CN105802919B - 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其应用 - Google Patents

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其应用 Download PDF

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CN105802919B CN201410852444.8A CN201410852444A CN105802919B CN 105802919 B CN105802919 B CN 105802919B CN 201410852444 A CN201410852444 A CN 201410852444A CN 105802919 B CN105802919 B CN 105802919B
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Beijing Biomedical Technology Center Of Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co ltd
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Beijing Kemufeng Biological Pharmaceutical Co ltd
Zhaofenghua Biotechnology Fuzhou Co ltd
Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co ltd
Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
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Fuzhou Da Bei Nong Biotech Co ltd
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Abstract

本发明涉及一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)及其应用。本发明从临床发病猪的组织病料中用Marc‑145细胞分离到一株PRRSV,该毒株的3’UTR区第14位存在1个核苷酸缺失,其序列如SEQ ID No.4所示。该分离株能在Marc‑145细胞上增殖并能致其产生典型的细胞病变,用Marc‑145测得分离株效价为106.5 TCID50/mL;该分离株属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属成员;该毒株可以此研究为基础开发相应的RT‑PCR检测/诊断方法(试剂),强毒感染模型,也可研制用于本病临床预防用疫苗等生物制品。

Description

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其应用
技术领域
本发明属于病毒领域,具体涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是造成养猪国家经济损失较为严重的猪病之一,又称“猪蓝耳病”,主要引起仔猪和育成猪呼吸道疾病以及母猪的繁殖障碍(Hopper, et al., 1992; 杨汉春等,2006)。该病的原发性病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus, RRSV),与马动脉炎病毒(Equine arteritis virus, EAV)、小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(Lactate dehydrogenase-elevating virus, LDV)和猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fever virus, SHFV)同属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属(Arterivirus)(Dea, et al., 2000; Snijder, et al., 1998)。
该病1987年首次在美国发生,1991年分离到病原(Wensvoort, et al.,1991 ;Collins, et al.,1992),此后在全球蔓延的速度非常快,造成了极其严重的经济损失。1996年我国郭宝清首次分离到PRRSV(郭宝清等,1996),证实了我国存在PRRS疾病。而在此后的一段时间内,该病在我国大部分地区的发生和流行呈上升趋势。目前,PRRS呈世界性分布,在世界各主要养猪国家如美国、英国、中国、荷兰、德国、日本等都有流行(Gate, etal., 1997)。PRRS是危害养猪业的主要疫病之一,该病传播迅猛,仅1991年在欧洲和美洲的一次大流行就造成100万头猪的死亡,被形象的称为“流产风暴”。PRRSV具有较强的传染性,能够在短期内感染猪场内所有的猪,且能够引起猪体持续性感染和免疫抑制,使猪群免疫力下降,容易继发其他细菌和病毒病的感染。自从被发现以来,PRRS已给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失。由PRRS造成的经济损失仅在美国每年就可达到5.6亿美元(Neumann,et al., 2005)。1992年世界动物卫生组织(OIE)将该病列为B类传染病。
