CN110564882A - 一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法 - Google Patents

一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：（1）对马梨形虫病两种病原马泰勒虫和驽巴贝斯虫18S核糖体RNA编码基因进行保守性分析，选择特异区域设计两条TaqMAN探针及对应的特异性引物；（2）待测DNA的提取；（3）将步骤（2）中提取的DNA为模板，使用步骤（1）中所设计的引物及探针配制反应体系并设置PCR反应程序，根据反应体系要求，设置荧光定量PCR仪，检测探针所对应的荧光信号；（4）实验中设置标准对照组及空白组，若反应在30循环内检测到探针信号，则为阳性；本发明具有很强的特异性和较好的抗干扰性。

Description

一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种马梨形虫病的检测方法，具体为一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法。.
背景技术
马梨形虫病(Equine Piroplasmosis，EP)，是一种由梨形虫寄生于马属动物的红细胞中，引发马属动物发生一系列临床症状甚至死亡的血液原虫病。本病的主要临床特点是急性溶血性贫血，其他特点包括高热，呼吸困难，贫血和黄疸。
马梨形虫病的命名，来源于梨形虫在红细胞内复制时所展现的类似“梨子型”的形态外观。研究发现感染马属动物、导致马梨形虫病发生的梨形虫病原体包括顶复亚门(Apicomplexa)孢子虫纲(Sporozoasida)梨形虫亚纲(Piroplasmasina)的巴贝斯虫科(Babesiidae)的驽巴贝斯虫(Babesia caballi)和归属于泰勒虫科(Theileriidae)的马泰勒虫(Theileria equi)，这两种虫体主要靠中间宿主“硬蜱”的叮咬感染马属动物。
马梨形虫病呈世界性分布，主要集中在热带，亚热带和一些温带地区。研究表明该病的分布区域与硬蜱的活动范围密切相关。
马梨形虫病给马属动物，特别是给马带来的危害十分严重。当马感染梨形虫时，不仅会导致患病马匹流产、身体机能下降、甚至会导致患畜死亡，对马的养殖产业造成的巨大的经济损失；还会因检疫不合格影响马在进出口贸易或参加国际马术运动项目等有关方面受到限制。
近年来，国内外学者对其建立了显微镜检测技术、等温扩增技术、荧光抗体试验、普通PCR诊断，SYBRGreen实时荧光定量PCR等技术对马梨形虫病进行检测。普通PCR方法成本较低，操作方便，得到了广泛应用。但普通PCR诊断存在灵敏度较低的问题，马梨形虫病会存在一定的潜伏期，普通PCR灵敏度较差，易造成漏检。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种快速简便的马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测，其具有特异性强、灵敏度高的特点，且成本较低，检测周期短，有良好的应用前景
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，主要包括如下步骤：
(1)对马梨形虫病两种病原马泰勒虫和驽巴贝斯虫18S核糖体RNA编码基因进行保守性分析，选择特异区域设计两条TaqMAN探针及对应的特异性引物，其中马泰勒虫所对应的荧光探针标记HEX荧光素，驽巴贝斯虫所对应的荧光探针标记为FAM荧光素；
(2)待测DNA的提取；
(3)将步骤(2)中提取的DNA为模板，使用步骤(1)中所设计的引物及探针配制反应体系并设置PCR反应程序，根据反应体系要求，设置荧光定量PCR仪，检测探针所对应的荧光信号；
(4)实验中设置标准对照组及空白组，若反应在30循环内检测到探针信号，则为阳性。
所述的步骤(1)中，引物及探针序列为：
B.caballi-F：TGCATGGCCGTTCTTAGTTG
B.caballi-R：CCCAGGACATCTAAGGGCAT
B.caballi-Probe：FAM-ACAGCTTGTCGCTGTAAAGTCCCTCT-BHQ1
T.equi-F：TCTGCTGTTTCGTTGACTGC
T.equi-R：GTAAACGCCGGGAAACGAAT
T.equi-Probe：HEX-ACCCAACCAAGCCGCAACGA-BHQ1。
所述的步骤(2)中，使用真空抗凝管于待测马颈部静脉采血，离心30分钟，取白细胞层处血液，使用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用。
所述的步骤(3)中，荧光定量PCR反应体系50μl，其中Master Mix(2×)25μL，各引物添加1μl，探针添加0.5μl，目的样本添加2μl，剩余体系用ddH2O补齐。
所述的步骤(3)中，荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性10s，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，45个循环。荧光信号在退火延伸结束时检测。
