CN101899421B - 重组杆状病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒包含：编码猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性病毒颗粒蛋白的核苷酸序列。本发明还公开了重组杆状病毒的构建方法及应用。本发明的重组杆状病毒，在昆虫细胞、以及PRRSV敏感和非敏感哺乳细胞中都能成功表达出感染性PRRSV颗粒，可用于研制PRRSV疫苗，以及建立体外培养病毒的培养体系。

Description

重组杆状病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种含猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的重组杆状病毒及其构建方法和应用。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征，即猪“蓝耳病”病原，于上世纪八十年代末首先发现于美国，九十年代初相继分离于欧洲和美国。PRRSV属于套式病毒目(Nidovirales)，与马动脉炎病毒(Equine arteritis virus，EAV)、猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fever virus，SHFV)和鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(Lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)一起形成动脉炎病毒科。根据病毒的血清学和遗传学特征，将病毒分成两型，即PRRSV I型(欧洲型，代表株为Lelystad Virus)和PRRSV II型(美洲型，代表株为VR-2332)，两株间基因组的同源性约为63％。PRRSV基因组为一单股正义RNA，长约15Kb，有5’端帽状结构和3’poly(A)尾，含9个开放性阅读框(open reading frames，ORFs)。左端占基因组总长四分之三的ORF 1a和1b编码病毒的非结构蛋白，其余的ORF(2a，2b和3-7)编码病毒结构蛋白。结构蛋白的表达需要通过不连续转录(discontinuous transcription)产生至少七个亚基因组mRNA(subgenomic mRNA，sgmRNA)，这与冠状病毒中结构蛋白的表达机制相同。非结构蛋白与病毒基因组的复制和亚基因组mRNA的转录相关。结构蛋白中，GP2a、GP3、GP4和GP5是4种膜糖蛋白；M蛋白是非糖基化的膜蛋白，N蛋白是核衣壳蛋白，以及新发现的E蛋白是由ORF2b编码的73个氨基酸的非糖基化。根据病毒粒子中蛋白的含量，可将结构蛋白分成主要结构蛋白(包括GP5、N和M蛋白)和次要结构蛋白(包括GP2a、GP3、GP4和E蛋白)。结构蛋白中，GP5和GP3可诱导机体产生保护性免疫反应。 

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是导致养猪业损失惨重的一种主要传染病，世界各国猪场普遍流行。我国自1996年郭宝清等从猪群中分离出PRRSV以来，各地陆续报道存在PRRSV感染，如今我国猪群中的PRRSV感染率高达90％。特别是2006年我国华东和南方部分地区爆发的“猪高热综合征”，导致了约3000万头生猪死亡，沉重打击了我国养猪业。调查认为，高致病性PRRSV是其主要致病原之一。目前，我国预防PRRS的主要途径是接种疫苗，商品化的疫苗有CH-1a株和NVDC-JXA1株，弱毒活疫苗有CH-1R株和JXA1-R株。由于PRRSV的易感细胞仅有猪肺泡巨噬细胞和MA104及 其衍生细胞系Marc-145。猪肺泡巨噬细胞为原代细胞，不易获得大量细胞用来生产疫苗，且质量也难以控制。而用于生产疫苗的基质细胞MA104和Marc-145细胞都为美国勃林格公司专利所限制。因此，有必要寻找一种新的无需通过MA104细胞或Marc-145细胞的途径来呈递或生产PRRSV。 

病毒反向遗传技术的兴起极大地促进了病毒的研究。现代病毒的研究，已越来越依赖于病毒的反向遗传技术。通过建立病毒的感染性克隆，并在克隆的特定区域进行突变、缺失、插入及置换等操作，来解析特定基因的功能、突变蛋白对病毒的影响、寻找病毒的毒力决定因子及作为病毒疫苗的研发平台等。在利用感染性克隆拯救病毒中，体外实验常用脂质体转染细胞产生病毒，也有将感染性克隆直接注射入体内或通过基因枪或电击接种体内产生病毒，但效率低，操作繁琐，难以将感染性克隆作为疫苗推广使用或在非敏感细胞上产生病毒来研究非细胞培养病原。 

大的DNA病毒，如禽痘病毒、腺病毒、伪狂犬病毒和杆状病毒等，常作为异源蛋白的真核表达载体，在真核细胞中表达功能性蛋白，或作为疫苗载体，在机体中表达呈递异源蛋白刺激免疫反应。但是，到目前为止，还没有出现含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性cDNA克隆的重组杆状病毒的研究报道。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能有效呈递感染性PRRSV的重组杆状病毒，该重组杆状病毒包含猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染性克隆，在昆虫和哺乳细胞中都能成功表达出感染性PRRSV颗粒。 

此外，还需要提供一种上述重组杆状病毒的构建方法和应用。 

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现： 

在本发明的一个方面，提供了一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒包含：编码猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性病毒颗粒蛋白的核苷酸序列。 

优选的，所述重组杆状病毒包含SEQ ID NO.1所示的猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列。更优选的，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列置于CMV启动子的控制下，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列的3’末端添加有丁型肝炎病毒的核酶序列。最优选的，所述重组杆状病毒的保藏号为：CCTCC V201005。 

杆状病毒常作为异源蛋白的真核表达载体，在真核细胞中表达功能性蛋白，或作为疫苗载体，在机体中表达呈递异源蛋白刺激免疫反应。由于杆状病毒不能在哺乳细胞中复制和表达自身蛋白，因此是一种安全的基因治疗载体。 

优选的，本发明的杆状病毒是指苜蓿银纹夜蛾多形核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)。 

在本发明的另一方面，提供了一种包含上述重组杆状病毒的细胞。 

在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤： 

构建含有猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性基因序列的供体质粒； 

将所述供体质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得包含猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性基因序列、以及杆状病毒全基因组序列的质粒，并将该质粒转染到sf9昆虫细胞中，以获得重组杆状病毒。 

所述重组杆状病毒中，猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性基因序列置于杆状病毒的核多角体启动子的下游，形成核多角体启动子和CMV启动子串联的重组杆状病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性基因序列的3’端位于SV40转录终止/多腺苷加尾信号上游。 

在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组杆状病毒在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。 

在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组杆状病毒用于建立体外病毒培养系统的用途。 

本发明重组杆状病毒，利用杆状病毒的呈递作用，在昆虫细胞、以及PRRSV敏感和非敏感哺乳细胞中都能成功表达出感染性PRRSV颗粒，可用于研制PRRSV疫苗，避免利用哺乳细胞作为基质细胞生产疫苗时的外源污染。 

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 

图1是本发明实施例1中PRRSV的RT-PCR检测图； 

图2是本发明实施例2阳性重组质粒pBacAPS的Sma I酶切鉴定图； 

图3是本发明实施例2重组bacmid的SF12-SR683和SF14413-SR15497引物的PCR鉴定图； 

图4是本发明实施例2重组杆状病毒AcAPRRS的SF12-SR683和SF14413-SR15497引物的PCR鉴定图； 

图5是本发明实施例2AcAPRRS和AcLacZ的生长曲线图； 

图6是本发明实施例2中sf9细胞上抗杆状病毒GP64单抗(AcV1)、抗PRRSV nsp2单抗(Anti-nsp2)和抗N蛋白单抗(Anti-N)的染色结果图； 

图7是本发明实施例2PRRSV颗粒的电子显微镜图； 

图8是本发明实施例2sf9细胞上清中PRRSV RNA的RT-PCR检测图； 

图9是本发明实施例3Marc-145细胞上抗N蛋白单抗(anti-N)的染色图； 

图10是本发明实施例3Marc-145细胞上清中PRRSV的RT-PCR检测图； 

图11是本发明实施例3vASM与APRRS的5′末端和3′末端序列的比较分析图； 

图12是本发明实施例3vASM和APRRS在Marc-145上的空斑形态图； 

图13是本发明实施例3vASM和APRRS在Marc-145细胞上的一步生长曲线图； 

图14是本发明实施例4BHK-21细胞和vero细胞上抗N蛋白单抗染色图； 

图15是本发明实施例4AcAPRRS接种BHK-21细胞和vero细胞后产生的PRRSV曲线图。 

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。 

实施例1PRRSV感染性克隆pCAPRRS的构建 

根据GenBank登录号为GQ330474的PRRSV APRRS全长序列、pCMV-Script的载体序列和丁型肝炎病毒(HDV)的核酶序列，设计合成8条引物；以一对引物从pCMV-Script中扩增CMV启动子的序列，并克隆入pBluescript SK(+)中，再以一对从pAPRRS中扩增PRRSV 5’端片段，并克隆入CMV启动子的下游；以双酶切将CMV启动子及5’序列片段置换下pAPRRS中的T7及相应5’序列片段；以其余4条引物从pAPRRS中扩增PRRSV 3’端片段，扩增获得的片段在PRRSV 3’末端加有HDV核酶序列，通过酶切将含核酶序列的3’片段置换下相应的片段，获得的克隆称为pCAPRRS。以pCAPRRS转染MA-104细胞，通过免疫荧光和RT-PCR检测，证实pCAPRRS转染Marc-145细胞后，可产生PRRSV。具体过程如下： 