依据遗传特性、抗原性和致病性的相似性,将PRRS病毒分为北美型(NorthAmerican type)和欧洲型(European type)(Allende, et al., 1999; Meng, 2000 ;Meulenberg, et al., 1993)。当前,PRRSV已传遍了世界主要养猪国家,我国流行的PRRSV毒株几乎都为北美型(郭宝清等,1996;杨汉春等,2001;Jiang, et al., 2000)。2006年5月,在我国江西省暴发了“猪高热病”,主要表现为高热、高发病率(50%~100%)和高死亡率(20%~100%)。该病自首次暴发后便在我国主要养猪省份迅速传播,导致超过100万头猪死亡,给我国养猪业造成了极大的经济损失。经研究证实,引起此次疫病的主要病原是变异的北美型PRRSV,称为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome virus, HP-PRRSV)(Tian, et al., 2007;Tong, et al., 2007 ; Li, et al., 2007)。由其引起的疾病被称为高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome)。
CN101423821A公开了一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株,具体公开了:从临床“高热综合征”病例分离到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株,经细胞传代和蚀斑克隆,培育得到增殖性能稳定的新毒株。本发明新毒株Nsp2序列中第483和535~563位氨基酸存在缺失,属PRRSV变异株。该毒株第40代毒种序列的第3116~3127位核苷酸发生突变,添加了12个碱基序列。但是使用该毒株对断奶仔猪进行致病性实验,发现该变异株能使30%接种仔猪死亡。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株及其应用。
本发明从临床“高热综合症”病例分离到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),经过Marc-145细胞传代和蚀斑克隆纯化,培育得到增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV NMG2014001毒株。该毒株的nsp2蛋白具有与高致病性PRRSV相同的30个氨基酸缺失,具体的,所述nsp2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的提供的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome virus, PRRSV),该毒株的3’UTR区第14位存在1个核苷酸缺失,其序列如SEQ ID No.4所示。
在本发明优选的实施方案中,所述病毒已于2014年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏号为CGMCC No.9820。
本发明还提供含有所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的灭活疫苗。PRRSVNMG2014001在marc-145细胞生长良好。用PRRSV NMG2014001毒株接种marc-145细胞,接种剂量为0.01-10 moi,接种种子病毒3-4 d后,细胞出现明显的细胞病变(CPE)。收集细胞上清液,用甲醛或β-丙内酯灭活后用于制备灭活苗。
在本发明一个实施方案中,所述灭活疫苗还含有佐剂、免疫增强剂和/或防腐剂。其中,所述灭活疫苗的抗原含量优选为104~108 TCID50
本发明还提供含有所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的攻毒制剂,用于评估猪繁殖与呼吸综合征的疫苗效力。
其中,所述病毒的含量为102~107 TCID50
本发明还提供一种评估猪繁殖与呼吸综合征疫苗效力的方法,使用PRRSVNMG2014001毒株,经滴鼻或口服、肌肉注射途径感染猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫过的猪,然后观察疫苗免疫猪或未免疫猪的发病情况、临床症状、大体解剖、显微病理、死亡等情况,进而评判疫苗免疫效力。
本发明还提供所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的疾病中的应用。
本发明提供含有所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的攻毒制剂,仔猪接种该制剂后第2天体温开始明显升高,最高可达到40℃以上,并出现高致病性猪繁殖与呼吸综合征的临床症状,伴随厌食与精神沉郁,后期感染仔猪全部死亡。攻毒后1天感染仔猪血清中就可检测到明显的病毒血症,攻毒后7天血清中也有明显病毒血症。血清抗体在攻毒后第7天转阳。病死猪肺部组织可检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒。
附图说明
图1为 PRRSV NMG2014001分离株在MARC-145细胞产生的细胞病变(CPE)。A,MARC-145细胞接种PRRSV NMG2014001毒株72 h产生的CPE;B, 未接种病毒的对照MARC-145细胞。
图2为图2 PRRSV NMG2014001分离株的PCR鉴定。1, 临床肺脏样品的研磨液;2,PRRSV NMG2014001分离毒株第4代病毒;3, PCR水对照;4, PCR阳性对照;5, DL2000 plusDNA marker。
图3为 PRRSV NMG2014001毒株攻毒后仔猪体温反应。
图4为 PRRSV NMG2014001毒株攻毒后仔猪存活曲线。
图5 为PRRSV NMG2014001毒株攻毒后血清抗体产生情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1 PRRS病毒的分离鉴定
