CN112813038A

CN112813038A - 一株表达asfv结构囊膜蛋白的prrs病毒及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN112813038A
Application number: CN202110102802.3A
Authority: CN
Inventors: 刘定祥; 黄梅; 冯涛声; 代过
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2021-05-18

Abstract

本发明公开了一株表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒及其构建方法与应用。本发明通过将ASFV结构囊膜蛋白基因克隆入上游设置T7启动子的PRRS病毒基因组中的非结构蛋白基因与结构蛋白基因之间；在结构囊膜蛋白基因和结构蛋白基因之间设置调控序列；再对所得到的序列进行转录，得到的RNA转染细胞，收集病变的细胞，得到表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒。本发明提供的构建方法可快速获得含有ASFV和PRRSV免疫原的重组病毒，从而为开发多效价疫苗奠定基础。

Description

一株表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一株表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒及其构建方法与应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状的病毒性传染病，发病急、传染性强、致死率高；非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性传染病。病程短、发病急、致死率高。可以感染任何种类和年龄段的家猪和野猪。PRRSV和ASFV感染对全球的养猪业每年都造成不可估量的经济损失。

目前，商品化的疫苗作为预防和控制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的主要方法，包括传统的灭活病毒(KV)疫苗减毒活病毒(MLV)疫苗。然而，这些疫苗的保护效果并不理想，导致了病毒的不断进化和反复出现，以至新变种的不断出现。由单一的野生分离株制备而来的传统疫苗无法对多样化的PRRSV及ASFV毒株提供足够的保护。PRRS自1987年在美国首次发现。1995年，PRRS首次在中国出现，随后迅速蔓延到其它省市。2006年，高致病性蓝耳病毒株(HP-PRRSV)导致的“高热病”疫情爆发，初期就造成超过100万头猪只死亡，对我国养猪业造成重创。

ASF疫情于2018年8月首次在我国辽宁省沈阳市发现，随后迅速蔓延至全国23个省份，对我国养猪业造成了极其严重的经济损失。对于非洲猪瘟疫苗的研发，尽管世界范围的科学家已尽了不懈的努力然而效果不佳，至今尚无有效疫苗推出。加之非洲猪瘟又是一种急性、出血性、烈性传染病，目前也无特效药治疗。因此，开发安全有效的基因工程疫苗视为当前可行的应对策略。

亟需一种既能抗PRRSV、又能抗ASFV的疫苗。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的构建方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述构建方法得到的表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒。

本发明的再一目的在于提供上述表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取PRRSV RNA，逆转录得到cDNA；在该cDNA的上游设置T7启动子，得到PRRS病毒基因组；

(2)将ASFV结构囊膜蛋白基因克隆入步骤(1)得到的PRRS病毒基因组中的非结构蛋白基因与结构蛋白基因之间；在结构囊膜蛋白基因和结构蛋白基因之间设置调控序列；再对所得到的序列进行转录，得到的RNA转染细胞，收集病变的细胞，得到表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒；调控序列的设置使得结构蛋白得以正常表达，从而表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒仍能正常组装成感染性的病毒颗粒。

步骤(1)优选如下：提取PRRSV RNA，逆转录得到cDNA；在该cDNA的上游设置T7启动子，克隆入出发载体上，得到含PRRS病毒基因组的重组载体。

所述的出发载体优选为低拷贝载体；更优选为pBR322。

所述的含PRRS病毒基因组的重组载体优选为质粒pBR322-SP，其通过如下步骤制备得到：

(A)提取PRRSV RNA，逆转录得到cDNA；以此cDNA为模板，利用引物F1和R1扩增得到A片段，利用引物F2和R2扩增得到B片段，利用引物F3和R3扩增得到C片段，利用引物F4和R4扩增得到D片段；

F1:5’-taatacgactcactataggatgacgtataggtgttggct-3’；

R1:5’-cacttcaagaacgtccccgt-3’；

F2:5’-gtctgcatcctcgcatactg-3’；

R2:5’-gaagggacccgagctgagac-3’；

F3:5’-ctgtttaccccgtctcagct-3’；

R3:5’-gcgtctcatcacagatattctgtcc-3’；

F4:5’-gcgtctctgtgatgccatccagcc-3’；

R4:5’-gcgtctctttttt(30)aatttcggccgcatggttt-3’；

(B)以pBR322为模板，通过引物F5和R5进行PCR扩增，得到用于同源重组的线性化载体pBR322；以步骤(A)得到的A片段为模板，通过引物F6和R6进行PCR扩增，得到用于同源重组的片段A；将用于同源重组的线性化载体pBR322和用于同源重组的片段A进行同源重组，得到质粒pBR322-SP-A；

F5:5’-ggggacgttcttgaagtgcgtctctaaaagggtcggcatggcatc-3’；

R5:5’-cctatagtgagtcgtattaatggagcg-3’；

F6:5’-taatacgactcactataggatgacgtataggtgttggct-3’；

R6:5’-cacttcaagaacgtccccgt-3’；

(C)通过BsmBI酶切分别酶切步骤(A)得到的B片段、C片段和D片段；将酶切后的B片段与BsmBI酶切后的载体pCR2.1-TOPO连接，得到质粒pTOPO-SP-B；将酶切后的C片段、D片段分别与BsmBI酶切后的载体pCR-XL-TOPO连接，得到质粒pXL-SP-C和pXL-SP-D；

(D)用BsmBI酶切质粒pBR322-SP-A，回收长度为5402bp的A1片段和长度为2122bp的A2片段；用BsmBI酶切质粒pTOPO-SP-B，回收长度为916bp的B1片段和长度为1697bp的B2片段；用BsmBI酶切质粒pXL-SP-C，回收长度为4870bp的C1片段；用BsmBI酶切质粒pXL-SP-D，回收长度为4974bp的D1片段；

