CN106282407A - 一种b亚群禽肺病毒疫苗的效检方法 - Google Patents

一种b亚群禽肺病毒疫苗的效检方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种B亚群禽肺病毒疫苗的效检方法，所使用的引物组，其序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；本发明提供了一套基于分子方法的B亚群禽肺病毒快速诊断体系，能灵敏、特异、快速、稳定、简便地检测B亚群禽肺病毒。由于采用了内参基因，从而校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。能有效地能有效地区分出病毒含量的高低的方法，从而来检测禽肺病毒疫苗的效价。

Description

一种B亚群禽肺病毒疫苗的效检方法
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉一种B亚群禽肺病毒疫苗的效检方法。
背景技术
禽肺病毒(Avian pneumovirus，APV)又称火鸡鼻气管炎病毒(turkeyRhinotracheitis viru，TRTV)，属于单链负股RNA病毒。肺病毒引起的疾病最早在火鸡上发现，引起火鸡的呼吸道疾病并导致产蛋量下降。APV基因组包含了8个主要的结构蛋白基因，N-P-M-F-M2-SH-G-L。根据其G蛋白差异和血清学分析，APV分为A亚型(英国)和B亚型(欧洲大陆)，A亚型和B亚型相似，但是G蛋白只有38％的相似率，这两个亚型在欧洲广泛流行。我国主要流行的为B亚型禽肺病毒。目前主要用普通的RT-PCR进行检测，但普通的RT-PCR方法虽然可以定性检测禽肺病毒核酸的有无，但是不能显示出病毒量的变化。因此，有必要提供一种能区分出病毒含量的高低的方法，从而来检测禽肺病毒疫苗的效价。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种B亚群禽肺病毒疫苗的效检方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种用于B亚群禽肺病毒疫苗效检的引物组，其序列信息如下：
G-S:CCGGGACAAGTATCTCTATGG(SEQ ID NO:1)、
G-AS:TGTTGACTGTCCTGGATGTAAG(SEQ ID NO:2)、
作为检测内参基因β-actin的特异性引物，其引物信息如下：
Actin-s：ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC(SEQ ID NO:3)、
Actin-as：GTGGTGCCAGATCTTCTCCA(SEQ ID NO:4)；
本发明另一个方面提供一种用于检测B亚群禽肺病毒疫苗效检的试剂盒，包含有上述的引物组
本发明的再一个方面是提供一种B亚群禽肺病毒疫苗的效检方法，具体如下：
1)免疫及攻毒：
将禽肺病毒疫苗免疫21日龄的SPF鸡，滴鼻点眼攻击禽肺病毒；攻毒5日后，分离组织样品；
2)RNA的提取：
称取免疫攻毒组、对照组组织提取RNA；
3)荧光定量RT-PCR：
用上述的引物进行荧光定量RT-PCR，对目的基因进行相对定量，从而对疫苗的效果进行评价。
本发明提供了一套基于分子方法的B亚群禽肺病毒快速诊断体系，能灵敏、特异、快速、稳定、简便地检测B亚群禽肺病毒。由于采用了内参基因，从而校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。能有效地能有效地区分出病毒含量的高低的方法，从而来检测禽肺病毒疫苗的效价。
附图说明
图1：样品G基因和actin基因的溶解曲线图；
图2：荧光定量RT-PCR的灵敏性试验图；其中A1～A9为免疫组，D1～D5为对照组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1引物的设计
1、G蛋白引物的设计
本发明根据GenBank中禽肺病毒(APV)A、B、C亚群序列以及本实验室分离的一株B亚型病毒基因序列，进行同源性分析后设计几对针对B亚型的特异性引物，引物的序列信息如下：
G1-S:CCGGGACAAGTATCTCTATGG
G1-AS:TGTTGACTGTCCTGGATGTAAG
G2-S:GGGACAAGTATCCAGATGGGG
G2-AS:GCATAACTGCGATCATGCATATC