一、猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离
内蒙古猪场送检的“高热综合症”猪肺脏样品,研磨后,用RT-PCR方法进行检测,结果为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性。
取适量送检肺脏研磨,研磨液为PBS,按照1:5的比例(重量:体积)加入。研磨物反复冻融3次,12000 r/min低温离心10 min,取上清,0.22 μm滤膜过滤。
按常规方法接种长满的Marc-145细胞(接种前用pH7.4 的PBS洗三次),按照10%的比例接种病毒,37℃吸附30分钟,补足细胞维持液,37℃温箱培养。每天观察是否产生CPE。同时设置空白细胞作为对照。
培养3天后细胞出现明显、稳定的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)变化,特征性病变表现为细胞变圆,聚集,固缩,最终从培养瓶上脱落等(图1)。
二、分离病毒进行RT-PCR及序列测序鉴定
按照北京全式金生物技术有限公司病毒RNA提取试剂盒的操作说明书提取第4代细胞毒RNA。参考GenBank发表的PRRSV的序列(EF635006),采用Primer Premier 5软件设计引物。扩增PRRSV相对保守的N基因。检测引物序列为:
PR-F:5’ CAGATGCCGTTTGTGCTTGCT 3’;
PR-R:5’ GGCACAGCTGATTGACTGGCT 3’;
临床样品和第4代分离病毒液均可扩增出294 bp的特异性片段(图2),扩增片段经测序分析为PRRSV N基因,序列如SEQ ID No.2所示。
三、分离病毒含量测定
将PRRSV NMG2014001毒株第4代病毒用DMEM维持液进行10倍比系列稀释,取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、及10-8,共6个稀释度分别接种长满Marc-145单层细胞的96孔细胞板,每个稀释度接种10孔,100μl/孔,同时设10孔阴性对照细胞,37℃ 5% CO2培养箱培养72~120小时,观察细胞病变。细胞出现聚集,固缩等现象判为感染。同时阴性对照组细胞孔应不出现细胞病变。采用Reed-Muench法,计算TCID50。经测定,PRRSV NMG2014001毒株第4代病毒的含量为106.5 TCID50/ml。
实施例2 nsp2基因扩增比对方法及结果
按照北京全式金生物技术有限公司病毒RNA提取试剂盒的操作说明书提取第4代细胞毒RNA。参考GenBank发表的PRRSV的序列(EF635006),采用Primer Premier 5软件设计引物,分4段扩增分离毒株的nsp2基因,同时设计了3’ UTR区域的测序引物。扩增引物序列如下:
nsp2基因扩增引物序列(5’→3’):
PR-2F GCCACGTGCATTCCCCA;
PR-2R ACCGCCCTTATGCTCACAAC;
PR-3F CTGGAGGGTGAGCATTGGAC;
PR-3R GAGCTGCTTGATGACACAGGTG;
PR-4F GGCGGGGGGGCAAGAA;
PR-4R GAACACGTTGAAGGCGATCTC;
PR-5F TATGTGCTTTCTCAAGGTAGGTGTAA;
PR-5R CACTCCGCCAGAGCCCA。
3’ UTR测序引物序列(5’→3’):
PR-6F CCCAACAAAACCAGTCCAGA;
PR-6R CACGCTGTCGdT(25)。
4对nsp2引物扩增产物均1.4 kb左右,并重叠覆盖了全部nsp2基因。3’ UTR测序引物扩增产物约450 bp。PCR扩增产物经回收后进行序列测定。Nsp2的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所述,3’ UTR的核苷酸序列如SEQ ID No.4所述。
将上述序列与北美型代表毒株VR-2332及其他高致病性毒株使用Lasergene软件MegAlign程序中的Clustal W方法进行序列比对。结果发现,NMG2014001毒株nsp2蛋白具有与高致病性PRRSV完全相同的30氨基酸(aa)缺失。此外,NMG2014001毒株除了polyA尾巴,3’UTR区域长度为149 nt,与VR-2332毒株相比,在第14位缺失1个核苷酸T。
实施例3 PRRSV NMG2014001毒株的动物致病性试验
一、PRRSV NMG2014001毒株的动物致病性试验
筛选PRRSV抗原、抗体双阴性的4周龄仔猪6头,随机分为2组,一组每头颈后肌肉注射1 ml共105 TCID50病毒液,另外一组仔猪在相同部位注射1 ml 2% MDEM培养液作为对照。
实验猪攻毒后每天检查临床症状,监测直肠体温。体温监测结果表明,攻毒前后,对照组仔猪体温一直在正常范围内波动;仔猪接种PRRSV NMG2014001毒株后第2天体温开始明显升高,3只仔猪体温均升高到40℃以上,最高40.7℃,之后7天体温一直维持高烧状态(见图3)。临床症状观察表明,仔猪接种NMG2014001毒株后,伴随体温升高,仔猪出现皮肤发红,厌食与精神沉郁,后期食欲废绝,攻毒13天,2头仔猪死亡,第14天剩余1头仔猪死亡。攻毒后仔猪存活曲线见图4。可知,PRRSV NMG2014001毒株为高致病性毒株,仔猪在感染该毒株后在2周内全部死亡;对照组仔猪全部正常生长。
攻毒前及攻毒后1、7、14、21天采集前腔静脉血,分离血清。血清样品检测PRRSV N蛋白抗体(ELISA试剂盒S/P值)及病毒血症(RT-PCR)。检测结果表明,对照组仔猪攻毒前及攻毒后血清抗体一直为阴性,病毒血症检测也为阴性。NMG2014001毒株攻毒组仔猪攻毒前血清抗体、抗原均为阴性,攻毒后第1天血清抗体阴性,第7天转阳(图5)。实验猪病毒血症的核酸检测结果见表1。病毒血症检测结果显示,攻毒后1天感染组血清中就可检测到明显的病毒血症,攻毒后7天血清中也有明显病毒血症。攻毒猪死亡后采集肺脏组织,用RT-PCR方法检测PRRSV核酸,结果显示阳性,而对照组仔猪为阴性。
