CN111996174A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株猪繁殖与呼吸综合征病毒，其保藏编号为CCTCC NO：V 202020。据此，发明人构建了该病毒基因组全长感染性克隆pGXAM并建立相应构建方法和插入基因的方法。该载体是以Gxnn1396‑P96为母本，通过分子生物学的手段，构建PRRSV全长感染性克隆载体，在cDNA克隆的基础上，在ORF4和ORF5a中插入一个独立的转录调控序列(TRS)，构建了一种表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的PRRSV重组病毒。该荧光标记病毒的成功构建，为研制重组猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗奠定了基础。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法
技术领域
本发明属于猪繁殖与呼吸综合征病毒技术领域，尤其涉及一株猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus， PRRSV)是威胁世界养猪业的重要传染病病原之一，引起的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)为高度接触传染性疾病，主要引起母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等严重的繁殖障碍和仔猪呼吸障碍、生长停滞、高死亡率等临床表现。PRRSV给世界的养猪业带来了巨大的经济损失。
PRRSV是动脉炎病毒家族的成员，是一种单链RNA病毒，其基因组长度约为15.4kb，包括至少由九个开放阅读框编码的病毒的复制酶多蛋白和八个结构蛋白。PRRSV基因组的5′端约2/3区域编码两种多聚蛋白(pp1a和pp1ab)，经病毒蛋白酶处理后形成成熟的非结构蛋白(nsps)，Nsps在病毒复制和转录中起关键作用。PRRSV基因组的3′端约1/3区域编码7个病毒结构蛋白。结构蛋白由一系列的3′-5′共末端、嵌套的亚基因组(sg) mRNAs翻译而来。转录调控序列(TRS)在合成sg mRNA的过程中起关键作用。。TRS包含6 个核苷酸核心序列，每侧由15-20个核苷酸组成，有助于调节结构蛋白sg mRNA的产生。这八种结构蛋白包括糖蛋白5(GP5)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)、2b、GP2、GP3、GP4 和ORF5a，它们在产生感染性子代病毒方面都具有重要的功能。
PRRSV感染性cDNA克隆可作为潜在的病毒载体。Nsp2是PRRSV中变化最大的非结构蛋白。在nsp2的高变区(HVR)常见有氨基酸的自然缺失和插入。将nsp2的HVR中病毒复制非必须的免疫优势表位进行缺失并插入外源基因，可开发出一种新的可区分感染和接种动物的标记PRRSV疫苗(DIVA)。然而，在MARC-145细胞中连续传代后，大多这些重组病毒中插入的外源基因遗传不稳定。另一种表达外源基因的策略是通过插入额外的独立转录单元来产生额外的sg mRNA来表达外源基因。但是，PRRSV采用严格控制的基因表达策略，除了ORF1b和ORF2、ORF4和ORF5a、ORF7和3′UTR外，大多数编码结构蛋白的ORF 之间存在重叠区域。在重叠序列之间插入外源基因会引起相邻的编码区域一些氨基酸突变，使突变克隆难以获得拯救。目前，在ORF1与2或ORF7与3′UTR之间插入外源基因的重组克隆，已经成功获得多个表达外源基因的重组病毒，其策略是将外源基因插入ORF1 与2或ORF7与3′UTR之间，在外源基因下游插入TRS，ORF1b和ORF2a或ORF7和3′UTR 上游的TRS负责外源基因的转录，插入的TRS调节下游病毒基因sg mRNA的产生。利用该策略，成功获得表达外源基因的重组PRRSV，包括标记基因、猪病毒免疫原基因和细胞因子基因，拯救的重组病毒在细胞和体内传代过程中证明了外源基因的稳定性和生物活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和在 ORF4和ORF5a之间插入外源基因方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一株猪繁殖与呼吸综合征病毒，保藏编号为CCTCC NO：V 202020，分类命名为porcine reproductive and respiratory syndrome virus Gxnn1396-P96。