G3-S:GGCGGAAAATGGATCCTTACATC
G3-AS:GGAGTTCCTCTGGGCAGTGGT
并设计了两对针对内参基因β-actin的特异性引物，建立了一种快速检测不同组织中APV B亚群病毒载量的检测方法。
Actin1-s：ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC
Actin1-as：GTGGTGCCAGATCTTCTCCA
Actin2-s：TATTGCTGCGCTCGTTGTTGA
Actin2-as：GGGCTACTCTCAGCTCATTGTA
1.1材料与方法
1.1病料APV病料由青岛易邦生物工程提供。
1.2仪器与试剂ABI 7500荧光定量PCR仪，北京天恩泽动物柱式RNA提取试剂盒，宝生物PrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ，引物由上海生物工程有限公司合成。
1.3RNA的提取称取不同的病料各0.1～0.2g组织放入MagNA Lyser Green Beads的离心管中，加10倍体积的生理盐水，置冰上。将离心管放入中通量组织研磨器，以6000r/min捣碎45秒,迅速放入冰盒中冷却10分钟，再重复2次。按照北京天恩泽动物柱式RNA提取试剂盒提取RNA。
1.4反应体系的配置
2×Buffer 10μL
引物-S 1μL
引物-AS 1μL
ROX 0.4μL
Enzyme-mix 0.8μL
水 4.8μL
模板 2μL
总体积 20μL
1.5反应条件42℃反转录5分钟；95℃预变性10秒；95℃变性5秒；60℃退火延伸35秒，共40个循环。在每一循环的延伸结束时采集荧光信号进行荧光定量PCR检测。
2结果用3对B型G蛋白引物和2对β-actin的特异性引物分别对APV病料进行荧光定量RT-PCR，结果显示G蛋白的引物(G1-S和G1-AS)和β-actin(Actin1-s和Actin1-as)特异性最好。
本发明还提供一种禽肺病毒B亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒，能特异性扩增禽肺病毒B亚群G基因的异性引物和维持细胞基本活动的管家基因β-actin，然后以管家基因的定量结果为依据对目的基因进行比值校正，求得相对比值即为相对表达量。
实施例2：引物组的效果检测
用荧光定量RT-PCR对IBV、IBDV、NDV、AIVH9、APV病料进行检测。
1.引物特异性试验
1.1材料与方法
1.1.1病料IBV、IBDV、NDV、AIVH9、APV病料由青岛易邦生物工程提供。
1.1.2仪器与试剂ABI 7500荧光定量PCR仪，北京天恩泽动物柱式RNA提取试剂盒，宝生物PrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ，引物由上海生物工程有限公司合成。
1.1.3RNA的提取称取不同的病料各0.1～0.2g组织放入MagNA Lyser GreenBeads的离心管中，加10倍体积的生理盐水，置冰上。将离心管放入中通量组织研磨器，以6000r/min捣碎45秒,迅速放入冰盒中冷却10分钟，再重复2次。按照北京天恩泽动物柱式RNA提取试剂盒提取RNA。
1.1.4反应体系的配置
2×Buffer 10μL
引物-S 1μL
引物-AS 1μL
ROX 0.4μL
Enzyme-mix 0.8μL
水 4.8μL
模板 2μL
总体积 20μL
1.1.5反应条件42℃反转录5分钟；95℃预变性10秒；95℃变性5秒；60℃退火延伸35秒，共40个循环。在每一循环的延伸结束时采集荧光信号进行荧光定量PCR检测。
1.2结果用引物G1-S、G1-AS和Actin1-s、Actin1-as对IBV、IBDV、NDV、AIVH9、APV病料进行荧光定量RT-PCR检测，结果IBV、IBDV、NDV、AIVH9样品G蛋白检测均为阴性，而APV病料有特异性很好的扩增曲线。
2.引物的灵敏性
2.1材料与方法
2.1.1病料APV病料由青岛易邦生物工程提供。
2.1.2仪器与试剂ABI 7500荧光定量PCR仪，北京天恩泽动物柱式RNA提取试剂盒，宝生物PrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ，引物由上海生物工程有限公司合成。