(E)将步骤(D)回收得到的6个片段连接，转化克隆细胞，得到含有SP基因组全长cDNA的质粒pBR322-SP。

步骤(A)中所述的PRRSV优选为PRRSV疫苗株SP。

步骤(E)中所述的克隆细胞优选为trans10化学感受态细胞。

步骤(2)优选如下：

1)以质粒pBR322-SP为模板，将其设计为3个可以通过PCR进行扩增的片段，片段两端根据同源重组要求设计带有长度为15～25bp的同源序列的上下游扩增引物，通过PCR扩增，得到片段F1、F2和F3；

2)在ASFV的结构蛋白基因的上游引物引入与SP基因组的非结构蛋白nsp12的3’端的长度为15～25bp的同源序列；ASFV的结构蛋白基因的下游引物引入PRRSV的TRS6调控序列的前半部分，TRS6序列的后半部分引入结构蛋白GP2(ORF2a)的上游引物，同源序列为TRS6序列中间长度为15～20bp部分序列；通过该上游引物和下游引物对ASFV的结构蛋白基因进行扩增，得到片段F4；

3)通过片段F1、F2、F3和F4同源重组，将ASFV病毒结构囊膜蛋白基因分别与TRS6调控序列一起插入质粒pBR322-SP中的非结构蛋白nsp12与结构蛋白GP2之间，得到克隆质粒pBR322-SP-ASFV；

4)将克隆质粒pBR322-SP-ASFV单酶切后进行转录，得到的RNA转染细胞，收集病变的细胞，获得表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒。

步骤1)中所述的3个可以通过PCR进行扩增的片段的引物如下：

F7：5’-cccctttaaccagagtttcagcggaacaatgaaatggggtccatgcaaag-3’；

R7：5’-cctatagtgagtcgtattaATGGAGCG-3’；

F8：5’-AATACGACTCACTATAGGATGACGTATAGG-3’；

R8：5’-CAACCGGGTGTTGGTTGTG-3’；

F9：5’-CACAACCAACACCCGGTTG-3’；

R9：5’-TTCAATTCAGGCCTAAAGTTGGTTC-3’。

步骤2)中所述的ASFV结构囊膜蛋白优选为P22、P30和P54中的至少一种；

当为P22时，上游引物和下游引物如下：

F10：5’-CTTTAGGCCTGAATTGAAATGTTTAATATTAAAATGACAATTTCTACATTGCTTATTGCTC-3’；

R10：5’-aaactctggttaaaggggttgccgcggacccatcaTTATGCATGTTTATGATTTCTAGGTAAGGCTATGATGTG-3’；

当为P30时，上游引物和下游引物如下：

F11：5’-CTTTAGGCCTGAATTGAAATGGATTTTATTTTAAATATATCCATGAAAATGGAGG-3’；

R11：5’-aaactctggttaaaggggttgccgcggacccatcaTTATTTTTTTTTTAAAAGTTTAATAACCATGAGTCTTACCACCTC-3’；

当为P54时，上游引物和下游引物如下：

F12：5’-CTTTAGGCCTGAATtgaaATGGATTCTGAATTTTTTCAACCGG-3’；

R12：5’-aaactctggttaaaggggttgccgcggacccatcaTTACAAGGAGTTTTCTAGGTCTTTATGCGTATAGG-3’。

步骤(2)中所述的ASFV结构囊膜蛋白优选为P22、P30和P54中的至少一种。

步骤(2)中所述的非结构蛋白优选为非结构蛋白nsp12。

步骤(2)中所述的结构蛋白优选为结构蛋白GP2。

步骤(2)中所述的调控序列优选为PRRSV TRS6调控序列。

所述的PRRSV TRS6调控序列的序列如下所示：tgatgggtccgcggcaacccctttaaccagagtttcagcggaaca。

步骤(2)中所述的细胞为哺乳动物细胞，优选为MARC-145细胞或BHK21细胞。

所述的转染优选为电转染。

一种表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒，通过上述构建方法得到。

所述的表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒在制备疫苗中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供了一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-SP)的感染性克隆系统的快速构建和病毒拯救方法，以及基于此感染性克隆系统构建的3株分别表达非洲猪瘟病毒囊膜蛋白P22、P30和P54的感染性克隆并获得PRRSV重组毒株rSP-P22、rSP-P30、rSP-P54。即本发明提供一个能同时抵抗PRRSV和ASFV感染的疫苗研发平台和3个疫苗候选株。

(2)本发明应用基因克隆与同源重组技术及高保真长片段DNA聚合酶的特性实现快速准确的构建疫苗株SP的感染性克隆系统，同时在疫苗株SP基因组(非结构蛋白nsp12和结构蛋白GP2之间)分别插入SP自身的高效调控序列TRS6和ASFV的病毒结构囊膜蛋白，在该病毒结构囊膜蛋白基因的上游设置有带T7启动子的重组病毒cDNA克隆；再利用T7体外转录技术转录全长mRNA。通过电转染细胞的方法将此全长mRNA导入细胞内，在细胞内翻译、复制、组装，最终释放出重组病毒，获得了表达ASFV病毒结构囊膜蛋白(P22、P30、P54)的PRRSV重组毒株，为PRRS及ASF新型多价疫苗的研发提供了新的途径。从方法上看，由上述方法可快速获得重组病毒。由于SP全基因组cDNA放入低拷贝载体pBR322中，质粒稳定且方便设计同源重组引物进行多片段同源重组，以便快速组建重组病毒感染性克隆和拯救重组病毒。此方法不仅适合PRRSV病毒也适合任何其它的RNA病毒。

(3)从研发目的看，有了这个重组病毒的平台，可以人为地对病毒基因组进行精准改造，快速获得到能在特定位点插入外源基因的PRRSV重组质粒。从而获得理想的，既有较强免疫能力而致病性低的重组疫苗株。进一步可以开发高效广谱抗PRRSV及其它传染性猪病的疫苗。