上述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体，为该病毒基因组全长感染性克隆pGXAM。
上述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体，该克隆载体中Gxnn1396-P96基因组14402 核苷酸处产生一个沉默突变(C-G突变)，形成了MluⅠ酶切位点。
上述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体在制备重组病毒或基因工程疫苗方面的应用。
上述克隆载体的构建方法，从Gxnn1396-P96病毒感染的细胞培养物中提取病毒RNA，通过反转录获得第一链cDNA；以第一链cDNA为模板，用4对引物扩增出4个覆盖全基因组的cDNA片段，克隆到Zero
Figure BDA0002380606400000021
TOPO载体中，得到4个克隆质粒，分别命名为PRRSV-A、PRRSV-B、PRRSV-C和PRRSV-D；用限制性内切酶酶切四个克隆质粒，纯化回收目的片段，逐步替换到同样酶切的质粒pJX143(Lv J,Zhang J,Sun Z,Liu W,Yuan S.An infectious cDNAclone of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndromevirus variant associated with porcine high fever syndrome.J Gen Virol.2008；89(Pt 9):2075–2079.)中；为引入MluⅠ限制性内切酶位点，用JX14402MluⅠF和PR15300引物在Gxnn1396-P96基因组14402核苷酸处产生了一个沉默突变(C-G突变)，所得片段经Mlu I和Not I酶切后连接到类似的酶切质粒 pJX143中，得到Gxnn1396-P96株PRRSV的全长cDNA克隆pGXAM。
应用上述克隆载体插入基因的方法，以ORF4和ORF5a之间作为外源基因插入位点，可以作为活载体病毒插入一种或者多种动物病原抗原基因，以获得表达外源基因的重组病毒，制备基因工程活载体疫苗。
上述插入基因的方法，用序列表SEQ.NO.ID.10-14所示序列作为引物进行PCR扩增，在ORF4和ORF5a之间通过融合PCR的方法引入酶切位点BstbⅠ和SbfⅠ以及TRS序列(序列表SEQ.NO.ID.17)，得到可以在ORF4和ORF5a之间插入外源基因的PRRSV重组质粒pGX45BSTRS；外源基因为绿色荧光基因GFP(序列表SEQ.NO.ID.18)，用序列表SEQ.NO.ID.15-16所示序列作为引物扩增得到后，用BstbⅠ和SbfⅠ限制性内切酶酶切后，连入同样酶切的重组质粒pGX45BSTRS后，得到可以表达绿色荧光基因的重组质粒pGX45BSTRS-GFP。
PRRSV重组质粒pGX45BSTRS按以下操作制备：以pGXAM感染性克隆为模板，用正向引物GF11706和反向引物45BSR扩增出一个上游片段，该片段含有BstB I和sbf I限制性内切酶位点，用正向引物45BSF和反向引物JX14402Mlu I R扩增出一个下游片段，该引物含有BstBⅠ和sbf I限制性内切酶位点，将得到的上下游片段作为第二轮融合PCR的模板，用正向引物GF11706和反向引物JX14402Mlu I R进行PCR扩增，获得的PCR产物克隆到Zero
Figure BDA0002380606400000031
载体中，得到中间质粒pTOPO-45BS；以质粒pTOPO-45BS为模板，用含有Sbf I限制性内切酶位点和TRS序列的正向引物SbfI-TRS和反向引物JX14402Mlu I R扩增出一个片段，并用限制性内切酶Sbf I和Mlu I酶切该含有SbfI和TRS的片段，并将其连接到用SbfI和Mlu I酶切过的pGXAM，获得可以在ORF4和ORF5a之间表达外源基因的PRRSV重组感染性克隆pGX45BSTRS。
重组质粒pGX45BSTRS-GFP按以下操作制备：扩增具有BstB I和Sbf I两个酶切位点的绿色荧光基因GFP，将其酶切产物连接到同样酶切后的pGX45BSTRS中，获得在ORF4和ORF5a之间插入表达GFP的PRRSV重组感染性克隆pGX45BSTRS-GFP。
发明人自行分离得到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒，它是在MARC-145细胞上连续传代致弱的一株PRRSV细胞适应型毒株，其保藏编号为CCTCC NO：V 202020，分类命名为porcine reproductive and respiratory syndrome virus Gxnn1396-P96。
