CN105018622B - 一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质bhk-21细胞残留的方法 - Google Patents

一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质bhk-21细胞残留的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK‑21细胞残留的方法，属于生物技术领域。该方法是利用破乳剂对口蹄疫疫苗进行破乳，然后提取疫苗残留的总RNA，使用荧光定量RT‑PCR的方法检测残留细胞的Cytb基因，同时使用PCR‑RFLP技术对目的片段进行特异性分析，最后根据标准品的标准曲线，计算样品中Cytb的含量，从而达到快速、稳定检测口蹄疫疫苗中残留BHK‑21细胞残留的目的。本发明操作过程简单、可操作性强、周期短、灵敏度高、结果准确、重复性好，具有广泛的应用前景。

Description

一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测口蹄疫疫苗中培养细胞残留的方法，特别涉及一种利用实时荧光定量PCR的方法检测口蹄疫疫苗中BHK-21细胞残留的方法。
背景技术
口蹄疫是偶蹄动物携带的一种急性、热性和可快速远距离传播的传染病，感染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其他家养和野生的偶蹄动物，易感动物多达70多种。传播快、感染性强，给畜牧业造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易。素有“政治经济病”之称。由于其防控口蹄疫的措施主要是扑杀发病动物和应用质量可靠的灭活疫苗免疫易感动物。因此高质量安全的灭活疫苗对于口蹄疫防控至关重要。
口蹄疫疫苗的制备通常采用BHK-21细胞作为基质。BHK-21细胞又称幼仓鼠肾成纤维细胞，该细胞系是由I.A.Macpherson和M.G.P.Stoker于1961年从1日龄的仓鼠科仓鼠亚科金仓鼠属金仓鼠种金仓鼠肾脏建立了BHK-21亲本，随后84天连续培养，通过单细胞分离建立了13号克隆。这株细胞可用作转染宿主，用于表达包含选择及扩增标记的DNA的载体。BHK-21细胞广泛用于口蹄疫、狂犬病毒、乙脑病毒等病毒疫苗的生产基质。然而在口蹄疫疫苗的制作过程中容易残留培养基质细胞时所用的血清、水解乳蛋白，基质细胞蛋白等多种非目的蛋白成分。这些异源蛋白不仅导致注苗动物经常出现不同程度的不良反应，轻者减食、停食或发生流产，重者发生死亡，而且能够裂解病毒粒子，降低疫苗效力。目前口蹄疫的制苗工艺往往不能完全去除非目的蛋白成分，因此建立一种快速准确的非目的蛋白残留的检测方法，对于提高疫苗的生产效率和质量控制具有重要意义。
线粒体Cytb基因(细胞色素B基因)是一种蛋白质编码基因，几乎在所有真核生物和许多原核生物的线粒体中都有发现，在不同物种间序列长度没有明显差异，并且遗传变异小，但具有种间的差异。目前Cytb基因被广泛用于系统学研究，该基因片段包含着种内到种间甚至到科间的遗传进化信息，且在系统进化和分类研究、群体遗传结构研究等方面有很强的适用性。因此，本发明采用BHK-21细胞中的Cytb基因作为检测口蹄疫疫苗中是否含有基质细胞蛋白残留的特异性检测基因。该技术还未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种口蹄疫疫苗培养细胞BHK-21细胞残留物的快速检测方法，该方法具有简便迅速，结果准确和重复性好的特点，易于推广应用。
本发明采用的技术方案如下：
Cytb质粒标准品的构建：在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得BHK-21细胞Cytb基因的保守片段，利用基因克隆技术构建含有该保守基因序列的标准质粒分子。
口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的检测引物，是由1对引物BHK-1和BHK-2组成，序列如下：
上游引物BHK-1：5’-GGCTACGTACTACCATGAGG-3’；(SEQ ID NO.1)
下游引物BHK-2：5’-TCTGGGTCTCCGAGAACATC-3’。(SEQ ID NO.2)
本发明还提供一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，使用上述的口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的检测引物，包括以下步骤：