1.1引物设计 

根据GenBank登录号为GQ330474的PRRSV APRRS全长序列、pCMV-Script的载体序列和丁型肝炎病毒(HDV)的核酶序列，设计合成8条引物，具体序列如下： 

1.2CMV启动子序列的克隆 

1.2.1pCMV-Script质粒的提取 

将含pCMV-Script的TOP10细菌接种含卡那霉素的LB液体，培养12h，按说明书以华舜质粒小量抽提(W5002)提取pCMV-Script。 

1.2.2CMV启动子片段的扩增 

以PCMVF和PCMVR为引物，以5ng的pCMV-Script为模板，进行PCR。 

将PCR产物以1％的琼脂糖电泳，按说明书以博大泰克小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收约600bp目的片段。 

1.2.3CMV启动子片段的克隆 

以Not I酶切上述回收的CMV启动子片段，37℃酶切12h，以1％的琼脂糖电泳回收酶切片段。同时以Not I和EcoRV酶切pBluescript SK(+)，并以1％的琼脂糖电泳回收载体片段。以T4连接酶将酶切的CMV启动子片段和pBluescript SK(+)连接。16℃连接过夜，转化TOP10感受态细胞，挑选氨苄抗性菌落，提取质粒，并以Not I和Xho I酶切筛选阳性质粒。阳性质粒称为pBSCMV。 

1.3丁型肝炎病毒核酶序列的添加 

以5ng的pAPRRS为模板，以SF14413为上游引物，以PHDVR1为下游引物，进行PCR。 

将PCR产物以1％的琼脂糖电泳，按说明书以博大泰克小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收约1100bp目的片段。以上轮回收PCR目的条带为模板，以SF14413为上游引物，分别以PHDVR2和PHDVR3为下游引物，再进行二轮PCR扩增。以1％的琼脂糖电泳回收第三轮PCR的目的条带，并以Xho I和Xba I酶切回收条带。37℃酶切12h，以1％的琼脂糖电泳回收酶切片段。同时以Xho I和Xba I酶切pAPRRS，并以1％的琼脂糖电泳回收大的片段。以T4连接酶将酶切的带核酶的3′端片段与pAPRRS连接。16℃连接过夜，转化TOP10感受态细胞，挑选氨苄抗性菌落，提取质粒，并以SF14413与PHDVR2为引物PCR筛选阳性质粒。阳性质粒称为pAPRRSr。 

1.4CMV启动子控制下PRRSV感染性克隆的构建 

1.4.1PRRSV 5′末端修饰序列的扩增与克隆 

为了将PRRSV全长克隆置于CMV启动子下游，以CMV-SF1和SR2573为引物，以5ng的pAPRRS为模板，扩增PRRSV 5’端序列并同时引入酶切位点。 

以1％琼脂糖电泳回收目的片段，并以Sph I酶切该片段。37℃酶切10h，以1％琼脂糖电泳回收酶切片段。同时，以Xho I酶切pBSCMV，回收后以T4 DNA聚合酶补平粘端，再以Sph I酶切，1％琼脂糖电泳回收大片段。以T4 DNA连接酶将酶切后的5′修饰片段和pBSCMV相连 接，16℃连接过夜，转化TOP10感受态细胞，挑选氨苄抗性菌落，提取质粒，并以Mlu I酶切筛选阳性质粒。阳性质粒称为pCM5PS。 

1.4.2CMV启动子下全长PRRSV克隆的拼结 

以Not I和Afl II酶切pCM5PS和pAPRRSr。 

37℃酶切12h，以1％琼脂糖电泳回收pCM5PS酶切后的小片段和pAPRRSr酶切后的大片段，并以T4DNA连接酶将回收的两个片段连接，16℃连接过夜，转化TOP10感受态细胞，挑选氨苄抗性菌落，提取质粒，并以Sma I酶切筛选阳性质粒。阳性质粒称为pCAPRRS。 

1.4.3pCAPRRS感染性的鉴定 

参照说明书，以FuGENE HD将2μg pCAPRRS转染Marc-145细胞。转染3d后，Marc-145细胞明显细胞病变。将细胞上清在Marc-145细胞传一代，2d后即出现明显的细胞病变。按说明书以QIAamp Viral RNA Mini Kit提取Marc-145细胞第一代及传代上清中的RNA为模板，以Qst为引物，用Quant Revers Transcriptase作反转录。以SF14413和SR15497为引物作PCR。 

将PCR产物以1％琼脂胶电泳，如图1所示出现约1000bp的目的条带(箭头所指的目的条带)，这表明pCAPRRS转染Marc-145细胞可产生感染性PRRSV。在图1中，“1”指DNA MarkerDL2000，“2”指转染pCAPRRS的Marc-145细胞上清，“3”指传代上清。 

在实施例1中，将pAPRRS中的T7启动子更换为CMV启动子，并在3′末端插入丁型肝炎病毒核酶序列，获得pCAPRRS。将pCAPRRS直接转染Marc-145细胞，3天后出现细胞病变，传代及RT-PCR证实产生了PRRSV，表明pCAPRRS具有感染性。 

实施例2猪繁殖与呼吸综合征病毒重组杆状病毒的构建 

利用bac-to-bac系统，将pCAPRRS中PRRSV APRRS全长cDNA重组入杆状病毒中，构建了重组杆状病毒AcAPRRS。AcAPRRS在sf9细胞上连续传5代，通过对嵌合处序列分析，证实AcAPRRS具有较好的稳定性。比较了AcAPRRS与空载体杆状病毒AcLacZ在sf9细胞上的生长曲线，结果显示AcAPRRS具有与AcLacZ相近的生长动力特性。以RT-PCR和间接免疫荧光检测了PRRSV基因在sf9细胞中的转录和表达，结果显示，AcAPRRS感染sf9细胞后，有低水平的PRRSV亚基因组转录和N蛋白的表达。通过PRRSV颗粒的浓缩与纯化，在电镜下发现样品中存在PRRSV颗粒，并以RT-PCR检测到样品中存在PRRSV RNA，这表明AcAPRRS感染sf9细胞后产生PRRSV。 

2.1引物设计 

根据pCAPRRS和bac-to-bac中pFastbac 1的序列，设计合成下列引物 

2.2重组供体质粒的构建 

以Not I和Xho I酶切pCAPRRS和pFastbac1。 

37℃酶切12h，以1％的琼脂糖电泳回收pCAPRRS酶切后的大片段(含PRRSV全长cDNA)和载体pFastbac1。并以T4 DNA连接酶将PRRSV全长cDNA片段和载体pFastbac1相连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。以质粒小量快速提取纯化试剂盒提取重组质粒，并以Sma I酶切鉴定，pCAPRRS作为对照质粒，酶切结果见图2，鉴定阳性重组质粒称之为pBacAPS，pBacAPS经Sma I酶切后的条带基本与pCAPRRS的相同，只有一条较大，这是因为pFastbac1载体质粒比pBluescript SK(+)大所致，与预期结果一致。在图2中，“1”指DNAMarker DL2000，“2”指pBacAPS1，“3”指pBacAPS2，“4”指pBacAPS3，“5”指pCAPRRS，“6”指DNA Marker DL15000。pFastbac1载体质粒可以将PRRSV全长cDNA转座到杆状病毒的基因组中。 

2.3重组bacmid的筛选 

以分光光度仪测定pBacAPS的浓度。按照上述转化方法，以1ng pBacAPS转化DH10Bac^TME.coli感受态细胞。在本发明中，bacmid是指在杆状病毒表达系统中，一种含有经修饰的杆状病毒AcMNPV全基因组DNA的质粒。以含卡那霉素(50μg/ml)，庆大霉素(7μg/ml)和四环素(10μg/ml)的LB平板(含100μg/ml的X-gal和40μg/ml IPTG)筛选阳性菌落。挑选白色单菌落在上述三抗LB平板纯化一次。参照说明书，以碱裂解法分离重组杆状病毒基因组(bacmid)，并以引物SF12-SR683和SF14413-SR15497作PCR检测。 

以SF14413-SR15497为引物的PCR如上例1.4中所述方法。 

如图3a和3b所示，所鉴定的6个菌落，以SF12-SR683和SF14413-SR15497为引物的PCR鉴定结果均扩增出目的条带，以SF12-SR683为引物扩增出的目的条带大小为700bp(见图3a)，以SF14413-SR15497为引物扩增出的目的条带大小为1000bp(见图3b)，表明筛选得到的重组bacmid都含有PRRSV cDNA序列。在图3a和3b中，“1”指DNA Marker DL2000，“2”指 重组bacmid-1，“3”指重组bacmid-2，“4”指重组bacmid-3，“5”指重组bacmid-4，“6”指重组bacmid-5，“7”指重组bacmid-6，“8”指pBacAPS对照，“9”指H₂O对照。 

