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1320

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1380

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1440

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1500

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1560

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1620

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1680

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1740

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 1800

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 1860

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 1920

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 1980

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 2040

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 2100

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 2160

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 2220

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 2280

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 2340

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 2400

ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 2460

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 2520

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 2580

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 2640

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 2700

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 2760

acatttcccc gaaaagtgcc acctgatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 2820

aaaataccgc atcaggaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt 2880

tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca 2940

aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta 3000

aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta 3060

cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg 3120

aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga 3180

aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg 3240

ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtccattcgc 3300

cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 3360

agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 3420

agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta ta 3472

<210> 14

<211> 972

<212> DNA

<213> 双重gRNA的基因表达元件（DNA）

<400> 14

ggggctcgag gaattcacgc gttgtacaaa aaagcaggct ttaaaggaac caattcagtc 60

gactggatcc ggtaccaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata 120

tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac 180

aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt 240

tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga 300

tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc ggtgtgccag tgctaaaact 360

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 420

ggcaccgagt cggtgctttt tttctagacc cagctttctt gtacaaagtt ggcattagtt 480

aacgatatcc catggtgtac aaaaaagcag gctttaaagg aaccaattca gtcgactgga 540

tccggtacca aggtcgggca ggaagagggc ctatttccca tgattccttc atatttgcat 600

atacgataca aggctgttag agagataatt agaattaatt tgactgtaaa cacaaagata 660

ttagtacaaa atacgtgacg tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc agttttaaaa 720

ttatgtttta aaatggacta tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt cgatttcttg 780

gctttatata tcttgtggaa aggacgaaac accgtatcta cacccattaa gcagttttag 840

agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg 900

agtcggtgct ttttttctag acccagcttt cttgtacaaa gttggcatta acgcgtaagc 960

ttgcggccgc tt 972

Claims (10)

1.一种双重gRNA的基因表达元件，其特征在于，包括如下结构：多克隆酶切位点I-U6启动子-gRNA特异性序列1-结构序列-中间连接序列-U6启动子-gRNA特异性序列2-结构序列-多克隆酶切位点III。

2.根据权利要求1所述的双重gRNA的基因表达元件，其特征在于，所述结构序列包括骨架、框架及终止序列。

3.根据权利要求1所述的双重gRNA的基因表达元件，其特征在于，所述中间连接序列包括多克隆酶切位点II。

4.根据权利要求1所述的双重gRNA的基因表达元件，其特征在于，所述gRNA特异性序列1和gRNA特异性序列2均具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的碱基序列。

5.一种双重gRNA的基因表达元件的构建方法，其特征在于，包括如下步骤，

设计、合成引物并纯化，所述引物包括正向引物F1、F4、F5、F8和Fa，分别依次具有SEQID NO.3～7的碱基序列，反向引物F2、F3、F6、F7和Fb，分别依次具有SEQ ID NO.8～12的碱基序列；

以pGEM-T/U6-gRNA-X为模板，以引物F1、F3和F4、F2，第一次PCR扩增出构成U6-gRNA-1的DNA片段A和B，引物F5、F7和F8、F6，第一次PCR扩增出U6-gRNA-2的DNA片段C和D，并采用重叠PCR扩增将DNA片段A和B融合成U6-gRNA-1，C和D融合成U6-gRNA-2；并向U6-gRNA-1融合体系中加入引物F1、F2，U6-gRNA-2融合体系中加入引物F5、F6后，进行第2次PCR扩增，得U6-gRNA-1和U6-gRNA-2；

采用第二次重叠PCR扩增将U6-gRNA-1和U6-gRNA-2融合成一个双位点基因编辑的双重gRNA表达体系，然后向双重gRNA表达体系中加入引物Fa和Fb进行第三次PCR扩增，得双位点基因编辑的双重gRNA全套基因表达元件。

6.根据权利要求5所述的双重gRNA的基因表达元件的构建方法，其特征在于，所述pGEM-T/U6-gRNA-X具有SEQ ID NO.13碱基序列。

7.根据权利要求5所述的双重gRNA的基因表达元件的构建方法，其特征在于，所述第一次PCR扩增采用高保真的DNA聚合酶，配方如下：

8.根据权利要求5所述的双重gRNA的基因表达元件的构建方法，其特征在于，所述重叠PCR扩增配方如下：

9.根据权利要求5所述的双重gRNA的基因表达元件的构建方法，其特征在于，所述第二次重叠PCR扩增配方如下：

10.一种双重gRNA的基因表达元件的应用，其特征在于，所述双重gRNA的基因表达元件可以直接转染细胞，也可以利用其两端多个酶切位点接进载体中进而转染细胞，进行基因编辑。