PRRSV基因组在ORF4和ORF5a之间有一个不重叠的区域，发明人假设选择这两个ORF 连接区作为外源基因的插入位点，可以最大限度地减少对基因组结构的破坏，从而在PRRSV 基因组找到新位点来插入外源基因。发明人研究了重组PRRSV基因组ORF4和ORF5a之间插入的独立转录单元来表达外源基因的能力。结果发现在PRRSV重组克隆ORF4和5a之间插入一个额外的转录单元来表达GFP，拯救的重组病毒具有复制能力。重组病毒可在 MARC-145细胞中稳定传三代，外源基因稳定表达，重组病毒在第四代后不稳定，荧光逐渐丢失。
据此，发明人构建了该病毒基因组全长感染性克隆pGXAM，并建立相应构建方法和插入基因的方法。该载体是以Gxnn1396-P96为母本，通过分子生物学的手段，构建PRRSV 全长感染性克隆载体，在cDNA克隆的基础上，在ORF4和ORF5a中插入一个独立的转录单元TRS，构建了一种表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的PRRSV重组病毒。对重组病毒 rGX45BSTRS-GFP的生物学评估表明，它保持了与亲本病毒相似的生长特性，重组病毒三代内遗传稳定。这些数据表明PRRSV全基因组的ORF4和ORF5a之间能够耐受外源基因的插入，可以作为多价载体用于疫苗的开发。该荧光标记病毒的成功构建，为研制重组猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗奠定了基础。
附图说明
图1是PRRSV全长cDNA克隆构建的总体方案示意图，图中：基因组结构和单一的限制性酶切位点以及它们的核苷酸位置显示在顶部；利用RT-PCR技术，从基因组RNA中合成4个以粗线为代表的cDNA片段(A、B、C和D)，覆盖PRRSV的全基因组；感染性PRRSV 的cDNA克隆pJX143与Gxnn1396-P96具有共同的限制性酶位点(PacⅠ、AfeⅠ、AflⅡ、 AscⅠ和NotⅠ)，为构建感染性cDNA克隆(pGXAM)提供了基础；用适当的限制性内切酶酶切4个中间产物，并将其一步一步地连接到同样酶切的质粒pJX143中，得到PRRSV的全长cDNA克隆(pGXAM)；在CMV启动子的控制下定位完整的PRRSV cDNA。
图2是PRRSV全长cDNA克隆的拯救结果，图中：(a)间接免疫荧光法检测重组病毒和亲本PRRSV感染细胞后病毒蛋白的表达(20倍物镜拍摄)；(b)重组病毒与亲本病毒生长动力学的比较，在MOI＝0.1时在MARC-145细胞上的生长情况；(c)MARC-145细胞上亲本病毒和克隆PRRSV病毒的空斑形态。
图3是外源基因插入ORF4和5a之间位点的重组PRRSV的构建策略示意图，图中：重组克隆pGX45BSTRS作为外源基因插入的PRRSV载体，引进的两个单一的限制性内切酶位点BstBⅠ和SbfI用黑体字和下划线表示，旁边用斜体字表示的是引入的合成体TRS；下划线序列下面的星号表示相应ORF的终止密码子。
图4是ORF4和ORF5a中插入GFP基因的重组克隆载体的拯救与鉴定结果图，图中：(a) 间接免疫荧光法检测重组病毒N蛋白的表达(20倍物镜拍摄)；(b)MARC-145细胞接种于6孔板上，用MOI为0.1的P2代rGX45BSTRS-GFP感染细胞，感染后不同时间活细胞成像 (20倍物镜拍摄)；(c)重组病毒与亲本病毒生长动力学的比较，比较重组病毒和亲本病毒在MARC-145细胞上MOI为0.1时的生长情况；(d)亲本和重组PRRSV在MARC-145细胞上的空斑形态。。
图5是rGX45BSTRS-GFP病毒连续传代过程中GFP的表达结果图，图中：(a)MARC-145细胞接种于6孔板上，用MOI为0.1的P1-P8代rGX45BSTRS-GFP病毒分别感染，在72hpi 时，用荧光显微镜对活细胞进行成像；(b)rGX45BSTRS-GFP重组病毒在6孔板单层 MARC-145细胞上以0.1的MOI连续传代；病毒基因组RNA是从每一代72hpi的澄清培养液中提取的；用RT-PCR扩增rGX45BSTRS-GFP中插入的GFP基因，在1％琼脂糖凝胶上分离 RT-PCR产物，在紫外光下成像；其中，L代表Marker。
保藏信息说明
porcine reproductive and respiratory syndrome virus Gxnn1396-P96，保藏编号为CCTCC NO：V 202020，保藏日期：2019年01月16日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编 430072，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
具体实施方式
