CN110656187B - 多重raa以及多重pcr检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒及检测方法 - Google Patents

多重raa以及多重pcr检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多重RAA以及多重PCR检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒，其用于同时检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫，该试剂盒包括如下引物：细粒棘球绦虫的特异性引物：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2；多房棘球绦虫的特性引物：SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4。此外本发明还公开了一种细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的多重RAA以及多重PCR检测方法。通过各种验证表明本发明具有快速、敏感、特异性强的特点，解决了进行多次检测的繁琐步骤，一次反应可以达到同时检测两个基因，明确病原体的作用，大大减轻了工作量，缩短了检测时间，降低了检测成本，具备更大的发展趋势。

Description

多重RAA以及多重PCR检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试 剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及农业和动物检疫技术领域，具体涉及一种细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的检测方法，尤其涉及一种细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的多重重组酶介导的扩增技术(Recombinase-aid Amplification,RAA)与多重PCR检测方法及试剂盒。此外，本发明涉及用于同时检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的引物。
背景技术
棘球蚴病(Echinococciosis)又称包虫病(Hydatidosis)，是棘球绦虫的幼虫寄生于人体组织、器官引起的一种慢性寄生虫病，也是一种重要的人兽共患病。棘球绦虫生活史复杂、流行范围广泛且宿主众多，不同国家或地区的中间宿主与终末宿主也有所差异。而对人体可造成严重危害的棘球蚴病主要包括有囊型棘球蚴病(cystic echinococcosis)和泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis)两种类型。囊型棘球蚴病是细粒棘球蚴寄生人体所致，泡型棘球蚴病是多房棘球蚴寄生人体所致。囊型棘球蚴病呈全球性分布，我国流行区分布于北部、西北和西南的牧区和半农半牧区，主要流行于西藏、四川、青海、宁夏等省(区)，青藏高原地区尤为严重。泡型棘球蚴病分布于北半球，我国流行区主要分布于西藏、四川、青海等，主要流行区也是位于青藏高原。
棘球蚴病是一种可以造成严重疾病负担的慢性寄生虫病，尤其是多房棘球蚴病更有“虫癌”之称，该病发病进程缓慢，早期无明显临床症状，有临床症状时已为晚期，除外科治疗外，目前该病无特效治疗方法。棘球绦虫终末宿主主要是犬科动物等，家犬在棘球蚴病的传播与流行方面上起着重要作用。因此，采取早期诊断、早期治疗以及积极防治动物传染源的综合性防治措施，对控制棘球蚴病对人类健康和畜牧业发展的影响十分重要。随着分子生物学等检测技术的不断发展，尤其PCR、环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification method,LAMP)以及RAA等为棘球蚴病诊断技术的创新和发展提供了机遇，也为棘球绦虫的检测和鉴定、棘球蚴病的早期诊断以及棘球绦虫环境污染的监测等方面的突破提供了有利条件。但单一虫种检测，成本昂贵，费时费力。Chamberian于1988年首次将多重PCR(Multiplex PCR)技术用于人的杜氏营养不良症(DMD)的检测，该技术目前在众多领域方面得以应用。目前，应用多重PCR技术对感染性疾病病原检测主要有两个方向：一是针对每一种病原的单个特异基因进行多重检测，可同时检测一种或几种病原体是否存在；二是针对某一病原的多个基因进行多重检测，可以减少假阳性结果的出现。
目前在棘球绦虫虫种鉴定检测方面已开发了几种多重PCR方法，如Trachsel D等建立了一种检测细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫以及其他绦虫的多重PCR方法(Trachsel D,Deplazes P,Mathis A.Identification of taeniid eggs in the faeces fromcarnivores based on multiplex PCR using targets in mitochondrial DNA[J].Parasitology,2007,134(06):911.)，该方法在鉴定细粒、多房棘球绦虫的同时也可对其他绦虫进行鉴别；刘聪暖等建立了一种检测细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫以及石渠棘球绦虫的多重PCR检测方法(Cong-Nuan L,Zhong-Zi L,Li L,et al.Discrimination betweenE.granulosus sensu stricto,E.multilocularis and E.shiquicus Using a MultiplexPCR Assay[J].PLOS Neglected Tropical Diseases,2015,9(9):e0004084-.)