2.4重组杆状病毒的获得与鉴定 

参照说明书，以S.N.A.P.^TM MidiPrep Kit从100ml培养物中提取重组bacmid，并以分光光度计测定其浓度，以备转染之用。 

以SF-900II SFM培养的sf9细胞，分种于35mm培养皿。经过夜生长，细胞密度达70％左右用于转染。按说明书操作，以6μl cellfectin将1μg重组bacmind转染sf9细胞。转染后每天观察细胞，当细胞出现明显的病变，收获细胞上清，并添加FBS至终浓度为2％，一部分保存于4℃，另一部分冻存-75℃。重组杆状病毒称之为AcAPRRS，该重组杆状病毒保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，其保藏号为：CCTCC V201005，保藏日期为：2010年2月25日，其分类命名为：Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus(AcMNPV)。将AcAPRRS在sf9细胞上扩大培养，感染后5d收上清，添加2％FBS，冻存于-75℃。 

按照上述方法，提取DH10Bac^TM E.coli中未重组的bacmid转染sf9细胞，获得的杆状病毒称之为AcLacZ，以作为对照杆状病毒。 

按说明书，以DNeasy Tissue Kit提取AcAPRRS基因组DNA，以SF12-SR683和SF14413-SR15497为引物，按2.3所述方法作PCR检测，并以AcLacZ的DNA做对照。PCR产物经1％琼脂电泳，如图4a和4b所示，以AcAPRRS基因组DNA为模板可扩增出约700bp(见图4a)和1000bp(见图4b)的条带，而以AcLacZ基因组DNA为模板则未扩增出条带。这表明，AcAPRRS携带有PRRSV基因组cDNA。图4a是重组杆状病毒AcAPRRS的SF12-SR683引物的PCR鉴定图，其中，“1”指DNA Marker DL2000，“2”指AcAPRRS P1，“3”指AcAPRRS P2，“4”指pBacAPS对照，“5”指AcLacZ对照。图4b是重组杆状病毒AcAPRRS的SF14413-SR15497引物的PCR鉴定图，其中，“1”指DNA Marker DL2000，“2”指AcAPRRS P1，“3”指AcAPRRSP2，“4”指pBacAPS对照，“5”指AcLacZ对照。 

2.5重组杆状病毒在sf9细胞上的稳定性 

将AcAPRRS在sf9上连续传5代。将第5代上清接种Marc-145细胞，同时以AcLacZ作对照。另以DNeasy Tissue Kit提取第5代AcAPRRS基因组DNA，以引物PBacF350-CMVnR和SF15008-M13R为引物分别扩增重组病毒中PRRSV 5′和3′嵌合序列。以DNA片段小量快速回收试剂盒回收目的片段，以pBS-T载体克隆目的片段，筛选阳性克隆，委托上海桑尼生物。 

16℃连接过夜，按上述方法转化Top10感受态细胞，以含X-gal和IPTG的Amp平板作蓝白斑法筛选阳性克隆。将阳性克隆委托上海桑尼生物公司测定序列。序列比较分析表明，经sf9细胞传代后，重组杆状病毒中与PRRSV病毒嵌合处序列并未出现改变。 

3.1.8AcAPRRS与AcLacZ在sf9细胞上的生长曲线 

将AcAPRRS和AcLacZ以0.1MOI(感染复数)接种35mm细胞培养皿中的sf9细胞，27℃孵育1h，并以SF-900 II SFM洗两遍，每培养皿加入SF-900 II SFM 3ml，27℃培养。接种后每24h收取细胞上清200μl，保存于-75℃。以96孔板中的sf9细胞测定各点的每毫升半数组织感染量(TCID₅₀/ml)。 

杆状病毒TCID₅₀/ml的具体测定方法如下： 

(a)以SF-900 II SFM将样品作10倍系列稀释，每个96孔板稀释四个样品。 

(b)向96孔板中每孔加入50μl稀释病毒液。 

(c)再向每孔加入100μl Sf9细胞液(3×10⁵细胞/ml)。 

(d)上样后的96孔板置27℃培养箱中培养，1周后观察并记录细胞病变。 

(e)以Reed-Muench法计算病毒滴度，并以GraphPad Prism软件绘制病毒的生长曲线。 

AcAPRRS和AcLacZ的生长曲线如图5所示，在对数生长期，AcLacZ的增殖速度比AcAPRRS稍快，但感染后96h，AcAPRRS和AcLacZ的滴度都可达到10⁷TCID₅₀/ml，且二者的峰值滴度相近。这表明，长达16kb的PRRSV基因组cDNA的插入不影响重组杆状病毒的生产。 

2.6间接免疫荧光(IFA) 

以0.2MOI(感染复数)的AcAPRRS接种35mm细胞培养皿中的sf9细胞，同时以0.2MOI的AcLacZ和5MOI的PRRSV APRRS接种sf9细胞作为病毒对照，设一35mm细胞培养皿中的sf9细胞作为空白对照。接种3d后以抗PRRSV NSP2单抗(Anti-nsp2)、抗PRRSV N蛋白单抗(Anti-N)和抗杆状病毒GP64单抗(AcV1)作IFA检测NSP2蛋白和N蛋白的表达。IFA方法如下： 

将细胞以PBS洗一次，每平皿加入1ml冰甲醇在-20℃固定10min。以含1％的Tween-20的PBS洗两次，每次5min。加入1％BSA 37℃封闭30min，用抗PRRSV N蛋白的特异性单抗37℃孵育1.5h，PBS洗5次，每次3-5min，再加入FITC标记羊抗鼠的二抗，37℃孵育1h，PBS洗3遍后，在荧光显微镜下观察结果。 

如图6所示，以抗NSP2和N蛋白单抗作荧光染色，仅有AcAPRRS感染的昆虫细胞呈阳性染色；以抗GP64单抗作荧光染色，则AcAPRRS和AcLacZ感染昆虫细胞呈阳性染色。这表明，PRRSV不能感染sf9细胞，sf9细胞中出现的PRRSV蛋白是由于AcAPRRS所携带的PRRSV基因组发生转录与表达所致。 

2.7sf9细胞中产生的PRRSV颗粒纯化 

以0.2MOI的AcAPRRS接种T75细胞培养瓶中的sf9细胞，接种7天后，收获细胞上清，以2000rpm 4℃离心20分钟，然后10000rpm 4℃离心30分钟(Sigma，H-12150)，取上清。将上清以50,000×g 4℃离心1h(BeckMan，SW32 Ti)，二次离心以沉淀去除其中的杆状 病毒，上清在30％蔗糖垫上以106,750×g超速离心2h(BeckMan，SW32 Ti)，沉淀以STE缓冲液重悬。收集的重悬液再在30％蔗糖垫上以106,750×g超速离心2h，沉淀以STE重悬。将最终的重悬液滴一滴在铜网上，以1％的磷钨酸负染1分钟，在电子显微镜下观察。经过浓缩和纯化的重悬液中，存在一些直径为45-60nm的颗粒(见图7)，与PRRSV颗粒大小一致。 

为了检测AcAPRRS感染的sf9细胞上清经浓缩纯化的样品中是否存在PRRSV基因组RNA，以北京天根公司RNAprep pure Cell/Bacteria Kit提取上清中的核酸。为了消除样品中的DNA污染，在提取过程中使用DNase I。为了检测RNA，先使用Qst为引物作RT，再以SF14413和SR15497为引物作PCR。为了检测是否存在DNA，直接以SF14413和SR15497为引物作PCR。检测结果如图8，超离心样品经过DNase I消化后，PCR检测为无条带(图8中“2”)，而RT-PCR检测出现预期大小条带(图8中“1”)，这表明样品中含有PRRSV RNA。 

在实施例2中，通过bac-to-bac系统获得了重组杆状病毒AcAPRRS，通过传代后序列分析证实AcAPRRS的稳定性；通过与AcLacZ的生长曲线比较分析，表明长达16kb的PRRSV序列插入对重组杆状病毒的生产无影响；通过间接免役荧光证实，AcAPRRS携带的PRRSV cDNA可在昆虫细胞中表达；通过病毒纯化和核酸检测，证实AcAPRRS感染的sf9细胞上清中存在包装有PRRSV RNA的PRRSV颗粒。 

实施例3Marc-145细胞上产生感染性猪繁殖与呼吸综合征病毒 

将重组杆状病毒AcAPRRS接种Marc-145细胞，3天后接种的Marc-145细胞出现细胞病变，以抗PRRSV N蛋白单抗作免疫荧光染色，出现荧光。将接种的Marc-145细胞上清在Marc-145细胞上传代，传代接种细胞均能出现细胞病变。以RT-PCR检测接种与传代的Marc-145细胞上清，样品均呈现PRRSV阳性。以上结果表明，AcAPRRS接种Marc-145细胞后，能产生感染性PRRSV。将源自于AcAPRRS的PRRSV称之为vASM。比较了vASM与亲本毒株PRRSVAPRRS的一步生长曲线和空斑形态，结果显示，vASM与APRRS的生长特性相近。5′-Race和3′-Race分析结果显示，vASM与APRRS具有相同的末端序列。上述结果表明，重组杆状病毒未改变携带外源病毒基因组的特性。 

