CN111621602B - 猪圆环病毒3型快速检测荧光定量pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

猪圆环病毒3型快速检测荧光定量pcr试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111621602B
CN111621602B CN202010571893.0A CN202010571893A CN111621602B CN 111621602 B CN111621602 B CN 111621602B CN 202010571893 A CN202010571893 A CN 202010571893A CN 111621602 B CN111621602 B CN 111621602B
Authority
CN
China
Prior art keywords
porcine circovirus
circovirus type
kit
quantitative pcr
fluorescent quantitative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010571893.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111621602A (zh
Inventor
薛霜
徐松
万佳
徐丹丹
李婷婷
谢红玲
朱薇
漆世华
石宝兰
李晶梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd
Original Assignee
National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd filed Critical National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd
Priority to CN202010571893.0A priority Critical patent/CN111621602B/zh
Publication of CN111621602A publication Critical patent/CN111621602A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111621602B publication Critical patent/CN111621602B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒3型快速检测荧光定量PCR试剂盒及其应用。试剂盒包括用于扩增猪圆环病毒3型cap基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针；其中，上游引物序列为5’‑TGGGCCTCCTAATGAATAGTTTT‑3’，下游引物序列为5’‑GAGACACAGAGCTATATTCAGAAG‑3’；TaqMan荧光标记探针序列为5’FAM‑CCAAGGAGACGACGACGC‑BHQ13’。本发明试剂盒可同时进行大批量样本的分析，灵敏度高、特异性好，用于快速定性/定量检测猪圆环病毒3型的感染或感染早期的任一种或其组合，更优选用于定量检测猪圆环病毒3型病毒拷贝数。

Description

猪圆环病毒3型快速检测荧光定量PCR试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型快速检测荧光定量PCR试剂盒及其应用。
背景技术
猪圆环病毒病又叫仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)，是由猪圆环病毒(Porcinecircoviruses，PCV)感染引起的以猪只体质下降、消瘦、腹泻、呼吸困难、免疫抑制以及多病原继发感染为主要特征的一类病毒性传染病。猪圆环病毒是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为1.7kb长，是最小的动物DNA病毒之一。已经确定有两种类型的PCV，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在细胞培养物中作为一种污染物鉴定，其对猪只没有致病性。PCV2于1998年首次报道，能引起猪只的猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，主要引起仔猪多系统衰竭综合征，肺炎、猪皮炎和肾病综合征及繁殖障碍，该病对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。而近几年，一种新型的猪圆环病毒，即猪圆环病毒3型(PCV3)首先在美国报道，该病毒基因组长为2.0kb，能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍以及心脏和多系统的炎症反应。近期，华中农业大学何启盖教授组在我国首次检出PCV3。研究人员通过大范围的检测发现，该病原可以在来自我国多个省份的样品中检测到，说明其在中国已广泛存在。而在检测到的PCV3阳性病料中，部分病料表现为PCV2和PCV3共感染。
病毒分离是实验室确诊特定病原体感染的经典方法，但由于PCV3在PK15细胞或ST细胞上均不产生细胞病变，目前仍未有研究资料报道能够成功通过细胞分离到PCV3，而仅仅只是使用分子生物学检测方法检测到PCV3病毒核酸的存在，并进行测序鉴定。目前广泛应用的常规PCR检测方法简单快速，但容易出现交叉污染，容易产生假阳性，而隐性感染和混合感染的猪群中病毒含量可能并不高。因此，建立一种快速、准确、灵敏且操作简便的PCV3检测方法势在必行。