，该方法检测细粒、多房和石渠棘球绦虫基因组DNA的下限分别为20pg，10pg以及20pg。随着分子生物学技术在寄生虫病上的不断发展，一种新型的核酸扩增技术——重组酶介导的核酸等温扩增方法(Recombinase-aid Amplification,RAA)在该领域得以发展与应用。该技术利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温(37℃)条件下进行核酸扩增，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段，结合荧光即时检测，可实现5－30min得出结果。新技术的产生与应用为棘球绦虫的检测和鉴定、棘球蚴病的早期诊断以及棘球绦虫环境污染的快速监测等方面的突破提供了有利条件。
本研究基于细粒与多房棘球绦虫线粒体基因，设计了单个反应管中两对特异性引物的多重RAA与多重PCR检测方法，用于鉴定源自中间宿主或终末宿主的细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫。该方法的建立将为检测棘球蚴病病原和疾病监测提供诊断工具，有望成为流行区和基层兽医站棘球绦虫感染犬检测的新方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种多重RAA以及多重PCR检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒。本发明以细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫为研究对象，建立了一种快速，敏感，特异的检测试剂盒。
本发明要解决的技术问题之二在于提供一种细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的多重RAA以及多重PCR检测方法。多重RAA以及多重PCR方法的建立，解决了进行多次RAA或PCR检测的繁琐步骤，一次反应可以达到同时检测多个基因，明确病原体的作用，大大减轻了工作量，缩短了检测时间，降低了检测成本，具备更大的发展趋势。
本发明要解决的技术问题之三在于提供用于同时检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的引物及其用途。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
在本发明的一方面，提供一种多重RAA以及多重PCR检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒，其用于同时检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫，该试剂盒包括如下引物：
细粒棘球绦虫G1虫的特异性引物：
Eg-F：5’-AGATTGATGATGGTGTTGATGATGCTTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示序列；
Eg-R：5’-CTCATACCCGAGTTAATACAGTCAGCCTAA-3’，如SEQ ID NO.2所示序列；
多房棘球绦虫的特异性引物：
Em-F：5’-AGCCTTTGCGAATGATTTATGGTTTGCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.13所示序列；
Em-R：5’-CCAGCCAACAACGCATTAACCACCAACAAT-3’，如SEQ ID NO.14所示序列。
作为本发明优选的技术方案，该试剂盒包括以下多重PCR反应体系：10×ReactionBuffer 5μL；25.0mmol/L氯化镁3μL；10.0mmol/L dNTPMix 4μL；5U/μL TaqDNA聚合酶0.4μL；模板DNA各1μL；10μmol/L所述引物：细粒棘球绦虫G1上、下游引物各1μL，多房棘球绦虫上、下游引物各1.3μL；加无菌双蒸水补足至50μL。
作为本发明优选的技术方案，所述多重PCR反应体系的多重PCR反应条件为：95℃6min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
作为本发明优选的技术方案，该试剂盒包括以下多重RAA反应体系：50μL体系中缓冲液，25μL；模板DNA各1μL；10μmol/L所述引物：细粒棘球绦虫G1上、下游引物各1μL，多房棘球绦虫上、下游引物各1.5μL；280mmol/L醋酸镁2.5μL；加无菌双蒸水补足至50μL。
作为本发明优选的技术方案，所述多重RAA反应体系的多重RAA反应条件为：将以上反应体系混合均匀，置水浴箱或PCR反应仪在37℃条件下反应40min。
在本发明的另一方面，提供一种细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的多重RAA以及多重PCR检测方法，具体步骤包括如下:
(1)细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的虫体DNA提取；
(2)引物设计与筛选，所述设计的引物序列为：
经实验筛选后得到如下引物：
细粒棘球绦虫G1虫的特异性引物：
Eg-F：5’-AGATTGATGATGGTGTTGATGATGCTTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示序列；
Eg-R：5’-CTCATACCCGAGTTAATACAGTCAGCCTAA-3’，如SEQ ID NO.2所示序列；
多房棘球绦虫的特异性引物：
Em-F：5’-AGCCTTTGCGAATGATTTATGGTTTGCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.13所示序列；
