CN115852043B

CN115852043B - 一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光pcr引物探针组、试剂盒及应用

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Publication number: CN115852043B
Application number: CN202210872029.3A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 邹俊伟; 余菊; 穆苑苑; 刘璇; 李淑艳
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2022-07-19
Filing date: 2022-07-19
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-07-19
Also published as: CN115852043A

Abstract

本发明公开了一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光PCR引物探针组、试剂盒及应用，属于生物信息检测技术领域。该引物探针组包括检测猫星状病毒的如SEQ IDNO：1‑3所示的引物探针组；检测猫博卡病毒1型的如SEQ ID NO：4‑6所示的引物探针组；检测猫库布病毒的如SEQ ID NO：7‑9所示的引物探针组；检测猫细小病毒的如SEQ ID NO：10‑12所示的引物探针组。本发明能同时检测并鉴别猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒，具有良好的灵敏性、特异性和重复性。并且首次提供了猫库布病毒的荧光定量PCR检测方法，填补了该病毒检测缺口，完善了针对猫腹泻病毒临床诊断的医疗体系。

Description

一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光PCR引物探针组、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物信息检测技术领域，特别是涉及一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光PCR引物探针组、试剂盒及应用。

背景技术

病毒性腹泻是猫常见的疾病，根据相关报道，大部分腹泻猫存在肠道病毒合并感染的情况。猫细小被认为是导致腹泻的主要原因，目前临床诊断仅针对猫细小病毒(Felineparvovirus，FPV)具有较完善的诊断与诊疗系统，2018年后陆续出现报道的猫库布病毒(Feline kobuvirus，FeKoV)，猫博卡病毒(Feline bocavirus，FBoV)和新型猫星状病毒(Feline astrovirus，FeAstV)，这些病毒在针对腹泻猫的病原学调查中易被忽略。

猫细小病毒是一种小型的，无包膜的单链DNA病毒，是食肉动物原病毒属1的成员，属于细小病毒科原病毒属。具有高度传染性，主要通过粪口途径感染六月龄以下的幼猫，可造成严重的腹泻和免疫抑制疾病，死亡率高达25％-90％，呈急性发作时死亡率高达100％，在全世界范围内呈大范围流行。猫博卡病毒属于博卡病毒属的肉食动物博卡病毒，目前猫博卡病毒已被分为1、2、3型，猫博卡病毒1型在腹泻症状猫中呈高流行率，主要导致家猫出血性肠炎，与猫细小病毒共同感染的情况下会出现更严重的临床表现。猫库布病毒是一种小的球型非包膜RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科新建立的一个属。猫库布病毒在腹泻猫粪便中检出，随后的报道中发现了猫库布病毒与猫细小病毒和猫冠状病毒较为普遍的混合感染现象，猫库布病毒作为一种新型病毒已经成为猫肠道病毒的常见部分，但目前对其的检测方法尚未深入开发，其致病机理同时缺乏相关研究报道。猫星状病毒是一种小型的，无包膜的单链RNA病毒，分类为星状病毒2型，是一种已知的常见的猫肠道病毒。在人类中，星状病毒感染主要引起婴儿腹泻，是婴幼儿病毒性肠炎的第二位病因，同时有研究发现猫星状病毒会造成人的隐形感染。星状病毒由于其病毒特性变异较快，病理现象复杂，目前的疫苗仅有用于鸡星状病毒的防治。作为猫重要的肠道病毒之一，猫星状病毒常常伴随着猫细小病毒、猫博卡病毒和猫库布病毒等病毒造成混合感染。

由于这四种病毒都主要通过粪口途径传播，混合感染的概率较高，引起的临床症状较为相似，在临床诊断和流行病学调查中往往容易被忽视。现阶段对于猫病毒腹泻的病原检测主要通过临床症状分析、免疫检测及普通PCR等常规手段进行诊断及病原体排查。免疫检测灵敏度低，且存在“窗口期”，感染后3-7天才能检测出相应的抗原或抗体。普通PCR作为传统分子检测技术，虽然耗时短但相比Taqman法灵敏度较差，易出现假阴性情况，并且只能通过核酸凝胶电泳观察结果，步骤相对繁琐。TaqMan法具有灵敏度高和特异性高的特点，可用于定量分析。相比普通PCR可以精确并可视化地检测出腹泻猫粪便和体液中的病毒种类和含量，更方便高效。目前仅有针对猫细小病毒、猫博卡病毒1型和猫星状病毒单个病毒的TaqMan检测技术，而猫库布病毒的TaqMan检测技术未见报道。目前对猫腹泻相关病毒的多重检测仅限于多重普通PCR方法建立的尝试，该方法最低检测限为每份病毒拷贝数10⁵到10⁴，检测灵敏度不甚理想。因此，开发一种检测猫腹泻相关病毒的多重荧光PCR方法是十分有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光PCR引物探针组、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过四重荧光PCR反应，一次反应能够覆盖四种病原体检测并将其准确区分，相比于现阶段的免疫检测技术，更加高效精准。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光PCR引物探针组，包括：