本发明所用PRRSV毒株Gxnn1396-P96为细胞传代适应弱毒株，，目前该毒株保存于广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室。
以下实施例所用引物序列：
(1)扩增PRRSV-A：
PF1：TAAATTAATTAAATGACGTATAGGTGTTGGCTCTATGC(序列表SEQ.NO.ID.1)
PR2379：ATGAACCTCGTCACCTTGT(序列表SEQ.NO.ID.2)
(2)扩增PRRSV-B：
PF2108:ATCAGTACCTCCGTGGCG(序列表SEQ.NO.ID.3)
PR7728:CGTCTTTTAGCTCAACCTCACTGGC(序列表SEQ.NO.ID.4)
(3)扩增PRRSV-C：
PF7556：AAAGAATAATTGACAAACTCCAGGG(序列表SEQ.NO.ID.5)
PR11958：TTCAATTCAGGCCTAAAGTTGGTTC(序列表SEQ.NO.ID.6)
(4)扩增PRRSV-D：
PF11804：ATTTGAATCGGATACAGCGTATCTG(序列表SEQ.NO.ID.7)
PR15300：GTGGCGGCCGCTAATTACGGCCGCATGGTTCTC(序列表SEQ.NO.ID.8)
(5)引入酶切位点Mlu I：
JX14402Mlu I F：ATGATAACCACGCGTTTGTCGATCCG(序列表SEQ.NO.ID.9)
(6)构建重组感染性克隆pGX45BS-TRS的引物
GF11706：TTCTCGCTTGATGATCCAGTAAGGT(序列表SEQ.NO.ID.10)
45BSR：CCCAACATACTTCAACATCCTGCAGGATCCTTCGAATCAAATTGCC AGTAGGAT(序列表SEQ.NO.ID.11)
45BSF：ATCCTACTGGCAATTTGATTCGAAGGATCCTGCAGGATGTTGAAGTA TGTTGGG(序列表SEQ.NO.ID.12)
JX14402Mlu I R：CGGACGACAAACGCGTGGTTATCATT(序列表SEQ.NO.ID.13)
SbfI-TRS：GGATCCTGCAGGGAGACCATGAGGTGGGCAACCGTCTTAGCCTGTCTTTTTGCTATCCTACTG GCAATTTGAATGTTCAAGTATGTTGGG(序列表SEQ.NO.ID.14)
(7)扩增绿色荧光基因GFP：
GFP BstBI F：GAGTTCGAAATGCCCGCCATGAAGATC(序列表SEQ.NO.ID.15)
GFP SbfI R：ATATCCTGCAGGCTAGGCGAATGCGATCGGGGTCTTGAA(序列表SEQ.NO.ID.16)
以下实施例所插入外源基因序列
TRS：GAGACCATGAGGTGGGCAACCGTCTTAGCCTGTCTTTTTGCTATCCTACTGGCAATTTGA(序列表 SEQ.NO.ID.17)
GFP：序列表SEQ.NO.ID.18。
实施例1 Gxnn1396-P96株PRRSV的全长感染性克隆(pGXAM)的构建(图1)
从Gxnn1396-P96病毒感染的细胞培养物中提取病毒RNA，以此RNA为模板，在42℃下用禽骨髓母细胞病病毒(AMV)逆转录酶(TaKaRa，大连，中国)和锚定的poly(T)引物Qst进行反转录，持续1h，获得第一链cDNA。以获得的cDNA为模板，用PfuUltra高保真DNA聚合酶(Stratagene)和4对引物(序列表SEQ.NO.ID.1-8)扩增出4个覆盖全基因组的cDNA片段，分别命名为PRRSV-A、PRRSV-B、PRRSV-C，PRRSV-D，然后克隆到Zero
Figure BDA0002380606400000061
载体中，得到4个中间质粒。构建包含5′端到2379位核苷酸和5′端前Pac Ⅰ序列的PRRSV-A。构建包含2108-7728位核苷酸序列的PRRSV-B。构建包含7556-11958 位核苷酸序列的PRRSV-C。构建包含11804位核苷酸到具有poly(A)尾的3′端序列的 PRRSV-D，该序列包含Not I限制性内切酶位点。用限制性内切酶Pac I和Afe I酶切 PRRSV-A，Afe I和Afl II酶切PRRSV-B，Afl II和Asc I酶切PRRSV-C以及Asc I和 Not I酶切PRRSV-D，逐步连接到具有相同的酶切位点的质粒pJX143中。为了引入MluⅠ限制性内切酶位点，用引物JX14402MluⅠF(序列表SEQ.NO.ID.9)和PR15300(序列表 SEQ.NO.ID.8)在Gxnn1396-P96基因组14402核苷酸处产生了一个突变(C碱基突变为G 碱基)，所得片段经Mlu I和Not I酶切后连接到类似的酶切质粒pJX143中，得到 Gxnn1396-P96株PRRSV的全长cDNA克隆，命名为pGXAM。