步骤(1)，使用破乳剂对口蹄疫疫苗进行破乳；
步骤(2)，对步骤(1)破乳得到的水相层进行总RNA的提取；
步骤(3)，将步骤(2)得到的总RNA反转录为cDNA后，以cDNA为模板，以BHK-1和BHK-2为上下游引物，进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增产物；
步骤(4)，根据10倍梯度稀释Cytb质粒标准品的标准曲线，计算步骤(3)得到的扩增产物中Cytb的含量；如果含有Cytb，则为阳性，反之，为阴性，即无残留；
步骤(5)，将步骤(3)得到的扩增产物用限制性内切酶StuⅠ进行直接酶切，进一步验证基因的特异性，如果得到243bp和131bp条带大小为阳性，反之则阴性。
上述技术方案中，步骤(1)中，使用正丁醇作为破乳剂，在4℃的条件下静置60分钟，使油水分层，分离出含有抗原和细胞残留物的水相层；其中，破乳剂的加入的体积是口蹄疫疫苗体积的15％。
上述技术方案中，步骤(2)中，使用RNAiso Plus、氯仿和异丙醇进行总RNA的提取，具体的提取方法为：
向200μL水相层加入800μL RNAiso Plus，混匀，4℃静置10min，然后在10000rpm、4℃的条件下，离心10min，取上清液；
向上清液中加入体积为上清液体积一半的氯仿，混匀后，室温静置10min，接着在10000rpm、4℃的条件下，离心10min，取上清液并向该上清液中加入等体积的异丙醇，混匀后，室温静置10min，再在10000rpm、4℃的条件下，离心10min，取沉淀；
向沉淀中加入乙醇700μL，并在10000rpm、4℃的条件下，离心5min，去上清，并将沉淀吹干，最后加入至30μL DEPC水中，混匀，置于-80℃进行保存。
上述技术方案中，将步骤(2)得到的总RNA反转录为cDNA的反应体系为10μL，包括：
RNase Free dH2O 4.5μL；
5×PrimeScript Buffer 2μL；
PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 0.5μL；
Random 6mers(100mol/L)0.5μL；
Oligo dT Primer(50mol/L)0.5μL；
总RNA 2μL；总计25μL；
反应程序为：37℃，15min；85℃，5s。
上述技术方案中，步骤(3)中所述的荧光定量PCR的方法的PCR反应体系为25μL，其中包括：
Premix Ex taqTM Ⅱ 12.5μL；
上游引物BHK-1，10uM，0.5μL；
下游引物BHK-2，10μM，0.5μL；
ddH2O 9.5μL；
cDNA 2μL；总计25μL；
扩增程序为：
①95℃预变性30sec；
②95℃变性30s，62℃退火5s，共35个循环；
③每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测；
结束后，样本4℃保存。
上述技术方案中，步骤(4)中，所述的Cytb质粒标准品为含Cytb基因片段的pMDTM-18T重组质粒；所述Cytb基因片段是以权利要求1所示核苷酸序列为引物，以Cytb基因为模板扩增得到的。
上述技术方案中，步骤(4)中，所述10倍稀释的Cytb质粒标准品，其稀释浓度分别为：①1×108拷贝/μL；②1×107拷贝/μL；③1×106拷贝/μL；④1×105拷贝/μL；⑤1×104拷贝/μL；⑥1×103拷贝/μL；⑦1×102拷贝/μL。
上述技术方案中，步骤(4)中，所述计算扩增产物中Cytb的含量，将梯度稀释的标准品进行实时荧光定量PCR，以标准品拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，再将待检样品的实时荧光定量PCR检测结果与标准曲线对照，得出检测残留物的拷贝量，即得到扩增产物中Cytb的含量。
上述技术方案中，步骤(5)进一步鉴定扩增产物的特异性时，使用StuⅠ对荧光PCR产物在37℃进行单酶切1.5-3小时，酶切体系为20μL，其中包括10×M buffer，2μL；StuⅠ，0.5μL；扩增产物，5μL；ddH2O余量；酶切后，取酶切产物与10×Loading Buffer按体积比为9：1混匀后，加入到含0.8μg/ml溴化锭的1％w/v琼脂糖凝胶中，在120V电压下电泳30分钟，然后用凝胶成像系统观察，得到243bp和131bp条带大小为阳性，反之则阴性。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