检测猫星状病毒的如SEQ ID NO：1-2所示的引物组和如SEQ ID NO：3所示的探针；

检测猫博卡病毒1型的如SEQ ID NO：4-5所示的引物组和如SEQ ID NO：6所示的探针；

检测猫库布病毒的如SEQ ID NO：7-8所示的引物组和如SEQ ID NO：9所示的探针；

检测猫细小病毒的如SEQ ID NO：10-11所示的引物组和如SEQ ID NO：12所示的探针。

进一步地，所述探针5’端连接有荧光基团，3’端连接有猝灭基团，且，任一所述探针的所述荧光基团与其他三者荧光基团不同。

本发明还提供一种上述的多重荧光PCR引物探针组在制备检测猫腹泻相关病毒产品中的应用。

本发明还提供一种检测猫腹泻相关病毒的试剂盒，包括上述的多重荧光PCR引物探针组。

本发明还提供一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光PCR方法，包括以下步骤：

(1)以待测样本的DNA或cDNA为模板，使用上述的多重荧光PCR引物探针组或上述的试剂盒进行PCR扩增；

(2)根据有无扩增曲线和Ct值，判断待测样本是否为四种猫腹泻相关病毒。

进一步地，若有扩增曲线，且满足Ct≤35，说明待测样本为所述多重荧光PCR引物探针组的荧光基团对应的猫腹泻相关病毒；若无扩增曲线，说明待测样本不是四种病毒中的任何一种。

进一步地，所述PCR扩增的扩增体系包括以下组分：2X TaqMan Fast qPCR MasterMix 10μL，上下游引物各0.4μL，探针各0.2μL，模板DNA 1μL，ddH₂O补足至20μL。

进一步地，所述PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃检测信号30s，循环40次。

本发明还提供一种如上述的多重荧光PCR引物探针组或上述的试剂盒在检测猫腹泻相关病毒中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供了一种检测多种新发猫腹泻病毒的试剂盒及检测方法，该方法能同时检测并鉴别猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒，具有良好的灵敏性、特异性和重复性。本发明的方法最低检测限可达到每个病毒1×10²拷贝数，相比常规PCR灵敏了100-1000倍；本发明所设计的猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的上下游引物和特异性探针特异性高，不会与猫冠状病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒和猫茶帕病毒产生交叉反应造成假阳性；同时本发明的方法具有较好的重复性，重复实验结果稳定，对不同环境下不同人员进行的实验组采集数据，组间分析与组内分析变异系数均小于0.05。

本发明的方法首次提供了猫库布病毒的荧光定量PCR检测方法，填补了市场上该新发病毒检测方法的缺口，完善了针对猫腹泻病毒临床诊断的医疗体系。本发明的方法能够为猫腹泻的病原学调查提供快速、可靠的检测方法，针对国内新发猫腹泻相关病毒进行检测鉴定和监控，相比传统方法在提高效率和精准度的同时降低人力与物力消耗，高效并便捷地对常见猫病毒性腹泻做出病原诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为阳性对照品和阴性对照品扩增结果图；其中1-4为阳性对照品扩增结果：1：1×10⁸copies/μL的猫博卡病毒1型质粒模板；2：1×10⁸copies/μL的猫细小病毒质粒模板；3：1×10⁸copies/μL的猫库布病毒质粒模板；4：1×10⁸copies/μL的猫星状病毒质粒模板；5为阴性对照品扩增结果；

图2为多重荧光定量PCR的灵敏性结果；从左往右依次为拷贝数1×10⁸copies/μL至1×10²copies/μL的猫博卡病毒1型、猫细小病毒、猫库布病毒和猫星状病毒的标准质粒扩增结果；

