CN103882151A - 猪细环病毒i型检测的引物、探针及实时荧光pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于猪细环病毒Ⅰ型检测的引物、探针及其实时荧光PCR检测方法。本申请为猪细环病毒I型的检测提供了一种全新的检测引物，具有很强的特异性和灵敏度，能够满足猪细环病毒I型的日常检验检疫需求；为猪细环病毒I型的检疫、流行病学调查，以及为生产中指导猪细环病毒I型的检测提供了技术帮助。

Description

猪细环病毒I型检测的引物、探针及实时荧光PCR检测方法

技术领域

本申请涉及分子检测领域，特别是涉及一种用于猪细环病毒I型检测的引物、探针及实时荧光PCR检测方法。

背景技术

TTV是一种无包被的单股环状负义的DNA病毒，由于最初是在肝炎患者中分离得到，猜测与肝炎有关，受到医学领域的广泛关注。猪源TTV的中文名字被定义为猪细环病毒（Torque Teno Sus Virus，TTSuV）。流行病学研究发现，TTV通过输血、性行为、粪-口途径等方式进行传播，同时血液、唾液、粪便、乳汁、胆汁均可带毒，通过不同人群的TTV的感染率的研究结果显示：一般人群的感染率多在10%以上，呈无症状携带。除了人可感染TTV以外，猫、狗、猪、牛、鸡、羊、老鼠等动物也是TTV的宿主。Okamota H等根据人TTV非编码区的DNA序列设计引物，扩增了猪、狗和猫血清中的TTV基因片段，发现在这几个不同种属中TTV基因序列和长度差异极大，核酸同源性较小，具有物种专一性。美国学者Leary等应用巢式PCR方法从猪血清中检测到TTV（Sd-TTV31），基因组长度为2878bp。2005年，Niel C等利用多重引导滚环式扩增法(Multiplyprimed rolling-circle amplification,RCA)检测到猪TTV的另一种亚型：Sd-TTV2p，基因组长度为2735bp，与之前发现的Sd-TTV31的同源性非常低，只有45.1%，于是将TTSuV分为两种基因型，TTSuV1型以Sd-TTV31为原型，TTSuV2型以Sd-TTV2p为原型。目前，统一的将TTSuV1型称为猪细环病毒I型（简写TTSuV I），TTSuV2型称为猪细环病毒II型（简写TTSuV II）。

TTSuV和人TTV基因组结构组成相似，由非编区(UTR)和编码区两部分组成，非编区由一个富含GC的区域、一个启动子和一个转录增强子组成，两末端的GC区域形成具茎环的二级结构，在病毒复制中可能有重要调控作用；TTV编码区包含3个开放阅读框(ORF1～ORF3)、一个PolyA和一个TATA盒，变异率较高。ORF1的N端富含精氨酸(Arg)蛋白质，该蛋白质有可能是复制相关的蛋白-Rep蛋白；ORF2编码与复制相关的蛋白；ORF3编码结合蛋白，分为两段，其中隔着一个类似于真核生物编码区中内含子的序列。编码区转录时产生3种不同的mRNA，能翻译表达6种不同的蛋白。两种基因型TTV编码蛋白具有相似的序列和功能。

国外已有许多相关报道，表明TTSuV的感染在全球分布很广且其流行率很高。Segalés等对西班牙猪场1985-2005年采集的162份猪血清进行追溯性调查，结果在所有年份均检出TTSuV病毒，TTSuV1和TTSuV2的感染率分别是33.3%（54/162）和55.6%(90/162)，两种基因型共感染率为23.5%（38/162），证实了TTSuV的感染早在最初发现这病毒(Leary et al.,1999)的14年前就存在了。

近年来，国内也陆续开展了对TTSuV感染情况的研究。这些研究显示，TTSuV在猪群中的感染在国内外已经非常普遍，是一个不容忽视的新病原。而目前对TTSuV的了解还非常有限，综合国内外检测TTSuV的方法主要有血清免疫学法和分子生物学法,血清免疫学法有酶联免疫吸附(ELISA)法，ELISA是用于疫病检测和监控的常用方法，但由于TTSuV具有高度基因变异性，不同基因亚型抗体间存在交叉反应，用它对基因变异进行分析时准确率较低，不能完全反映体内基因变异情况，更重要的是ELISA法的漏检率较高。除此之外，由于感染时间较短而尚未产生抗体也可造成ELISA实验结果的假阴性。

目前用于TTSuV检测的分子生物学方法主要有普通PCR、套式PCR、半套式PCR和滚环扩增等方法。常规PCR和套式PCR方法均根据目前已知的TTSuV基因序列的最保守的非编码区来设计引物，对核酸进行检测。滚环扩增法是以任意的寡核苷酸作为引物，在恒温下以滚环扩增待测环状DNA。由于血清中TTSuV病毒滴度较低，用普通PCR一轮难以扩增出目的片段，需加大循环数，但这样会使引物非特异性结合或者聚合酶活性下降。巢氏PCR克服了单次扩增“平台期效应”的限制且保证了反应的特异性，但是需要进行第二次PCR，引起交叉污染的几率较大。普通PCR敏感性较差，巢氏PCR、半巢氏PCR和滚环扩增耗时较长，且这些传统的PCR技术只能对基因的检测做定性分析，无法精确的定量所检测出的基因数量，大大制约了PCR技术的应用。

Taqman荧光定量PCR是近年来发展起来的一项核酸检测技术，可以快速、敏感地检测出核酸中的目的基因。采用引物和探针相结合，对基因片段进行扩增，其特异性更强，检测更准确。利用荧光信号与PCR产物的对应关系来对检测样本进行定性及定量分析，敏感性极高，可以检测到几个拷贝/μL的病毒核酸。在检测过程中荧光定量PCR方法无需进行凝胶电泳，用仪器收集荧光进行判断结果，避免了人为主观因素的影响。而且与常规PCR技术相比，其检测速度更具有优势，可以在4-6h内完成。而目前针对用于检测TTSuV的高通量、快速、灵敏的Taqman荧光定量PCR检测方法的研究较少；远不能满足检验检疫实践应用的需求。

发明内容

本申请的目的是提供一种全新的用于猪细环病毒I型检测的引物、探针以及基于该引物和探针的实时荧光PCR检测方法。

为了实现以上目的，本申请的一方面公开了一种用于猪细环病毒I型检测的引物，该引物包括上游引物和下游引物，其中，上游引物含有Seq ID No.1所示序列，下游引物含有Seq ID No.2所示序列；

Seq ID No.1：5’-GGTTCAGGAGGCTCAATTTGG-3’

Seq ID No.2：5’-TTTGAATTTAACGGTTTTCAGTCTTC-3’。

本申请的另一面公开了一种用于猪细环病毒I型检测的探针，该探针含有Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.3：5’-TCGCTTCGCTCGCACCACGT-3’。

优选的，探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

更优选的，探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。

本申请的另一面公开了一种猪细环病毒I型的实时荧光PCR检测方法，包括采用本申请的引物和探针进行Taqman荧光定量PCR检测。

本申请的再一面公开了一种猪细环病毒I型的检测试剂盒，该检测试剂盒中含有本申请设计的引物。

进一步的，本申请的检测试剂盒中还含有本申请设计的探针。

本申请的再一面公开了本申请的检测试剂盒在猪细环病毒I型检测中的应用。

本申请的再一面公开了一种采用本申请的检测试剂盒对猪细环病毒I型进行的检测，该检测包括但不限于，常规PCR、染料法实时荧光PCR、探针法实时荧光PCR中的至少一种。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请为猪细环病毒I型的检测提供了一种全新的检测引物，具有很强的特异性和灵敏度，能够满足猪细环病毒I型的日常检验检疫需求；为猪细环病毒I型的检疫、流行病学调查，以及为生产中指导猪细环病毒I型的检测提供了技术帮助。

附图说明

图1：是本申请实施例中巢式PCR电泳结果图，其中A为样品扩增结果，B为克隆后的菌落PCR电泳结果；

图2：是本申请实施例中提取质粒的酶切结果图；

图3：是本申请实施例中TTSuV1标准品（10^-1）退火温度优化结果；

图4：是本申请实施例中TTSuV1标准品（10^-1-10^-6）退火温度优化结果；

图5：是本申请实施例中TTSuV1标准品（10^-1-10^-6）优化的标准曲线；

图6：是本申请实施例中TTSuV2标准品（10^-1）退火温度优化结果；

图7：是本申请实施例中TTSuV2标准品（10^-1-10^-6）退火温度优化结果；

图8：是本申请实施例中TTSuV2标准品（10^-1-10^-6）优化的标准曲线；

图9：是本申请实施例中TTSuV1实时荧光PCR的特异性试验结果；

图10：是本申请实施例中TTSuV2实时荧光PCR的特异性试验结果；

图11：是本申请实施例中TTSuV1实时荧光PCR的灵敏度测试结果；

图12：是本申请实施例中TTSuV2实时荧光PCR的灵敏度测试结果；

图13：是本申请实施例中TTSuV1标准品的扩增曲线；

图14：是本申请实施例中TTSuV1标准品的标准曲线；

图15：是本申请实施例中TTSuV2标准品的扩增曲线；

图16：是本申请实施例中TTSuV2标准品的标准曲线；

图17：是本申请实施例中双重实时荧光PCR的特异性结果；

图18：是本申请实施例中双重实时荧光PCR对TTSuV1的灵敏度检测；

图19：是本申请实施例中双重实时荧光PCR对TTSuV2的灵敏度检测。

具体实施方式

本申请以TTSuV不同基因型的保守序列为目的片段进行研究，设计实时荧光定量PCR的引物及Taqman探针，最终获得分别针对TTSuV1和TTSuV2的非编码区(UTR)设计的特异性引物和Taqman探针，分别建立检测TTSuV1和TTSuV2的单重实时荧光PCR检测方法。另外，考虑到临床检测的工作量和检验检疫业务快速准确的要求，本申请在建立的单重实时荧光PCR方法的基础上，建立了同时检测TTSuV1和TTSuV2双重实时荧光PCR方法。

本申请在现有研究的基础上进一步研究，从而获得了一对全新的检测引物和探针，为猪细环病毒I型和猪细环病毒II型的检测提供了一种新的方案，从而提高了检验检疫的质量和工作效率，对检验检疫和实践生产都具有重要的意义。需要说明的是，本申请的引物和探针都是针对实时荧光PCR检测而设计的，具体的是特别针对双重实时荧光PCR方法而设计的；因此，本申请的引物和探针都具有很好的特异性；可以理解，在本申请的基础上，完全可以单独将本申请的引物直接用于常规PCR检测或者其它基于PCR扩增的检测；同样的，本申请的探针也完全可以用于除了本申请的实时荧光PCR方法的其它检测中，比如基因芯片检测，或者其它基于核苷酸片段的检测。其中，基于PCR扩增的检测如基因芯片的靶标片段扩增、克隆、测序等。

还需要说明的是，将本申请的探针用于实时荧光PCR检测时，根据探针法实时荧光PCR检测的原理，探针的5’端需要标记荧光报告基团，3’端需要标记荧光淬灭基团，可以理解，如果不考虑双重或多重实时荧光PCR检测，现有的荧光报告基团和荧光淬灭基团都可以用于本申请。另外，本申请的实时荧光PCR检测方法中，其关键在于采用了本申请设计的引物和探针，可以理解，检测样品可以是培养提纯的病毒样品、提取自疑似感染的生物的组织或分泌物的样品或通过其它方式提取或保存的样品。

在本申请的引物、探针和实时荧光PCR检测方法的基础上，本申请进一步研究了用于检测猪细环病毒I型的检测试剂盒。可以理解，直接将本申请的引物或探针制备成干粉或者高浓度的溶液即可作为试剂盒组分保存备用。另外，如前面所提到的，本申请的引物或者探针可以单独的用于其它的检测使用，因此，试剂盒中同样可以只含有引物或探针；此外，对于涉及到的常规PCR检测或实时荧光PCR检测等所需要的试剂，可以直接放置于本申请的试剂盒中，也可以在使用试剂盒时，从市场购买相应的试剂，在本申请中不做具体限定。

本申请中的检测试剂盒在猪细环病毒I型检测中的应用，如前面所述，同样的，该应用也包括了目前的各种基于引物和/或探针的核酸分子检测；如常规PCR、实时荧光PCR、基因芯片、克隆、测序等等。

还需要说明的是，本申请中的染料法实时荧光PCR和探针法实时荧光PCR是实时荧光PCR方法中的两大类型；染料法实时荧光PCR如SYBR GREEN等，是利用染料与双链DNA结合后荧光强度大大增强实现检测的，因此可以仅用一对特异性的引物即可进行；探针法实时荧光PCR如Taqman实时荧光PCR，是利用特异性探针两端标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团，在探针完整时报告基团的信号被淬灭基团吸收，而PCR扩增时将结合到模板上的特异性探针被酶切降解，报告基团和淬灭基团分开，产生可以被检测的荧光信号，实现实时荧光PCR检测。

下面通过具体实施例并结合附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本申请进行进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。

一、试验材料和设备

1.工具酶和主要试剂

MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit购自Roche。Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)、Premix Ex Taq、Ex Taq、dNTP Mixture、2×GC bufferⅠ、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL5000、凝胶DNA回收试剂盒、pMD18-T Vector、质粒DNA小量纯化试剂盒等购于大连宝生物公司。Jm109大肠杆菌、IPTG、X-Gal、甘油、NaCl均为分析纯，购自上海生工。Ampicillin、CaCl2购自Sigma。琼脂糖购自Promega。胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉等购自广东环凯微生物科技公司。胶红购自Biotium。

2.试验仪器

本实验中使用的主要仪器如表1所示。

表1实验中使用的主要仪器

3.溶液和培养基的配制

LB培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl10g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.0，加去离子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20min。4℃保存。如果是固体培养基还需要加质量份数1.5%的琼脂。

氨苄青霉素(Ampicillin)母液：配成100mg/mL水溶液,-20℃保存备用。

IPTG：在蒸馏水中溶解IPTG，配制成24mg/mL的贮存液，用0.22μm过滤器除菌，用l mL EP管分装，贮存于-20℃。

X-gal：用二甲基甲酰胺溶解X-gal，配制成20mg/mL的贮存液。保存于避光的EP管中，并贮存于-20℃。

LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl10g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.0,加入15g琼脂粉，高温高压灭菌后，冷却至60℃左右。加入1mL Ampicillin(100mg/mL)、1mL IPTG(24mg/mL)、2ml X-Gal(20mg/mL)后均匀混合，倒平板，30～35mL培养基/90mm培养皿，4℃避光保存。

LB/Amp液体培养基：称取酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl10g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.0，加去离子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20min。冷却至室温，加入1mL Ampicillin(100mg/mL)后均匀混合，4℃保存。如果是固体培养基还需要加质量份数1.5%的琼脂。

4.试验样本

本试验样本均来自2011年第三季度江西地区各猪场采集的220个猪血清样本。特异性实验所需的病毒包括：猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcine Parvovlirus，PPV)、猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus type2，PCV2)由河南农业大学提供。

二、试验方法

1.猪TTSuV1和TTSuV2阳性标准品的制备

TTSuV作为一种新发现的病毒，目前还没有一种成熟的分离培养方法，所以在本实验中先用巢式PCR扩增包含有TTSuV Taqman rt-PCR扩增基因的片段，然后将这段基因连接到T载体中，构建阳性的重组质粒，作为TTSuV Taqmanrt-PCR的阳性标准品。

（1）样品核酸提取

用Roche MagNA Pure LC2.0自动核酸提取仪提取全基因组核酸。每个样品取140μL血清，按MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit说明操作，最后用100μL elution buffer溶解DNA，保存于-20℃冻存备用。

（2）巢式PCR扩增

参考Kekarainen T报道的引物序列进行巢式PCR扩增，分别扩增TTSuV1和TTSuV2部分片段，扩增片段包含有TTSuV的高度保守的非编码区。S1、S2为扩增TTSuV1的外引物，S3、S4为扩增TTVSu1的内引物；T1、T2为扩增TTSuV2的外引物，T3、T4为扩增TTSuV2的内引物。引物委托上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列及相关信息见表2。

Kekarainen T的报道具体参见：Kekarainen T,Sibila M,Segales J.Prevalence ofswine Torque teno virus in post-weaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)-affected and non-PMWS2affected pigs in Spain[J].J Gen Virol,2006,87:833-837。

表2巢式PCR扩增引物

表3第一轮巢式PCR扩增体系

TTSuV巢式PCR第一轮引物序列如表2所示为S1+S2、T1+T2，第一轮反应体系如表3所示，配制PCR预混液，加入DNA模板，分别进行TTSuV1和TTSuV2的扩增，整个反应在梯度PCR仪（Eppendorf，AG22331Hamburg）上进行。TTSuV1巢式PCR第一轮扩增条件为：94℃，5min预变性；然后进入35个循环：94℃，30s变性，59℃，30s退火，72℃，2min延伸；循环完成后72℃，5min延伸。TTSuV2的巢式PCR第一轮扩增的条件与TTSuV1相同，只是在循环过程中，30s退火的温度为60℃。

第一轮PCR反应结束后，分别取TTSuV1和TTSuV2的PCR产物作为模板，用第二套引物，如表2所示的S3+S4、T3+T4，进行第二轮的扩增，第二轮反应体系如表4所示。

表4第二轮巢式PCR扩增体系

TTSuV1巢式PCR第二轮扩增条件：94℃，5min预变性；然后进入35个循环：94℃，30s变性，60℃（TTSuV1），30s退火，72℃，2min延伸；循环完成后72℃，5min延伸。TTSuV2的巢式PCR第二轮扩增的条件与TTSuV1相同，只是在循环过程中，30s退火的温度为62℃。

（3）DNA电泳检测

先取50×TAE电泳缓冲液加水稀释成1×TAE电泳缓冲液，备用。然后制备胶液：称取0.3g琼脂糖粉末置于200ml锥形瓶中，加入30ml1×TAE的电泳缓冲液中，加热至琼脂糖全部熔化。将制胶板置水平的胶槽内，插样品梳子，向琼脂糖凝胶溶液加入3微升胶红，待冷却至50℃左右，将凝胶倒入制胶板内，凝胶厚度3～5mm间，冷却30min左右至凝胶完全凝固后轻轻拔去梳子。

将制好的凝胶置于电泳槽中，加1×TAE缓冲液使其没过胶面约1mm。用微量移液枪取3μL DNA样品与1μL6×loading buffer混匀，小心加样于加样孔中，marker加3μL，加完样后盖上电泳槽。电泳的条件为：设定电泳仪电压80V，电泳时间30min。电泳完毕后，将凝胶放入图像分析系统观察拍照并存档。

（4）PCR产物回收和纯化

将含有目的DNA的琼脂糖凝胶在紫外灯下进行切割回收，操作严格按照TaKaRa Agrose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(50次量)说明书进行，试剂盒组成包括：DR-ⅠBuffer、DR-ⅡBuffer、Rinse A、Rinse B、Elution Buffer、SpinColumn、Collection Tube。

A、在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，并吸尽凝胶表面的液体。切胶应快速完成以减少DNA暴露于紫外灯下的时间，减少DNA的损伤。

B、将胶块切碎以加快后续的胶块融化时间。

C、称胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μL进行计算。

D、向胶块中加入胶块融化液DR-ⅠBuffer：1.0％凝胶浓度加DR-ⅠBuffer量为3个凝胶体积量。

E、充分混合均匀后置于75℃振荡孵育以融化胶块（约6～10min）。

F、向上述胶块融化液中加入DR-ⅠBuffer量的1/2体积量的DR-ⅡBuffer，充分混合均匀。

G、将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

H、将步骤G的溶液转移于Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。

I、向Spin Column中加500μL Rinse A，室温12,000rpm离心30s，弃滤液。

J、向Spin Column中加700μL Rinse B，室温12,000rpm离心30s，弃滤液。

K、重复操作步骤J。

L、将Spin Column置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25μl的Elution Buffer，室温静置1min。先将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃。

M、室温12,000rpm离心1min洗脱DNA。

（5）大肠杆菌JM109感受态细胞的制备

A、从-70℃挑取JM109细胞，划线于LB固体培养基中，37℃培养过夜；

B、从过夜培养的平板上挑取一个单菌落，转到一个含有3-5ml LB液体培养基中，37℃下220rpm振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于含有100mL LB液体培养基的500mL锥形瓶中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。

C、然后把菌液转移到一个无菌的用冰预冷的50mL离心管中，冰浴20min；使培养物冷却至0℃。

D、4000rpm离心10min，去上清，将管倒置1min使痕量培养液流尽。

E、每50mL初培养物加30mL预冷的0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮

F、然后再在4℃，4000rpm离心10min，去上清，并将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。重复步骤E、F一次；

G、将菌体悬浮于1mL预冷的0.1M CaCl2溶液中，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮

H、加入50%甘油使其终浓度为15%并按100μL/管分装于-80℃保存。

（6）回收DNA片段的克隆

将回收的DNA片段与T载体连接，并转化大肠杆菌感受态细胞，操作严格按照pMD18-T Vector（TaKaRa Code:D101A）说明书进行。试剂盒组分包括：pMD18-T Vector（50ng/μL）、Control Insert（50ng/μL）、SolutionI。

A、在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μL。进行克隆时载体DNA和插入DNA的摩尔比一般为1:2-1:10。

B、加入等量的Solution I即5μl。连接体系见表5

表5连接反应体系

C、16℃反应30min。

D、全量10μL加入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30min。

E、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1min。

F、加入890μl LB培养基，37℃振荡培养60min。

G、在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

H、挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

（7）菌落PCR验证转化结果

菌落PCR采用表2所示的巢式PCR第二套引物进行，即S3+S4、T3+T4。PCR体系按表6所示，配制菌落PCR预混液，用灭菌的牙签从平板培养基上挑选白斑至PCR预混液中，进行菌落PCR验证。

表6菌落PCR反应体系

TTSuV1菌落PCR反应条件：94℃，5min预变性；然后进入35个循环：94℃，30s变性，60℃，30s退火72℃，2min延伸；循环后72℃，5min延伸。取3μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳观察。TTSuV2菌落PCR反应条件与TTSuV1相同，只是在循环过程中，30s退火的温度为62℃。

（8）质粒的抽提

根据菌落PCR结果，选取可能正确的菌液抽提质粒，使用质粒抽提试剂盒TaKaRa MiNiBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0(50次量)抽提,操作严格按照说明书进行，试剂盒组成包括：SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ、Rinse A、Rinse B、Elution Buffer。

A、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4mL的含有Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养，即培养12-16小时。

B、取1～4mL的培养过夜的菌液，12,000rpm离心2min，弃上清。

C、用250μL的含RNase A的SolutionⅠ使细菌沉淀充分悬浮。

D、加入250μL的SolutionⅡ上下轻轻翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明的溶液，轻轻颠倒混合，不可剧烈振荡，此步骤不宜超过5min。

E、加入400μL的4℃预冷的SolutionⅢ，上下轻轻翻转混合5～6次，直至形成紧实的凝集块，然后于室温静置2min。

F、室温12,000rpm离心10min，取上清。

G、将Spin Column安置于新的Collection Tube上。

H、将上步骤的上清液移至Spin Column中，12,000rpm离心1min，弃滤液。

I、向Spin Column中加入500μL的Rinse A，12,000rpm离心30s，弃滤液。

J、向Spin Column中加入700μL的Rinse B，12,000rpm离心30s，弃滤液。

K、重复操作步骤J。

L、将Spin Column置于Collection Tube，12,000rpm离心1min，除尽残液。

M、将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。

N、12,000rpm离心1min洗脱DNA。

（9）质粒DNA的浓度定量和纯度鉴定

将提取的pMD18-TTV1和pMD18-TTV2质粒，用核酸蛋白紫外分析仪测定其浓度。

（10）酶切验证质粒并送测序

用限制性内切酶ScaI和XbaI将重组质粒进行双酶切，酶切体系如表7所示。

表7重组质粒酶切反应体系

37℃酶切反应2-3h后，取5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

（11）重组质粒DNA的测序和序列分析

将酶切结果正确的重组质粒送上海生工进行测序，并将获得的TTSuV1和TTSuV2部分基因序列登陆NCBI分别与TTSuV1原型Sd-TTV31(accessionnumbers AB076001)和TTSuV2原型Sd-TTV2p(accession numbers AY823991)进行BLAST分析比较。

（12）重组质粒的稀释

取10μL重组质粒DNA溶液，用DEPC水分别按10的稀释倍数进行一系列稀释，制备成一系列标准品DNA溶液，存于-20℃，用于制作标准曲线。

2.TTSuV Taqman实时荧光PCR条件优化及方法的建立

（1）TTSuV基因组序列分析，设计引物和探针

TTSuV1型以Sd-TTV31(accession numbers AB076001)为原型，TTSuV2型以Sd-TTV2p(accession numbers AY823991)为原型，这两种基因型的同源性不足50%，针对TTV高度保守的UTR区域，根据Taqman引物和探针设计原则，并最终筛选出引物并和该引物的扩增区内的Taqman荧光探针，TTV1探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ1，TTV2探针5’端标记的荧光报告基团是HEX，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ1。BHQ1为非荧光染料的淬灭报告基团，但自身不发射荧光。

引物和探针序列如表8所示，引物和探针委托上海英骏生物技术有限公司合成。

表8本申请设计的引物和探针

（2）TTSuV Taqman实时荧光PCR条件的优化

将获得pMD18-TTV1和pMD18-TTV2质粒作为阳性标准品模板。分别摸索最适的TTSuV1和TTSuV2的Taqman rt-PCR反应条件和体系。

在PCR扩增中，温度的变化，特别是退火温度的高低对PCR的扩增结果产生较大的影响。提高退火温度，Taqman rt-PCR反应的特异性提高，但是产物的量降低；而退火温度降低时，呈现出相反的结果。

分别从pMD18-TTV1和pMD18-TTV2稀释好的质粒中挑选10^-1-10^-6这6个梯度，在53℃-65℃设置退火温度梯度进行荧定量PCR，以扩增曲线的出现时间、曲线平滑度、平台期荧光强度强弱等标准摸索出最优退火温度。

TTSuV1和TTSuV2的引物序列如表8所示，加样于96孔板上，在实时荧光PCR仪（Bio Rad，CFX96Real-time System）上进行反应。每次反应都以DEPC水为空白对照。TTV Taqman rt-PCR的初试反应体系见表9。

表9实时荧光PCR反应体系

常用的Taqman rt-PCR实验用两步法代替传统的变性、退火、延伸三步PCR循环。两步法：第一步为变性，第二步为退火和延伸合并，温度为55-60℃，这确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合，通常将Taqman探针设计在其Tm在60-70℃之间。

Taqman rt-PCR反应条件：95℃，90s预变性；然后进入40个循环：95℃，10s变性，在53-65℃之间设置8个温度梯度，30s退火延伸。在延伸的时候收集荧光信号。

确定了最佳退火温度后，再分别以pMD18-TTV1和pMD18-TTV2质粒的10^-3质粒为模板，在相同浓度的阳性质粒为模板的反应体系中，采用矩阵法优选TTV1和TTV2的引物和探针最佳浓度，荧光引物浓度在0.1μM到0.8μM之间，探针浓度在0.1μM到0.8μM之间进行筛选。引物浓度为0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM与探针浓度为0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM两两组合试验，确定最优的引物探针浓度比，读取检测结果。

对比不同条件下的扩增情况，遵循扩增曲线达到最小Ct值和最大扩增效率的优化原则，选定猪TTV Taqman rt-PCR的最优反应体系与扩增条件。

（3）TTSuV Taqman实时荧光PCR特异性试验

按照常规方法，利用Roche，MagNA Pure LC2.0，对猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcine Parvovlirus，PPV)、猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus type2，PCV2)等病毒进行核酸提取。

分别使用建立的TTSuV1Taqman rt-PCR和TTSuV2Taqman rt-PCR检测方法，对上述病毒的核酸进行检测，以确定该方法的特异性，同时，分别以构建的重组质粒pMD18-TTV1和pMD18-TTV2为阳性对照，DEPC水为阴性对照。

（4）TTSuV Taqman实时荧光PCR灵敏度试验

取pMD18-TTV1和pMD18-TTV2梯度稀释的样品为模板，即稀释度为10⁰-10^-10的重组质粒，分别用优化后的方法进行实时荧光扩增，检测该方法的灵敏度。

（5）TTSuV Taqman实时荧光PCR重复性试验

分别使用建立的TTSuV1Taqman rt-PCR和TTSuV2Taqman rt-PCR检测方法，对3个不同浓度的TTSuV1和TTSuV2阳性质粒在同一反应条件下进行5次独立检测，以确定此方法的批内重复性；连续5天对相同的样品进行检测，以确定此方法的批间重复性。

（6）TTSuV Taqman实时荧光PCR标准曲线的绘制

pMD18-TTV1和pMD18-TTV2质粒各取6个稀释度（10^-2-10^-7）作为标准模板，每个梯度各做6个平行样，分别用本实验建立的TTSuV1和TTSuV2单重Taqman实时荧光定量PCR方法，进行荧光定量PCR反应，计算Ct值并绘制标准曲线。

（7）双重实时荧光PCR

采用本申请设计的检测TTSuV1和TTSuV2两套引物、探针，进行双重实时荧光PCR检测，初步测试了双重实时荧光PCR的特异性和分别对两个病毒的检测灵敏度。

三、结果与分析

1.制备阳性标准品结果

（1）巢式PCR扩增产物电泳结果

用TTSuV1和TTSuV2的引物对样品进行巢式PCR扩增，得到的结果显示，扩增TTSuV1片段得到的产物大小为1397bp，扩增TTSuV2片段得到的产物大小为1268bp，电泳结果与预期片段大小一致。结果如图1中A部分所示，其中，M为DNA Marker DL2000，1为TTV1阳性样品扩增产物，2为TTV2阳性样品扩增产物。

（2）菌落PCR电泳结果

挑取白斑进行菌落PCR验证，得到的结果如图1中B所示，扩增TTSuV1克隆阳性菌得到的产物大小为1397bp；扩增TTSuV2克隆阳性菌得到的产物大小为1268bp；电泳结果与预期片段大小一致。图1的B中，M为DNA Marker DL2 000，1为TTV1阳性样品扩增产物，2为TTV2阳性样品扩增产物。

（3）质粒酶切验证电泳图

对抽提的重组质粒进行双酶切验证，结果如图2所示，TTSuV1重组质粒酶切后的产物是约2692bp的pMD18-T载体和约1397bp的插入片段。TTSuV2重组质粒酶切后的产物为约2692bp的pMD18-T载体和约1268bp的插入片段。结果与预期片段数量及大小一致，表明连入T载体的DNA片段和试验设计完全一致。图2中，M为DNA Marker DL5000，1为TTV1阳性样品扩增产物，2为TTV2阳性样品扩增产物。

（4）质粒测定浓度

用核酸蛋白分析仪对重组质粒进行浓度测定，pMD18-TTV1重组质粒的浓度为40.54ng/μL，重组质粒pMD18-TTV2的浓度为24.24ng/μL，两个重组质粒的OD₂₆₀/OD₂₈₀均>1.8，表明提取的质粒纯度较好。

（5）测序结果

重组质粒pMD18-TTV1和pMD18-TTV2经上海生工测序鉴定后，将获得的TTSuV1和TTSuV2部分DNA序列在美国国立生物信息中心NCBI Blast在线分析软件进行DNA序列的同源性对比，验证是否为TTV序列，结果表明pMD18-TTV1与Sd-TTV31(accession numbers AB076001)匹配度为97%，pMD18-TTV2Sd-TTV2p(accession numbers AY823991)匹配度为89%。说明引物特异性扩增且无错配，克隆成功并保持了序列的完整性，重组质粒pMD18-TTV1和pMD18-TTV2为本实验中的预期标准品。

（6）重组质粒的稀释

按DNA浓度和拷贝数换算公式换算其浓度单位，换算后TTSuV1标准品溶液的浓度为9.2×10⁹copies/μL。TTSuV2标准品溶液的浓度为5.6×10⁸copies/μL。

本申请中采用的换算公式为：

取10μL TTSuV1标准品溶液，用DEPC水分别按10的稀释倍数进行一系列稀释，制备成9.2×10⁹copies/μL-9.2×10⁶copies/μL，即稀释度为10⁰-10^-3，取10μLTTSuV2标准品溶液，用DEPC水分别按10的稀释倍数进行一系列稀释，制备成5.6×10⁸copies/μL-5.6×10⁵copies/μL，即稀释度为10⁰-10^-3，同时将10^-3标准品小量分装，存于-20℃，使用标准品DNA时，每次取出1管，临时按1:10梯度稀释，用于制作标准曲线。

2.TTSuV Taqman实时荧光PCR结果

（1）TTSuV Taqman实时荧光PCR优化后的反应条件和体系

TTSuV1标准品9.2×10⁶copies/μL浓度的重组质粒的10^-1的稀释质粒在53℃-65℃范围内的8个梯度退火温度进行荧定量PCR反应，结果显示，温度越高，扩增效率越低；57.7℃，55.4℃，53.8℃，53℃这4个退火温度的扩增结果较好，且结果很接近，如图3所示。TTSuV1标准品的10^-1-10^-6这6个梯度质粒在53℃-65℃范围内进行荧定量PCR反应的结果显示：在55.4℃扩增效率最高E=101.9%，结果如图4和图5所示。图4中从左到右依序为10^-1-10^-6的6个梯度质粒的检测曲线。

TTSuV2标准品5.6×10⁵copies/μL浓度的重组质粒的10^-1的稀释质粒在53℃-65℃范围内的8个不同退火温度进行荧定量PCR反应，结果显示，温度越高，扩增效率越低，57.7℃，55.4℃，53.8℃，53℃这4个退火温度的扩增结果较好，且结果很接近，如图6所示。TTSuV2标准品的10^-1-10^-6这6个梯度质粒在53℃-65℃范围内进行Taqman rt-PCR反应的结果显示，在55.4℃扩增效率最高E=97.5%，结果如图7和图8所示。图7中从左到右依序为10^-1-10^-6的6个梯度质粒的检测曲线。

本申请采用矩阵法优选TTSuV1和TTSuV2的引物和探针最佳浓度，试验结果表明，本实验最终确定的引物探针终浓度分别为0.6μmol/L和0.6μmol/L,检测获得的Ct值最小、荧光扩增曲线最典型而ΔRn值较大，从而确定其为最佳引物和探针浓度。

优化后的反应体系如表10所示，优化后的反应条件为：95℃，90s预变性；然后进行40个循环：95℃，10s变性，55.4℃，30s退火延伸。

表10优化的实时荧光PCR反应体系

（2）TTSuV Taqman实时荧光PCR特异性试验

采用本实验建立的TTSuV1和TTSuV2Taqman rt-PCR方法对TTSuV1和TTSuV2病毒及其它猪DNA病毒进行检测，结果表明，TTSuV1Taqman实时荧光定量PCR方法只对猪TTSuV1能得到特异性的荧光扩增曲线，而对TTSuV2和其他病毒没有荧光扩增曲线，结果如图9所示；TTSuV2Taqman rt-PCR方法只对TTSuV2能得到特异性的荧光扩增曲线，而对TTSuV1和其他病毒没有荧光扩增曲线，结果如图10所示。表明本实验建立的TTSuV1Taqman实时荧光PCR和TTSuV2Taqman实时荧光PCR检测方法对TTSuV1和TTSuV2病毒有很好的特异性，与其它猪DNA病毒无交叉反应。

（3）TTSuV Taqman实时荧光PCR灵敏度试验

对pMD18-TTV1的11个梯度质粒的检测结果显示，在9.2×10⁹copies/μL-9.2copies/μL范围内，各个浓度梯度的扩增曲线平滑，反应体系效率高，平台期荧光强度强，浓度与CT值有很好的线性关系，如图11所示，荧光曲线排列顺序，从左到右模板浓度依次为9.2×10⁹copies/μL、9.2×10⁸copies/μL、9.2×10⁷copies/μL、9.2×10⁶copies/μL、9.2×10⁵copies/μL、9.2×10⁴copies/μL、9.2×10³copies/μL、9.2×10²copies/μL、9.2copies/μL。Taqman rt-PCR方法检测TTV1基因组的检测限为9.2copies/μL，灵敏度高。

对pMD18-TTV2的11个梯度质粒的检测结果显示，在5.6×10⁸copies/μL-5.6×10¹copies/μL范围内，各个浓度梯度的扩增曲线平滑，反应体系效率高，平台期荧光强度强，浓度与Ct值有很好的线性关系，如图12所示，荧光曲线排列顺序，从左到右模板浓度依次为5.6×10⁸copies/μL、5.6×10⁷copies/μL5.6×10⁶copies/μL、5.6×10⁵copies/μL、5.6×10⁴copies/μL、5.6×10³copies/μL、5.6×10²copies/μL、5.6×10¹copies/μL。Taqman rt-PCR方法检测TTV2基因组的检测限为56copies/μL，灵敏度高。

（4）TTSuV Taqman实时荧光PCR重复性试验

运用TTSuV1Taqman rt-PCR方法对3个不同浓度的TTSuV1标准品在同一反应条件下分别做5个批内重复和5个批间重复，结果显示批内重复变异系数均小于1%，批内重复变异系数均小于3%，表明该方法重复性好，详见表11。

表11TTSuV1实时荧光PCR重复性实验结果

运用TTSuV2单重Taqman rt-PCR方法对3个不同浓度的猪TTSuV2标准品在同一反应条件下分别做5个批内重复和5个批间重复，结果显示批内重复变异系数均小于1%，批内重复变异系数均小于3%，表明该方法重复性好。详见表12。

表12TTSuV2实时荧光PCR重复性实验结果

（5）TTSuV Taqman实时荧光PCR标准曲线

本实验以质粒模板的拷贝数的对数为X轴，Ct值为Y轴绘制了TTSuV1Taqman rt-PCR标准曲线，TTSuV1标准品的扩增曲线如图13所示，荧光曲线排列顺序，从左到右模板浓度依次为9.2×10⁷copies/μL、9.2×10⁶copies/μL、9.2×10⁵copies/μL、9.2×10⁴copies/μL、9.2×10³copies/μL、9.2×10²copies/μL。其中扩增效率E是根据标准曲线的斜率计算出来的，方程等式为：E=10-1/斜率。结果显示，在9.2×10⁷-9.2×10²copies/μL范围内，扩增效率为96.9%，标准曲线的斜率为-3.398，截距为42.685，R2为1.000。各浓度范围内有良好的线性关系，如图14所示。直线方程为：y=-3.398X+42.685，y为循环值，x为log拷贝数/μL。

以质粒模板的拷贝数的对数为X轴，Ct值为Y轴绘制了TTSuV2Taqmanrt-PCR标准曲线。TTSuV2标准品的扩增曲线如图15所示，荧光曲线排列顺序，从左到右模板浓度依次为5.6×10⁶copies/μL、5.6×10⁵copies/μL、5.6×10⁴copies/μL、5.6×10³copies/μL、5.6×10²copies/μL、5.6×10¹copies/μL。在5.6×10⁶copies/μL-5.6×10¹copies/μL范围内，扩增效率为95.3%，标准曲线的斜率为-3.44，截距为39.511，R2为0.998。各浓度范围内有良好的线性关系，如图16所示。直线方程为：y=-3.44X+39.511，其中y为循环值，x为log拷贝数/μL。

在对送检样品进行检测时，可根据获得的Ct值和标准曲线计算该样品所含病毒数量，但所检测到的只是病毒的DNA拷贝数，而非具有感染性的病毒颗粒。

本申请针对TTSuV1、TTSuV2分别建立了Taqman实时荧光PCR检测方法，具有快速、灵敏、特异、定性、定量等优点，为TTSuV的快速诊断奠定了基础。与常规PCR相比较，本方法不但可以定性检测TTSuV1、TTSuV2，而且能够检测出常规PCR无法检测的病料，同时也免去了DNA水平电泳的步骤，更加省时，且操作简单。利用本试验建立的检测方法，可以对TTSuV感染猪进行早期、快速检测及流行病学调查，同时也为研究TTSuV在猪体内的感染及分布提供了新的技术手段。

（6）双重实时荧光PCR检测结果

在前述实时荧光PCR检测的基础上，本申请还将两套引物和探针进行组合，对TTSuV1和TTSuV2进行双重实时荧光PCR检测，优化的双重实时荧光PCR检测的反应体系如表13所示。

表13优化的双重实时荧光PCR反应体系

双重实时荧光PCR的特异性结果如图17所示，本实验建立的双重TaqMan实时荧光PCR检测方法对TTSuV1和TTSuV2病毒有很好的特异性，与其它常见猪DNA病毒无交叉反应。检测所用的对照样品与单重实时荧光PCR的相同。

双重实时荧光PCR对pMD18-TTV1的11个梯度质粒的检测结果显示，在9.2×10⁹copies/μL-9.2copies/μL范围内，各个浓度梯度的扩增曲线平滑，反应体系效率高，平台期荧光强度强，浓度与CT值有很好的线性关系如图18所示，荧光曲线排列顺序，从左到右模板浓度依次为9.2×10⁹copies/μL、9.2×10⁸copies/μL、9.2×10⁷copies/μL、9.2×10⁶copies/μL、9.2×10⁵copies/μL、9.2×10⁴copies/μL、9.2×10³copies/μL、9.2×10²copies/μL、9.2copies/μL。Taqmanrt-PCR方法检测TTV1基因组的检测限为9.2copies/μL，灵敏度高。

双重实时荧光PCR对pMD18-TTV2的11个梯度质粒的检测结果显示，在5.6×10⁸copies/μL-5.6×10¹copies/μL范围内，各个浓度梯度的扩增曲线平滑，反应体系效率高，平台期荧光强度强，浓度与CT值有很好的线性关系如图19所示，荧光曲线排列顺序，从左到右模板浓度依次为5.6×10⁸copies/μL、5.6×10⁷copies/μL、5.6×10⁶copies/μL、5.6×10⁵copies/μL、5.6×10⁴copies/μL、5.6×10³copies/μL、5.6×10²copies/μL、5.6×10¹copies/μL，Taqman rt-PCR方法检测TTV2基因组的检测限为56copies/μL，灵敏度高。

本试验在单重Taqman实时荧光PCR检测方法的基础上，建立了能够同时检测TTSuV1和TTSuV2的双重Taqman实时荧光PCR检测方法，具有快速、准确、特异、灵敏、高通量等优点，为出入境生猪快速检测提供了实用的检测手段。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于猪细环病毒I型检测的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物含有Seq ID No.1所示序列，所述下游引物含有SeqID No.2所示序列；

Seq ID No.1：5’-GGTTCAGGAGGCTCAATTTGG-3’

Seq ID No.2：5’-TTTGAATTTAACGGTTTTCAGTCTTC-3’。

2.一种用于猪细环病毒I型检测的探针，其特征在于：所述探针含有Seq IDNo.3所示序列；

Seq ID No.3：5’-TCGCTTCGCTCGCACCACGT-3’。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于：所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

5.一种猪细环病毒I型的实时荧光PCR检测方法，包括采用权利要求1所述的引物和权利要求3或4所述的探针进行Taqman荧光定量PCR检测。

6.一种猪细环病毒I型的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中含有权利要求1所述的引物。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还含有权利要求2-4任一项所述的探针。

8.根据权利要求6或7所述的检测试剂盒在猪细环病毒I型检测中的应用。

9.一种采用权利要求6或7所述的检测试剂盒对猪细环病毒I型进行的检测，所述检测包括但不限于，常规PCR、染料法实时荧光PCR、探针法实时荧光PCR中的至少一种。

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