附图说明

图1是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-SP)的感染性克隆系统流程图。

图2是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-SP)cDNA片段及酶切示意图；其中，(A)是含有A、B、C、D各个片段的重组载体、质粒所含抗性基因、用于转化的大肠杆菌菌株、所用的酶以及酶切后的片段长度；(B)是酶切产物的电泳照片图，圈出的片段为目的片段；(C)是各个片段的位置示意图。

图3是质粒pBR322-SP-P22，pBR322-SP-P30和pBR322-SP-P54同源重组克隆示意图。

图4是PRRSV-SP及重组病毒rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54基因组全长cDNA的线性化质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1是Trans 15K DNA Marker，泳道2是PRRSV-SP基因组全长cDNA的线性化质粒pBR322-SP，泳道3是重组病毒rSP-P22基因组全长cDNA的线性化质粒pBR322-SP-P22，泳道4是重组病毒rSP-P30基因组全长cDNA的线性化质粒pBR322-SP-P30，泳道5是重组病毒rSP-P54基因组全长cDNA的线性化质粒pBR322-SP-P54。

图5是PRRSV-SP及重组病毒rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54基因组全长cDNA的体外转录产物RNA琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1是Trans 8K DNA Marker，泳道2是PRRSV-SP基因组全长cDNA的体外转录产物，泳道3是重组病毒rSP-P22基因组全长cDNA的体外转录产物，泳道4是重组病毒rSP-P30基因组全长cDNA的体外转录产物，泳道5是重组病毒rSP-P54基因组全长cDNA的体外转录产物。

图6是重组病毒PRRSV-SP突变位点测序结果图。

图7是重组病毒rSP-P22，rSP-P30和rSP-P54对应的插入基因P22、P30和P54基因测序结果图。

图8是用免疫细胞化学法检测到的PRRSV-SP、rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54感染后的细胞的结果图。

图9是WB验证重组病毒PRRSV-SP、rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54感染结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-SP)的感染性克隆系统的构建

如图1所示，首先，构建4个质粒，这些质粒包含横跨整个PRRSV-SP基因组的全长cDNA片段及pBR322-A载体部分，在片段A的始端引入一个T7启动子。质粒酶切后，提取片段A1-A2-B1-B2-C-D，经T4DNA连接酶(NEB)连接后转化Trans10化学感受态细胞(TransGenBiotech)，挑选正确的克隆提质粒送测序，即为含有SP基因组全长cDNA的质粒pBR322-SP。该全长cDNA质粒经限制性内切酶NotI(NEB)线性化后，利用T7RNA聚合酶进行体外转录。具体步骤如下：

(1)PRRSV疫苗株SP感染MARC-145细胞(方法见文献“吕永钢[1],et al.不同接毒方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖效果比较”)，一般一个3.5cm小皿可接种100-200μL病毒液，48～96h细胞出现50％以上凋亡或病变达80％左右即可收毒，然后提取SP病毒RNA。MARC-145细胞购自美国ATCC公司，PRRSV疫苗株SP购自Schering-Plough Animal Health公司。

(2)提取病毒RNA并通过逆转录(RT)得到第一链cDNA。病毒RNA通过使用RNeasyMini kit试剂盒按制造商的说明方法提取PRRSV-SP病毒RNA。将此病毒RNA用作模板，使用Expand Reverse Transcription试剂盒进行逆转录(RT)得到第一链cDNA。以此cDNA为模板，用PRRSV-SP的特异性引物进行PCR反应扩增出PRRSV-SP的cDNA片段，引物见表1。然后将PCR产物纯化并分别将它们克隆到相应的质粒载体(pBR322、pCR2.1-TOPO或pCR-XL-TOPO)，得到相应的质粒pBR322-SP-A、pTOPO-SP-Bm、pXL-SP-C和pXL-SP-D。片段A与低拷贝载体pBR322(含有T7启动子、HDV核酶和T7终止子序列)设计带有同源臂的引物进行同源重组，同源重组及转化克隆操作遵循全是金公司的同源重组试剂盒(

-Basic SeamlessCloning and Assembly Kit，TransGen Biotech)说明进行。同源臂引物及线性化载体pBR322与插入片段A加入量(摩尔比为1:2)见表2。同源重组克隆反应体系以10μL为标准，其中2×Basic Assembly Mix 5μL，线性化载体及各片段加水补足到总体积5μL，体系配好后轻轻混匀，50℃反应15min，重组产物转化100μL Trans10化学感受态细胞(TransGenBiotech)，挑选正确的克隆，提取质粒，经酶切测序验证后，即为含有片段A的质粒pBR322-SP-A；片段B、C、D分别通过BsmBI酶切后与载体经过BsmBI酶切后的片段连接的方式将它们分别克隆到相应的高拷贝质粒载体(pCR2.1-TOPO或pCR-XL-TOPO)获得相应的质粒pTOPO-SP-B、pXL-SP-C和pXL-SP-D。

构建PRRSV-SP全长感染性克隆的质粒名称，含PRRSV-SP序列在PRRSV-SP全基因组的位置(起始-终止)，在质粒内的方向，在母株的基础上做了什么修改，以及用于PCR链反应的特异性引物分别具体列表如下：