本发明的优点及有益效果为：(1)本发明所提供的病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法，根据马泰勒虫及驽巴贝斯虫的18S核糖体RNA编码基因序列设计出的2条特异性TaqMAN探针以及对应的特异性引物，其中马泰勒虫所对应的荧光探针标记HEX荧光素，激发光谱为，驽巴贝斯虫所对应的荧光探针标记为FAM荧光素。通过实验验证，采用该引物的双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法其具有很强的特异性和较好的抗干扰性。
(2)本方法可靠性高，实用性强，可用于对组织样本、血清、血浆等样本的检测，适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。
附图说明
图1a、图1b为荧光定量PCR特异性检测结果曲线图；
图2为马泰勒虫标准质粒双重荧光定量PCR灵敏性检测结果曲线图；
图3为驽巴贝斯虫标准质粒双重荧光定量PCR灵敏性检测结果曲线图；
图4为T.equi标准阳性质粒双重荧光定量PCR标准曲线图；
图5为B.caballi标准阳性质粒双重荧光定量PCR标准曲线图图。
图1中，HEX：HEX荧光素；FAM：FAM荧光素；；T.equi：马泰勒虫；B.caballi：驽巴贝斯虫；T.Sinensis：中华泰勒虫。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面将结合实施例对本发明做进一步的描述，但并不是限制本发明的范围，仅作示例说明。
实施例1
双重荧光定量PCR特异性试验结果；
使用两种虫体所对应的荧光探针及引物分别进行特异性检测，并用中华泰勒虫虫体DNA(T.sinensis)作为近似种做为对照，引物浓度为10μM，模板上样量为1ng；结果表明，建立的荧光定量PCR方法对驽巴贝斯虫具有较好的特异性。
其中T.equi所对应的探针标记有HEX荧光基团，所使用的荧光定量PCR仪对其荧光信号的检测波长范围是465nm-510nm；B.caballi所对应的探针标记有FAM荧光基团，所使用的荧光定量PCR仪对其荧光信号的检测波长范围是533nm-580nm。
马梨形虫病巢式PCR检测方法的建立。
(1)引物设计，通过马泰勒虫和驽巴贝斯虫的18S RNA碱基序列的特异性区域，设计得到两条特异性TaqMAN探针及对应的特异性引物，其中，驽巴贝斯虫所对应的探针及序列为Primer B.caballi-F、Primer B.caballi-R、B.caballi-Probe：马泰勒虫对应的引物及探针为Primer T.equi-F、Primer T.equi-R、T.equi-Probe，参照表1，其序列如下：
B.caballi-F：TGCATGGCCGTTCTTAGTTG
B.caballi-R：CCCAGGACATCTAAGGGCAT
B.caballi-Probe：FAM-ACAGCTTGTCGCTGTAAAGTCCCTCT-BHQ1
T.equi-F：TCTGCTGTTTCGTTGACTGC
T.equi-R：GTAAACGCCGGGAAACGAAT
T.equi-Probe：HEX-ACCCAACCAAGCCGCAACGA-BHQ1
(2)采样与DNA提取，使用真空抗凝管于待测马颈部静脉采血，离心30分钟，取白细胞层处血液200μL使用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用。
(3)双重荧光定量PCR检测，：用外侧检测引物18S Out-F、18S Out-R进行第一次PCR扩增。按照表2所示配制反应体系，荧光定量PCR反应体系50μl，其中Master Mix(2×)25μL，各引物添加1μl，探针添加0.5μl，目的样本添加2μl，剩余体系用ddH2O补齐。
荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性10s，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，45个循环，见表3。荧光信号在退火延伸结束时检测。
(4)结果分析，根据荧光定量PCR检测结果判定：在30个循环扩增后，若模板组有荧光信号，且阴性及空白对照物组信号则判定为阳性；并根据不同荧光信号判定，所检测样本感染病原种类，确定样本为单一感染或混合感染。
实施例2
荧光定量PCR引物特性检测。
(1)特异性试验：使用两种虫体所对应的荧光探针及引物分别进行特异性检测，并用中华泰勒虫虫体DNA(T.sinensis)作为近似种做为对照，引物浓度为10μM，模板上样量为1ng；结果表明，建立的荧光定量PCR方法对驽巴贝斯虫具有较好的特异性。
其中T.equi所对应的探针标记有HEX荧光基团，所使用的荧光定量PCR仪对其荧光信号的检测波长范围是465nm-510nm；B.caballi所对应的探针标记有FAM荧光基团，所使用的荧光定量PCR仪对其荧光信号的检测波长范围是533nm-580nm。结果见图1。
(2)敏感性试验：将标准质粒按照不同浓度，进行10倍梯度稀释(1×10-1-1×10-8ng/μL)浓度作为模版，并使用无菌ddH2O作为空白对照。进行双重荧光定量PCR扩增检测，来确定能本方法最低检测效率并通过公式计算拷贝数。试验结果见图2和3。
根据计算，本试验所建立的双重荧光定量PCR检测方法，可检测最低的检测实数为4.47×102copies/μL。
表1引物及探针序列
表2双重荧光定量PCR反应体系
表3双重荧光定量PCR反应条件

Claims (5)

1.一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)对马梨形虫病两种病原马泰勒虫和驽巴贝斯虫18S核糖体RNA编码基因进行保守性分析，选择特异区域设计两条TaqMAN探针及对应的特异性引物，其中马泰勒虫所对应的荧光探针标记HEX荧光素，驽巴贝斯虫所对应的荧光探针标记为FAM荧光素；
(2)待测DNA的提取；
(3)将步骤(2)中提取的DNA为模板，使用步骤(1)中所设计的引物及探针配制反应体系并设置PCR反应程序，根据反应体系要求，设置荧光定量PCR仪，检测探针所对应的荧光信号；
(4)实验中设置标准对照组及空白组，若反应在30循环内检测到探针信号，则为阳性。
2.根据权利要求1所述的一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述的步骤(1)中，引物及探针序列为：
B.caballi-F：TGCATGGCCGTTCTTAGTTG
B.caballi-R：CCCAGGACATCTAAGGGCAT
B.caballi-Probe：FAM-ACAGCTTGTCGCTGTAAAGTCCCTCT-BHQ1
T.equi-F：TCTGCTGTTTCGTTGACTGC
T.equi-R：GTAAACGCCGGGAAACGAAT
T.equi-Probe：HEX-ACCCAACCAAGCCGCAACGA-BHQ1。
3.根据权利要求1所述的一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述的步骤(2)中，使用真空抗凝管于待测马颈部静脉采血，离心30分钟，取白细胞层处血液，使用DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度备用。
4.根据权利要求1所述的一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述的步骤(3)中，荧光定量PCR反应体系50μl，其中Master Mix(2×)25μL，各引物添加1μl，探针添加0.5μl，目的样本添加2μl，剩余体系用ddH2O补齐。
5.根据权利要求1所述的一种马梨形虫病双重TaqMAN探针荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述的步骤(3)中，荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性10s，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，45个循环；荧光信号在退火延伸结束时检测。
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