Em-R：5’-CCAGCCAACAACGCATTAACCACCAACAAT-3’，如SEQ ID NO.14所示序列。
(3)目的基因克隆；
(4)建立多重RAA以及多重PCR方法，对所设计的引物进行反应条件优化，得到最佳多重RAA以及多重PCR模式；
(5)按照步骤(4)RAA或PCR的反应条件进行RAA或PCR扩增特异性验证；
(6)按照步骤(4)的RAA或PCR反应条件进行RAA或PCR敏感性验证；
(7)按照建立的多重RAA以及多重PCR方法对样本进行检测和可行性验证。
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)具体为：将细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫进行PCR扩增，PCR产物回收，将产物进行克隆测序，并获取质粒。
作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：退火温度根据引物合成后参考温度，选取54℃-64℃进行PCR，根据扩增效果确定退火温度，最后确定最佳的多重PCR模式。退火温度优选为58℃。
作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，最佳多重PCR模式具体为：最佳多重PCR反应体系：50μL反应体系中10×Reaction Buffer 5μL；25.0mmol/L氯化镁3μL；10.0mmol/LdNTPMix 4μL；5U/μL TaqDNA聚合酶0.4μL；模板DNA各1μL；10μmol/L所述引物：细粒棘球绦虫G1上、下游引物各1μL，多房棘球绦虫上、下游引物各1.3μL；加无菌双蒸水补足至50μL；最佳的多重PCR反应条件为：95℃6min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，最佳多重RAA模式具体为：所述最佳多重RAA模式具体为：最佳多重RAA反应体系:50μL体系中缓冲液25μL；模板DNA各1μL；10μmol/L所述引物：细粒棘球绦虫G1上、下游引物各1μL，多房棘球绦虫上、下游引物各1.5μL；280mmol/L醋酸镁2.5μL；加无菌双蒸水补足至50μL；将以上反应体系混合均匀，置水浴箱或PCR反应仪在37℃条件下反应40min。
在本发明的另一方面，提供用于同时检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的引物组，其序列为：
细粒棘球绦虫G1虫的特异性引物：
Eg-F：5’-AGATTGATGATGGTGTTGATGATGCTTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示序列；
Eg-R：5’-CTCATACCCGAGTTAATACAGTCAGCCTAA-3’，如SEQ ID NO.2所示序列；
多房棘球绦虫的特异性引物：
Em-F：5’-AGCCTTTGCGAATGATTTATGGTTTGCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.13所示序列；
Em-R：5’-CCAGCCAACAACGCATTAACCACCAACAAT-3’，如SEQ ID NO.14所示序列。
在本发明的另一方面，提供上述引物在制备多重RAA以及多重PCR检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明建立了一种同时检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的多重RAA以及多重PCR检测试剂盒以及检测方法，在一个反应体系中能够同时扩增两种棘球绦虫的基因，既弥补了形态学方法检出率低、费时费力的不足，又避免了免疫学方法假阳性高的缺点。本研究所建立的多重RAA法可利用重组酶蛋白在37℃条件下即可实现目的片段的扩增，通常在1h内就得到可用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。此方法简便快捷，对仪器设备要求较低，37℃恒温环境条件下可完成反应，一台恒温装置即可(如水浴、金属浴等)。但在引物设计方面，相对于PCR而言，RAA对引物的要求比较严格，引物的长度一般为28至35个核苷酸，引物过短会严重影响重组酶的活性。不过，长引物并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的影响。同时目前RAA检测只适合扩增不超过500bp的扩增子，这极大程度限制了多重RAA检测技术的开发。本发明建立的多重RAA以及多重PCR检测试剂盒以及检测方法具有特异性、灵敏性高，可实现单样本多病原高通量检测，既节约单个样本检测成本，又提高检出率。本发明中所包含的引物既满足了多重RAA同时也适用于多重PCR，解决了本领域的技术难题。本发明建立的方法可应用于动物病变组织样本和动物粪便样本等细粒与多房棘球绦虫的同时检测，也可用于各级疾控中心对该类棘球绦虫的监测，具有深远的经济价值和社会效益。
附图说明
图1-1和图1-2是本发明实施例1中细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫基因组DNARAA以及PCR扩增的结果示意图，其中，图1-1为PCR扩增的结果，图1-2为RAA扩增的结果；其中，M为Marker：2000bp，1、3为单一RAA或PCR结果，5为多重RAA或PCR结果，2、4、6为阴性内参。
图2是本发明实施例1中两种虫的退火温度确定示意图，其中，M：2000bp Marker从上到下是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-11：54℃-64℃；图2-1为细粒棘球绦虫基因组DNA PCR温度梯度，图2-2为多房棘球绦虫基因组DNA PCR温度梯度，图2-3为细粒和多房棘球绦虫基因组DNA多重PCR温度梯度。