新兴的实时荧光定量PCR技术不但克服了传统PCR技术存在的缺点，且具有结果直观可靠、特异性强、灵敏度高、快速简单等优点，可以直观地从分子生物学水平检测到病毒核酸的存在。该技术包括染料法和探针法两种，其中，染料法是利用能与双链DNA结合的染料(如SYBR Green)结合到双链DNA产物内部，再根据检测到的荧光信号实现定量检测的目的，但存在无法区分引物二聚体及非特异产物信号的缺陷；探针法是在常规的PCR基础上加入一条特异性的荧光探针(如TaqMan探针)，根据探针两边标记的报告荧光基团和荧光淬灭基团之间产生的荧光共振能量转移原理，释放的荧光信号强度与扩增产物的量呈正比关系而实现定量检测。但是，实验室人员在使用实时荧光定量PCR技术时，通常需要分别购买荧光染料和酶体系，并花费大量时间用于设计合适的引物探针和优化反应体系等工作，且在目前的临床检测或科研实践中，尚没有开发出一种通过简单操作即能实现快速检测PCV3的试剂盒产品。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒3型快速检测荧光定量PCR试剂盒及其应用，具体是指特异性检测猪圆环病毒3型的荧光定量PCR试剂盒及其在猪圆环病毒3型快速检测中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于扩增猪圆环病毒3型cap基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，其中，所述特异性引物对的上游引物序列为5’-TGGGCCTCCTAATGAATAGTTTT-3’，序列如 SEQ ID NO.1所示；特异性引物对的下游引物序列为5’-GAGACACAGAGCTATATTCAGAAG-3’，序 列如SEQ ID NO.2所示；所述TaqMan探针的序列为5’-CCAAGGAGACGACGACGC-3’，序列如SEQ ID NO.3所示；且TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1。
本发明的优选技术方案中，所述特异性引物对和特异性的TaqMan探针被包括在PCR反应液中，其中，所述的PCR反应液是由1×PCR Buffer、0.5mmol/L的dNTP混合物、0.2μmol/L的TaqMan探针、0.2μmol/L的上游引物、0.2μmol/L的下游引物和无核酸酶水组成。
本发明的优选技术方案中，所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、阳性质控品和阴性质控品的任一组份或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述的阳性质控品为含有猪圆环病毒3型cap基因保守序列的T载体质粒。
本发明的目的在于提供本发明的荧光定量PCR试剂盒用于检测待检样本中是否存在猪圆环病毒3型DNA的方法中的应用。
本发明的目的还在于提供本发明的荧光定量PCR试剂盒用于快速定性/定量检测猪圆环病毒3型的方法中的应用，优选用于快速定性/定量检测猪圆环病毒3型的感染或猪圆环病毒3型感染早期的任一种或其组合，更优选用于定量检测猪圆环病毒3型病毒拷贝数。
本发明所述的Ct值(Cycle threshold，Ct)是指PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值(threshold)时所经过的扩增循环数，Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光到达阈值的循环数越少，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，再根据检测获得的待测样品的Ct值，即可由标准曲线计算待测样品的起始拷贝数。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明优化了特异性检测猪圆环病毒3型感染的荧光定量PCR试剂盒的组成，包括优化了用于扩增猪圆环病毒3型cap基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针，还优化了包括特异性引物对和特异性的TaqMan探针的PCR反应液组成，所述的试剂盒具有特异性良好、灵敏度高、检测方便快速等优点。
2、本发明的特异性检测猪圆环病毒3型感染的荧光定量PCR试剂盒的检测下限为1个拷贝/μl的病毒核酸量，具有检测灵敏度高的优点。
3、本发明的特异性检测猪圆环病毒3型感染的荧光定量PCR技术中所用的TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记了本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1，降低了背景荧光信号，提高了信噪比，显著提高了实验结果的精确性。
4、本发明的特异性检测猪圆环病毒3型感染的荧光定量PCR技术在整个扩增和检测过程均在同一个封闭管内进行，有效避免了气溶胶污染而造成的假阳性，具有操作简便、自动化、快速(整个检测过程仅需1～1.5小时)、准确等优点。
附图说明
图1是实施例1中第1组引物和探针的扩增曲线；
其中：A、B、C、D分别是稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍的PCV3病毒核酸，E是水对 照。图2～图5中的相关说明与此相同。
图2是实施例1中第2组引物和探针的扩增曲线。
图3是实施例1中第3组引物和探针的扩增曲线。
图4是实施例1中第4组引物和探针的扩增曲线。
图5是实施例1中第5组引物和探针的扩增曲线。
图6是实施例4中本发明特异性检测猪圆环病毒3型的荧光定量PCR技术灵敏度的动力学曲线；
其中：A～G分别是1×106个拷贝/μl、1×105个拷贝/μl、1×104个拷贝/μl、1×103 个拷贝/μl、1×102个拷贝/μl、1×101个拷贝/μl和1个拷贝/μl模板浓度的检测动力学曲线， H是阴性质控品的扩增曲线。
图7是实施例4中本发明特异性检测猪圆环病毒3型的荧光定量PCR技术灵敏度的标准曲线。
图8是实施例5中本发明特异性检测猪圆环病毒3型的荧光定量PCR技术特异性的动力学曲线；