表1 PRRSV-SP全长感染性克隆的质粒及所用引物

表2质粒pBR322-SP-A克隆所用同源重组引物和线性化载体与片段的用量

(3)将表1中的4个质粒分别转化大肠杆菌(所用菌株见图2)并扩增，用质粒提取试剂盒(Qiagen)提取质粒后送测序公司测序。测序正确的4个质粒分别用BsmBI酶切，片段跑DNA胶分离，用胶回收试剂盒(Omega)回收大小正确的片段，如图2所示圈出的条带A1-A2-B1-B2-C-D，即是覆盖PRRSV-SP全长基因组的cDNA片段。因质粒pBR322-A用限制性内切酶BsmBI酶切后，变为A1和A2片段；B片段含一个内在BsmBI酶切位点，因此酶切后被分成了B1和B2片段。将这6个片段在16℃下用T4 DNA连接酶(NEB)连接2h左右，载体片段取100ng为基准，载体与各插入片段的摩尔浓度比为1:2。各片段加入量比例见表3。连接反应体系以10μL为标准，连接产物转化100μL Trans10化学感受态细胞(TransGen Biotech)，挑选正确的克隆提质粒送测序，即得到含有SP基因组全长cDNA的质粒pBR322-SP。其5’端含T7启动子，3’端含35个碱基A。引物合成和核苷酸测序由苏州金维智生物科技有限公司(GENEWIZ)公司完成。

表3连接体系各片段加入量比例

cDNA片段(含载体片段)	bp	ng
			A1	5402	100
A2	2122	78.56
			B1	916	33.91
B2	1697	62.83
			C	4870	180.3
D	4974	184.2

(4)SP基因组全长cDNA的质粒pBR322-SP经限制性内切酶NotI或SphI(NEB)线性化后，然后用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提纯化(参照《分子克隆》操作)。如图4所示，纯化后的产物即为含有PRRSV-SP的基因组全长cDNA的线性化片段，大小在15000bp以上。以其为模板进行体外转录。使用高产量加帽RNA转录试剂盒(mMmessage

kit，Ambion)在体外生成全长转录本。转录反应20μL标准体系：取5×缓冲液4μL、2×NTP/CAP(CAP:GTP＝1:3)10μL、30mM GTP1.5μL、模板cDNA(线性化质粒pBR322-SP)2.5μL、T7RNA聚合酶2μL进行体外转录，转录反应体系见表4。在37℃孵育3h。

表4转录反应体系

组分	体积/μL
		5×反应缓冲液	4
2×NTP/CAP(CAP:GTP＝1:3)	10
		30mM GTP	1.5
模板cDNA	2.5
		T7 RNA聚合酶	2
总体系	20

(5)用含10％(v/v)FBS的MEM培养基培养MARC-145或BHK21细胞(ATCC)生长密度达到90％，用胰酶(Gibco)消化后再用预冷的PBS(80mM Na₂HPO₄，20mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，pH7.5)悬浮，500g、4℃离心5min，弃去上清，再用预冷的PBS悬浮。重复离心一次，弃去上清后用预冷的PBS重悬细胞。将上述体外转录的PRRSV-SP的mRNA与100-200μl悬浮细胞(约1×10⁶个细胞/mL)混匀加入预冷好的2mm电击杯(Bio-Rad)，在120V、25ms的方波条件下用Bio-Rad Gene Pulser II电穿孔仪将RNA电转进细胞。电转后的细胞加入含2％(v/v)FBS的DMEM培养基培养4-5天。当细胞出现50％以上凋亡后置-80℃冰箱冻存。将细胞连同培养基冻融三次后离心取上清保存于-80℃。

实施例2表达非洲猪瘟病毒结构囊膜蛋白P22、P30和P54的PRRSV重组毒株rSP-P22,rSP-P32,rSP-P54的感染性克隆的构建

以实施例1得到的SP基因组全长cDNA的质粒pBR322-SP为模板，将其设计为3个可以通过PCR进行扩增的片段，片段两端根据同源重组要求设计带有20bp左右同源序列的上下游扩增引物，将来自黑龙江的2018年的一株ASFV的病毒结构囊膜蛋白P22、P30、P54基因(GENEWIZ公司合成，序列已在GenBank上公开，序列号在文末)分别设计带有20bp左右同源序列的引物。ASFV的结构蛋白基因的上游引物引入与SP基因组的非结构蛋白nsp12的3’端20bp左右同源序列；ASFV的结构蛋白基因的下游引物引入SP自身的TRS6序列(45bp)的前半部分，TRS6序列的后半部分引入结构蛋白GP2(ORF2a)的上游引物，同源序列为TRS6序列中间18bp。通过片段之间同源重组方式将ASFV的病毒结构囊膜蛋白P22、P30和P54分别与疫苗株SP自身的TRS6序列一起插入SP基因组的非结构蛋白nsp12与结构蛋白GP2之间。通过同源重组试剂盒克隆质粒pBR322-SP-P22、pBR322-SP-P30和pBR322-SP-P54。然后用与SP基因组全长cDNA的质粒pBR322-SP拯救疫苗株SP相同的方法得到3株分别表达非洲猪瘟病毒结构囊膜蛋白P22、P30和P54的PRRSV重组毒株。具体步骤如下：

(1)以实施例1得到的SP基因组全长cDNA的质粒pBR322-SP为模板，将该全长质粒分为3个片段，分别为F1-F2-F3，片段两端根据同源重组要求设计带有20bp左右同源序列的上下游扩增引物，同时将来自黑龙江的2018年的一株ASFV的病毒结构囊膜蛋白P22、P30、P54基因(GENEWIZ公司合成)也分别设计带有20bp左右同源序列的引物，ASFV的病毒结构囊膜蛋白基因的上游引物引入与SP基因组的非结构蛋白nsp12的3’端20bp左右同源序列；ASFV的结构蛋白基因的下游引物引入SP自身的TRS6序列(45bp)的前半部分，TRS6序列的后半部分引入结构蛋白GP2(ORF2a)的上游引物，同源序列为TRS6序列中间18bp。通过片段之间同源重组方式将ASFV的结构蛋白P22、P30和P54分别与SP自身的TRS6序列一起插入SP基因组的非结构蛋白nsp12与结构蛋白GP2之间。TRS6序列紧接ASFV的病毒结构囊膜蛋白P22、P30或P54基因终止子后面是用来调控下游相邻蛋白GP2的正常表达，使重组的PRRSV仍能正常组装成感染性的病毒颗粒。TRS6序列作为PRRSV病毒的一个高效调控序列，其长度相对较短，一般在45bp左右，也便于通过将其加在引物5’的方式克隆到需要的序列。PRRSV疫苗株SP的TRS6调控序列为tgatgggtccgcggcaacccctttaaccagagtttcagcggaaca。如图3所示，通过4个片段的同源重组，首尾相连为3个质粒，分别是pBR322-SP-P22、pBR322-SP-P30和pBR322-SP-P54。同源重组及转化克隆操作遵循全是金公司的同源重组试剂盒(