图3是本发明实施例1中单重(或多重)RAA以及PCR方法检测不同虫间交叉反应(特异性)实验示意图，其中，M:DNA分子Marker从上到下是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；N：阴性对照；图3-1以及图3-3分别代表细粒棘球绦虫G1与多房棘球绦虫单一引物的PCR扩增，图3-2以及图3-4分别代表细粒棘球绦虫G1与多房棘球绦虫单一引物的RAA扩增，其中，1-13分别为细粒棘球绦虫G1(多房棘球绦虫)、多房棘球绦虫(细粒棘球绦虫G1)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首线虫、贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、以及华支睾吸虫基因组DNA。图3-5以及图3-6分别代表2对引物的PCR扩增以及RAA扩增，其中，1-14分别为多房棘球绦虫与细粒棘球绦虫G1混合物、细粒棘球绦虫G1、多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首线虫、贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、以及华支睾吸虫基因组DNA。
图4是本发明实施例1中两种棘球绦虫基因组DNA的RAA以及PCR敏感性实验调试结果示意图，其中，M:DNA分子Marker从上到下是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-7反应体系中加入的基因组DNA浓度分别为10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01ng/μL；N：阴性对照。其中，图4-1为细粒棘球绦虫G1基因组DNA PCR敏感性检测；图4-2为细粒棘球绦虫G1基因组DNA RAA敏感性检测；图4-3为多房棘球绦虫基因组DNA PCR敏感性检测；图4-4为多房棘球绦虫基因组DNA RAA敏感性检测。
图5是本发明实施例1中两种棘球绦虫基因组DNA混合样本多重RAA以及多重PCR敏感性调试结果示意图，其中，M:DNA分子Marker从上到下是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-7反应体系中加入混合基因组DNA浓度分别为10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01ng/μL；N：阴性对照。其中，图5-1为两种棘球绦虫基因组DNA多重PCR敏感性检测；图5-2为两种棘球绦虫基因组DNA多重RAA敏感性检测。
图6是本发明实施例1中两种棘球绦虫克隆质粒的RAA以及PCR敏感性实验调试结果示意图，其中，M:DNA分子Marker从上到下是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1：1×105个拷贝/μL；2：1×104个拷贝/μL；3：1×103个拷贝/μL；4：102个拷贝/μL；5：10个拷贝/μL；N：阴性对照。其中，图6-1为细粒棘球绦虫G1克隆质粒PCR敏感性检测；图6-2为细粒棘球绦虫G1克隆质粒RAA敏感性检测；
图6-3为多房棘球绦虫克隆质粒PCR敏感性检测；图6-4为多房棘球绦虫克隆质粒RAA敏感性检测。
图7是本发明实施例1中两种棘球绦虫克隆质粒混合样本的多重RAA以及多重PCR敏感性调试结果示意图，其中，M:DNA分子Marker从上到下是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1：1×105个拷贝/μL；2：1×104个拷贝/μL；3：1×103个拷贝/μL；4：102个拷贝/μL；5：10个拷贝/μL；N：阴性对照。其中，图7-1为两种棘球绦虫克隆质粒的多重PCR敏感性检测；图7-2为两种棘球绦虫克隆质粒的多重RAA敏感性检测。
图8是本发明实施例1中部分动物源样本以及模拟现场样本的检测结果示意图，其中，M:DNA分子Marker从上到下是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1为阳性内参；N：阴性对照。图A1与A2分别是PCR与RAA的扩增结果，其中，2-11分别为10份阳性感染细粒棘球绦虫的动物组织样本；图B1与B2分别是PCR与RAA的扩增结果,其中，2-10分别为9份感染多房棘球绦虫的阳性动物组织样本；在所构建的模拟阳性犬粪的结果中，RAA与PCR扩增方法均显示出良好的检测效果，其中，1为阳性内参；N：阴性对照。图C1、C2分别为单细粒PCR以及RAA扩增，2-4分别为含不同量的细粒组织样本的模拟粪便样本；图D1、D2分别为单多房PCR以及RAA扩增，2-4分别为含不同量的多房组织样本的模拟粪便样本；图E1、E2为多重RAA以及多重PCR扩增，2-4分别为含不同量的两种棘球绦虫组织样本的模拟粪便样本。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如J.Sambrook等在《分子克隆实验指南》(科学出版社，1992)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
一、材料与方法
1.材料
1.1样本
1.1.1细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫组织样本由申请人中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所健教中心与重点实验室提供，-20℃保存。
1.1.2样本的采集：感染组织样本分别采自青海、四川、新疆以及实验室感染的动物组织样本(19份)，阴性犬粪样本采自上海。
1.2试剂