其中：A～K分别是PCV3 DNA、PCV1 DNA、PCV2 DNA、PPV DNA、PRV DNA、PRRSV cDNA、 CSFV cDNA、PEDV cDNA、TGEV cDNA、PDCoV cDNA和PCV3阴性质控品的扩增曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的进一步的解释和说明，而非用于限制本发明的范围。
实施例1猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测引物和探针的对比研究
1、引物和探针的设计
参考Genebank中已公布的PCV3的cap基因序列，并结合荧光PCR引物探针设计特点，利用Beacon Designer及LaserGene软件设计针对PCV3的cap基因保守区片段的引物和探针(见表1中第1组)，同时将文献1(Wang J,ZhangY,Wang J,Liu L,Pang X,YuanW.Development ofa TaqMan-based real-time PCR assay for the specific detectionof porcine circovirus 3[J].J Virol,2017,248:177-180.)、文献2(Palinski R,
Figure BDA0002549621630000062
P,Shang P,et al.A novel porcine circovirus distantly related to knowncircoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndromeand reproductive failure[J].J Virol,2016,91(1):e01879-16.)、专利1(公布号CN107653348A，用于检测猪圆环病毒3型的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法、应用)和专利2(公布号CN 109593883A，猪圆环病毒多重实时荧光PCR检测引物对、探针、及制备的试剂盒)中报道的检测PCV3的引物和探针序列(即表1中第2～5组)作为对照进行比较研究。
表1扩增PCV3的引物和探针序列
Figure BDA0002549621630000061
Figure BDA0002549621630000071
注：表1中的PCV3 F表示上游引物，PCV3 R表示下游引物，PCV3 P表示荧光探针。
2、引物和探针的对比试验
将PCV3病毒核酸(该核酸来自于临床分离的PCV3阳性病料，并经基因测序鉴定为PCV3)进行10倍稀释形成4个梯度，即稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍。用PCR反应预混液(商购，Premix Ex TaqTM，TAKARA)对表1中的5套引物探针进行敏感性和扩增效率的对比。结果见图1～图5，其中，图1～图5中的A、B、C、D分别是稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍的PCV3病毒核酸，E是水对照。
由图1～图5可见，第1组引物和探针的扩增曲线平滑，敏感性较好，且扩增效率高，将第1组的引物和探针序列作为本发明试剂盒的引物和探针，即上游引物(PCV3 F)：5’-TGGGCCTCCTAATGAATAGTTTT-3’，序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物(PCV3 R)：5’-GAGACACAGAGCTATATTCAGAAG-3’，序列如SEQ ID NO.2所示；荧光探针(PCV3 P)：5’FAM-CCAAGGAGACGACGACGC-BHQ13’，序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测体系的优化
引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，特异性引物对的浓度分别选用0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L，特异性探针的浓度分别选用0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L，进行PCR预实验，优选特异性引物对浓度为0.2μmol/L，特异性探针浓度为0.2μmol/L。
dNTP混合物浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，dNTP混合物的浓度分别选用0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L，进行PCR预实验，优选dNTP混合物浓度为0.5mmol/L。
Taq DNA聚合酶用量的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，Taq DNA聚合酶的浓度分别选用1.5U/反应、2U/反应、2.5U/反应、3U/反应、3.5U/反应，进行PCR预实验，优选Taq DNA聚合酶用量为2.5U/反应。
通过预实验的筛选和优化，确定试剂盒的组成如下：
1.PCV3 PCR反应液：1.1ml/管。每个反应体系包括10×PCR Buffer(缓冲液)2.5μl、25mmol/L dNTP混合物0.5μl、10μmol/L TaqMan探针0.5μl、10μmol/L上游引物0.5μl、10μmol/L下游引物0.5μl、无核酸酶水17μl，共21.5μl。
2.DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶(5U/μl)，25μl/管。每个反应体系使用0.5μl。
3.无核酸酶水：1ml/管。
