CN101240351A

CN101240351A - 淋巴囊肿病毒的实时定量pcr检测方法

Info

Publication number: CN101240351A
Application number: CNA2008100148268A
Authority: CN
Inventors: 岳志芹; 梁成珠; 陈晓; 徐彪; 邓明俊; 应骏; 朱来华; 郑小龙; 肖西志; 辛学谦
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2008-03-20
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2008-08-13
Anticipated expiration: 2028-03-20
Also published as: CN101240351B

Abstract

一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，属于病毒检验技术。其技术方案是：首先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后建立PCR反应体系和反应程序，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线，最后建立检测样品的结果判定依据。本发明包括设计的特异性引物序列和荧光探针序列，以及与之配套的定量PCR反应体系和反应程序，记忆检测样品的结果判定方法。本发明解决了从鱼样本中检测淋巴囊肿病毒的方法，具有快速，准确、特异性好、灵敏度高的优点，可以进行定性、定量检测，适合鱼病毒的快速检验检疫，具有很强的推广性和实用性。

Description

淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法

技术领域

本发明是属于淋巴囊肿病毒的检测技术，是一种采用荧光探针或SYBR GREEN I荧光染料的实时定量PCR技术的检测方法——淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法。

背景技术

淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)属于虹彩病毒科，淋巴囊肿病毒属，可感染9目34科计140种以上鱼类，对鱼类危害严重，给水产养殖业带来巨大的损失，同时严重影响经济鱼类的进出口贸易。淋巴囊肿病毒被世界动物卫生组织(OIE)、世界粮农组织亚太水产病害网络(NACA)和各个国家列入水生动物病害检疫名录，因此，迫切需要建立快速、灵敏、准确的淋巴囊肿病毒的检测方法。

目前检测淋巴囊肿病毒的方法包括细胞学技术、免疫学诊断技术、分子生物学技术三大类：

1.细胞学诊断技术主要包括：采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察。这些方法操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低。

2.免疫学技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交。这些方法具有特异性强、敏感性高的优点，但操作步骤相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测。

3.分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，该技术比较快速、灵敏，但是需要琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察结果，EB是致癌物，对人体和环境有危害，并且交叉污染问题比较严重；另外PCR只能进行定性检测，不能对病毒进行定量。

实时定量PCR技术目前已被广泛应用于检测水生生物细菌(如对虾弧菌、贝副溶血弧菌)、病毒(对虾白斑综合症病毒、鱼传染性造血器官坏死病毒)等病原体，但是尚未用于淋巴囊肿病毒的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用荧光探针(Taqman探针)或SYBR GREEN I荧光染料定量检测淋巴囊肿病毒的方法，以克服现有技术的不足。本发明的技术方案如下：

首先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线，最后建立待测样品的结果判定依据。

上述的设计特异性引物序列和荧光探针序列：选取淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(MCP)基因保守序列，利用已有的Primer Express 2.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列，为：

正向引物LCDV-F：5′-CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3′

反向引物LCDV-R：5′-CAGCAGCAATACCCGGTAAATC-3′

荧光探针LCDV-T：5′-FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT-TAMRA-3′。

荧光探针的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA，扩增片断长度为82bp。

上述的建立实时定量PCR反应体系和反应程序：按照常规操作，首先要采用传统的酚/氯仿法或者商业化的DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA，之后通过调整实时定量PCR各组分的用量，以定量PCR仪器检测到高荧光信号和低Ct值为依据，建立定量PCR的反应体系和反应程序。

上述的制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线：首先设计包含实时定量PCR扩增区域的正链引物和负链引物，扩增淋巴囊肿病毒得到401bp的扩增产物，按照已有的分子克隆操作方法，制备质粒并提取质粒DNA，命名为pLCDV-MCP，即为标准品。将标准品测定浓度后并梯度稀释，之后进行实时定量PCR反应。定量PCR仪器计算Ct值(Threshold cycle，循环阈值)，Ct值是指PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。根据标准品的浓度和Ct值，仪器软件自动绘制出标准曲线。

上述的建立待测样品的结果判定依据：利用实时定量PCR仪器收集荧光信号，再利用分析软件处理数据，得到扩增曲线、熔解曲线、Ct值、Tm值。以最低浓度的标准品对应的Ct值作为待测样品的判定界限，以标准品对照的Tm值作为SYBR GREEN I荧光染料的判定依据。