3.1引物设计 

本例所用引物如下： 

3.2间接免疫荧光 

生长于6孔板中的Marc-145细胞，当生长成单层时，用PBS洗两次，以5MOI的AcAPRRS接种Marc-145细胞。同时以5MOI的AcLacZ和0.01MOI的PRRSV APRRS作为对照病毒接种Marc-145细胞。37℃吸附2h后，用PBS洗细胞一次，每孔加入3ml含2％FBS的MEM，在37℃含5％的CO2培养箱中培养3d后，以抗PRRSV N蛋白单抗按上例2.6方法进行IFA。 

IFA结果如图9，AcAPRRS和APRRS接种Marc-145细胞出现阳性染色，而AcLacZ接种细胞与阴性对照细胞一样，未显示荧光。这表明AcAPRRS接种的Marc-145细胞中出现PRRSV N蛋白的表达，且AcAPRRS接种细胞的荧光染色率与APRRS接种细胞的荧光染色率相近，显示AcAPRRS接种Marc-145细胞可能产生感染性PRRSV。 

3.3AcAPRRS转导Marc-145细胞后子代PRRSV病毒的产生 

生长于35mm细胞培养皿中的Marc-145细胞单层，用PBS洗两次，以5MOI的AcAPRRS接种Marc-145细胞，同时以另一35mm培养皿中的Marc-145细胞接种AcLacZ作为对照。37℃吸附1h后，用PBS洗细胞一次，每培养皿加入3ml含2％FBS的MEM，37℃含5％的CO₂培养箱中培养。3d后AcAPRRS接种的Marc-145细胞上出现细胞病变。4d后，AcAPRRS接种的Marc-145细胞病变显著，而AcLacZ接种的Marc-145细胞未出现病变。收获上清，称之为vASM，冻存于-75℃备用。再将vASM作1∶100稀释，和AcLacZ转导Marc-145细胞上清(vALZ)原液分别感染Marc-145细胞，vASM接种的Marc-145细胞2d后即出现细胞病变，3d后收获其上清。vALZ接种的Marc-145细胞至接种后7d未出现病变。按说明书，以QIAamp Viral RNAMini Kit提取vASM第一代F1及继代上清F2中的RNA为模板，按1.4.3中所述方法，以Qst为引物用Quant Revers Transcriptase作反转录。以SF14413-SR15497作为引物，作PCR检测。RT-PCR检测结果(见图10)显示，AcAPRRS接种的Marc-145细胞的上清中的vASM与其传代均为PRRSV阳性，而AcLacZ接种的Marc-145细胞上清与传代均为PRRSV阴性。这表明，AcAPRRS接种的Marc-145细胞产生感染性PRRSV。 

3.35′-Race和3′-Race 

以QIAamp Viral RNA Mini Kit提取vASM在Marc-145上原代(F1)和第二代(F2)的RNA，以大连宝生物公司的5′-Full Race Kit和3′-Full Race Core Set，按试剂盒说明书进 行5′-Race和3′-Race。具体方法如下。 

5′-Race：按试剂盒说明书，经过去磷酸化、“去帽子”和5′RACE Adaptor的连接的RNA进行反转录反应。 

反转录反应条件如下：30℃10min；42℃1h；70℃15min。反应结束后，cDNA冻存于-30℃备用。 

以上述cDNA为模板，以5′outer primer和SR1124为引物进行第一轮PCR。 

以第一轮PCR产物为模板，以5′inner primer和SR683为引物进行第二轮PCR的扩增。 

3′-Race： 

(1)反转录反应。 

反转录反应条件为：42℃1h；70℃15min。反应结束后，cDNA冻存于-30℃备用。 

(2)以上述cDNA为模板，以SF14413和3′outer primer为引物，仅作一轮PCR。 

以1％的琼脂胶回收5′-Race和3′-Race的PCR目的条带，并以pBS-T载体克隆，委托上海桑尼生物公司测序。序列分析结果如图11所示，在图11中，“A”为PRRSV APRRS末端序列，“B”为vASM F1和F2的5’末端与APRRS 5’末端序列的比较，“C”为vASM F1和F2的3’末端与APRRS 3’末端序列的比较，可见vASM F1和F2序列与APRRS的末端序列一致，这表明，AcAPRRS可介导产生的完整的PRRSV。 

3.4空斑试验 

将vASM和PRRSV APRRS作10倍系列稀释至10^-5，分别取10^-3、10^-4和10^-5稀释病毒液200μl接种6孔板中的Marc-145细胞单层。37℃吸附1h后，以PBS将细胞洗涤二次，每孔加入5ml覆盖培养基(含2％FBS和1％琼脂糖)。在CO₂培养箱中培养4天后，以5％的结晶紫染色。空斑结果如图12，vASM所致空斑与APRRS所致空斑大小相近。 

3.5一步生长曲线 

分别以5MOI的vASM和PRRSV APRRS接种35mm细胞培养皿中的Marc-145细胞单层。接种1h后以PBS洗细胞2次，每平皿加入3ml含2％FBS的MEM，置37℃CO2中培养。分别于接种后4h、8h、12h、16h、20h、24h和28h收获200ul细胞上清，同时补充200ul含2％FBS的MEM。收获上清冻存于-75℃，以96孔板中的Marc-145细胞测定不同时间点上清中的病毒TCID₅₀/ml。 

PRRSV的TCID₅₀/ml的测定方法如下： 

(a)以含2％FBS的MEM将样品作10倍系列稀释，每个96孔板稀释四个样品。 

(b)向96孔板中每孔加入50μl稀释病毒液。 

(c)再向每孔加入100μl Marc-145细胞液(3×10⁵细胞/ml)。 

(d)上样后的96孔板置37℃CO₂培养箱中培养，1周后观察并记录细胞病变。 

(e)以Reed-Muench法计算病毒滴度，并以GraphPad Prism软件绘制病毒的生长曲线。 

生长曲线如图13，虽然在对数生长期APRRS的生长速度比vASM稍快，但在感染后24h，vASM和APRRS都达到病毒滴度的峰值，且峰值滴度相近。 

在实施例3中，重组杆状病毒接种Marc-145细胞，出现N蛋白的表达，并可产生感染性PRRSV。测定了AcAPRRS介导产生PRRSV的末端序列，并比较了其与亲本株APRRS的一步生长曲线和空斑，结果表明AcAPRRS介导产生的PRRSV与亲本株末端序列完全一致，生长特性与亲本株也相近，这些表明AcAPRRS对携带的全长PRRSV cDNA的活性无影响。 

实施例4BHK-21细胞和vero细胞上产生感染性猪繁殖与呼吸综合征病毒 

将重组杆状病毒AcAPRRS接种BHK-21细胞和vero细胞。接种2天后，以抗PRRSV N蛋白单抗作免疫荧光染色，出现荧光。将接种的BHK-21细胞和vero细胞上清接种Marc-145细胞，2天后，Marc-145细胞出现细胞病变。以RT-PCR检测BHK-21细胞和vero细胞上清及传代的Marc-145细胞上清，均呈PRRSV阳性。以上结果表明，AcAPRRS接种BHK-21细胞和vero细胞后，可产生感染性PRRSV。以AcAPRRS接种BHK-21和vero后，测定了PRRSV的生产曲线，结果显示，PRRSV的滴度最高可达10⁴TCID₅₀/ml以上。 

4.1AcAPRRS转导BHK-21和vero细胞后PRRSV N蛋白的表达 

分种于6孔板中的BHK-21和vero细胞，当生长成单层时，用PBS洗两次，以5MOI的AcAPRRS接种BHK-21和vero细胞。同时以5MOI的AcLacZ和5MOI的PRRSV APRRS作为对照病毒接种BHK-21细胞。37℃孵育8h后，以PBS洗细胞二次，每孔加入3ml含2％FBS的DMEM，在37℃含5％的CO2培养箱中培养2d后，以抗PRRSV N蛋白单抗按上例3.2所述方法作IFA。 

IFA试验结果(图14)显示，仅有AcAPRRS接种的BHK-21细胞和vero细胞呈现阳性染色，而其它细胞染色均呈阴性。这显示，PRRSV虽然不能感染BHK-21和vero细胞，但AcAPRRS可介导其携带的PRRSV cDNA在其中表达。 