血液/组织DNA提取试剂盒以及粪便DNA提取试剂盒购自美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶(5U/μL)、dNTPMix、Mgcl2、10×Reaction Buffer购自上海Takara公司，PCR引物由上海生工生物有限公司合成。50×TAE缓冲液、Agarose琼脂糖购自北京索莱宝科技有限公司，2 000bp DNA分子质量标志物为MBI公司产品；RAA试剂盒购自江苏奇天基因生物科技有限公司；pMD19-T克隆目的基因由生工生物工程(上海)股份有限公司所构建。
2.方法
2.1引物设计与筛选
从GenBank上下载多条两种棘球绦虫基因序列进行比对，设计引物，引物名称及序列如见表1。
表1：多重PCR基因和引物
Figure BDA0002286989000000091
Figure BDA0002286989000000101
筛选获取的引物不但要适用于多重检测而且特异性与敏感性好，而其他引物由于特异性差、目的条带太短或两种虫的目的条带长度接近导致不适用于多重检测则达不到预期的效果，如细粒棘球绦虫引物2(SEQ ID NO.3)与(SEQ ID NO.4)的目的条带略短，不易与引物二聚体区分；细粒棘球绦虫引物对3(SEQ ID NO.5)与(SEQ ID NO.6)、细粒棘球绦虫引物对5(SEQ ID NO.9)与(SEQ ID NO.10)以及多房引物对2(SEQ ID NO.14)与(SEQ IDNO.15)特异性差。经实验筛选后，发现如下引物对达到了其它引物对所预料不到的技术效果：
细粒棘球绦虫G1虫的特异性引物：
Eg-F：5’-AGATTGATGATGGTGTTGATGATGCTTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
Eg-R：5’-CTCATACCCGAGTTAATACAGTCAGCCTAA-3’，如SEQ ID NO.2所示；
多房棘球绦虫的特异性引物：
Em-F：5’-AGCCTTTGCGAATGATTTATGGTTTGCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.13所示；
Em-R：5’-CCAGCCAACAACGCATTAACCACCAACAAT-3’，如SEQ ID NO.14所示。
2.2目的基因克隆
两种棘球绦虫的PCR反应体系相同，循环参数大致相同，而两种棘球绦虫的退火温度不同，如表2、3，其中细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的退火温度分别为59℃与58℃。
表2：单个基因PCR扩增反应体系
10×Reaction Buffer 5μL
Mgcl2 3μL
dNTPMix 4μL
TaqDNA聚合酶 0.4μL
Primer 1 1μL(10μM)
Primer 2 1μL(10μM)
模板 1μL
ddH2O 34.6μL
总体积 50μL
将细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫进行PCR扩增，PCR产物回收，将产物进行克隆测序，并获取质粒。
表3：单虫PCR循环参数
Figure BDA0002286989000000111
2.3多重PCR方法建立
引物进行退火温度的确定，根据引物合成后参考温度，选取54℃-64℃进行PCR，根据扩增效果确定退火温度。最终选择58℃作为确认的退火温度，PCR体系及条件如下表4、5，将两种基因组DNA等比例混合，按照以下方法进行PCR。
表4 PCR体系
10×Reaction Buffer 5μL
Mgcl2 3μL
dNTPMix 4μL
TaqDNA聚合酶 0.4μL
Primer Eg1/2 (1*2)μL
Primer Em1/2 (1.3*2)μL
模板 (1*2)μL
ddH2O 31μL
总体积 50μL
表5 PCR循环参数
1 95℃，6min
2 95℃30s；58℃30s；72℃45s(35个循环)
3 72℃10min
2.4多重RAA方法建立
RAA体系及条件如下表6、7，将两种基因组DNA等比例混合，按照以下方法进行RAA。
表6
缓冲液 25μL
Primer Eg1/2 (1*2)μL
Primer Em1/2 (1.5*2)μL
模板 (1*2)μL
ddH2O 15.5μL
乙酸镁 2.5μL
总体积 50μL
表7
1 37℃，4min(混匀)
2 37℃,36min
3 加入酚/氯仿(1:1)混合液50μL，混匀并离心
2.5特异性实验
2.5.1单一引物特异性实验
分别以细粒棘球绦虫G1、多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首线虫、贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、以及华支睾吸虫基因组DNA为模板，进行RAA以及PCR扩增，用来检测引物的特异性，结果只能扩增出针对该特异性引物的基因。
2.5.2两对引物特异性实验
分别以两种棘球绦虫基因组DNA混合物、细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首线虫、贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、以及华支睾吸虫基因组DNA为模板，进行RAA以及PCR扩增，结果只能扩增出两种对应的PCR产物。
表明设计的引物具有很好的特异性。
2.6基因组DNA敏感性实验
2.6.1单个基因的灵敏度检测
将所提取的细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫基因组DNA稀释至10ng/μL，然后进行一系列梯度稀释，分别得到浓度为10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01ng/μL的细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫基因组DNA样本。