2.1.3RNA的提取称取不同的病料各0.1～0.2g组织放入MagNA Lyser GreenBeads的离心管中，加10倍体积的生理盐水，置冰上。将离心管放入中通量组织研磨器，以6000r/min捣碎45秒,迅速放入冰盒中冷却10分钟，再重复2次。按照北京天恩泽动物柱式RNA提取试剂盒提取RNA。
2.1.4反应体系的配置
2×Buffer 10μL
引物-S 1μL
引物-AS 1μL
ROX 0.4μL
Enzyme-mix 0.8μL
水 4.8μL
模板 2μL
总体积 20μL
2.1.5反应条件42℃反转录5分钟；95℃预变性10秒；95℃变性5秒；60℃退火延伸35秒，共40个循环。在每一循环的延伸结束时采集荧光信号进行荧光定量PCR检测。
2.2结果将APV的RNA进行10倍系列稀释，用引物G1-S、G1-AS和Actin1-s、Actin1-as对10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的APV-RNA进行荧光定量RT-PCR检测，结果显示该引物能很好地检测到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的APV-RNA。该结果说明引物灵敏性好。
实施例3：B亚群禽肺病毒疫苗的效检
1、材料与方法
1.1毒株禽肺病毒B亚群SHS/B株由青岛易邦生物工程分离。
1.2SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，购买后在青岛易邦动物房负压隔离器内饲养。
1.3仪器与试剂ABI 7500荧光定量PCR仪，北京天恩泽动物柱式RNA提取试剂盒，宝生物PrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ，引物由上海生物工程有限公司合成。
1.4免疫与攻毒将禽肺病毒B亚群SHS/B株制备疫苗免疫21日龄的SPF鸡，21日后，滴鼻点眼攻击SHS/B毒株。攻毒5日后，分离肺。
1.5RNA的提取称取免疫攻毒组、对照组0.1～0.2g组织放入MagNA Lyser GreenBeads的离心管中，加10倍体积的生理盐水，置冰上。将离心管放入中通量组织研磨器，以6000r/min捣碎45秒,迅速放入冰盒中冷却10分钟，再重复2次。按照北京天恩泽动物柱式RNA提取试剂盒提取RNA。
1.6反应体系的配置
2×Buffer 10μL
引物-S 1μL
引物-AS 1μL
ROX 0.4μL
Enzyme-mix 0.8μL
水 4.8μL
模板 2μL
总体积 20μL
1.7反应条件42℃反转录5分钟；95℃预变性10秒；95℃变性5秒，60℃进行退火延伸35秒，共40个循环。在每一循环的延伸结束时采集荧光信号进行荧光定量PCR检测。
2、结果免疫组和对照组肺组织中的病毒含量
将免疫组和对照组的肺进行荧光定量RT-PCR，从图2可明显看出，对照组中病毒含量远高于免疫组，可见该方法能有效地检测疫苗的效力。

Claims (5)

1.一种用于B亚群禽肺病毒疫苗效检的引物组，其特征在于，所述的引物组，其上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2。
2.权利要求1所述的引物组在制备B亚群禽肺病毒疫苗效检制品中的应用。
3.一种用于检测B亚群禽肺病毒疫苗效检的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物组。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有作为检测内参基因β-actin的特异性引物组，其上下游引物的序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。
5.一种B亚群禽肺病毒疫苗的效检方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求4所述的试剂盒进行检测，包括如下的步骤：
1)免疫及攻毒：
将禽肺病毒疫苗免疫21日龄的SPF鸡，滴鼻点眼攻击禽肺病毒；攻毒5日后，分离组织样品；
2)RNA的提取：
称取免疫攻毒组、对照组组织提取RNA；
3)荧光定量RT-PCR：
用权利要求1所述的引物组和内参基因β-actin的特异性引物组进行荧光定量RT-PCR，对目的基因进行相对定量，从而对疫苗的效果进行评价。
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