图3为多重荧光定量PCR的标准曲线图；

图4为多重荧光定量PCR特异性结果图；其中1-4分别为猫博卡病毒1型、猫细小病毒、猫库布病毒和猫星状病毒的标准质粒，5-9分别为猫冠状病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒、猫茶帕病毒和ddH₂O。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1同时检测四种猫腹泻相关病毒的荧光定量PCR方法

1.取腹泻猫粪便样本，用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315，天根，北京)进行核酸提取，得到样本中的总核酸，即总DNA和总RNA，于-20℃保存；

2.取一部分步骤1中提取的总核酸，运用FastKing RT Kit反转录试剂盒(KR116，天根，北京)进行反转录，得到对应样本cDNA；混合待测样本的DNA和cDNA，得到待检样本核酸。

3.目标基因的选择和引物探针的设计，见表1：

表1上下游引物和探针的序列信息

4.打开qPCR仪器预热准备检测，取出qPCR仪器对应的反应试剂八连管，进行样本核酸、阳性对照品和阴性对照品的加样，每个样孔体系均为20μL；a.样本核酸孔：以样本核酸为模板，分别加入10μL的2X TaqMan Fast qPCR Master Mix酶混合液，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的上游和下游引物各0.4μL，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的探针各0.2μL，样本核酸模板1μL，ddH₂O补足至20μL；b.阳性对照孔：分别加入10μL的2X TaqMan Fast qPCR Master Mix酶混合液，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的引物各0.4μL，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的探针各0.2μL，1μL阳性对照品模板(包含猫细小病毒质粒、猫博卡病毒1型质粒、猫库布病毒质粒和猫星状病毒质粒，拷贝数均为1×10⁸copies/μL)，ddH₂O补足至20μL；c.阴性对照孔：分别加入10μL的2X TaqMan Fast qPCR Master Mix酶混合液，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的引物各0.4μL，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的探针各0.2μL，ddH₂O补足至20μL。

5.将加好样的八联管上机检测。a.循环条件设置：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃检测信号30s，循环40次。b.仪器检测通道选择：荧光通道设定为FAM、HEX、CY5和TexasRed。

6.收集仪器反应结束每个样孔的ct值，进行有效性判断。阴性对照品应无Ct值或者为0，阳性对照品Ct值应≤35，否则，本次实验结果无效。阳性对照品和阴性对照品的扩增结果见图1，其中1-4为阳性对照品扩增结果：1：1×10⁸copies/μL的猫博卡病毒1型质粒模板；2：1×10⁸copies/μL的猫细小病毒质粒模板；3：1×10⁸copies/μL的猫库布病毒质粒模板；4：1×10⁸copies/μL的猫星状病毒质粒模板；5为阴性对照品扩增结果。

7.确定实验结果有效后，对样本阳性进行判断。a.Texas Red通道Ct值≤35时视为猫细小病毒阳性，否则为猫细小病毒阴性。b.CY5通道Ct值≤35时视为猫博卡病毒1型阳性，否则为猫博卡病毒1型阴性。c.FAM通道Ct值≤35时视为猫库布病毒阳性，否则为猫库布病毒阴性。d.HEX通道Ct值≤35时视为猫星状病毒阳性，否则为猫星状病毒阴性。

实施例2多重荧光定量PCR的灵敏性分析

1.取阳性对照品，里面含有猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的重组质粒模板，所有模板拷贝数均为1×10⁸copies/μL。对阳性对照品进行10倍梯度稀释，具体步骤如下：a.取90μL ddH₂O至ep管内，再加入10μL阳性对照品，吹打混匀后震荡离心，得到猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的质粒拷贝数均为1×10⁷copies/μL的质粒样。b.取90μL ddH₂O至ep管内，再加入10μL操作a中所得的1×10⁷copies/μL质粒样，吹打混匀后震荡离心，得到猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的质粒拷贝数均为1×10⁶copies/μL的质粒样。c.取90μL ddH₂O至ep管内，再加入10μL操作b中所得的1×10⁶copies/μL质粒样，吹打混匀后震荡离心，得到猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的质粒拷贝数均为1×10⁵copies/μL的质粒样。d.取90μL ddH₂O至ep管内，再加入10μL操作a中所得的1×10⁵copies/μL质粒样，吹打混匀后震荡离心，得到猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的质粒拷贝数均为1×10⁴copies/μL的质粒样。e.取90μL ddH₂O至ep管内，再加入10μL操作a中所得的1×10⁴copies/μL质粒样，吹打混匀后震荡离心，得到猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的质粒拷贝数均为1×10³copies/μL的质粒样。f.取90μL ddH₂O至ep管内，再加入10μL操作a中所得的1×10³copies/μL质粒样，吹打混匀后震荡离心，得到猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的质粒拷贝数均为1×10²copies/μL的质粒样。

2.将阳性对照品和步骤1中所得的六个质粒样组成一套10倍梯度稀释的标准质粒样，进行加样。打开qPCR仪器预热准备检测，取出qPCR仪器对应的反应试剂八连管，进行标准质粒样孔和阴性对照品孔的加样，每个样孔体系均为20μL。a.标准质粒样孔：以稀释好的每个质粒样为模板，分别加入10μL的2X TaqMan Fast qPCR Master Mix酶混合液，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的引物各0.4μL，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的探针各0.2μL，1μL质粒样模板，ddH₂O补足至20μL；b.阴性对照孔：分别加入10μL的2X TaqMan Fast qPCR Master Mix酶混合液，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的引物各0.4μL，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的探针各0.2μL，ddH₂O补足至20μL；

3.将加好样的八联管上机检测。a.循环条件设置：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃检测信号30s，循环40次。b.仪器检测通道选择：荧光通道设定为FAM、HEX、CY5和TexasRed。

4.收集仪器反应结束每个样孔的Ct值，进行有效性判断。阴性对照品应无Ct值或者为0，否则，本次实验结果无效。

5.确定实验结果有效后，进行标准曲线的构建，得出反应最低检测限。

图2为多重荧光定量PCR的灵敏性结果；从左往右依次为拷贝数1×10⁸copies/μL至1×10²copies/μL的猫博卡病毒1型、猫细小病毒、猫库布病毒和猫星状病毒的标准质粒扩增结果，该四种病毒最低共同检测限为1×10²copies/μL。

图3为多重荧光定量PCR的标准曲线图；根据猫博卡病毒1型、猫细小病毒、猫库布病毒和猫星状病毒的标准质粒扩增结果构建标准曲线图，其中猫博卡病毒1型相关系数(R²＝0.996)；猫细小病毒相关系数(R²＝0.9985)；猫库布病毒相关系数(R²＝0.9997)；猫星状病毒相关系数(R²＝0.998)。

结合图2-3实验结果可知，所有病毒相关系数均大于0.995，本发明对猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的重组质粒模板最低检测限度为1×10²copies/μL。

实施例3多重荧光定量PCR的特异性分析

1.取猫冠状病毒(Genbank序列号：MT444152)、猫杯状病毒(Genbank序列号：MT649084)、猫茶帕病毒(Genbank序列号：MT708231)和猫疱疹病毒(Fel-0 Vax PCT felinevaccine,Boehringer-Ingelheim，疫苗株)的病毒株并提取核酸，得到相应病毒的DNA和cDNA作为模板。

2.取阳性对照品，里面包含猫细小病毒(Genbank序列号：MT614366)、猫博卡病毒1型(Genbank序列号：MT577646)、猫库布病毒(Genbank序列号：ON219928)和猫星状病毒(Genbank序列号：MN977118)的重组质粒。

3.分别对猫冠状病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫茶帕病毒、阳性对照品和阴性对照品进行加样。a.病毒核酸孔：以猫冠状病毒cDNA、猫杯状病毒cDNA、猫疱疹病毒DNA和猫茶帕病毒DNA分别为模板，分别加入10μL的2X TaqMan Fast qPCR Master Mix酶混合液，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的引物各0.4μL，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的探针各0.2μL，1μL模板，ddH₂O补足至20μL；b.阳性对照孔：分别加入10μL的2X TaqMan Fast qPCR Master Mix酶混合液，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的引物各0.4μL，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的探针各0.2μL，1μL阳性对照品模板，ddH₂O补足至20μL；c.阴性对照孔：分别加入10μL的2X TaqMan Fast qPCR Master Mix酶混合液，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的引物各0.4μL，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的探针各0.2μL，ddH₂O补足至20μL。

4.将加好样的八联管上机检测。a.循环条件设置：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃检测信号30s，循环40次。b.仪器检测通道选择：荧光通道设定为FAM、HEX、CY5和TexasRed。

5.收集仪器反应结束每个样孔的Ct值，进行有效性判断。阴性对照品应无Ct值或者为0，否则，本次实验结果无效。

图4为多重荧光定量PCR特异性结果图，其中1-4分别为猫博卡病毒1型、猫细小病毒、猫库布病毒和猫星状病毒的标准质粒，5-9分别为猫冠状病毒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒、猫茶帕病毒和ddH₂O。

6.确定实验结果有效后，分析实验结果。图4结果显示，仅猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒出现了典型的扩增曲线。而其它病毒基因组均无扩增曲线出现，表明该方法具有良好的特异性。

实施例4多重荧光定量PCR的重复性分析

1.根据实施例2中的步骤1，得到一套猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的重组质粒模板拷贝数均由1×10⁸copies/μL至1×10²copies/μL的一套标准质粒。进行标准质粒样孔和阴性对照品孔的加样，每个样孔体系均为20μL。a.标准质粒样孔：以稀释好的每个质粒样为模板，分别加入10μL的2X TaqMan Fast qPCR Master Mix酶混合液，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的引物各0.4μL，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的探针各0.2μL，1μL质粒样模板，ddH₂O补足至20μL；b.阴性对照孔：分别加入10μL的2X TaqMan Fast qPCR Master Mix酶混合液，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的引物各0.4μL，猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的探针各0.2μL，ddH₂O补足至20μL；标准质粒每个浓度设3个重复样孔，用本发明建立的多重荧光定量PCR方法进行检测并确定实验结果有效，作为组内重复性试验。

2.由不同的实验人员在在相同条件下重复进行三次独立的步骤1实验，作为组间重复性试验。

3.收集组内重复性实验和组间重复性实验的Ct值，分别计算平均数和变异系数，来验证该方法的重复性。

4.组内重复性分析和组间重复性分析的结果见表2，结果显示所有变异系数均小于0.05，表明该方法具有良好的重复性和稳定性。

表2多重荧光定量PCR重复性分析结果

实施例5可疑样本的临床检测

根据实施例1的方法对135份腹泻猫粪便可疑样本进行临床检测，得到多重荧光定量PCR检测样本病毒感染率结果见表3。再对该135份腹泻猫粪便可疑样本运用普通PCR方法进行检测，具体实施步骤如下：

1.按实施例1中的步骤1和2得到135份待检可疑样本核酸。

2.取540个0.1mL离心管，以4个离心管为一个样品小组，总共135个样品小组分别对应135个可疑样本核酸进行加样。

3.每个样品小组的4个离心管分别对应加入猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的上游和下游引物各0.5μL；统一加入样品小组对应可疑样本核酸1μL、2×Taq PCR MasterMixⅡ10μL，ddH₂O补足至20μL。

4.将加好样的离心管上机检测。循环条件设置：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；72℃再延伸10min。

5.制备核酸电泳胶，具体实施步骤如下：a.取10g琼脂糖(Agarose)加入500mL 1×TAE溶液中混匀，室温时为浑浊溶液，加入微波炉中或水浴加热使其高温溶解成澄清透明状粘稠溶液。b.待琼脂糖溶液降温至60℃左右，加入50μL核酸染料(本次加入为50μL SparkGoldView)，混匀后将含有核酸染料的琼脂糖溶液倒入已插好胶梳的制胶模中待其凝固。c.凝固后得到2％的带孔核酸胶，可直接进行后续点样跑胶步骤。f.对PCR产物进行点样和核酸电泳，具体实施步骤如下：a.将制好的核酸胶放入核酸琼脂糖水平电泳仪中，往电泳槽中倒入1×TAE溶液至浸没胶体。b.在每块胶第一个孔加入DNA Marker(本次加入为D2000 DNAMarker)，取PCR结束后的反应产物进行加样，每个离心管对应一个胶孔。c.加样完毕后进行核酸电泳，电泳仪设置：电压120V、电流不限、电泳时长30min。d.电泳完毕后取出胶体置于紫外灯下观察，通过DNA Marker条带位置确定猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的目的条带位置，其中猫细小病毒目的条带位置在126bp、猫博卡病毒1型目的条带位置在114bp、猫星状病毒目的条带位置在137bp、猫库布病毒目的条带位置在112bp。若样本孔泳道无条带则为病毒阴性；若样本孔泳道出现条带并与对应病毒目的条带位置一致，则可确定为对应病毒感染。

6.对每个样品小组分别进行观察分析防止混淆出错，统计并收集135个可疑样本的普通PCR检测数据，汇总得到普通PCR检测样本病毒感染率结果见表4。

根据表3和表4数据可得，针对样本中腹泻病毒总阳性、单病毒感染和混合感染情况分别进行分析，本发明所提供的多重荧光定量PCR检测方法的检测结果均优于普通PCR。对比于动物医院和兽医诊疗所在临床诊断上使用较多的普通PCR检测方法，本发明所提供的多重荧光定量PCR检测方法的灵敏性较高，对可疑样本的检出率高，在临床诊断中能更灵敏和精确地对病毒进行检测和鉴别。同时本发明所提供的多重荧光定量PCR检测方法省去了制胶跑胶观察条带等传统PCR的必须步骤，可做到通过直观的数据分析得出结果；并能够在单个反应管内同时检测单个样本中的四个病毒，相当于节省了四倍试剂酶消耗并同时地减少了人员工作量和诊断时间，节省了目前临床上在猫腹泻病毒诊断环节的人力物力资源消耗，同时提高了检测效率和精确度。

表3多重荧光定量PCR检测样本病毒感染率结果

表4普通PCR检测样本病毒感染率结果

实施例6病毒质粒的构建

本试剂盒中的阳性对照品内含有猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的重组质粒模板，所有模板拷贝数均为1×10⁸copies/μL。质粒的构建过程如下：1.取含有猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒毒株的阳性样本，其中病毒序列均通过公司测序鉴定并上传至Genbank获得对应序列号，猫细小病毒(Genbank序列号：MT614366)、猫博卡病毒1型(Genbank序列号：MT577646)、猫库布病毒(Genbank序列号：ON219928)和猫星状病毒(Genbank序列号：MN977118)。

2.取病毒阳性样本，用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315，天根，北京)进行核酸提取，得到样本中的总核酸，即总DNA和总RNA，于-20℃保存；

3.取一部分步骤2中提取的总核酸，运用FastKing RT Kit反转录试剂盒(KR116，天根，北京)进行反转录，得到对应样本cDNA；混合待测样本的DNA和cDNA，得到目的病毒核酸。

4.取4个0.1mL离心管，分别对应加入猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的上下游引物各0.5μL，2×Taq PCR MasterMixⅡ10μL、目的病毒核酸1μL，ddH₂O补足至20μL。

5.将加好样的离心管上机进行普通PCR扩增。循环条件设置：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；72℃再延伸10min。

6.制备2％核酸电泳胶，取DNA Marker和PCR扩增产物点样进行核酸电泳，电泳结束后胶体置于紫外灯下观察。确定病毒目的条带位置，其中猫细小病毒目的条带位置在126bp、猫博卡病毒1型目的条带位置在114bp、猫星状病毒目的条带位置在137bp、猫库布病毒目的条带位置在112bp。目的条带在紫外灯下呈明亮的淡绿色，目的胶块为病毒对应目的条带明亮部分的胶块。分别切下猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的目的胶块。

7.用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209，天根，北京)对目的胶块进行胶回收，得到猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的纯化目的片段，目的片段序列经公司测序鉴定，详细序列见表5。

8.取克隆载体pMD 19-T质粒(pMD^TM 19-T Vector Cloning Kit，Takara，北京)加入纯化目的片段进行载体连接，分别得到连接有猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒目的片段的重组质粒。

9.将猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的重组质粒分别转化入DH5α感受态细胞(CB101，天根，北京)，涂布于氨苄抗性LB培养基平板，37℃过夜培养。

10.第二天分别挑取猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的单克隆菌株于氨苄抗性LB液体培养基中摇菌扩增，摇床摇速200r/min，37℃摇菌8h。

11.得到猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒浑浊菌液，用质粒小量抽提试剂盒(D0007M，碧云天，上海)分别抽提菌液中的重组质粒，得到猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒的粗质粒。

12.通过核酸浓度测定仪确定猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒粗质粒的浓度，分别进行倍比稀释得到模板拷贝数均为4×10⁸copies/μL的猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒重组质粒。

13.将步骤12中稀释好的模板拷贝数均为4×10⁸copies/μL的猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒重组质粒，等比等容混匀最终得到含有模板拷贝数均为1×10⁸copies/μL的猫细小病毒、猫博卡病毒1型、猫库布病毒和猫星状病毒重组质粒的阳性标准品。

表5病毒目的片段序列

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光PCR引物探针组，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的多重荧光PCR引物探针组，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光基团，3’端连接有猝灭基团，且，任一所述探针的所述荧光基团与其他三者荧光基团不同。

3.一种权利要求1所述的多重荧光PCR引物探针组在制备检测四种猫腹泻相关病毒产品中的应用。

4.一种检测猫腹泻相关病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的多重荧光PCR引物探针组。