2.6.2混合基因灵敏度检测
将所提取的细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫基因组DNA稀释至10ng/μL，然后进行一系列梯度稀释，分别得到浓度为10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01ng/μL的细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫基因组DNA样本，再将系列稀释的细粒棘球绦虫基因组DNA与多房棘球绦虫基因组DNA等比混合。
2.7质粒敏感性实验
2.7.1单个基因的灵敏度检测
首先对所获取的质粒进行浓度测定，经过计算每个样品按拷贝数由高到低进行稀释，见表8。
表8两种棘球绦虫DNA拷贝数
细粒棘球绦虫 多房棘球绦虫
浓度(ng/μL) 16.5 21.5
拷贝数(个/μL) 5.02×109 4.77×109
Figure BDA0002286989000000131
稀释后拷贝数分别为：1×105μL、1×104μL、1×103μL、1×102μL、10μL。
2.7.2混合基因灵敏度检测
两种棘球绦虫样品模板按等比例混合，然后按拷贝数由高到低进行稀释。
稀释后拷贝数分别为：1×105μL、1×104μL、1×103μL、1×102μL、10μL。
2.8现场样本以及实验室模拟样本应用
感染组织样本：采集来自青海、四川、新疆以及实验室感染的阳性动物组织样本19份，用血液/组织DNA提取试剂盒，用于多重RAA以及多重PCR检测。
模拟现场犬粪样本：采集上海阴性犬粪3份，将细粒棘球绦虫以及多房棘球绦虫组织分别加入到粪便中，用粪便DNA试剂盒提取粪便基因组DNA，用于多重RAA以及多重PCR检测。
二、结果
1.目的片段的扩增
将所获取的基因组DNA进行PCR与RAA鉴定，从图1-1与图1-2中可以看出均得到了与预期大小一致的目的片段。将目的产物送测序，经过序列分析结果表明各片段均正确。
2.多重RAA与PCR检测方法建立
(1)按照上述条件进行单个基因PCR与RAA扩增，PCR扩增结果如图1-1所示，RAA扩增结果如图1-2所示，从图1-1和图1-2中可以看出，各虫基因均有良好的扩增效果。将两种棘球绦虫基因组DNA等比例混合后，按照上述建立的多重PCR与多重RAA方法进行扩增，结果如图1-1和图1-2所示，得到很好的扩增效果，证明该方法能够同时检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫。
(2)按照上述条件进行单个基因PCR扩增，温度选择59℃和58℃，PCR扩增结果如图2-1、图2-2所示，从图2-3中可以看出，各虫基因在58℃均匀良好的扩增效果，确认58℃为多重PCR最终退火温度。
3.特异性实验
3.1单一引物特异性实验
用单一引物进行RAA以及PCR扩增，分别以细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首线虫、贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、以及华支睾吸虫基因组DNA为模板，进行RAA以及PCR扩增，结果只能扩增出相对应的RAA以及PCR产物。
结果如图3-1,图3-2,图3-3,图3-4所示，从图中可以看出，每对引物均能扩增出其目的基因，而不能扩增出其他虫种基因。
3.2 2对引物特异性实验
分别以两种棘球绦虫基因组DNA混合物、细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首线虫、贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、以及华支睾吸虫基因组DNA为模板，进行RAA以及PCR扩增，结果只能扩增出两种对应的RAA以及PCR产物。
从图3-5和图3-6的结果来看，说明本发明中建立的多重RAA以及多重PCR方法具有很好的特异性。
4.基因组DNA敏感性试验
4.1单个基因敏感性实验
将单个样本按照上述方法稀释后用RAA以及PCR方法进行扩增，敏感性结果如图4所示。从图4-1、图4-2、图4-3与图4-4中可以看出，最低检测可达到0.2pg/μL。
4.2多个基因敏感性实验：
将混合样本按照2.6.2中所述方法进行倍比稀释用于以上建立的多重RAA以及多重PCR方法，以检验所建方法的敏感性，结果如图5-1与图5-2所示，表明该方法敏感性较好，同时检测出两种棘球绦虫的最低检出浓度为2pg/μL。
5.质粒敏感性试验
5.1单个基因敏感性实验
将单个样本按照上述方法稀释后用RAA以及PCR方法进行扩增，敏感性结果如下图6。从图6-1、图6-2、图6-3与图6-4中可以看出，最低检测可达到1×104个拷贝，即200拷贝/μL。
5.2多个基因敏感性实验：
将混合样本按照2.7.2中所述方法进行倍比稀释用于以上建立的多重RAA以及多重PCR方法，以检验所建方法的敏感性，结果如图7-1与图7-2所示，表明该方法敏感性较好，最低检出浓度为1×104个拷贝，即200拷贝/μL。
6.多重RAA与多重PCR方法现场应用
用以上建立的多重RAA以及多重PCR方法用于病变组织以及动物(犬)粪便等样本检测，代表性样本RAA与PCR结果如图8所示，与单一RAA以及PCR方法检测结果相一致，证明该方法有较好的稳定性和重复性，可用于病变组织和动物粪便等样本检测。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
<120> 多重RAA以及多重PCR检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒
<130> WH-NP-19-100451
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