本发明适用于对淋巴囊肿病毒进行快速检测，可广泛应用于鱼类特别是牙鲆、鲈鱼等养殖场的疫病监控及进出口贸易中淋巴囊肿病毒的检测。

本发明与已有技术对比其特点是：

1、检测快速、高效：该检测方法在定量PCR反应结束后，可立即通过仪器软件进行结果判定，不需要琼脂糖凝胶电泳、EB染色观察结果，减少了环境污染和样品交叉污染，从核酸提取到结果判定仅需要4小时；一次可以进行96个样品的检测，具有高效性。

2、可实现准确定量：通过制备标准品及绘制标准曲线，再根据待测样品的Ct值，可以对待测样品中的淋巴囊肿病毒进行定量，准确度高，做到了真正意义上的定量检测。

3、特异性强：特异性引物和荧光探针只与淋巴囊肿病毒特异性地结合，与虹彩病毒科的其他病毒都没有反应。

4、检测范围广，灵敏度高，在标准品为3×10⁷-30拷贝范围内都有极好的线性关系，检测范围可达7个数量级；检测限达30个拷贝，是其他检测方法无法比拟的。

附图说明：

图1.本发明的不同浓度的淋巴囊肿病毒标准品的实时定量PCR反应的扩增曲线图谱横坐标代表PCR反应循环数，纵坐标代表荧光信号强度。

1-7：PCR反应体系中标准品浓度分别为3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹拷贝

图2.本发明的淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法的标准曲线图谱横坐标代表样品的拷贝数，纵坐标代表Ct值2

拷贝数X与Ct值的线性关系为：Ct＝-3.63lgX+41.86，相关系数R²＝0.9915。

图3.本发明的利用荧光探针实时定量PCR检测牙鲆样品的扩增曲线图谱P：淋巴囊肿病毒标准品；B：空白对照；1-5：为5份牙鲆样品

图4.本发明的利用SYBR GREEN I实时定量PCR检测牙鲆样品的熔解曲线图谱横坐标代表反应温度，纵坐标代表荧光信号导数。

A：淋巴囊肿病毒标准品及5份牙鲆样品，熔解曲线的峰值对应的温度即为Tm值，待测样品的Tm值介于74.4℃-74.7℃之间；

B：空白对照(水)

图5.本发明的其他病毒的SYBR GREEN I实时定量检测结果的熔解曲线图谱

A：淋巴囊肿病毒标准品；B：流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图进一步阐述本发明。

实施例1、

以牙鲆样品为例，采用荧光探针实时定量PCR方法定量检测淋巴囊肿病毒。

牙鲆样品采自山东莱州某养殖场，具有感染淋巴囊肿病毒的典型临床症状，鱼皮肤、鳍及眼球等处出现小泡状的肿胀物，其病史患有纤毛虫病、鼓眼病等。

上述的设计特异性引物序列和荧光探针序列：

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/中搜索淋巴囊肿病毒的序列，利用已有的DNALASERGENE7.1软件分析比较各个基因序列的保守性，结果表明淋巴囊肿病毒的主衣壳蛋白(MCP)基因序列比较保守。因此，以MCP基因为目标基因，利用已有的Primer Express2.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列。设计的引物序列Tm值在58℃-60℃之间，不具有二级结构，两条引物的Tm值相差2℃以内，且不形成引物二聚体。荧光探针的Tm值比引物高8℃-10℃。特异性引物包括正向引物和反向引物，荧光探针为Taqman探针，设计的实时定量PCR的特异性引物序列和荧光探针序列如下：

正向引物LCDV-F：5′-CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3′

反向引物LCDV-R：5′-CAGCAGCAATACCCGGTAAATC-3′

荧光探针LCDV-T：5′-FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT-TAMARA-3′。

扩增片断长度为82bp。

设计好特异性引物序列和荧光探针序列后，通过TAKARA商业公司，采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行特异性引物和荧光探针的合成与荧光标记。荧光探针的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA。上述的建立PCR反应体系和反应程序：