4.阳性质控品：含有猪圆环病毒3型cap基因保守序列的T载体质粒(浓度为1×106个拷贝/μl)，100μl/管。
5.阴性质控品：健康猪血清，PBS稀释后分装，300μl/管。
实施例3猪圆环病毒3型荧光定量PCR快速检测试剂盒的应用方法
1.病毒DNA的提取
使用商品化的病毒核酸提取试剂盒提取阴性质控品和待检样品中的病毒DNA，按试剂盒说明书方法进行操作。
2.PCR扩增
2.1PCR反应体系的配制
设定PCR扩增所需的PCR反应管的管数为n，其中n＝1管阴性质控品+5管PCV3定量标准品(用无核酸酶水将阳性质控品梯度稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，得到浓度为1×105个拷贝/μl、1×104个拷贝/μl、1×103个拷贝/μl、1×102个拷贝/μl、1×101个拷贝/μl的定量标准品系列)+待测样本的管数。
每个PCR反应前需配制预混液，所述预混液的组成为，21.5μl的PCV3 PCR反应液和0.5μl的Taq酶。取出PCV3 PCR反应液，室温融化并颠倒混匀，2000rpm离心10秒；取出Taq酶，2000rpm离心10秒，收集粘在管壁的酶贮液；量取预混液中各试剂的所需量，将其加入适当体积的离心管中，完全颠倒混匀，2000rpm离心10秒，即得。
向设定的n个PCR反应管中各加入22μl的上述预混液后，再分别向设定的PCR反应管中加入提取的待测样本DNA、阴性质控品和稀释好的定量标准品各3μl，盖紧管盖，置于荧光PCR仪(如StepOne Plus，ABI)上，记录待测样本的摆放孔位。
2.2PCR反应参数的设置
第一步：95℃，3分钟，1个循环；
第二步：95℃，5秒，60℃，40秒(收集荧光信号)，40个循环；其中，需根据使用的检测仪器而适当调整反应参数。
3.结果判定
结果分析条件设定：点击分析界面，取3～10个循环或3～15个循环的荧光信号确定基线(baseline)。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品及阴性样本的扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，不出现Ct值且与阳性质控品的指数期相交为准。
结果判定：当检测样品Ct值≤37，且曲线有明显的指数增长期时，样品判为阳性；当检测样品Ct值＞37时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性；当检测样品无Ct值并且扩增曲线无明显指数增长期时，样品判为阴性。当进行定量检测时，荧光定量PCR仪可根据设置的定量标准品浓度和相应的检测Ct值自动得出标准曲线并计算出样品DNA浓度。所设置的定量标准品(1×101个拷贝/μl～1×105个拷贝/μl)检测结果均应为阳性(Ct值≤37)，标准曲线线性相关系数(R2)应≥0.98。当上述条件成立时，可根据荧光定量PCR仪计算结果自动得出样品DNA浓度。
实施例4猪圆环病毒3型荧光定量PCR快速检测试剂盒的灵敏性试验
将PCV3阳性质控品用无核酸酶水进行10倍梯度稀释至1个拷贝/μl，利用本发明试剂盒进行检测，结果见图6。其中，图6中的A～G模板浓度分别为1×106个拷贝/μl、1×105个拷贝/μl、1×104个拷贝/μl、1×103个拷贝/μl、1×102个拷贝/μl、1×101个拷贝/μl、1个拷贝/μl，H是PCV3阴性质控品。
由图6可见，本发明的特异性检测猪圆环病毒3型的荧光定量PCR技术在1个拷贝/μl～1×106个拷贝/μl的范围内可得到良好的动力学曲线，其检测限低至1个拷贝/μl的病毒量，具有良好的检测灵敏度。并且，在1个拷贝/μl～1×106个拷贝/μl范围内的标准曲线理想(见图7)，标准曲线的线性相关系数(R2)在0.99以上，误差小，检测结果可信度较高。
实施例5猪圆环病毒3型荧光定量PCR快速检测试剂盒的特异性试验
利用本发明的荧光定量PCR快速检测试剂盒检测猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)等猪体常见病原的核酸，并设阴性对照组(PCV3阴性质控品)，以验证本试剂盒的特异性。结果见图8，其中，A是PCV3 DNA、B是PCV1 DNA、C是PCV2DNA、D是PPV DNA、E是PRV DNA、F是PRRSV cDNA、G是CSFV cDNA、H是PEDV cDNA、I是TGEVcDNA、J是PDCoV cDNA、K是PCV3阴性质控品。
由图8可见，本发明试剂盒可特异性地检出猪圆环病毒3型，而对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型及其他几种常见猪病毒病原的检测结果均为阴性。
序列表
<110> 国药集团动物保健股份有限公司
<120> 猪圆环病毒3型快速检测荧光定量PCR试剂盒及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 1
tgggcctcct aatgaatagt ttt 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 2
gagacacaga gctatattca gaag 24
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 3
ccaaggagac gacgacgc 18
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 4
cggacttgta acgaatccaa act 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 5
ggagcattta tgtcccggaa a 21
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 6
ctttsgtgcc gtagaagtct gtcattcca 29