实施例2允许外源基因插入的重组感染性克隆pGX45BSTRS的构建(图3)
用前向引物GF11706(序列表SEQ.NO.ID.10)和反向引物45BSR(序列表SEQ.NO.ID.11) 从pGXAM感染性克隆主干中扩增出一个上游片段，该片段含有BstB I和sbfI限制性酶切位点。以pGXAM感染性克隆为模板，用前向引物45BSF(序列表SEQ.NO.ID.12)和反向引物JX14402MluⅠR(序列表SEQ.NO.ID.13)，扩增出一个下游片段，该片段含有BstBⅠ和SbfI限制性内切酶位点。将得到的上下游片段作为第二轮融合PCR的模板，用GF11706 (序列表SEQ.NO.ID.10)和JX14402MluⅠR(序列表SEQ.NO.ID.13)作为引物进行扩增，将获得的产物纯化回收后克隆到Zero
Figure BDA0002380606400000071
载体中，得到中间质粒pTOPO-45BS。用含有Sbf I限制性酶切位点和TRS序列的前向引物SbfI-TRS(序列表SEQ.NO.ID.14)和反向引物JX14402Mlu I R(序列表SEQ.NO.ID.13)从pTOPO-45BS中扩增出一个片段，并用限制性内切酶(SbfI和Mlu I)酶切该含有SbfI和TRS的片段，将其连接到用SbfI和 Mlu I酶切过的pGXAM的相应区域，获得可以在ORF4和ORF5a之间表达外源基因的PRRSV 重组感染性克隆pGX45BSTRS。
实施例3在ORF4和ORF5a之间表达标记基因GFP的PRRSV重组感染性克隆pGX45BSTRS-GFP的构建(图3)
用引物GFP BstBI F(序列表SEQ.NO.ID.15)和GFP SbfI R(序列表SEQ.NO.ID.16)扩增具有BstB I和SbfI两个酶切位点的绿色荧光基因GFP，回收目的片段后，用BstB I 和SbfI限制性内切酶进行双酶切，将其酶切产物纯化回收后，连接到pGX45BSTRS的类似酶切区，克隆出在ORF4和ORF5a之间表达标记基因GFP的PRRSV重组感染性克隆 pGX45BSTRS-GFP。
实施例4 PRRSV重组病毒的拯救和鉴定。
将重组质粒pGXAM转染BHK-21细胞，按照Fugene-HD转染试剂(Roche)的使用说明，将接种在6孔板中的BHK-21细胞每孔转染2μg DNA，转染后，细胞在37℃和5％的二氧化碳中孵育48h后，收取上清液，接种于单层的MARC-145，直到出现细胞病变效应(CPE)。在MARC-145细胞上采集获救病毒，标记为初级传代(P1)，然后在每个传代处用10-2倍稀释液感染MARC-145细胞进行后续传代。
拯救的病毒被传至MARC-145细胞时，病毒感染后72h的MARC-145细胞出现了典型的细胞病变效应(CPE)。病毒液感染MARC-145单层细胞72h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗MARC-145细胞，室温下冰甲醇固定15min，用3％牛血清白蛋白(Roche,Mannheim, Germany)封闭30min，将封闭液弃后，用PRRSV N蛋白抗体SR30-A(Roche,Mannheim, Germany)用PBS按照1:2500的比例稀释后作为一抗，37℃下孵育2小时。然后，吸出一抗，PBS清洗5次后，用Alexa Fluor 568山羊抗鼠IgG(Thermo Fisher Scientific) 在37℃下以1:1000的稀释度孵育细胞1h，用PBS洗涤细胞五次。最后，在荧光显微镜下拍摄图像。如图2a显示克隆病毒rGXAM和亲本病毒Gxnn1396-P96均可以观察到明显的红色荧光，这表明PRRSV的全长感染性克隆得到拯救，拯救的病毒能够感染MARC-145细胞，且其N蛋白能够与PRRSV N蛋白抗体发生特异性的结合。
实施例5 PRRSV重组病毒的生物学特性分析
在MARC-145细胞上测定病毒生长动力学的方法：在6个孔板上的MARC-145细胞中，以0.1的多重感染率(MOI)感染获救病毒(P3)和亲本病毒。在6、12、24、48、72、96、 120hpi下收集200μL上清液，并在-70℃下冷冻直至使用。取上清液10倍于EMEM中连续稀释，然后将病毒样品100μl稀释液接种到铺有单层MARC-145细胞的96孔平板的8 个孔中。用Reed&Muench法测定MARC-145细胞上清液的病毒滴度(log10 TCID50/mL)。
为了研究拯救病毒rGXAM和亲本病毒Gxnn1396-P96的病毒学特性，在不同时间点采集病毒感染细胞的培养基，在MARC-145细胞上测定病毒滴度。在这两种病毒之间观察到类似的病毒生长曲线(图2b)。