表1 仔猪攻毒前后病毒血症动态
攻毒后天数(d) 0 1 7 14 21
NMG2014001 0/3 3/3 3/3 死亡 死亡
对照组 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3
NMG2014001毒株攻毒后,2头仔猪于13天死亡,1头于14天死亡。死亡后剖检,肺部有明显水肿、出血,淋巴结、肾脏也有明显水肿、出血。NMG2014001毒株的动物攻毒实验结果表明,PRRSV NMG2014001毒株是高致病性毒株,仔猪感染该毒株以后全部发病死亡。以上数据表明,PRRSV NMG2014001毒株可以用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征的强毒攻毒模型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110> 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心
福州大北农生物技术有限公司
北京大北农动物保健科技有限责任公司
北京大北农科技集团股份有限公司
<120> 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1166
<212> PRT
<213> PRRSV nsp2
<400> 1
Gly Ala Gly Lys Arg Ala Arg Lys Thr Arg Ser Gly Ala Thr Thr Met
1 5 10 15
Val Ala Arg His Ala Ser Ser Ala His Glu Thr Arg Gln Ala Thr Lys
20 25 30
His Glu Gly Ala Gly Ala Asn Lys Ala Glu His Leu Lys Arg Tyr Ser
35 40 45
Pro Pro Ala Glu Gly Asn Cys Gly Trp His Cys Ile Ser Ala Ile Val
50 55 60
Asn Gln Met Val Asn Ser Asn Phe Glu Thr Thr Leu Pro Glu Arg Val
65 70 75 80
Arg Pro Ser Asp Asp Trp Ala Thr Asp Glu Asp Leu Val Asn Thr Ile
85 90 95
Gln Ile Leu Arg Leu Pro Ala Ala Leu Asp Arg Asn Gly Ala Cys Gly
100 105 110
Ser Ala Lys Tyr Val Leu Lys Leu Glu Gly Glu His Trp Thr Val Ser
115 120 125
Val Ile Pro Gly Met Ser Pro Thr Leu Leu Pro Leu Glu Cys Val Gln
130 135 140
Gly Cys Cys Glu His Lys Gly Gly Leu Val Ser Pro Asp Ala Thr Glu
145 150 155 160
Ile Ser Gly Phe Asp Pro Ala Cys Leu Asp Arg Leu Ala Lys Val Met
165 170 175
His Leu Pro Ser Ser Ala Ile Pro Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ser Asp
180 185 190
Asp Ser Tyr Arg Pro Val Ser Pro Ala Ala Thr Thr Trp Thr Val Ser
195 200 205
Gln Phe Tyr Ala Arg His Arg Gly Gly Asp His His Asp Gln Val Cys
210 215 220
Leu Gly Lys Ile Ile Ser Leu Cys Gln Val Ile Glu Asp Cys Cys Cys
225 230 235 240
His Gln Asn Lys Thr Asn Arg Ala Thr Pro Glu Glu Val Ala Ala Lys
245 250 255
Ile Asp Gln Tyr Leu Arg Gly Ala Thr Ser Leu Glu Glu Cys Leu Ala
260 265 270
Lys Leu Glu Arg Val Ser Pro Pro Ser Ala Ala Asp Thr Ser Phe Asp
275 280 285
Trp Asn Val Val Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Asn Gln Thr Thr Glu
290 295 300
Gln Pro His Val Asn Ser Cys Cys Thr Leu Val Pro Pro Val Thr Gln
305 310 315 320
Glu Pro Leu Gly Arg Asp Ser Val Pro Leu Thr Ala Phe Ser Leu Ser
325 330 335
Asn Cys Tyr Tyr Pro Ala Gln Gly Asp Glu Val His His Arg Glu Arg
340 345 350
Leu Asn Ser Val Leu Ser Lys Leu Glu Glu Val Val Leu Glu Glu Tyr
355 360 365
Gly Leu Met Ser Thr Gly Leu Gly Pro Arg Pro Val Leu Pro Ser Gly