4.2AcAPRRS转导BHK-21和vero细胞产生感染性PRRSV 

以5MOI的AcAPRRS接种35mm细胞培养皿中的BHK-21和vero细胞单层，同时以AcLacZ作为对照病毒以5MOI接种BHK-21和vero细胞。37℃孵育8h后，以PBS洗细胞二次，每孔加入3ml含2％FBS的DMEM。接种后3d收获细胞上清，并取一部分上清感染35mm培养皿中的Marc-145细胞单层。感染2d后，接种过AcAPRRS的BHK-21和vero细胞上清均能引致Marc-145细胞出现病变。3d后收获上清。按照上例3.3所述方法，将BHK-21和vero细胞上清及Marc-145细胞上清以QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA，以Qst为引物，反转录为 cDNA，以SF14413-SR15497为引物，作PCR检测PRRSV序列。PCR检测结果显示，接种过AcAPRRS的BHK-21和vero细胞上清及其传代的Marc-145细胞上清均呈现PRRSV阳性，而AcLacZ接种的BHK-21和vero细胞上清及其传代的Marc-145细胞上清则均为阴性。这表明，AcAPRRS接种BHK-21和vero细胞后，可产生感染性PRRSV。 

4.3BHK-21细胞和vero细胞上PRRSV的生产曲线 

生长于35mm培养皿中的BHK-21细胞和vero细胞单层，以PBS洗两次后，均以5MOI的AcAPRRS接种。37℃孵育8h后，以DMEM洗两次，每培养皿加入3ml含2％的DMEM，37℃培养。在培养中，每8h收获细胞上清200μl，并相应补充200μl含2％FBS的DMEM。按上例3.5所述方法，以96孔板中的Marc-145细胞测定各点的PRRSV病毒滴度。 

如图15所示，BHK-21和vero细胞接种AcAPRRS后，BHK-21细胞中产生PRRSV较快，16h即出现PRRSV，而vero细胞出现PRRSV稍慢。但从产生的PRRSV最高滴度看，vero细胞中产生的PRRSV滴度(10^4.28TCID₅₀/ml)比BHK-21细胞中的(10^4.05TCID₅₀/ml)略高。 

在实施例4中，以AcAPRRS接种BHK-21和vero细胞，以抗N单克隆抗体作间接免疫荧光染色，证实了BHK-21和vero细胞出现N蛋白的表达。将BHK-21和vero细胞上清在Marc-145细胞上传代和RT-PCR检测，证实了BHK-21和vero细胞虽不是PRRSV敏感细胞，但经AcAPRRS转导，可产生感染性PRRSV。 

综上所述，将PRRSV感染克隆pAPRRS中T7启动子替换为CMV启动子，并在PRRSV cDNA3′末端添加HDVr序列，获得的感染性克隆pCAPRRS直接转染Marc-145细胞可产生感染性PRRSV。将CMV启动子控制下的全长PRRSV cDNA重组入杆状病毒，获得的重组杆状病毒AcAPRRS在感染的昆虫细胞后，可表达携带的PRRSV基因，并产生PRRSV颗粒，这有利于利用杆状病毒-昆虫细胞系统来研究体外非培养病毒。AcAPRRS接种Marc-145细胞后，可产生感染性PRRSV，且来自AcAPRRS产生的PRRSV与其亲本病毒在生长特性上无差异，经杆状病毒呈递后产生的PRRSV序列也无变异。此外，AcAPRRS接种PRRSV非敏感细胞后，也可产生感染性PRRSV。这表明，可以利用杆状病毒来建立体外非培养病毒的培养系统，或利用杆状病毒作为呈递系统接种机体，来研制疫苗，避免利用哺乳细胞作为基质细胞生产疫苗时的外源污染。 

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>重组杆状病毒及其构建方法和应用

<160>27

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>15541

<212>DNA

<213>Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

<400>1

atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg acatttgtat tgtcaggagc tgtgatcatt     60

gacacagccc aaagcttgct gcacagaaac acccttctgt gacagcctcc ttcaggggag    120

tttaggggtc tgtccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccac    180

ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt    240

catggcggag ggccaagtct actgcacacg atgcctcagt gcacggtctc tccttcctct    300

gaatctccaa gttcctgaac tcggggtgct gggcctattc tataggcccg aagagccact    360

ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgttgagtgc tcccccgccg gagcctgctg    420

gctttctgcc atctttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aatctgaact ttcaacaaag    480

aatggtgcgg gtcgcagctg agctttacag agccggccag ctcacccctg cagtcttgaa    540

gactctacaa gtttatgaac ggggttgcca ctggtacccc attgttggac ctgttcctgg    600

agtggccgtt tatgccaact ccctacatgt gagtgataaa cctttcccgg gagcaactca    660

cgtgttaacc aacctgccgc tcccgcagag acccaagcct gatgattttt gcccctttga    720

gtgtgctatg gctactgtct atgacattgg tcatgacgcc gtcatgtatg tggccgaaga    780

gaaagtctcc tgggcccctc gtggcgggga tgaagtgaaa ttcgaacctg tccccgggga    840

gttgaagttg attgcgaacc gactccgcac ctccttcccg ccccaccacg cagtggacat    900

gtctaagttc accttcacag cccctgggcg tggtgtttct atgcgggtcg aacgccaaca    960

cggctgcctc cccgctgaca cagttcctga aggcaactgc tggtggagct tgttcaactt   1020

gctcccactg gaagttcaga acaaagaaat tcgtcatgcc ggccaatttg gctaccagac   1080

taagcatggt gtctctggca agtacctaca gcggaggctg caagttaatg gtcttcgagc   1140

agtaactgac ctaaatggac ctatcgtcgt acagtgcttc tccgttaagg agagttggat   1200

ccgccacttg aaactggcgg aagaacccag ctaccctggg tttgaggacc tcctcagaat   1260

aagggttgag cccaacacgt cgccattggc tgacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg   1320

caatcacaag tggtatggcg ctggaaagag agcaaggaaa gcacgctcta gtgcgactgc   1380

tacagtcgct ggccgcgctt tgcccgttcg tgaaacccgg caggtcgagg agcacgaggt   1440

tgccggcgcc aacaaggctg agcacctcaa acactactcc ccgcctgccg aagggaattg   1500

tggttggcac tgcatttccg ccatcggcaa ccggatgttg aattccaaat ttgaaaccac   1560

ccttcccgaa agagtgagac ctccagatga ctgggctact gatgaggatc ttgtgaatgc   1620

catccaaatc ctcagactcc ctgcggcctt ggacaggaac ggtgcttgtg ctagcgccaa   1680

gtacgtactt aagctggaag gtgagcattg gactgtcact gtgacccctg ggatgtcccc   1740

ttctttgctc cctcttgaat gtgttcaggg ctgttgcgag cataagggcg gtcttggttc   1800

cccagatgca gtcgaggttt tcggatttga ccctgcctgc cttgactggc tggctgaggt   1860

gatgcacttg cctagcaatg ccatcccagc cgctctggcc gaaatgtccg gcgattccaa   1920

tcgtccggct tccccggtca ccaccgtgtg gactgtttcg cagttcttag cccgccacaa   1980

cggagggaat caccctgacc aaatacgctt agggaaaatt atcagccttt gtcaggtgat   2040

tgaggactgc tgctgttccc agaacaaaac caaccgggtc accccggagg aggtcgcagc   2100

aaagattgac ctgtacctcc gtggtgcaac aaatcttgaa gaatgcttgg ccaggcttga   2160

gaaagcgcgc ccgccacgcg taatggacac ctcctttgat tgggatgttg tgctccctgg   2220

ggttgaggcg gcaactcaaa cgaccgaact gccccaagtc aaccagtgtc gcgctctggt   2280

ccctgttgtg actcaaaagt ccttggacaa caactcggtc cctctgaccg ccttttcact   2340

ggctaactac tactaccgcg cgcaaggtga cgaagttcgt caccgtgaaa gactaaccac   2400

cgtgctctct aagttggaag gggttgttcg agaagaatac gggctcatgc caaccgggcc   2460

tggtccacgg cccacactgc cacgcgggct cgacgaactc aaggaccaga tggaggtgga   2520

cttgctgaaa ctggctaacg cccagatgac ttcggacatg atggcctggg cagtcgagca   2580

ggttgaccta aagacttggg tcaagaacta tccgcggtgg acaccaccac ctcctccgcc   2540

aatagttcag cctcgaaaaa cgaagcttgt caagagctta ccagagagca agcctgttcc   2700

tgcaccgcgt aggaaggtca ggtccgattg tgactgcccc accctatcgg gcaacaatct   2760

tcctgacagt tgggaagatt tggctgttgg ttgcccctct gatctcccta cctcacctga   2820

gccggtaaca cctttgagtg agccggcatc tgtgtccgca ccgcgacgct cttttaggcc   2880

ggtgaagcct ttgagtgaac cagttccagt ccctgcaccg cgcaagactg tgtcccgacc   2940

ggcaacacct ctgagtgagc cgatccctgt gcccgcaccg cgacgcaagt ttcagcaggt   3000

agaaaaagtg aatccggcgg cggcaaccct ggcgtgccaa gacgagtttc cagatttgtc   3060

tgcatcctcg catactgaat atgaggcgtc tccccttgta ctaccgcaga acggggacgt   3120

tcttgaagtg gaggagcggg aagctgagga aatcctgagt ggaatctcag acatactgga   3180

tgccatcaaa ccggcatctg catcatcaag cagctccctg tcaagtgtgg cgatcacacg   3240

cccgaaatac tcagctcaag ccatcattga ctcgggtggg ccctacagcg ggcatctcca   3300

agaggtgaag gaaacatgcc taagcatcat gagtgaggca tgtgatgtga ccaagcttga   3360

tgaccctgcc acgcaggaat ggctttctcg catgtgggat agggtggaca tgctgacttg    3420

gcgcaatacg tctgttcacc aggcgtctcg caccttggac gacagattta agtttctccc    3480

gaagatgata cttgaaacac cgccgcccta cccgtgtggg ttcgtgatga tgcctcgcac    3540

acctgcaccc tccgtgggtg cggagagcga cctcactatt ggctcagtcg ctactgagga    3600

cgttccacgc atcttcggga aagtaaatga tgtctgcaag atgatcgacc agagaccctt    3660

ggtactcttt gaaaatgagc tggcagatga ccaacctgcc agagatcctc ggacatcatc    3720

gcagaggttt gacgggagca caccagctcc gcccgcaggc acggatggca ccggtttggc    3780

ttcgggccct ggagtgagag aagtggattc atgtgaggcg agctcaaccg agaaaaatga    3840

acagcccttc gtgttgaacg gcggcgccag cacacaggcg tcaacgttta ccaatttgcc    3900

gcctccaggc ggtatagatg cgggcgggag tgggccgtta caaacggtgc gaaagaaggc    3960

tgaacggttc tttgacctac taagccgtca ggtttttaat ctcgtctccc atctccctgt    4020

tttcttctca cgccttttca aacctggcgg tgactattct ccgggtgatt ggggttttgc    4080

agcttttact ttattgtgcc tctttttgtg ttacagttac ccggcctttg gtgctgttcc    4140

cctcttgggt gtattttctg ggtcttctcg gcgtgttcga atgggggttt ttggctgctg    4200

gttggctttt gctgttagtc tgttcaaacc tgtgtccgac ccagtcggcg ctgcttgtga    4260

atttgattcg ccagagtgta gaaacatcct tcattctttt gagcttctca aaccttggga    4320

ccctgttcgc ggccttgttg tgggccccgt cggtctcagt cttgccattt ttggcaggtt    4380

attgggcggg gcacgccaca tctggcactt tttgcttagg tttggcattg ttgcagattg    4440

tatcttggct ggagcttatg tgctttctca aggcaggtgt aaaaagtgct ggggatcttg    4500

tataagaact gctcctaatg aggtcgcctt taacgtgttt ccttttacac gtgcgaccag    4560

gtcgtcactt atcgacctgt gcaatcggtt ttgcgcgcca aaaggtatgg accccatttt    4620

cctcgccact gggtggcgcg ggtgctggac cggccgaagc cccattgagc aaccctctga    4680

aaaacccatc gcgtttgccc agttggatga aaaaaagatt acggctagga ctgtggtcgc    4740

ccagccctat gaccccaacc aagctgtaaa gtgcttgcgg gtattgcagg cgggcggggt    4800

gatggtggct gaggcagtcc caaaagtggt caaagtttct gctgttccat tccgagcccc    4860

cttctttccc accggagtga aagttgatcc tgaatgcagg attgtggttg accccgacac    4920

tttcactgca gccctccgat ctggctactc caccacaaac ctcgtccttg gtgtggggga    4980

ctttgcccag ctgaatggat taaaaatcag gcaaatttcc aagccttcag ggggaggtcc    5040

acacctcatg gctgccctgc atgttgcttg ctctatggct ctgcacatgc ttgttgggat    5100

ttatgtgact gctgtgggtt cttgcggcac cggcactaac gatccgtggt gcgccaaccc    5160

gtttgccgtc cctggctacg gacctggctc tctctgcacg tccagattgt gcatctccca    5220

acatggcctt accctaccct tgacagcact tgtggcggga ttcggctttc aggaaattgc    5280

cttggttatt ttgatttttg tttctatcgg aggcatggct catagattga gttgcaaggc    5340

tgatatgctg tgtattttgt ttgcaatcgc cagctatgtt tgggtacctc ttacctggtt    5400

gctttgtgtg tttccttgct ggttgcgctg tttttcgttg caccccctca ccatcctatg    5460

gttggtgttt ttcctgattt ctgtaaatat gccttcagga atcttggcct tggtgttgtt    5520

gatttctctc tggcttcttg gtcgttatac caacgttgcc ggtcttgtca ctccctatga    5580

cattcatcat tacaccagtg gcccccgcgg tgttgccgcc ttggctaccg caccagatgg    5640

gacctacttg gccgctgtcc gccgcgccgc gttgactggt cgcaccatgc tgtttacccc    5700

gtctcagctc gggtcccttc ttgagggcgc tttcagaact cgaaagccct cactgaacac    5760

cgttaatgtg gtcgggtcct ccatgggctc tggcggggtg ttcaccatcg acgggaaaat    5820

taagtgcgta actgctgcac atgtccttac gggtaattca gctagggttt ccggggttgg    5880

cttcaatcaa atgcttgact tcgatgtgaa aggagacttc gccatagccg attgcccaga    5940

ctggcaaggg gctgctccca agacccaatt ctgcgaggaa ggatggactg gccgggccta    6000

ttggctaacg tcttctggtg tcgaacccgg cgtcattgga aaaggattcg ccttctgctt    6060

caccgcgtgc ggcgattccg gatccccagt aatcaccgag gccggcgagc ttatcggcgt    6120

tcacacgggg tcaaataaac aaggaggagg catcgtcacg cgcccctcag gccagttttg    6180

tagtgtggca cccgtcaaat taagcgaact aagtgaattc tttgcagggc ctaaggtccc    6240

gctcggtgat gtgaaagttg gcagccacat aattgaagac gtaggcgagg tgccttcaga    6300

tctttgcgcc ttgcttgctg ccaaacctga actggaagga ggcctctcca ccgttcaact    6360

tctgtgtgtg tttttcctcc tgtggagaat gatgggacat gcctggacgc ccttggttgc    6420

cgtagggttt tttatcttga atgaggtcct cccagctgtc ctggtccgga gtgttttctc    6480

ctttggaatg tttgtgctat cctggctcac accatggtct gcgcaagttc tgatgatcag    6540

gcttctaaca gcagctctta acaggaatag atggtcactt gccttttaca gcctcggtgc    6600

aatgactggt tttgtcgcag atctcgcggc tactcagggg tatccgttgc aggcagtgat    6660

gagtttgagc acttatgcat tcctgcctcg gataatggtt gtgacttcac cagtcccagt    6720

ggttgcgtgt ggtgttgtgc acctacttgc catcattttg tacttgttta agtaccgctg    6780

cctgcacaac atccttgttg gcgatggagt gttctctgcg gctttcttcc tgcgatattt    6840

tgccgaggga aagttgaggg agggggtgtc gcaatcctgc gggatgaatc atgagtcact    6900

taccggtgcc ctcgctatga gactcaatga cgaggacttg gatttcctca cgaaatggac    6960

tgatttcaag tgctttgttt ctgcgtccaa catgagaaat gctgcgggcc aattcatcga    7020

ggctgcctat gctaaagcac ttagagtaga acttgcccag ttggtgcagg ttgataaggt    7080

tcggggtact ttggccaaac ttgaagcttt tgccgacacc gtggcacccc aactctcgcc    7140

cggtgacatt gttgtcgctc ttggccatac gcctgttggc agtatcttcg acctgaaggt    7200

tggtaacacc aagcacactc tccaagccat cgagaccagg gtccttgctg ggtccaaaat    7260

gaccgtggcg cgcgtcgtcg atccgacccc cacgccccca cccgcacccg tgcccatccc    7320

cctcccaccg aaggttttgg agaacggtcc aaacgcttgg ggggatgaag accgtttgaa    7380

taaaaagagg aggcgcagga tggaagccct cggcatctat gttatgggcg ggaaaaagta    7440

ccagaaattt tgggacaaga attccggtga cgtgttttat gaggaggtcc ataacaacac    7500

agatgagtgg gagtgcctca gagttggcga ccctgccgac tttgaccctg agaagggaac    7560

tttgtgtggg catgtcacca ttgaagatag ggcttaccat gtttacacct ccccatctgg    7620

taagaaattc ctagtccccg tcaacccaga gaacggaaga gttcaatggg aggctgcaaa    7680

gctttccgtt gagcaggccc ttggtatgat gaacgtcgac ggcgagctga ctgccaagga    7740

actggagaaa ctgaaaagaa taattgacaa actccagggc ctgactaagg agcagtgttt    7800

aaactgctag ccgctagcgg cttgacccgc tgtggtcgcg gcggcttggt tgttactgag    7860

acagcggtaa aaatagtcaa atttcacaac cggaccttca ccttgggacc tgtaaattta    7920

aaagtggcta gtgaggttga gctaaaagac gcggtcgagc acaaccaaca cccggttgct    7980

agaccagtcg atggtggtgt tgtgctcctg cgttccgcgg ttccctcgct tatagatgtc    8040

ctgatctccg gtgctgatgc atctcccaaa ttacttgccc atcacggacc gggcaacacc    8100

gggatcgatg gcacgctctg ggattttgag tccgaagcca ctaaagagga agtcgcactc    8160

agcgcgcaaa taatacaggc ttgtgacatt aggcgcggcg acgcacctga aattggtctc    8220

ccttacaagc tgtaccctat taggggcaac cctgagcggg taaagggagt tttacggaat    8280

acaaggtttg gagacatacc ttataaaacc cccagtgaca ctggaagccc agtgcacgcg    8340

gctgcctgcc tcacgcctaa caccactccg gtgactgacg ggcgctccgt cttggccacg    8400

accatgccct ccgggtttga gttgtatgta ccgaccatac cagcgtctgt ccttgactat    8460

cttgattcta ggcccgactg ccctaaacag ttgacggagc acggctgtga agatgccgca    8520

ctgaaagacc tctccaagta tgacttgtcc acccaaggct ttgttttgcc tggagttctt    8580

cgccttgtgc ggaagtacct gtttgcccat gtgggcaaat gcccgcccgt tcatcggcct    8640

tccacttacc ctgccaagaa ttctatggct ggaataaatg ggaacaggtt tccaaccaag    8700

gacatccaga gcgtccctga aatcgacgtt ctgtgcgcac aggctgtgcg agaaaattgg    8760

caaactgtta ccccttgtac cctcaagaaa cagtattgtg ggaagaagaa gactaggacc    8820

atactcggca ccaataactt tatagcgctg gctcaccgtg cagcgttgag tggtgtcacc    8880

cagggcttca tgaaaaaggc gtttaactcg cctatcgccc tcgggaaaaa caaatttaag    8940

gagctacaga ctccggtcct aggcaggtgc cttgaagctg atcttgcatc ctgcgatcga    9000

tctacacctg caattgtccg ctggtttgcc gccaatcttc tttatgagct tgcctgtgct    9060

gaagagcatc taccgtcgta tgtgctgaac tgctgtcacg acttactggt cacgcagtcc    9120

ggtgcagtga ctaagagagg cggcctgtcg tctggcgacc cgataacctc tgtgtctaat    9180

accatttaca gcttggtgat ctatgcacag cacatggtgc ttagttgctt caaaagtggt    9240

cacccccatg gccttctgtt cttacaagac cagctaaagt ttgaggacat gctcaaggtt    9300

caacccctaa tcgtctattc ggacgacctc gtgctgtatg ccgagtctcc caccatgcca    9360

aactaccatt ggtgggttga acatctgaat ttgatgctgg ggtttcagac ggacccaaag    9420

aaaacagcca taacagactc gccatcattt ctaggctgta gaataataaa tgggcgccag    9480

ctagtcccca accgtgacag gattctcgcg gccctcgcct accacatgaa ggcgagtaat    9540

gtttctgaat actacgcctc agcggctgca atactcatgg acagctgtgc ttgtttggag    9600

tatgatcctg aatggtttga agaacttgta gttgggatag cgcagtgcgc ccgcaaagac    9660

ggctacagct ttcccggcac gccgttcttc atgtccatgt gggaaaaact caggtccaat    9720

tatgagggga agaagtcgag agtgtgcggg tactgcgggg ccccggcccc gtacgctact    9780

gcctgtggcc tcgacgtctg catttaccac acccacttcc accagcattg tccagtcaca    9840

atctggtgtg gccatccagc gggttctggt tcttgtagtg agtgcaaatc ccctgtaggg    9900

aaaggcacaa gccctttaga cgaggtgctg gaacaagtcc cgtataagcc cccacggacc    9960

gttatcatgc atgtggagca gggacttacc ccccttgacc caggtagata ccagactcgc   10020

cgcggattag tctctgtcag gcgtggaatc aggggaaatg aagttgaact accagacggt   10080

gattatgcta gtaccgcctt gctccctacc tgtaaagaga tcaacatggt cgctgtcgct   10140

tctaatgtat tgcgcagcag gttcatcatc ggtccacccg gtgctgggaa aacatactgg   10200

ctccttcaac aggttcagga tggtgatgtt atttacacac caactcacca gaccatgctt   10260

gacatgatta gagctttggg gacgtgccgg ttcaacgttc cggcaggcac aacgctgcaa   10320

ttccccgtcc cctcccgtac cggtccgtgg gttcgcattc tagccggcgg ttggtgtcct   10380

ggcaagaatt ccttcctgga tgaagcagca tattgcaatc accttgatgt tttgaggctt   10440

cttagcaaaa ctaccctcac ctgtctagga gacttcaaac aactccaccc agtgggtttt   10500

gattctcatt gctatgtttt tgacatcatg cctcaaactc aactgaagac catctggagg   10560

tttggacaga atatctgtga tgccatccag ccagattaca gggacaaact catgtccatg   10620

gtcaacacaa cccgtgtgac ctacgtggaa aaacctatca ggtatgggca agtcctcacc   10680

ccctaccaca gagatcgaga ggacgacgcc atcactattg actccagtca aggcgccaca   10740

ttcgatgtgg ttacactgca tttgcccact aaagattcac tcaacaggca aagagccctt   10800

gttgctatca ccagggccag acatgctatc tttgtgtatg acccacacag gcagctgcag   10860

agcttgtttg atcttcctga aaaaggcaca cccgttaacc tcgcagtgca ccgcgacggg   10920

cagctgatcg tgctggatag aaataacaaa gaatgcacgg ttgctcaagc tctaggcaac   10980

ggggataaat ttagggccac agacaagcgt gttgtagatt ctctccgcgc tatttgtgct   11040

gacctagaag ggtcgagctc tccgctcccc aaggtcgcac acaacttggg attttatttc   11100

tcacctgatt taacacagtt tgccaaactc ccagcagaac ttgcacctca ctggcctgtg   11160

gtgacaaccc agaacaatga aaattggcca gatcggctgg ttgccagcct tcgtcctatc   11220

catgagtata gccgcgcgtg catcggtgcc ggctatatgg ttggcccctc ggtgtttcta   11280

ggcacccccg gggtcgtgtc atactatctc acaaaatttg ttaagggcga ggctcaagtg   11340

cttccgaaga cggtcttcag caccggccga attgaggtag attgccggga atatcttgac   11400

gatcgggagc gagaagttgc tgcgtccctc ccacatgcct tcattggcga cgtcaaaggc   11460

actaccgttg gaggatgtca tcatgtcacc tccagatacc tcccgcgctt cctccccaag   11520

gaatcagttg ctgtggtcgg ggtttcaagt cccggaaaag ccgcgaaagc attgtgcaca   11580

ctgacagatg tgtacctccc agaccttgaa gcctatctcc acccggagac ccagtccaag   11640

tgctggaaaa tgatgttgga cttcaaggaa gttcgactaa tggtctggaa agacaaaaca   11700

gcctatttcc aacttgaagg acgctatttc acctggtatc agcttgctag ctatgcctcg   11760

tacatccgtg ttcctgtcaa ctctactgtg tacttggacc cctgcatggg ccccgccctt   11820

tgcaacagga gagtcgttgg gtccactcac tggggggctg acctcgcagt caccccttat   11880

gattacggcg ctaaaattat cctgtctagc gcgtaccatg gtgaaatgcc ccccggatac   11940

aaaattctgg cgtgcgcgga attctcgttg gatgacccag tcaagtacaa acatacttgg   12000

gggtttgaat cggatacagc gtatctgtat gagttcaccg gaaacggtga ggattgggag   12060

gattacaatg atgcgtttcg tgcgcgccag gaagggaaaa tttataaggc cactgccacc   12120

agcatgaagt tttattttcc cccgggccct gtcattgaac caactttagg cctgaattga   12180

aatgaaatgg ggtccatgca aagccttttt gacaaaattg gtcaactttt tgtggatgct   12240

ttcacggaat tcttggtgtc cattgttgat atcatcatat ttttggccat tttgtttggc   12300

ttcaccgtcg ccggttggct ggtggtcttt tgcatcagat tggtttgctc cgcgatactc   12360

cgtgcacgcc ctgcctttca ctctgagcag ttacagaaga tcctatgagg cctttctttc   12420

cctgtgtcag gtggacattc ccacctgggg aatcaaacat cctctggggg tgctttggca   12480

ccataaggtg tcaaccctga ttgatgaaat ggtgtcgcgt cgaatgtacc gcatcatgga   12540

aaaagcagga caggctgcct ggaaacaggt ggtgagcgag gccacgctgt ctcgcattag   12600

tagtttggat gtggtggctc attttcaaca tcttgccgcc gttgaagccg agacctgtaa   12660

atatttggcc tctcggctac ccatgctaca caacctgcgc atgacggggt caaatgtaac   12720

catagtatat aatggtactt tgaatcaggt gtttgccatt ttcccgaccc ctggttcccg   12780

gccaaagctt catgattttc agcaatggct gatagctgtg cattcgtcca tattttcctc   12840

tgttgcagct tcttgtactc tgtttgttgt actgtggttg cgggtcccaa tgctacgtac   12900

tgtttttggt ttccgctggt taggggcaat ttttccttcg agctcttggt gaattacacg   12960

gtgtgcccac cttgcctcac ccggcaagca gccgcacagc gctacgaacc tggcaaggct   13020

ctttggtgca gaattgggta cgatcgatgt gaggaggacg atcacgacga gctagggttc   13080

gtgataccgt ctggcctctc cagcgaaggc cacttgacta gtgtttacgc ctggttggcg   13140

tttttgtcct tcagttacac ggcccagttt catcctgaga tattcgggat agggaatgtg   13200

agcaaagtct atgttgacat caaacaccaa ttcatctgcg ctgttcatga tgggcagaac   13260

accaccttgc cccgccatga caacttttca gccgtgtttc agacctatta ccagcatcaa   13320

gtcgacggcg gcaattggtt tcacctagaa tggctgcgtc ccttcttttc ctcttggttg   13380

gttttaaatg tctcgtggtt tctcaggcgt ttgcctgcaa gccatgtttc agttcgagtc   13440

tttcagacat taagaccaac accaccgcag cagcgggctt tgctgtcctc caggacatca   13500

gctgccttag gcatggcgat ccgtcctctg cggcgattcg caaaagctct cagtgccgca   13560

cggcgatagg gacacccgtg tatatcacca ttacagccaa tgtgacagat gagaattatt   13620

tacactcctc tgatctcctc atgctttctt cttgcctttt ctatgcttct gagatgagtg   13680

aaaagggatt taaggtggta tttggcaatg tgtcaggcat cgtggctgtg tgtgttaatt   13740

ttaccagcta cgtccaacat gtcagggact tcacccaacg ctccttggtg gtcgatcatg   13800

tgcggctgct ccatttcatg acacctgagg ccatgaggtg ggcaactgtt ttagcctgtc   13860

tttttgccat tctgttggca gtttgaatgt ttaagtatgt tggggaaatg cttgaccgcg   13920

ggttgctgct cgcgattgct ttctttttgg tgtatcgtgc cgttctgttt tgctgtgctc   13980

gtcaacgcca gctacagcag cagctctcat ttacagttga tttataactt gacgctatgt   14040

gagctgaatg gtacagattg gctggctaat aaatttgatt gggcagtgga gagttttgtc   14100

atctttcctg tgttgaccca catcgtttcc tatggtgcac taaccaccag ccacttcctt   14160

gacacagttg gtctggttac tgtgtctacc gccgggtttt atcatgggcg gtatgtcctg   14220

agtagcatct acgcggtctg tgccctggct gcgttaattt gcttcgtcat taggttggcg   14280

aagaactgta tgtcctggcg ctactcatgc accagataca ccaactttct tctggacact   14340

aagggcagac tctatcgttg gcggtcgcct gtcatcatag agaaaggggg taaggtagag   14400

gtcgaaggcc atctgatcga cctcaaaaga gttgtgcttg atggttccgc ggcaacccct   14460

ttaaccagag tttcagcgga acaatggggt cgtccctaga cgacttttgt catgacagca   14520

cggctccaca gaaggtgctc ttggcgtttt ctattactta cacgccagtg atgatatatg   14580

ccctaaaggt aagtcgcggc cgattgctgg ggcttctgca ccttctgatc ttcctgaatt   14640

gtgctttcac cttcgggtat atgacattcg cgcactttca gagtacaaat agggtcgcgc   14700

tcactatggg agcagtagtt gcactccttt ggggggtgta ctcagccata gaaacttgga   14760

ggttcatcac ctctagatgc cgtttgtgct tgttaggccg caggtacatt ctggcccctg   14820

cccaccacgt tgaaagtgcc gcaggctttc atccgattac ggcaaatgat aaccacgcat   14880

ttgtcgtccg gcgtcccggc tccactacgg ttaacggcac attggtgccc gggttgaaga   14940

gcctcgtgtt gggtggcaga aaagctgtaa aacggggagt ggttaacctt gttaaatatg   15000

ccaaataaca acggcaaaca gcagaagaaa aagaaggggg atggccagcc agtcaatcag   15060

ctgtgccaga tgctgggtaa gatcatcgcc cagcaaaacc agtccagagg taagggaccg   15120

ggaaagaaaa acaagaagaa aaacccggag aagccccatt ttcctctggc gactgaatat   15180

gacgtcagac accactttac ccctagtgag cggcaattgt gcctgtcgtc aatacagact   15240

gcctttaatc aaggcgctgg tacttgcacc ctgtccgatt cagggaggat aagttacact   15300

gtggagttta gtttgcccac gcatcatact gtgcgcctga ttcgcgtcac agcatcaccc   15360

tcagcatgat gggctggcat tcttgaggca tctcagtgtt tgaattggaa gaatgtgtgg   15420

tgaatggcac tgattgatat tgtgcctcta agtcacctat tcaattaggg cgaccgtgtg   15480

ggggtaagat ttaattggcg aaaaccatgc ggccgaaatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   15540

a                                                                   15541

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<223>引物

<400>2

gtggcggccg ctagttatta atagtaatc                  29

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<400>3

cgtgcatgca cctctgctta tatagacc                   28

<210>4

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(38)

<223>引物

<400>4

accgcatgca cgcgtaggta tgacgtatag gtgttggc        38

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>引物

<400>5

ctgcccaggc catcatgtcc gaagtc                     26

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<400>6

ctgatcgacc tcaaaagagt tgtgcttg                   28

<210>7

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(78)

<223>引物

<400>7

cggaccgcga ggaggtggag atgccatgcc gacccttttt tttttttttt tttttttaat    60

ttcggccgca tggttttc                                                  78

<210>8

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(69)

<223>引物

<400>8

gagtggacgt gcgtcctcct tcggatgccc aggtcggacc gcgaggaggt ggagatgcca    60

tgccgaccc                                                            69

<210>9

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(56)

<223>引物

<400>9

tgcgcatgcc tcgagcgccc tcccttagcc atccgagtgg acgtgcgtcc tccttc        56

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(27)

<223>引物

<400>10

caattaaatc ttacccccac acggtcg                                        27

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>引物

<400>11

gtgttggctc tatgccttga c                                              21

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>引物

<400>12

gagcggcagg ttggttaa                                 18

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<400>13

ctgatcgacc tcaaaagagt tgtgcttg                      28

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(27)

<223>引物

<400>14

caattaaatc ttacccccac acggtcg                       27

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>引物

<400>15

gagcatcgtt tgttcgccca g                             21

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>引物

<400>16

cgcgtgcatg cacctctgct tatata                        26

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>17

acaacggcaa acagcagaag                               20

<210>18

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(17)

<223>引物

<400>18

caggaaacag ctatgac                                   17

<210>19

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(39)

<223>引物

<400>19

gagtgacgag gactcgagcg catgcttttt ttttttttt           39

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>引物

<400>20

gagcggcagg ttggttaa                                  18

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>21

cttgcagcct ccgctgtagg ta                             22

<210>22

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>引物

<400>22

ctgcccaggc catcatgtcc gaagtc                         26

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>23

catggctaca tgctgacagc cta                            23

<210>24

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(34)

<223>引物

<400>24

cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc gatg                34

<210>25

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<400>25

ctgatcgacc tcaaaagagt tgtgcttg                       28

<210>26

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>26

taccgtcgtt ccactagtga ttt                            23

<210>27

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(17)

<223>引物

<400>27

caggaaacag ctatgac                                   17

Claims (6)

1.一种重组杆状病毒，其特征在于，该重组杆状病毒包含SEQ ID NO.1所示的猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列，该猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列置于CMV启动子下游，且该全基因组序列的3’末端添加有丁型肝炎病毒的核酶序列，所述重组杆状病毒的保藏号为：CCTCC V201005。

2.一种细胞，其特征在于，包含权利要求1所述的重组杆状病毒。

3.一种权利要求1所述重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建含有SEQ ID NO.1所示猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列的供体质粒，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列置于CMV启动子下游，且该全基因组序列的3’末端添加有丁型肝炎病毒的核酶序列；

将所述供体质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得包含猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列、以及杆状病毒全基因组序列的质粒，并将该质粒转染到sf9昆虫细胞中，以获得重组杆状病毒，该重组杆状病毒的保藏号为：CCTCC V201005。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述重组杆状病毒中，CMV启动子控制下的猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列置于杆状病毒的核多角体启动子的下游。

5.权利要求1所述的重组杆状病毒在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。

6.权利要求1所述的重组杆状病毒用于建立体外病毒培养系统的用途。

Images