agattgatga tggtgttgat gatgcttgtt 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
ctcatacccg agttaataca gtcagcctaa 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 3
tgtttagaag tgttgtttgg tctgggtaag 30
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
cctaatagcc acctacatcc cactaaattc t 31
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 5
tgtgaccctg agatgatatt ggtttattgg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 6
ctacaataga taagaaccga cctggctcac 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 7
atgaagtgtg tttatgattt gtgggttatg 30
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 8
caacaataat atcaaaccag acatacacca a 31
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 9
gatggatgct gttcctggtc gtcttaatca 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 10
agccaataac gcattcacca ccaacataac 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 11
tactttggtt gctgctggtg tttggtttgt 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 12
cctaccgctc atcacatcac caactaacat 30
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 13
agcctttgcg aatgatttat ggtttgccgt at 32
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 14
ccagccaaca acgcattaac caccaacaat 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 15
ccctgagatg tattggtttg ttgagttaag 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 16
ctacaataga taagaaccga cctggcttac 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 17
ctgttacgat gattataggt gttccgactg 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 18
ccagtaatca acggtcacca tcaaataaac 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 19
ttctaggtat tctttgttgt gtgctggttg 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 20
taaacccact aactaactcc ctttcagact 30
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 21
tggtgttggt cgtgttggta gagtagttta tgg 33
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（未知）
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 22
cacaggaacc acagacatat ctatatcgcc taact 35

Claims (11)

1.一种多重RAA以及多重PCR检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒，其特征在于，其用于同时检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫，该试剂盒包括如下引物：
细粒棘球绦虫G1的特异性引物：
Eg-F：5’-AGATTGATGATGGTGTTGATGATGCTTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示序列；
Eg-R：5’-CTCATACCCGAGTTAATACAGTCAGCCTAA-3’，如SEQ ID NO.2所示序列；
多房棘球绦虫的特异性引物：
Em-F：5’-AGCCTTTGCGAATGATTTATGGTTTGCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.13所示序列；