370 375 380
Leu Asp Glu Leu Lys Asp Gln Met Glu Glu Asp Leu Leu Lys Leu Ala
385 390 395 400
Asp Thr Gln Ala Thr Ser Gly Met Met Ala Trp Ala Ala Glu Gln Val
405 410 415
Asp Leu Lys Ala Trp Val Lys Ser Tyr Pro Arg Trp Thr Pro Pro Pro
420 425 430
Pro Pro Pro Lys Val Gln Pro Arg Arg Thr Lys Ser Val Lys Ser Leu
435 440 445
Pro Glu Gly Lys Pro Val Pro Ala Pro Arg Arg Lys Ala Gly Ser Asp
450 455 460
Cys Gly Ser Pro Val Leu Met Gly Asp Asn Val Leu Asn Gly Ser Glu
465 470 475 480
Glu Thr Val Gly Gly Pro Leu Ile Phe Pro Thr Pro Ser Glu Pro Met
485 490 495
Thr Pro Val Ser Glu Pro Val Leu Met Pro Ala Ser Arg Arg Ala Pro
500 505 510
Lys Leu Met Thr Pro Leu Ser Gly Ser Ala Pro Val Pro Ala Pro Arg
515 520 525
Arg Thr Val Thr Thr Thr Leu Ala His Gln Asp Glu Pro Leu Asp Leu
530 535 540
Ser Ala Ser Ser Gln Thr Glu Tyr Glu Ile Pro Leu Leu Ala Pro Pro
545 550 555 560
Gln Asn Met Asp Thr Leu Glu Ala Gly Gly Gln Glu Ala Glu Glu Val
565 570 575
Leu Ser Glu Ile Ser Asp Leu Leu Asn Asp Thr Asn Pro Ala Pro Val
580 585 590
Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Val Lys Ile Thr Arg Pro Lys Tyr
595 600 605
Ser Ala Gln Ala Ile Ile Asp Ser Gly Gly Pro Cys Ser Gly His Leu
610 615 620
Gln Lys Glu Lys Glu Ala Cys Leu Ser Ile Met Arg Glu Ala Cys Glu
625 630 635 640
Ala Ser Lys Leu Gly Asp Pro Ala Thr Gln Glu Trp Leu Ser Arg Met
645 650 655
Trp Asp Arg Val Asp Met Leu Thr Trp Arg Asn Thr Ser Ala Tyr Gln
660 665 670
Ala Phe Arg Ile Leu Asn Gly Arg Ser Gly Phe Leu Pro Lys Met Ile
675 680 685
Leu Glu Thr Pro Pro Pro His Pro Cys Gly Phe Val Met Leu Pro Arg
690 695 700
Thr Pro Ala Pro Ser Val Ser Thr Glu Ser Asp Leu Thr Ile Gly Ser
705 710 715 720
Val Ala Thr Glu Asp Val Pro Cys Ile Leu Gly Lys Ile Gly Asp Thr
725 730 735
Asp Glu Leu Leu Asp Arg Gly Pro Ser Ala Leu Pro Lys Gly Glu Pro
740 745 750
Ala Cys Gly Gln Ser Ala Asn Asp Pro Arg Met Ser Pro Arg Glu Ser
755 760 765
Asp Gly Ser Met Ile Ala Pro Pro Ala Asp Thr Gly Gly Val Gly Leu
770 775 780
Leu Ala Asp Leu Pro Pro Ser Asp Gly Val Asp Val Asp Gly Gly Gly
785 790 795 800
Pro Leu Arg Thr Val Lys Ala Lys Ala Gly Arg Leu Leu Asp Gln Leu
805 810 815
Ser Cys Gln Val Phe Ser Leu Val Ser His Leu Pro Ile Phe Phe Ser
820 825 830
His Leu Phe Lys Ser Asp Ser Gly Tyr Ser Pro Gly Asp Trp Gly Phe
835 840 845
Ala Ala Phe Thr Leu Phe Cys Leu Phe Leu Cys Tyr Ser Tyr Pro Phe
850 855 860
Phe Gly Phe Ala Pro Leu Leu Gly Val Phe Ser Gly Ser Ser Arg Arg
865 870 875 880
Val Arg Met Gly Val Phe Gly Cys Trp Leu Ala Phe Ala Val Gly Leu
885 890 895
Phe Lys Pro Val Ser Asp Pro Val Gly Thr Ala Cys Glu Phe Asp Ser