-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，TransGen Biotech)说明进行。同源臂引物及线性化载体F1与各个插入片段加入量(摩尔比为1:2)见表5。同源重组克隆反应体系以10μL为标准，其中2×Basic Assembly Mix 5μL，线性化载体及各片段加水补足到总体积5μL，体系配好后轻轻混匀，50℃反应15min，重组产物转化100μL Trans10化学感受态细胞(TransGen Biotech)，挑选正确的克隆，提取质粒，经酶切测序验证后，即得到质粒pBR322-SP-P22、pBR322-SP-P30和pBR322-SP-P54。

表5质粒pBR322-SP-P22、pBR322-SP-P30和pBR322-SP-P54克隆所用同源重组引物和线性化载体与片段的用量

(2)PRRSV疫苗株重组病毒rSP-P22和rSP-P30的全长cDNA质粒pBR322-SP-P22和pBR322-SP-P30经限制性内切酶NotI或SphI线性化；重组病毒rSP-P54的全长cDNA质粒pBR322-SP-P54中P54基因含有NotI酶切位点，所以选用限制性内切酶SphI线性化。质粒线性化后的全长片段经苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)抽提纯化(参照《分子克隆》操作)。如图4所示，纯化后的产物在15000bp以上，即为含有重组病毒rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54的基因组全长cDNA的线性化片段。以其为模板进行体外转录。使用高产量加帽RNA转录试剂盒(mMmessage

kit，Ambion)在体外生成全长转录本。转录反应20μL标准体系：取5×缓冲液4μL、2×NTP/CAP(CAP:GTP＝1:3)10μL、30mM GTP1.5μL、模板cDNA(线性化质粒pBR322-SP)2.5μL、T7RNA聚合酶2μL进行体外转录，转录反应体系见表4。在37℃孵育3h。如图5所示，PRRSV-SP及重组病毒rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54基因组全长cDNA的体外转录产物RNA条带均匀分布，高度达到3000-5000bp之间，说明成功转录出这4个重组病毒的全长mRNA。

(3)用含10％(v/v)FBS的MEM培养基培养MARC-145或BHK21细胞(ATCC)生长密度达到90％，胰酶(Gibco)消化后再用预冷的PBS(80mM Na₂HPO₄、20mM NaH₂PO₄、100mM NaCl、pH7.5)悬浮，500g、4℃离心5min，弃去上清，再用预冷的PBS悬浮。重复离心一次，弃去上清后用预冷的PBS重悬细胞。将上述体外转录的重组病毒rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54的mRNA分别与100-200μL悬浮细胞(约1×10⁶个细胞/mL)混匀加入3个预冷好的2mm电击杯(Bio-Rad)，在120V、25ms的方波条件下用Bio-Rad Gene Pulser II电穿孔仪将RNA电转进细胞。电转后的细胞加入含2％FBS的DMEM培养基培养4-5天。当细胞出现50％以上凋亡后置-80℃冰箱冻存。将细胞连同培养基冻融三次后离心取上清保存于-80℃。

实施例3重组病毒测序验证

(1)重组病毒PRRSV-SP的验证：将电转PRRSV-SP的mRNA后的冻存细胞快速冻融2次后离心(1000rpm、2min)，取离心后上清液200μL感染一个3.5cm小皿或6孔板的一个孔长满的MARC-145细胞单层，待细胞出现50％以上凋亡时置-80℃冰箱冻存。重复此程序将重组病毒感染(每一次感染都用上一次出现50％凋亡的细胞离心后的上清液，取上清液200μL感染一个3.5cm小皿或6孔板的一个孔长满的MARC-145细胞单层)MARC-145细胞5次，即将重组病毒在MARC-145细胞传代5次。收获第5次感染后的上清液冻存为重组毒株PRRSV-SP。取200μL病毒样品用于提取总RNA。将此RNA用作模板，用特异性引物(PRRSV-T3448A-F和PRRSV-T3448A-R)作RT-PCR。将PCR产物送测序，测序结果与母株序列比较。如图6所示，其测序结果，除在T3148A的人为点突变，与原毒株序列完全相同。同时该突变作为一个分子标记，导致疫苗株SP该位置原有的一个BsmBI酶切位点失效。

PRRSV-T3448A-F:5’-acgttcttgaagtggaggagc-3’；

PRRSV-T3448A-R:5’-aacctgacggcttagtaggtc-3’。

(2)PRRSV疫苗株重组病毒rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54的验证。将电转重组病毒rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54的mRNA后的冻存细胞快速冻融2次后离心(1000rpm、2min)，取离心后上清液200μL感染一个3.5cm小皿或6孔板的一个孔长满的MARC-145细胞单层，待细胞出现50％以上凋亡时置-80℃冰箱冻存。重复此程序将重组病毒感染(每一次感染都用上一次出现50％凋亡的细胞离心后的上清液，取上清液200μL感染一个3.5cm小皿或6孔板的一个孔长满的MARC-145细胞单层)MARC-145细胞5次，即将重组病毒在MARC-145细胞传代5次。收获第5次感染后的上清液冻存为重组毒株rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54。取200μL病毒样品用于提取总RNA。将此RNA用作模板，用特异性引物(nsp12_SeqF和GP2_SeqR)作RT-PCR，分别扩增P22、P30、P54基因。将PCR产物送测序，测序结果与重组毒株rSP-P22、rSP-P30、rSP-P54序列比较。如图7，重组病毒rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54的测序结果与在疫苗株SP基因组的nsp12和GP2序列之间插入的2018年黑龙江非洲猪瘟流行株(ASFV/HLJ/2018)的病毒结构囊膜蛋白P22、P30、P54以及SP自身的TRS6(45bp)序列基因序列是一致的，没有引入任何突变。证明重组毒株rSP-P22、rSP-P30、rSP-P54已成功构建并能在细胞中稳定传代。

nsp12_SeqF:5’-TTCACCGGAAACGGTGAGG-3’；

GP2_SeqR:5’-GCGACGGTGAAGCCAAAC-3’。

实施例4免疫细胞化学法(ICC)检测重组病毒PRRSV-SP、rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54

利用免疫细胞化学ICC(或免疫荧光IF)技术可以将感染病毒的细胞进行染色标记，分别检测重组病毒PRRSV-SP、rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54(连续传5代)。具体操作如下：将上述收集的PRRSV-SP病毒液和重组病毒rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54的病毒液稀释成10^-1～10^-6接种于细胞密度达到90％的MARC-145单层细胞的96孔板中，每孔加入100μL稀释病毒样品，每种浓度使用8孔。37℃吸收1h后，去除上清液，加入含2％v/v的DMEM培养基。感染48-72h后，用磷酸盐缓冲液(1×PBS)洗涤细胞两次，每孔加100μL预冷的甲醇，将细胞平放于-20℃固定30分钟；去除甲醇，1×PBS洗3次，每孔加入100μL PRRSV阳性猪的血清抗体(稀释浓度为1:100)(华农(肇庆)生物产业技术研究院提供)，37℃孵育2h；1×PBS洗3次，每孔加入100μL HRP标记山羊抗猪IgG(美国Earthox)，37℃孵育1h；1×PBS洗3次，每孔加100μLAEC(IHC,Thermo)显色工作液，37℃避光孵育30min；显色完成后，甩掉板内液体，1×PBS洗3次。肉眼粗略观察细胞染色情况后，在显微镜下观察细胞染色信号。细胞出现红色标记为病毒感染的孔，空白对照为无色。如图8，重组病毒PRRSV-SP、rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54可以通过免疫细胞化学(ICC)方法成功检测。

实施例5Western blot(WB)验证重组病毒PRRSV-SP，rSP-P22,rSP-P30和rSP-P54

连续传代到第5代(P5)重组病毒PRRSV-SP、rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54分别感染MARC-145细胞(方法见文献“吕永钢[1],et al.不同接毒方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖效果比较”)，取上述的4个重组病毒200μL左右分别感染细胞密度达到90％的MARC-145单层细胞的6孔板的一个孔，剩余的孔不接种病毒，为空白细胞对照。72-96h细胞病变达80％左右即可收取病毒感染细胞的蛋白样品。用1×RIPA缓冲液(碧云天)150μL裂解重组病毒PRRSV-SP、rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54感染的MARC-145细胞，获得总蛋白，加入1/100蛋白样品体积的100mM的PMSF(碧云天)，再加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE SampleLoading Buffer，5×，碧云天)至终浓度为1×，然后将细胞裂解后的蛋白样品在95℃下煮沸5-10分钟，分2份样品进行SDS-PAGE电泳及蛋白质电转移(转膜)。蛋白膜在含5％w/v脱脂奶粉的PBST缓冲液(80mM Na₂HPO₄、20mM NaH₂PO₄、100mM NaCl、0.1％吐温20，pH7.5)中4℃孵育过夜；2张蛋白膜，一张用PRRSV阳性猪的血清抗体(主要含抗PRRSV-M蛋白抗体，稀释浓度为1:1000，华农(肇庆)生物产业技术研究院提供)于37℃孵育2h，另一张用ASFV阳性猪的血清抗体(含ASFV多克隆蛋白抗体，稀释浓度为1:1000，华农(肇庆)生物产业技术研究院提供)于37℃孵育2h；用PBST缓冲液洗涤3次后，与HRP标记山羊抗猪IgG(二抗，美国Earthox)于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次后，用化学发光检测试剂盒(ECL，Bio-Rad)检测。最后将2张蛋白膜通过Azure Biosystems C600成像系统进行扫描和拍照。WB结果如图9，可以看出重组病毒PRRSV-SP、rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54(P5)都能表达SP-M蛋白。而PRRSV-SP本来就不能表达ASFV蛋白，但在以疫苗株SP为载体的基础上分别插入ASFV病毒结构囊膜蛋白P22、P30和P54基因而构建的重组病毒rSP-P22、rSP-P30和rSP-P54分别可以表达ASFV的P22，P30和P54蛋白。并且，ASFV病毒结构囊膜蛋白P22、P30和P54都是重要的抗原蛋白，能够刺激机体产生针对该蛋白的抗体，可用于ASF疫苗研制。因此，这些表达非洲猪瘟病毒结构囊膜蛋白的重组PRRSV毒株的成功构建，使进一步开发能够同时抵抗PRRSV及ASFV感染的新一代多价疫苗成为了可能。

PRRSV-SP的氨基酸序列参见GenBank:AF184212.1。

ASFV的P22的核苷酸和氨基酸序列可参见GenBank:MK333183.1(African swinefever virus isolate DB/HLJ/2018KP177R(KP177R)gene,complete cds)。

ASFV的P30的核苷酸和氨基酸序列可参见GenBank:MK333184.1(African swinefever virus isolate DB/HLJ/2018CP204L(CP204L)gene,complete cds)。

ASFV的P54的核苷酸和氨基酸序列可参见African swine fever virus isolatePig/HLJ/2018,complete genome(GenBank:MK333180.1)的E183L基因及其CDS。

pBR322-A是在商业化载体pBR322上克隆入T7启动子、HDV核酶和T7终止子序列，序列如SEQ ID NO.30所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒及其构建方法与应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F1

<400> 1

taatacgact cactatagga tgacgtatag gtgttggct 39

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R1

<400> 2

cacttcaaga acgtccccgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F2

<400> 3

gtctgcatcc tcgcatactg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R2

<400> 4

gaagggaccc gagctgagac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F3

<400> 5

ctgtttaccc cgtctcagct 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R3

<400> 6

gcgtctcatc acagatattc tgtcc 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F4

<400> 7

gcgtctctgt gatgccatcc agcc 24

<210> 8

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R4

<400> 8

gcgtctcttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttaatttcgg ccgcatggtt 60

t 61

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F5

<400> 9

ggggacgttc ttgaagtgcg tctctaaaag ggtcggcatg gcatc 45

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R5

<400> 10

cctatagtga gtcgtattaa tggagcg 27

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F6

<400> 11

taatacgact cactatagga tgacgtatag gtgttggct 39

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R6

<400> 12

cacttcaaga acgtccccgt 20

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F7

<400> 13

cccctttaac cagagtttca gcggaacaat gaaatggggt ccatgcaaag 50

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R7

<400> 14

cctatagtga gtcgtattaa tggagcg 27

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F8

<400> 15

aatacgactc actataggat gacgtatagg 30

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R8

<400> 16

caaccgggtg ttggttgtg 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F9

<400> 17

cacaaccaac acccggttg 19

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R9

<400> 18

ttcaattcag gcctaaagtt ggttc 25

<210> 19

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F10

<400> 19

ctttaggcct gaattgaaat gtttaatatt aaaatgacaa tttctacatt gcttattgct 60

c 61

<210> 20

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R10

<400> 20

aaactctggt taaaggggtt gccgcggacc catcattatg catgtttatg atttctaggt 60

aaggctatga tgtg 74

<210> 21

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F11

<400> 21

ctttaggcct gaattgaaat ggattttatt ttaaatatat ccatgaaaat ggagg 55

<210> 22

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R11

<400> 22

aaactctggt taaaggggtt gccgcggacc catcattatt ttttttttaa aagtttaata 60

accatgagtc ttaccacctc 80

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F12

<400> 23

ctttaggcct gaattgaaat ggattctgaa ttttttcaac cgg 43

<210> 24

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R12

<400> 24

aaactctggt taaaggggtt gccgcggacc catcattaca aggagttttc taggtcttta 60

tgcgtatagg 70

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PRRSV TRS6调控序列

<400> 25

tgatgggtcc gcggcaaccc ctttaaccag agtttcagcg gaaca 45

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PRRSV-T3448A-F

<400> 26

acgttcttga agtggaggag c 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PRRSV-T3448A-R

<400> 27

aacctgacgg cttagtaggt c 21

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> nsp12_SeqF

<400> 28

ttcaccggaa acggtgagg 19

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GP2_SeqR

<400> 29

gcgacggtga agccaaac 18

<210> 31

<211> 4602

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pBR322-A载体的序列

<400> 31

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gcgcggccgc tccattaata cgactcacta 60

taggaccaaa cagagatttg gtgaatgaca tagctgtgtc gtcaaaaaca gacgacatat 120

cggtagaagg ttccctcagg ttcaagcttc gatctcgcgt tcggggttca caccttctac 180

ccgtacgatc tcgattgctt cttcgccttt tatcgtacct cacggattct ctgtttggtg 240

ggtcggcatg gcatctccac ctcctcgcgg tccgacctgg gcatccgaag gaggacgtcg 300

tccactcgga tggctaaggg agagctcgga tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc 360

tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg 420

ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggatcgagct agcgcgctat 480

atgcgttgat gcaatttcta tgcgcacccg ttctcggagc actgtccgac cgctttggcc 540

gccgcccagt cctgctcgct tcgctacttg gagccactat cgactacgcg atcatggcga 600

ccacacccgt cctgtggatc ctctacgccg gacgcatcgt ggccggcatc accggcgcca 660

caggtgcggt tgctggcgcc tatatcgccg acatcaccga tggggaagat cgggctcgcc 720

acttcgggct catgagcgct tgtttcggcg tgggtatggt ggcaggcccc gtggccgggg 780

gactgttggg cgccatctcc ttgcatgcac cattccttgc ggcggcggtg ctcaacggcc 840

tcaacctact actgggctgc ttcctaatgc aggagtcgca taagggagag cgtcgaccga 900

tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg 960

tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc 1020

tctgggtcat tttcggcgag gaccgctttc gctggagcgc gacgatgatc ggcctgtcgc 1080

ttgcggtatt cggaatcttg cacgccctcg ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca 1140

aacgtttcgg cgagaagcag gccattatcg ccggcatggc ggccgacgcg ctgggctacg 1200

tcttgctggc gttcgcgacg cgaggctgga tggccttccc cattatgatt cttctcgctt 1260

ccggcggcat cgggatgccc gcgttgcagg ccatgctgtc caggcaggta gatgacgacc 1320

atcagggaca gcttcaagga tcgctcgcgg ctcttaccag cctaacttcg atcactggac 1380

cgctgatcgt cacggcgatt tatgccgcct cggcgagcac atggaacggg ttggcatgga 1440

ttgtaggcgc cgccctatac cttgtctgcc tccccgcgtt gcgtcgcggt gcatggagcc 1500

gggccacctc gacctgaatg gaagccggcg gcacctcgct aacggattca ccactccaag 1560

aattggagcc aatcaattct tgcggagaac tgtgaatgcg caaaccaacc cttggcagaa 1620

catatccatc gcgtccgcca tctccagcag ccgcacgcgg cgcatctcgg gcagcgttgg 1680

gtcctggcca cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg 1740

gggttgcctt actggttagc agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg 1800

ctgctgcaaa acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc 1860

gtaaagtctg gaaacgcgga agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc 1920

aggatgctgc tggctaccct gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg 1980

accctgagtg atttttctct ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt taccctcaca 2040

acgttccagt aaccgggcat gttcatcatc agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg 2100

tttcatcggt atcattaccc ccatgaacag aaatccccct tacacggagg catcagtgac 2160

caaacaggaa aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga cattaacgct 2220

tctggagaaa ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca 2280

cgaccacgct gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa 2340

cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag 2400

cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac 2460

ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt 2520

gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 2580

cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 2640

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 2700

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 2760

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 2820

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 2880

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 2940

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 3000

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 3060

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 3120

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 3180

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 3240

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 3300

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 3360

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 3420

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 3480

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 3540

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 3600

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 3660

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 3720

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 3780

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 3840

gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 3900

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 3960

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 4020

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 4080

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 4140

ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 4200

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 4260

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 4320

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 4380

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 4440

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 4500

acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 4560

tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcaag aa 4602

Claims

1.一株表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(2)将ASFV结构囊膜蛋白基因克隆入步骤(1)得到的PRRS病毒基因组中的非结构蛋白基因与结构蛋白基因之间；在结构囊膜蛋白基因和结构蛋白基因之间设置调控序列；再对所得到的序列进行转录，得到的RNA转染细胞，收集病变的细胞，得到表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒。

2.根据权利要求1所述的达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的构建方法，其特征在于：

步骤(1)如下：提取PRRSV RNA，逆转录得到cDNA；在该cDNA的上游设置T7启动子，克隆入出发载体上，得到含PRRS病毒基因组的重组载体。

3.根据权利要求2所述的达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的构建方法，其特征在于：

所述的含PRRS病毒基因组的重组载体为质粒pBR322-SP，通过如下步骤制备得到：

F1:5’-taatacgactcactataggatgacgtataggtgttggct-3’；

R1:5’-cacttcaagaacgtccccgt-3’；

F2:5’-gtctgcatcctcgcatactg-3’；

R2:5’-gaagggacccgagctgagac-3’；

F3:5’-ctgtttaccccgtctcagct-3’；

R3:5’-gcgtctcatcacagatattctgtcc-3’；

F4:5’-gcgtctctgtgatgccatccagcc-3’；

R4:5’-gcgtctctttttt(30)aatttcggccgcatggttt-3’；

F5:5’-ggggacgttcttgaagtgcgtctctaaaagggtcggcatggcatc-3’；

R5:5’-cctatagtgagtcgtattaatggagcg-3’；

F6:5’-taatacgactcactataggatgacgtataggtgttggct-3’；

R6:5’-cacttcaagaacgtccccgt-3’；

4.根据权利要求3所述的达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的构建方法，其特征在于：

步骤(A)中所述的PRRSV为PRRSV疫苗株SP；

步骤(E)中所述的克隆细胞为trans10化学感受态细胞。

5.根据权利要求1所述的达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的构建方法，其特征在于：

步骤(2)如下：

2)在ASFV的结构蛋白基因的上游引物引入与SP基因组的非结构蛋白nsp12的3’端的长度为15～25bp的同源序列；ASFV的结构蛋白基因的下游引物引入PRRSV的TRS6调控序列的前半部分，TRS6序列的后半部分引入结构蛋白GP2的上游引物，同源序列为TRS6序列中间长度为15～20bp部分序列；通过该上游引物和下游引物对ASFV的结构蛋白基因进行扩增，得到片段F4；

6.根据权利要求5所述的达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的构建方法，其特征在于：

步骤1)中所述的3个可以通过PCR进行扩增的片段的引物如下：

F7：5’-cccctttaaccagagtttcagcggaacaatgaaatggggtccatgcaaag-3’；

R7：5’-cctatagtgagtcgtattaATGGAGCG-3’；

F8：5’-AATACGACTCACTATAGGATGACGTATAGG-3’；

R8：5’-CAACCGGGTGTTGGTTGTG-3’；

F9：5’-CACAACCAACACCCGGTTG-3’；

R9：5’-TTCAATTCAGGCCTAAAGTTGGTTC-3’；

步骤2)中所述的ASFV结构囊膜蛋白为P22、P30和P54中的至少一种；

当为P22时，上游引物和下游引物如下：

当为P30时，上游引物和下游引物如下：

F11：5’-CTTTAGGCCTGAATTGAAATGGATTTTATTTTAAATATATCCATGAAAATGGAGG-3’；

R11：5’-aaactctggttaaaggggttgccgcggacccatcaTTATTTTTTTTTTAAAAGTTTAATAACCATGAGTCTTA

CCACCTC-3’；

当为P54时，上游引物和下游引物如下：

F12：5’-CTTTAGGCCTGAATtgaaATGGATTCTGAATTTTTTCAACCGG-3’；

7.根据权利要求1所述的达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的构建方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的ASFV结构囊膜蛋白为P22、P30和P54中的至少一种；

步骤(2)中所述的非结构蛋白为非结构蛋白nsp12；

步骤(2)中所述的结构蛋白为结构蛋白GP2；

步骤(2)中所述的调控序列为PRRSV TRS6调控序列；

步骤(2)中所述的细胞为MARC-145细胞或BHK21细胞。

8.根据权利要求7所述的达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒的构建方法，其特征在于：

9.一种表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的构建方法得到。

10.权利要求9所述的表达ASFV结构囊膜蛋白的PRRS病毒在制备疫苗中的应用。