按照常规操作，首先要提取待测样品的DNA。取牙鲆的肾、脾、脑等组织匀浆，采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 3.0 DNA提取试剂盒，按照说明书进行DNA的提取，之后用核酸分析仪进行定量，调整DNA浓度为100ng/μL。实时定量PCR反应体系由以下组分构成：2μL待测样品DNA，12.5μL 2×PCR Master Mix(美国ABI公司)，10μmol/L正向引物、反向引物各2μL，1μL 10μmol/L荧光探针，补充水至25μL。采用ABI7900HT型定量PCR仪器进行反应，PCR反应程序为：50℃2min；95℃10min；之后95℃15sec，60℃1min进行40个循环。

上述的制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线：

利用PRIMER EXPRESS 2.0软件，设计包含定量PCR扩增区域的PCR引物，用于制备阳性质粒。PCR引物序列为：

LCDV-659F：ACGACTCTACCATCATGCCTTTG；

LCDV-1059R：AAGACGAGCACTATTTTCATAAACCA。扩增片断长度为401bp。

按照常规PCR扩增淋巴囊肿病毒，得到401bp的扩增片段。再按照黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，中国科学出版社，2003年1月，第1217-1259页，构建含有目的扩增片段的质粒，命名为pLCDV-MCP。用BECKMAN核酸分析仪测定质粒浓度为50ng/μL。pMD19-T载体长度为2692bp，插入的MCP基因片段长度为401bp，每对碱基的平均分子量为660g/mol，再根据阿佛加德罗常数(6.02×10²³)，计算出标准品的浓度为：1.5×10⁷拷贝/μL。

为了绘制标准曲线，将标准品进行10倍系列稀释，分别得到浓度为1.5×10⁷、1.5×10⁶、1.5×10⁵、1.5×10⁴、1.5×10³、1.5×10²、1.5×10¹拷贝/μL的标准品。以各个浓度的标准品为模板，进行实时定量PCR反应，每个浓度做2个平行样，通过定量PCR仪器的分析软件绘制出标准曲线。

ABI 7900HT型定量PCR仪器在反应过程中自动收集荧光信号，反应结束后，利用仪器自带的SDS 2.1软件进行数据分析，包括查看扩增曲线、Ct值。淋巴囊中病毒各个浓度的标准品的扩增曲线图谱见图1。结果表明，反应体系中标准品为3×10⁷-30个拷贝，7个数量级的范围内都有“S”型扩增曲线，表明该实时定量PCR检测方法检测范围广。标准品浓度最低为30个拷贝，对应的Ct值为35.85，因此以Ct值36作为判定待测样品结果的界限，判定该方法的检测限为30个拷贝。

根据标准品拷贝数与Ct值的关系，SDS 2.1软件自动绘制出的标准曲线见图2。其中，模板浓度X与Ct值的线性关系为：Ct＝-3.63lgX+41.86，相关系数R²＝0.9915。上述建立待测样品的结果判定依据：

待测样品的结果判定是通过其扩增曲线及Ct值进行的。若待测样品的Ct值≤36.0，同时有“S”型扩增曲线的待测样品，判定为含有淋巴囊肿病毒。经检测，发现5份牙鲆待测样品都含有淋巴囊肿病毒，其扩增曲线见图3。根据待测样品的Ct值，结合标准曲线，仪器计算出5份牙鲆样品的淋巴囊肿病毒拷贝数，见表2。在本检测过程中，以淋巴囊肿病毒标准品、水为模板，分别作为阳性对照、空白对照，以排除试剂污染或试剂失效造成的假阳性或者假阴性结果。

表2 5份牙鲆样品淋巴囊肿病毒的定量PCR检测结果

样品	Ct值	淋巴囊肿病毒量(拷贝/μg DNA)
样品	Ct值	淋巴囊肿病毒量(拷贝/μg DNA)	1	24.55	5.87×10⁵
2	31.45	7375.1	1	24.55	5.87×10⁵
2	31.45	7375.1	3	18.47	2.77×10⁷
4	15.74	1.56×10⁸	3	18.47	2.77×10⁷
4	15.74	1.56×10⁸	5	26.39	1.82×10⁵