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 7
agtgctcccc attgaacg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 8
acacagccgt tacttcac 18
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 9
accccatggc tcaacacata tgacc 25
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 10
acgtcgggaa atctgactga a 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 11
ccgcccatag cgtataaata ctg 23
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 12
ttgcggagaa gatg 14
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 13
gggtgaagta acggctgtgt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 14
tctccagctc agcaaacaaa 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 15
agatctatgg ctgtgtgccc 20

Claims (3)

1.一种荧光定量PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于扩增猪圆环病毒3型cap基因保守区域的特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针；其中，所述特异性引物对的上游引物序列，如SEQ ID NO.1所示；特异性引物对的下游引物序列，如SEQ IDNO.2所示；所述TaqMan探针的序列，如SEQ ID NO.3所示；且TaqMan探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记本身不发光的荧光淬灭基团BHQ1；
所述特异性引物对和特异性的TaqMan探针被包括在PCR反应液中；其中，所述的PCR反应液是由1×PCRBuffer、0.5mmol/L的dNTP混合物、0.2μmol/L的TaqMan探针、0.2μmol/L的上游引物、0.2μmol/L的下游引物和无核酸酶水组成；
所述试剂盒还包括TaqDNA聚合酶、无核酸酶水、阳性质控品或阴性质控品中的任一组份或其任意组合；
所述的阳性质控品为含有猪圆环病毒3型cap基因保守序列的T载体质粒。
2.一种如权利要求1所述荧光定量PCR快速检测试剂盒在制备用于特异性检测待检样本中猪圆环病毒3型DNA试剂中的应用，其特征在于：所述组合物包括特异性引物对和特异性的TaqMan荧光标记探针；所述特异性引物对用于扩增猪圆环病毒3型cap基因保守区域；且采用所述荧光定量PCR快速检测试剂盒的应用方式，以快速定性/定量检测猪圆环病毒3型DNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：用于定量检测猪圆环病毒3型病毒拷贝数。
CN202010571893.0A 2020-06-22 2020-06-22 猪圆环病毒3型快速检测荧光定量pcr试剂盒及其应用 Active CN111621602B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010571893.0A CN111621602B (zh) 2020-06-22 2020-06-22 猪圆环病毒3型快速检测荧光定量pcr试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010571893.0A CN111621602B (zh) 2020-06-22 2020-06-22 猪圆环病毒3型快速检测荧光定量pcr试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111621602A CN111621602A (zh) 2020-09-04
CN111621602B true CN111621602B (zh) 2023-03-14

Family

ID=72258493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010571893.0A Active CN111621602B (zh) 2020-06-22 2020-06-22 猪圆环病毒3型快速检测荧光定量pcr试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111621602B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112646930A (zh) * 2020-12-31 2021-04-13 四川省畜牧科学研究院 一种用于检测猪圆环病毒3型的引物对、探针、试剂盒及其检测方法
CN113846182B (zh) * 2021-06-18 2022-10-14 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 一种快速可视化检测pcv3的试剂盒及其检测方法