900 905 910
Pro Glu Cys Arg Asn Val Leu His Ser Phe Glu Leu Leu Glu Pro Trp
915 920 925
Asp Pro Val Arg Ser Leu Val Val Gly Pro Ile Gly Leu Gly Leu Ala
930 935 940
Ile Leu Gly Arg Leu Leu Gly Gly Ala Arg Tyr Ile Trp His Phe Leu
945 950 955 960
Leu Arg Leu Gly Ile Val Gly Asp Cys Val Leu Ala Gly Ala Tyr Val
965 970 975
Leu Ser Gln Gly Arg Cys Lys Lys Cys Trp Gly Ser Cys Val Arg Thr
980 985 990
Ala Pro Ser Glu Ile Ala Phe Asn Val Phe Pro Phe Thr Arg Ala Thr
995 1000 1005
Arg Ser Ser Leu Val Asp Leu Cys Asp Arg Phe Cys Thr Pro Lys
1010 1015 1020
Gly Met Asp Pro Ile Phe Leu Ala Thr Gly Trp Arg Gly Cys Trp
1025 1030 1035
Thr Gly Arg Ser Pro Ile Glu Gln Pro Ser Glu Lys Pro Ile Ala
1040 1045 1050
Phe Ala Gln Leu Asp Glu Lys Lys Ile Thr Ala Arg Thr Val Val
1055 1060 1065
Ala Gln Pro Tyr Asp Pro Asn Gln Ala Val Lys Cys Leu Arg Val
1070 1075 1080
Leu Gln Ala Gly Gly Ala Met Val Ala Glu Ala Val Pro Lys Val
1085 1090 1095
Val Lys Val Ser Ala Ile Pro Phe Arg Ala Pro Phe Phe Pro Ala
1100 1105 1110
Gly Val Lys Val Asp Pro Glu Cys Arg Ile Val Val Asp Pro Asp
1115 1120 1125
Thr Phe Thr Thr Ala Leu Arg Ser Gly Tyr Ser Thr Ala Asn Leu
1130 1135 1140
Val Leu Gly Thr Gly Asp Phe Ala Gln Leu Asn Gly Leu Lys Ile
1145 1150 1155
Arg Gln Ile Thr Lys Pro Ser Gly
1160 1165
<210> 2
<211> 294
<212> DNA
<213> PRRSV N
<400> 2
cagatgccgt ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgtcga 60
aagtgccgcg ggctttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg 120
tcccggctcc actacggtca acggcacatt ggtgcccggg ttgaaaagcc tcgtgttggg 180
tggcagaaaa gctgttaagc agggagtggt aaaccttgtt aaatatgcca aataacaacg 240
gcaagcagca aagaaaaaag aaggggaatg gccagccagt caatcagctg tgcc 294
<210> 3
<211> 3498
<212> DNA
<213> PRRSV nsp2
<400> 3
ggtgccggaa agagagcaag gaaaacacgc tctggtgcga ctactatggt cgctcgtcac 60
gcttcgtccg ctcatgaaac ccggcaggcc acgaagcacg agggtgccgg cgctaacaag 120
gctgagcatc tcaagcgcta ctctccgcct gccgaaggga actgtggttg gcactgcatt 180
tccgccatcg tcaaccagat ggtgaattcc aactttgaga ccacccttcc tgaaagagta 240
aggccttcag atgactgggc cactgacgag gatcttgtga acaccatcca aatcctcagg 300
ctccctgcgg ccttggacag gaacggcgct tgcggtagcg ccaagtacgt gcttaaactg 360
gagggtgagc attggactgt ctctgtgatc cctgggatgt cccctacttt gctccccctt 420
gaatgtgttc agggttgttg tgagcataag ggcggtcttg tttccccgga tgcgaccgaa 480
atttccggat ttgatcctgc ctgccttgac cgactggcta aggtaatgca cttgcctagc 540
agtgccatcc cagccgctct ggccgaattg tccgacgact cctaccgtcc ggtttccccg 600
gccgctacta cgtggaccgt ttcgcaattc tatgctcgtc atagaggagg agatcatcat 660
gaccaggtgt gcttggggaa aatcatcagc ctttgtcaag ttattgagga ttgctgctgc 720
catcagaata aaactaaccg ggccactcca gaagaggtcg cggcaaagat tgatcagtac 780
ctccgtggcg caacaagtct tgaggaatgc ttggccaaac ttgagagagt ttccccgccg 840
agcgctgcgg acacctcctt tgattggaat gttgtgcttc ctggggttga ggcggcgaat 900
cagacaaccg aacaacctca cgtcaactca tgctgcaccc tggtccctcc cgtgacccaa 960
gagcctttgg gcagggactc ggtccctctg accgccttct cactgtccaa ttgctattac 1020
cctgcacaag gtgacgaggt tcatcaccgt gagaggttaa attccgtact ctctaagttg 1080
gaagaggttg tcctggaaga atatgggctc atgtccactg gacttggccc gcgacccgtg 1140
ctgccgagcg gactcgacga gcttaaagac cagatggagg aggacctgct aaaactagcc 1200
gacacccagg cgacctcagg aatgatggcc tgggcggctg agcaggtcga tttaaaagct 1260
tgggtcaaaa gctacccgcg gtggacacca ccaccccctc caccaaaagt tcaacctcga 1320
agaacaaagt ctgtcaaaag cttgccagag ggcaagcctg tccctgctcc gcgcaggaag 1380
gccggatccg attgcggcag cccagttttg atgggcgaca atgtccttaa cggttcggaa 1440
gaaactgtcg gtggtcccct catttttccg acaccatctg agccgatgac acctgtgagt 1500
gagcccgtgc ttatgcccgc gtcgcgacgt gcccccaagc tgatgacacc tttgagtggg 1560
tcggcaccag ttcctgcacc gcgcagaact gtgacaacaa cgctggcgca ccaggatgag 1620
cctctggatt tgtctgcatc ttcacagacg gaatatgaga ttcccctcct ggcaccgcca 1680
cagaacatgg acaccctgga ggcggggggg caagaagctg aggaagttct gagtgaaatc 1740
tcggacttgc taaatgacac caaccctgca cctgtgtcat caagcagctc tctgtcaagt 1800
gttaagatta cacgcccaaa atactcagct caagccatca tcgactctgg cgggccttgc 1860
agtgggcatc tccaaaagga aaaagaagca tgtctcagca tcatgcgtga agcgtgtgag 1920
gcatccaagc ttggcgatcc tgctacgcag gagtggctct ctcgcatgtg ggatagggtt 1980
gacatgctga cttggcgcaa cacgtctgct taccaggcgt ttcgcatctt aaacggcagg 2040
tctgggtttc tcccaaagat gatcctcgag acaccgccgc ctcacccgtg cgggtttgtg 2100
atgttacctc gcacgcctgc accttccgtg agtacagaga gtgacctcac cattggttcg 2160
gtggccaccg aggatgttcc atgcattctc gggaaaatag gagacactga cgaactgctt 2220
gaccggggtc cctcggcact ccccaagggg gaaccggcct gtggccaatc agccaatgat 2280
ccccggatgt cgccgcgaga gtctgacggg agcatgatag ctccgcccgc agatacaggt 2340
ggtgtcggct tactcgctga tctgccgcct tcagatggtg tggatgtgga cggggggggg 2400
ccgttaagaa cggtgaaagc aaaagcaggg aggctcctgg accaactgag ctgccaggtt 2460
tttagcctcg tctcccatct ccctattttc ttctcacacc tctttaaatc tgacagtggt 2520
tactctccgg gtgattgggg ttttgcagct tttactctat tttgcctctt tctatgttac 2580
agttacccat tcttcggttt tgctcccctc ttgggtgtat tttctgggtc ttctcggcgt 2640
gtgcgaatgg gggtttttgg ctgctggttg gcttttgctg ttggtctgtt caagcctgtg 2700
tccgacccag tcggcactgc ttgtgagttt gactcgccgg agtgtaggaa tgtccttcat 2760
tcttttgagc ttctcgaacc ttgggaccct gtccgcagcc ttgttgtggg ccccatcggt 2820
ctcggccttg ccattcttgg caggttactg ggcggggcac gctacatctg gcactttttg 2880
cttaggcttg gcattgttgg agactgtgtc ttggctggag cttatgtgct ttctcaaggt 2940
aggtgtaaaa agtgctgggg atcttgtgta agaactgctc ctagtgagat cgctttcaac 3000
gtgttccctt ttacacgtgc gaccaggtcg tcactcgtcg acctgtgcga tcggttttgc 3060
acaccaaaag gcatggaccc catttttctc gccactgggt ggcgtgggtg ctggaccggc 3120
cggagcccca ttgagcaacc ttctgaaaaa cccatcgcgt tcgctcagct ggatgagaag 3180
aagattacgg ccagaaccgt ggtcgctcag ccttatgatc ccaaccaggc cgtaaagtgc 3240
ttgcgggtat tgcaggcggg tggggcgatg gtggccgagg cggtcccaaa agtggtcaaa 3300
gtttctgcta ttccattccg agctcctttt tttcccgctg gagtgaaagt tgatcctgag 3360
tgcagaatcg tggttgatcc cgatactttt actacagccc tccggtctgg ctattccacc 3420
gcgaacctcg tccttggtac gggggacttt gcccagctga atggactaaa gatcaggcaa 3480
attaccaagc cttcaggg 3498
<210> 4
<211> 149
<212> DNA
<213> PRRSV nsp2的3'UTR
<400> 4
tgggctggca ttcttggtac cccagtgtta gaatcgggag aatgtgtggt gaatggcact 60
gattgacact gtgcctctaa gtcacctatt caattagggc gaccgtgtgg gggtgaagtt 120
taattggcga gaaccatgcg gccgtaatt 149
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagatgccgt ttgtgcttgc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggcacagctg attgactggc t 21
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gccacgtgca ttcccca 17
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
accgccctta tgctcacaac 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctggagggtg agcattggac 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gagctgcttg atgacacagg tg 22
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggcggggggg caagaa 16
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaacacgttg aaggcgatct c 21
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tatgtgcttt ctcaaggtag gtgtaa 26
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cactccgcca gagccca 17
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cccaacaaaa ccagtccaga 20
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cacgctgtcg tttttttttt tttttttttt ttttt 35

Claims (9)

1.一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndromevirus,PRRSV),其特征在于,该毒株的3’UTR区第14位存在1个核苷酸缺失,其序列如SEQ ID No.4所示。
2.如权利要求1所述的病毒,其特征在于,保藏号为CGMCC No.9820。
3.含有权利要求1或2所述病毒的灭活疫苗。
4.如权利要求3所述的灭活疫苗,其特征在于,还含有佐剂、免疫增强剂和/或防腐剂。
5.如权利要求3或4所述的灭活疫苗,其特征在于,抗原含量为104~108 TCID50
6.一种用于评估猪繁殖与呼吸综合征的疫苗效力的攻毒制剂,其特征在于,含有权利要求1或2所述病毒。
7.如权利要求6所述的攻毒制剂,其特征在于,所述病毒的含量为102~107 TCID50
8.一种非疾病诊断与治疗目的的评估猪繁殖与呼吸综合征疫苗效力的方法,其特征在于,使用如权利要求6或7所述的攻毒制剂,经滴鼻或口服、肌肉注射途径感染猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫过的猪,进而评判疫苗免疫效力。
9.权利要求1所述的病毒在制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
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