(1)本发明所述方法简便迅速，整个过程仅需3～5个小时即可完成；(2)实时荧光定量PCR灵敏度高，结果准确，重复性好；(3)采用RFLP技术对qPCR产物进一步鉴定，保证了结果的特异和可靠性。(4)通过检测疫苗中的BHK-21细胞的Cytb基因，从而评价疫苗中基质细胞的残留，能够快速有效的间接评价疫苗质量。
附图说明
图1：10倍梯度稀释Cytb质粒标准品实时荧光定量扩增曲线示意图；其中①1×108拷贝/μL；②1×107拷贝/μL；③1×106拷贝/μL；④1×105拷贝/μL；⑤1×104拷贝/μL；⑥1×103拷贝/μL；⑦1×102拷贝/μL。
图2：10倍梯度稀释Cytb质粒标准品实时荧光定量标准曲线示意图；其中横坐标为质粒的拷贝数，纵坐标为Ct值。该标准曲线的方程为y＝-3.448x+32.333，R2值为0.999，扩增效率为95％。
图3：本发明检测口蹄疫疫苗中Cytb基因片段酶切鉴定示意图；其中M：DL1000Marker；1：样品1扩增产物酶切结果；2：样品2扩增产物酶切结果；3：样品3扩增产物酶切结果；4：样品4扩增产物酶切结果；5：样品5扩增产物酶切结果；6：样品:6扩增产物酶切结果；7：样品7扩增产物酶切结果。可见7个样品均得到243bp和131bp条带大小的产物，进一步证明7个样品均含有Cytb残留。
具体实施方式
以下结合附图1-3，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
以下实施例中所使用的技术，包括核酸提取、PCR扩增。酶切鉴定等分子生物学技术，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、细胞系等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员。
一、Cytb质粒标准品的制备方法
1、Cytb质粒标准品的构建：
在美国国立生物信息中心NCBI基因库(Genbank)中检索获得BHK-21细胞的Cytb基因的保守序列，基因序列号为EU660218.1，基因片段从14512～14885；利用常规的基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒分子，所用的质粒为pMDTM-18T(购自大连TaKaRa公司)。
2、Cytb质粒标准品的稀释：
将步骤1中构建的标准质粒作10倍梯度稀释；具体如下：①1×108拷贝/μL；②1×107拷贝/μL；③1×106拷贝/μL；④1×105拷贝/μL；⑤1×104拷贝/μL；⑥1×103拷贝/μL；⑦1×102拷贝/μL，稀释后在-20℃条件下保存备用。
二、口蹄疫油乳剂灭活疫苗的破乳方法
对口蹄疫疫苗进行破乳，取100ml商品口蹄疫疫苗，放入250ml分液漏斗中，加入15ml破乳剂正丁醇，充分混悬；将分液漏斗放入4℃冰箱，静置60分钟以上，待油、水分离后，取出水相层，将水相层分装于已灭菌的2mL Eppendo rf管中，即为实验样品。
三、Total RNA的提取
1、提取水相层总RNA。
取200μL水相层于1.5ml的离心管中，向200μL水相层中加入800μL R NAiso Plus，上下颠倒几次，混匀之后，4℃静置10min。然后10000rpm，4℃，离心10min。
2、用氯仿抽提，除去蛋白。
(1)每管吸取上层液体到新的离心管中(约600μL/管)。
(2)分别加入上层液体1/2体积的氯仿(约300μL)，上下颠倒几次，混匀之后，静置10min。
(3)10000rpm，4℃，离心10min。
3、异丙醇处理，沉淀RNA。
(1)离心后，吸取上清液体到新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒几次，混匀之后，静置10min。
(2)10000rpm，4℃，离心10min。
4、乙醇清洗沉淀。
弃掉液体，取沉淀，加入700μL的乙醇，10000rpm，4℃，离心5min。
5、RNA的溶解。
弃掉离心管里全部液体，取沉淀，在超净台中吹干15min。每管加入30μL冷藏的DEPC水混匀，置于-80℃进行保存。
四、实时荧光定量检测Cytb基因
1、用PrimeScriptTM RT reagent Kit(购自大连TaKaRa公司)将提取的总RNA反转录为cDNA，反应体系为10μL，其中RNase Free dH2 O 4.5μL，5×PrimeScriptBuffer 2μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 0.5μL，Random 6mers(100mol/L)0.5μL，OligodT Primer(50mol/L)0.5μL，总RNA 2μL。反应程序为：37℃，15min；85℃，5s。