使用6孔板中的MARC-145细胞进行病毒空斑试验的方法：病毒样本在EMEM中被连续稀释10倍。将每种稀释液的200μl样品加入6孔培养板中，接种MARC-145细胞并孵育 1h。MARC-145细胞单层上覆盖含有2％FBS和1％低熔点琼脂糖(Cam-brex，Rockland，ME， USA)的EMEM混合物，并在37℃下孵育5天。取下固定液后，用1％结晶紫染色，可见斑块。如图2c所示，rGXAM产生的斑块与亲本病毒相同。总的来说，这些数据表明亲本和重组病毒在MARC-145细胞中的复制和传播是不可区分的。
实施例6 PRRSV重组病毒衍生病毒的拯救和鉴定
将重组质粒pGX45BSTRS和pGX45BSTRS-GFP转染BHK-21细胞，按照Fugene-HD转染试剂(Roche)的使用说明，将接种在6孔板中的BHK-21细胞每孔转染2μg DNA，转染后，细胞在37℃和5％的二氧化碳中孵育48h后，收取上清液，接种于单层的MARC-145，直到出现细胞病变效应(CPE)。在MARC-145细胞上采集获救病毒，标记为初级传代(P1)，然后在每个传代处用10-2倍稀释液感染MARC-145细胞进行后续传代。
拯救的病毒被传至MARC-145细胞时，病毒感染后72h的MARC-145细胞出现了典型的细胞病变效应(CPE)。病毒液感染MARC-145单层细胞72h后，按照实施例4所述间接免疫荧光的方法，对获救的重组病毒进行鉴定。如图4a所示，重组病毒rGX45BSTRS和 rGX45BSTRS-GFP感染MARC-145细胞，均可观察到明显的红色荧光，这表明成功地从 pGX45BSTRS和pGX45BSTRS-GFP中分离出了活的感染性病毒。此外，如图4b所示，早在12hpi时，rGXBSTRS-GFP感染细胞中就已观察到GFP阳性细胞，72hpi和96hpi处显示绿色荧光的阳性细胞较多，提示病毒在感染过程中能够进行复制和传播，进一步表明 pGXBSTRS-GFP具有复制能力。
为了进一步鉴定重组病毒的特性，在MARC-145细胞中测定了重组病毒的多步生长动力学和空斑形态。如图4c所示，重组病毒及其衍生病毒显示出相似的多步生长曲线。然而，重组病毒的衍生病毒(rGX45BSTRS和rGX45BSTRS-GFP)的滴度低于重组病毒rGXAM。在MARC-145细胞中也检测了病毒空斑的大小。如图4d所示，由rGX45BSTRS产生的空斑在大小上几乎相似，但小于由亲本病毒产生的斑块。总的来说，结果表明重组病毒 rGX45BSTRS和rGX45BSTRS-GFP具有复制能力，并且具有传染性。
实施例7 PRRSV重组病毒rGX45BSTRS-GFP的传代稳定性鉴定
将转染BHK-21细胞上清液中的rGX45BSTRS-GFP病毒定义为P0代，用于MARC-145细胞的盲传。rGX45BSTRS-GFP病毒在MARC-145细胞上连续传代8次(P1～P8)。然后用P1 到P8病毒株感染MARC-145细胞。在72hpi时，进行活体细胞成像，如图5a所示。大多数细胞在感染P1至P3病毒液后检测到绿色自体荧光，说明重组病毒在3代内遗传稳定。感染P4病毒的培养物中荧光细胞的数量明显减少，感染P6和P7病毒的培养物中仅检测到少量荧光细胞。感染P8病毒的细胞中未观察到荧光细胞。提取P1～P8代病毒RNA，在 42℃下用禽骨髓母细胞病病毒(AMV)逆转录酶(TaKaRa，大连，中国)和引物GFP SbfI R (序列表SEQ.NO.ID.16)进行反转录，持续1h，获得第一链cDNA。以第一链cDNA为模板，用引物GFP BstBI F(序列表SEQ.NO.ID.15)和GFP SbfI R扩增插入ORF4和ORF5之间的GFP片段。与荧光图像结果一致，RT-PCR产物显示GFP基因从P4代开始丢失，GFP基因在P8代完全缺失(图5b)。
以上结果说明PRRSV基因组中，ORF4和ORF5a之间是一个新的外源基因插入位点。在 ORF4和ORF5a之间插入GFP基因的PRRSV重组克隆具有复制能力和传染性。重组病毒在MARC-145细胞传代过程中，在3代是稳定的，重组病毒在第4代后不稳定，荧光逐渐丢失。
序列表
<110> 广西大学
<120> 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taaattaatt aaatgacgta taggtgttgg ctctatgc 38
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaacctcg tcaccttgt 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcagtacct ccgtggcg 18
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtcttttag ctcaacctca ctggc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaagaataat tgacaaactc caggg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcaattcag gcctaaagtt ggttc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atttgaatcg gatacagcgt atctg 25
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtggcggccg ctaattacgg ccgcatggtt ctc 33
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgataacca cgcgtttgtc gatccg 26
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttctcgcttg atgatccagt aaggt 25
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccaacatac ttcaacatcc tgcaggatcc ttcgaatcaa attgccagta ggat 54
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcctactgg caatttgatt cgaaggatcc tgcaggatgt tgaagtatgt tggg 54
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggacgacaa acgcgtggtt atcatt 26
<210> 14
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggatcctgca gggagaccat gaggtgggca accgtcttag cctgtctttt tgctatccta 60
ctggcaattt gaatgttcaa gtatgttggg 90
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagttcgaaa tgcccgccat gaagatc 27
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atatcctgca ggctaggcga atgcgatcgg ggtcttgaa 39
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gagaccatga ggtgggcaac cgtcttagcc tgtctttttg ctatcctact ggcaatttga 60
<210> 18
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgcccgcca tgaagatcga gtgccgcatc accggcaccc tgaacggcgt ggagttcgag 60
ctggtgggcg gcggagaggg cacccccgag cagggccgca tgaccaacaa gatgaagagc 120
accaaaggcg ccctgacctt cagcccctac ctgctgagcc acgtgatggg ctacggcttc 180
taccacttcg gcacctaccc cagcggctac gagaacccct tcctgcacgc catcaacaac 240
ggcggctaca ccaacacccg catcgagaag tacgaggacg gcggcgtgct gcacgtgagc 300
ttcagctacc gctacgaggc cggccgcgtg atcggcgact tcaaggtggt gggcaccggc 360
ttccccgagg acagcgtgat cttcaccgac aagatcatcc gcagcaacgc caccgtggag 420
cacctgcacc ccatgggcga taacgtgctg gtgggcagct tcgcccgcac cttcagcctg 480