实施例2、

以牙鲆样品为例，利用SYBR GREEN I荧光染料检测牙鲆样品是否含有淋巴囊肿病毒。

牙鲆样品的来源同实施例1，设计的特异性引物序列实施例1，在利用SYBR GREEN I荧光染料的情况下不需要设计荧光探针。

SYBR GREEN I实时定量PCR反应体系及反应程序同实施例1，只是将反应体系中的1μL 10μmol/L荧光探针换成1μL 25×SYBR GREEN I荧光染料。而且要在PCR反应程序结束后，利用ABI 7900HT定量PCR仪器进行熔解曲线分析，其程序为95℃ 15min，60℃ 15min，95℃15min，升降温速率为每25秒温度变化1℃。结束后，由SDS2.1软件给出待测样品的Tm值。

定量PCR仪器收集荧光信号、分析数据同实施例1。5份牙鲆待测样品的熔解曲线见图4。在本检测过程中，以淋巴囊肿病毒标准品、水为模板，分别作为阳性对照、空白对照，以排除试剂污染或试剂失效造成的假阳性或者假阴性结果。结果表明，淋巴囊肿病毒标准品的熔解曲线的峰值与横坐标的交点，即Tm值，为74.5℃。由于定量PCR仪器有系统误差，因此若待测样品的Tm值介于74.0℃-75.0℃之间则判定感染了淋巴囊肿病毒。实验结果表明牙鲆待测样品的Tm值为74.4℃-74.7℃之间，荧光信号导数强度与质粒相当，因此判定5尾牙鲆都感染了淋巴囊肿病毒。

实施例3、

分析淋巴囊肿病毒的SYBR GREEN I实时定量PCR检测方法的特异性。

作为对照，采用与淋巴囊肿病毒亲缘关系较近的其他病毒，利用SYBR GREEN I实时定量PCR方法进行检测。这些病毒都属于虹彩病毒科，它们是流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)，。

检测步骤同实施例2，只是将待测样品的DNA换成流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)的DNA。

SYBR GREEN I实时定量PCR的熔解曲线见图5，其中淋巴囊肿病毒扩增产物的Tm值为74.5℃，其它4种病毒的Tm值约为77℃，超出了74.0℃-75.0范围，且熔解曲线的荧光信号值远低于阳性质粒，因此判定流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(SGIV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)没有发生实时定量PCR反应，表明SYBRGREEN I实时定量PCR检测淋巴囊肿病毒的方法特异性好，与其它相近病毒没有交叉反应。

核苷酸序列表

Claims

1、一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于首先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后建立实时定量PCR反应体系和反应程序，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线，最后建立待测样品的结果判定依据。

2、根据权利要求1所述的淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于特异性引物序列、荧光探针序列为：

正向引物LCDV-F：5′-CAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTT-3′；

反向引物LCDV-R：5′-CAGCAGCAATACCCGGTAAATC-3′；

荧光探针LCDV-T：5′-FAM-TTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCT-TAMRA-3′；

3、根据权利要求1所述的一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于上述PCR反应体系由以下组分组成：12.5μL 2×PCR Master Mix，10μmol/L正向引物、反向引物各1-2μL，0.5-1μL 10μmol/L荧光探针，100ng/μL待测样品的DNA 1-2μL，补充双蒸水至25μL。

4、根据权利要求1所述的一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于上述PCR反应体系由以下组分组成：12.5μL 2×PCR Master Mix，10μmol/L正向引物、反向引物各1-2μL；0.5-1μL 25倍SYBR GREEN I荧光染料，100ng/μL待测样品的DNA 1-2μL，补充双蒸水至25μL。

5、根据权利要求1所述的一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于PCR反应程序为：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15sec，57℃-63℃间的某一温度1min，进行40个循环。

6、根据权利要求1所述的一种淋巴囊肿病毒的实时定量PCR检测方法，其特征在于结果判定依据为：若采用荧光探针，当待测样品有“S”型扩增曲线，且Ct值≤36.0时，则待测样品中含有淋巴囊肿病毒，通过待测样品的Ct值和标准曲线，由定量PCR仪器自动计算出淋巴囊肿病毒含量值；若采用SYBR GREEN I荧光染料，当待测样品的Tm值介于74.0℃-75.0℃之间时，判定待测样品中含有淋巴囊肿病毒。