2、PCR反应体系为25μL，其中Premix Ex taqTM Ⅱ 12.5μL，PCR上游引物BHK-1(10μM)0.5μL，PCR下游引物BHK-2(10μM)0.5μL，ddH2O 9.5μL，cDNA 2μL。使用iQ5RealTime PCR仪进行扩增，扩增程序为：
①95℃预变性30sec；
②95℃变性30s，62℃退火5s，共35个循环；
③每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
结束后，扩增产物4℃保存，扩增产物基因序列如表1所示。
表1 扩增Cytb基因的特异性引物和扩增产物基因序列
五、根据Cytb质粒标准品的标准曲线，计算样品中Cytb的残留量。
1、10倍梯度稀释口蹄疫疫苗Cytb基因标准品实时荧光定量扩增曲线和标准曲线示意图：如图1、图2所示，7份标准品均有阳性扩增，用标准品拷贝数的对数值为x值，纵坐标为Ct值。该标准曲线的方程为y＝-3.448x+32.333，R2值为0.999，反应的扩增效率为95％。扩增曲线和标准曲线显示：本发明建立的实时荧光定量PCR检测方法有7个数量级的线性检测范围，进一步说明该检测方法具有非常高的灵敏度。
2、将不同生产厂家的7份样品经上述的实时荧光定量PCR方法扩增，所得到的Ct值带入计算公式y＝-3.448x+32.333，从递减的线性等式可以推导出未知样本的量分别为：1号样品第1次重复试验残留量为32.2拷贝，第2次重复试验残留量为21.1拷贝，平均值为26.7±7.8拷贝；2号样品第1次重复试验残留量为43.2拷贝，第2次重复试验残留量为36.8拷贝，平均值为40.0±4.5拷贝；3号样品第1次重复试验残留量为233.1拷贝，第2次重复试验残留量为222.4拷贝，平均值为227.8±7.6拷贝；4号样品第1次重复试验残留量为1770.3拷贝，第2次重复试验残留量为1799.8拷贝，平均值为1785.1±20.9拷贝；5号样品第1次重复试验残留量为160.8拷贝，第2次重复试验残留量为137.1拷贝，平均值为149.0±16.8拷贝；6号样品第1次重复试验残留量为101.3拷贝，第2次重复试验残留量为109.8拷贝，平均值为105.6±6.0拷贝；7号样品第1次重复试验残留量为220.5拷贝，第2次重复试验残留量为211.4拷贝，平均值为216.0±6.4拷贝；进一步说明该检测方法具有非常高的准确性。
表2 不同样品Cytb残留量
六：PCR-RFLP技术对目的片段进行特异性分析
1、采用StuⅠ对荧光PCR产物进行单酶切，Cytb基因(扩增序列长度为374bp，StuⅠ位于243bp)。酶切体系：10×M buffer，2μL；StuⅠ，0.5μL；扩增产物，5μL；补水至20μL体系，37℃单酶切1.5-3h。
2、将反应体系在37℃水浴作用1.5-3小时后，取9μL酶切产物和1μL10×LoadingBuffer混合后，全部加入含有0.8μg/ml溴化锭的1％w/v琼脂糖凝胶中，在120V电压下电泳30分钟，在凝胶成像系统上观察结果，并拍照。
3、由图3可见，经酶切后得到243bp和131bp的目的条带，表明PCR扩增结果具有很好的特异性，进一步证明了疫苗中残留Cytb。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的检测引物，其特征在于，由1对引物BHK-1和BHK-2组成，序列如下：
上游引物BHK-1：5’-GGCTACGTACTACCATGAGG-3’；
下游引物BHK-2：5’-TCTGGGTCTCCGAGAACATC-3’。
2.一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，使用权利要求1所述的口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的检测引物，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，使用破乳剂对口蹄疫疫苗进行破乳；
步骤(2)，对步骤(1)破乳得到的水相层进行总RNA的提取；
步骤(3)，将步骤(2)得到的总RNA反转录为cDNA后，以cDNA为模板，以BHK-1和BHK-2为上下游引物，进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增产物；
步骤(4)，根据10倍梯度稀释Cytb质粒标准品的标准曲线，计算步骤(3)得到的扩增产物中Cytb的含量；如果含有Cytb，则为阳性，反之，为阴性，即无残留；
步骤(5)，将步骤(3)得到的扩增产物用限制性内切酶StuⅠ进行直接酶切，进一步验证基因的特异性，如果得到243bp和131bp条带大小为阳性，反之则阴性。
3.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，步骤(1)中，使用正丁醇作为破乳剂，在4℃的条件下静置60分钟，使油水分层，分离出含有抗原和细胞残留物的水相层；其中，破乳剂的加入的体积是口蹄疫疫苗体积的15％。
4.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，步骤(2)中，使用RNAiso Plus、氯仿和异丙醇进行总RNA的提取，具体的提取方法为：
向200μL水相层加入800μL RNAiso Plus，混匀，4℃静置10min，然后在10000rpm、4℃的条件下，离心10min，取上清液；
向上清液中加入体积为上清液体积一半的氯仿，混匀后，室温静置10min，接着在10000rpm、4℃的条件下，离心10min，取上清液并向该上清液中加入等体积的异丙醇，混匀后，室温静置10min，再在10000rpm、4℃的条件下，离心10min，取沉淀；
向沉淀中加入乙醇700μL，并在10000rpm、4℃的条件下，离心5min，去上清，并将该沉淀吹干，最后与30μL DEPC水混匀，置于-80℃进行保存。
5.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，将步骤(2)得到的总RNA反转录为cDNA的反应体系为10μL，包括：
RNase Free dH2O 4.5μL；
5×PrimeScript Buffer 2μL；
PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5μL；
Random 6mers(100mol/L)0.5μL；
Oligo dT Primer(50mol/L)0.5μL；
总RNA 2μL；总计10μL；
反应程序为：37℃，15min；85℃，5s。
6.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的荧光定量PCR的方法的PCR反应体系为25μL，其中包括：
Premix Ex taqTM Ⅱ 12.5μL；
上游引物BHK-1，10uM，0.5μL；
下游引物BHK-2，10μM，0.5μL；
ddH2O 9.5μL；
cDNA 2μL；总计25μL；
扩增程序为：
①95℃预变性30sec；
②95℃变性30s，62℃退火5s，共35个循环；
③每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测；
结束后，样本4℃保存。
7.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的Cytb质粒标准品为含Cytb基因片段的pMDTM-18T重组质粒；所述Cytb基因片段是以权利要求1所示核苷酸序列为引物，以Cytb基因为模板扩增得到的。
8.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述10倍稀释的Cytb质粒标准品，其稀释浓度分别为：①1×108拷贝/μL；②1×107拷贝/μL；③1×106拷贝/μL；④1×105拷贝/μL；⑤1×104拷贝/μL；⑥1×103拷贝/μL；⑦1×102拷贝/μL。
9.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述计算扩增产物中Cytb的含量，将梯度稀释的标准品进行实时荧光定量PCR，以标准品拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，再将待检样品的实时荧光定量PCR检测结果与标准曲线对照，得出检测残留物的拷贝量，即得到扩增产物中Cytb的含量。
10.根据权利要求2所述的快速检测口蹄疫疫苗中培养基质BHK-21细胞残留的方法，其特征在于，步骤(5)进一步鉴定扩增产物的特异性时，使用StuⅠ对荧光PCR产物在37℃进行单酶切1.5-3小时，酶切体系为20μL，其中包括10×M buffer，2μL；StuⅠ，0.5μL；扩增产物，5μL；ddH2O余量；酶切后，取酶切产物与10×Loading Buffer按体积比为9：1混匀后，加入到含0.8μg/ml溴化锭的1％w/v琼脂糖凝胶中，在120V电压下电泳30分钟，然后用凝胶成像系统观察，得到243bp和131bp条带大小为阳性，反之则阴性。
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