Em-R：5’-CCAGCCAACAACGCATTAACCACCAACAAT-3’，如SEQ ID NO.14所示序列。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括对多重PCR反应体系和多重PCR反应条件的记载；所述多重PCR反应体系为：10×Reaction Buffer5μL；25.0mmol/L氯化镁3μL；10.0mmol/L dNTPMix 4μL；5U/μL TaqDNA聚合酶0.4μL；模板DNA各1μL；10μmol/L如权利要求1所述引物：细粒棘球绦虫G1上、下游引物各1μL，多房棘球绦虫上、下游引物各1.3μL；加无菌双蒸水补足至50μL；所述多重PCR反应体系的多重PCR反应条件为：95℃6min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括对以下多重RAA反应体系的记载：缓冲液25μL；模板DNA各1μL；10μmol/L如权利要求1所述引物：细粒棘球绦虫G1上、下游引物各1μL，多房棘球绦虫上、下游引物各1.5μL；280mmol/L醋酸镁2.5μL；加无菌双蒸水补足至50μL。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括对所述多重RAA反应体系的多重RAA反应条件的记载；所述多重RAA反应条件为：将以上多重RAA反应体系混合均匀，置水浴箱或PCR反应仪在37℃条件下反应40min。
5.一种细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的多重RAA与多重PCR检测方法，其特征在于，不用于疾病诊断，具体步骤包括如下:
(1)细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的虫体DNA提取；
(2)引物设计与筛选，设计的引物序列为：
细粒棘球绦虫G1的特异性引物：
Eg-F：5’-AGATTGATGATGGTGTTGATGATGCTTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示序列；
Eg-R：5’-CTCATACCCGAGTTAATACAGTCAGCCTAA-3’，如SEQ ID NO.2所示序列；
多房棘球绦虫的特异性引物：
Em-F：5’-AGCCTTTGCGAATGATTTATGGTTTGCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.13所示序列；
Em-R：5’-CCAGCCAACAACGCATTAACCACCAACAAT-3’，如SEQ ID NO.14所示序列；
(3)目的基因克隆；
(4)建立多重RAA以及多重PCR方法，对所设计的引物进行反应条件优化，得到最佳多重RAA以及多重PCR模式；
(5)按照步骤(4)RAA或PCR的反应条件进行RAA或PCR扩增特异性验证；
(6)按照步骤(4)的RAA或PCR反应条件进行RAA或PCR敏感性验证；
(7)按照建立的多重RAA以及多重PCR方法对样本进行检测和可行性验证。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：将细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫进行PCR扩增，PCR产物回收，将产物进行克隆测序，并获取质粒。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的PCR反应条件优化具体方法为：退火温度根据引物合成后参考温度，选取54℃-64℃进行PCR，根据扩增效果确定退火温度，最后确定最佳的多重PCR模式。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述退火温度为58℃；所述最佳多重PCR模式具体为：最佳多重PCR反应体系：50μL反应体系中10×Reaction Buffer 5μL；25.0mmol/L氯化镁3μL；10.0mmol/L dNTPMix 4μL；5U/μLTaqDNA聚合酶0.4μL；模板DNA各1μL；10μmol/L上、下游引物：细粒棘球绦虫G1各1μL、多房棘球绦虫各1.3μL；加无菌双蒸水补足至50μL；最佳的多重PCR反应条件为：95℃6min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述最佳多重RAA模式具体为：最佳多重RAA反应体系:50μL体系中缓冲液，25μL；模板DNA各1μL；10μmol/L上、下游引物：细粒棘球绦虫G1各1μL、多房棘球绦虫各1.5μL；280mmol/L醋酸镁2.5μL；加无菌双蒸水补足至50μL；将以上反应体系混合均匀，置水浴箱或PCR反应仪在37℃条件下反应40min。
10.用于同时检测细粒棘球绦虫G1和多房棘球绦虫的引物，其特征在于，其序列为：
细粒棘球绦虫G1的特异性引物：
Eg-F：5’-AGATTGATGATGGTGTTGATGATGCTTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示序列；
Eg-R：5’-CTCATACCCGAGTTAATACAGTCAGCCTAA-3’，如SEQ ID NO.2所示序列；
多房棘球绦虫的特异性引物：
Em-F：5’-AGCCTTTGCGAATGATTTATGGTTTGCCGTAT-3’，如SEQ ID NO.13所示序列；
Em-R：5’-CCAGCCAACAACGCATTAACCACCAACAAT-3’，如SEQ ID NO.14所示序列。
11.如权利要求10所述的引物在制备多重RAA以及多重PCR检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒中的应用。
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CN110283938A (zh) * 2019-06-20 2019-09-27 华南农业大学 一种PEDV和PDCoV的双重RT-RAA检测引物组、试剂盒及应用

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