cgcgacggcg gctactacag cttcgtggtg gacagccaca tgcacttcaa gagcgccatc 540
caccccagca tcctgcagaa cgggggcccc atgttcgcct tccgccgcgt ggaggagctg 600
cacagcaaca ccgagctggg catcgtggag taccagcacg ccttcaagac cccgatcgca 660
ttcgcctag 669

Claims (9)

1.一株猪繁殖与呼吸综合征病毒，保藏编号为CCTCC NO：V 202020，分类命名为porcine reproductive and respiratory syndrome virus Gxnn1396-P96。
2.权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体，其特征在于为该病毒基因组全长感染性克隆pGXAM。
3.根据权利要求2所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体，其特征在于该克隆载体中Gxnn1396-P96基因组14402核苷酸处产生一个沉默突变C-G突变，形成了MluⅠ酶切位点。
4.权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体在制备重组病毒或基因工程疫苗方面的应用。
5.权利要求3所述克隆载体的构建方法，其特征在于：从Gxnn1396-P96病毒感染的细胞培养物中提取病毒RNA，通过反转录获得第一链cDNA；以第一链cDNA为模板，用4对引物扩增出4个覆盖全基因组的cDNA片段，克隆到Zero
Figure FDA0002380606390000011
TOPO载体中，得到4个克隆质粒，分别命名为PRRSV-A、PRRSV-B、PRRSV-C和PRRSV-D；用限制性内切酶酶切四个克隆质粒，纯化回收目的片段，逐步替换到具有同样酶切位点的质粒pJX143中；用JX14402MluⅠF和PR15300引物在Gxnn1396-P96基因组14402核苷酸处产生了一个沉默突变C-G突变，所得片段经Mlu I和Not I酶切后连接到类似的酶切质粒pJX143中，得到Gxnn1396-P96株PRRSV的全长cDNA克隆pGXAM。
6.应用权利要求1所述克隆载体插入基因的方法，其特征在于：以ORF4和ORF5a之间作为外源基因插入位点，插入一种或者多种基因。
7.根据权利要求6所述的插入基因的方法，其特征在于：用序列表SEQ.NO.ID.10-14所示序列作为引物进行PCR扩增，在ORF4和ORF5a之间通过融合PCR的方法引入酶切位点BstbⅠ和SbfⅠ以及TRS序列，得到ORF4和ORF5a之间插入外源基因的PRRSV重组质粒pGX45BSTRS；所述外源基因为绿色荧光基因GFP，用序列表SEQ.NO.ID.15-16所示序列作为引物扩增得到后，用BstbⅠ和SbfⅠ限制性内切酶酶切后，连入同样酶切的重组质粒pGX45BSTRS，得到重组质粒pGX45BSTRS-GFP。
8.根据权利要求7所述的插入基因的方法，其特征在于所述PRRSV重组质粒pGX45BSTRS按以下操作制备：以pGXAM感染性克隆为模板，用正向引物GF11706和反向引物45BSR扩增出一个上游片段，该片段含有BstB I和sbf I限制性内切酶位点，用正向引物45BSF和反向引物JX14402Mlu I R扩增出一个下游片段，该引物含有BstBⅠ和SbfI限制性内切酶位点；将得到的上下游片段作为第二轮融合PCR的模板，用正向引物GF11706和反向引物JX14402Mlu IR进行PCR扩增，获得的PCR产物克隆到Zero
Figure FDA0002380606390000021
TOPO载体中，得到中间质粒pTOPO-45BS；以质粒pTOPO-45BS为模板，用含有Sbf I限制性内切酶位点和TRS序列的正向引物SbfI-TRS和反向引物JX14402Mlu I R扩增出一个片段，并用限制性内切酶SbfI和Mlu I酶切该含有SbfI和TRS的片段，将其连接到用Sbf I和Mlu I酶切过的pGXAM中，获得可以在ORF4和ORF5a之间表达外源基因的PRRSV重组感染性克隆pGX45BSTRS。
9.根据权利要求7所述的插入基因的方法，其特征在于所述重组质粒pGX45BSTRS-GFP按以下操作制备：扩增具有BstB I和Sbf I两个酶切位点的绿色荧光基因GFP，将其酶切产物连接到同样酶切后的pGX45BSTRS中，获得在ORF4和ORF5a之间插入GFP的PRRSV重组感染性克隆pGX45BSTRS-GFP。
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