CN114354526A (zh) * 2021-12-28 2022-04-15 国药集团动物保健股份有限公司 一种猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107653348A (zh) * 2017-11-30 2018-02-02 山东新希望六和集团有限公司 用于检测猪圆环病毒3型的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法、应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107653348A (zh) * 2017-11-30 2018-02-02 山东新希望六和集团有限公司 用于检测猪圆环病毒3型的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法、应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of a TaqMan-based real-time PCR assay for the specific detection of porcine circovirus 3;Jianchang Wang 等;《Journal of Virological Methods》;20170723;第248卷;第177-180页 *
猪圆环病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立和初步应用;李畅等;《畜牧兽医学报》;20180615(第06期);全文 *
猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR方法的建立和应用;张志等;《中国兽医科学》;20180208(第06期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111621602A (zh) 2020-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111621602B (zh) 猪圆环病毒3型快速检测荧光定量pcr试剂盒及其应用
CN105624330B (zh) 同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法
CN110760620A (zh) 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法
CN113502352B (zh) 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用
EP4159875A1 (en) Novel coronavirus rapid detection kit based on thermal convection pcr
CN111500776A (zh) 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法
CN112094944A (zh) 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒
CN109913591A (zh) 基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒
CN114015815B (zh) 猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法
CN113046484B (zh) 用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物探针、试剂盒及方法
CN111471800B (zh) 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物
CN116024208B (zh) 一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒
CN116814859A (zh) 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法
CN114438265B (zh) 同时检测猪德尔塔冠状病毒、呼肠孤病毒和猪嵴病毒的核酸组合物、试剂盒及检测方法
CN105907894B (zh) 一种检测仔猪脐带血中圆环病毒Ⅱ型的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其应用
CN111926109A (zh) 非洲猪瘟病毒荧光热对流pcr扩增引物对、探针引物、及制备的试剂盒
CN114540546A (zh) 用于prrsv和csfv二重荧光定量pcr检测的引物探针组、试剂盒及检测方法
CN112063757A (zh) 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用
CN103882150A (zh) 猪细环病毒ii型检测的引物、探针及实时荧光pcr检测方法
CN103882151A (zh) 猪细环病毒i型检测的引物、探针及实时荧光pcr检测方法
CN115852043B (zh) 一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光pcr引物探针组、试剂盒及应用
CN114317835B (zh) 一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重pcr检测引物组、试剂盒和检测方法
CN115323076B (zh) 一种检测猴d型逆转录病毒的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
Seprianto et al. Optimization of Da An Gene Kit for SARS-CoV-2 Detection in Real-Time RT-PCR
CN114574632A (zh) 用于同时检测pev和ptv的直接扩增荧光rt-pcr引物探针组和试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant