CN109628640B

CN109628640B - 一种快速检测鲤春病毒血症病毒的rpa-lfd引物、方法和试剂盒

Info

Publication number: CN109628640B
Application number: CN201811630534.7A
Authority: CN
Inventors: 丛锋; 曾伟伟; 曾繁文; 郭鹏举; 马磊; 王庆; 王英英; 尹纪元; 李莹莹
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS; Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS; Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109628640A

Abstract

本发明公开了一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA‑LFD引物、方法和试剂盒，本发明设计了针对RPA‑LFD反应的引物和探针，在一个反应体系内检测鲤春病毒血症病毒的RPA‑LFD试剂盒；本发明准确性高、特异性好、重复性好、可以准确、快速地进行检测，反应结果易于观察，通过试纸条的红色条带即可判读；灵敏度为10²copies/μL；特异性好，适用于出口检疫、养殖场的现场检测等，临床上具有极高的应用价值。

Description

一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA-LFD引物、方法和试剂盒

技术领域

本发明属于核酸检验领域，关于一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA-LFD引物、方法和试剂盒。

背景技术

鲤春病毒血症病毒(SVCV)属于水疱病毒属，弹状病毒科，有一层囊膜，病毒大小为180×70nm，含单链RNA和依赖于RNA的RNA聚合酶，它可引起鲤鱼类大规模鲤春病毒血症爆发。鲤春病毒血症(SVC)是一种急性出血性性传播疾病，它是鲤科鱼类最严重的病毒性疾病之一，被国际动物卫生组织(OIE)列为法定报告病。主要的临床症状包括发炎的发泄，皮肤瘀斑和腹胀。当水温在10到17℃之间，病毒潜伏约20天后即可发病。近年来，SVCV 大肆传播对水产养殖业构成了巨大威胁。

目前已经开发了几种用于诊断SVCV的方法，其包括间接荧光抗体测试，酶联免疫吸附测定(ELISA)，细胞培养中的病毒分离，病毒中和，半巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 和环介导等温扩增技术(LAMP)。但这些方法的缺点是：ELISA方法依赖于特异性抗血清，针对欧洲分离株的单克隆抗体通常不能与亚洲分离株反应；LAMP方法需要多个复杂的引物；对于巢式PCR方法，它通常需要几个小时，并需要昂贵的仪器。

重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种很有前途的等温核酸扩增技术，它依赖于重组酶，单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶的组合，在37到42℃的恒定温度下进行20～30min的DNA扩增。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合启动DNA复制；重组酶从复合体释放后DNA聚合酶与引物结合促进新链合成；ssDNA结合蛋白可以使非模板链和置换链稳定。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30～ 35个碱基，扩增产物在300bp以内，目前基于RPA扩增产物进行检测的方法主要有三种形式:RPA与琼脂糖凝胶检测技术相结合、RPA与荧光检测技术相结合、RPA与侧向流动免疫技术相结合。

然而，到目前为止，还没有开发出有效的药物或疫苗来预防由SVCV引起的疾病，阻止其流通的唯一方法是有效地识别病毒并杀死所感染的鱼。因此，建立一种快速可靠的诊断方法对SVCV的预防和控制具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA-LFD的引物、方法。

本发明的目的再一在于提供一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA-LFD的试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA-LFD引物，其核苷酸如下所示：

SVCV-RPA-F：5’-TACTCTAAGAAAGCTCTTTGGAATCAAGAA-3’；

SVCV-RPA-R：5’-Biotin-TGTAATCTACATCCCAATTTTTCAAGAGTC-3’。

一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA-LFD探针，其核苷酸序列如下所示：

SVCV-RPA-P：

5’-FITC-TGAGGTACCATGTTGAATTGGACATACAATTC(THF)ACTCGCCCTTGAAGACGA-(C3space r)-3’。

进一步的，所述探针的5'标记的荧光基团为：FITC、FAM、VIC中的一种。

一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA-LFD试剂盒，该试剂盒中含有上述所述的引物。

进一步的，该试剂盒中还含有上述所述的探针。

进一步的，该试剂盒中还含有MLV酶、醋酸镁和反应缓冲液Rehydration Buffer组成。

一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA-LFD方法，包含以下步骤：

1)提取样本核酸；

2)以提取的核酸为模板，用上述所述的引物SVCV-RPA-F和SVCV-RPA-R，以及上述所述探针SVCV-RPA-P进行RT-RPA反应；

3)将上述反应得到的RT-RPA反应产物加入LFD反应缓冲液混合稀释得到混合液；

4)将混合液滴在抗荧光标记的检测试纸条上，确定样品中是否含有鲤春病毒血症病毒。

进一步的，步骤2)中的RT-RPA反应体系为：

进一步的，步骤(2)RT-RPA反应条件为：39～40℃反应20～30min。

进一步的，所述检测试纸条为抗荧光标记的检测试纸条。

进一步的，所述的荧光标记为：FITC、FAM、VIC中的一种。

通过筛选病设计特异且灵敏度高的引物与荧光基团标记的探针组合，利用反转录和RPA 技术扩增鲤春病毒血症病毒M基因序列，获得扩增产物。通过阳性扩增产物与标记有抗荧光基团的检测试纸条特异性结合形成检测线，从而实现恒温快速检测鲤春病毒血症病毒的检测。

本发明的有益效果是：

本发明的结果肉眼可判读，准确性高、特异性好、重复性好、快速地进行分析，检测方便，反应结果易于观察，阳性反应试纸条即可判读；灵敏度为10²copies/μL，特异性好，适用于出口检疫、养殖场的现场检测等，有利于在临床实践中推广应用。

附图说明

图1是本发明扩散产物电泳图；

图2是本发明灵敏性试验；

图3是本发明特异性试验；

图4是本发明重复性试验；

图5是本发明对临床样品的试验图，图中左边第一个试纸条为阳性，右边第一个试纸条为空白对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1阳性标准品制备

1)病毒的提取

取感染了鲤春病毒血症病毒的组织(血液、胆汁、肠道和肌肉)。肠道或肌肉使用消毒过的剪刀剪碎并置于离心管，加入1mL 1xPBS研磨，3000rpm离心10min，吸取200μL的上清液。再加入600μL的TRIZOL试剂，震荡混匀后静置5min；再加入140μL的氯仿试剂，上下快速颠倒2min混匀，放置2min；4℃下12000rpm离心15min。取水相至EP1.5mL离心管，再加入等量的异丙醇，放置10min；在4℃下12000rpm下离心10min，倒掉上清液取沉淀；加入600μL75％的乙醇洗涤沉淀，轻微震荡至沉淀悬起；4℃下12000rpm离心5min，倒出液体，放置2min挥发残留的乙醇；加50μL RNase-free ddH₂O溶解沉淀，反复吹打直至沉淀溶解。溶解后的溶液就是RNA，放-80℃保存。

2)PCR扩增

RT-PCR反应体系为：2×1Step Buffer 25μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix2μL，SVCV 上游引物2μL，SVCV下游引物2μL，上步提取的模板RNA 2μL，dH₂O 17μL。

RT-PCR反应扩增程序为：50℃反转录30min；95℃灭活2min；95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，共35个循环；72℃再延伸10min；4℃保存。进行琼脂糖凝胶电泳。其中，图1为反转录后的SVCV cDNA的凝胶核酸电泳图。

按照琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收PCR反应产物，得到纯化的扩增产物。

SVCV引物核苷酸如下：

上游引物：5’-CCACTTACGAGGAGACAC-3’(SEQ ID NO:1)，

下游引物：5’-GAACAGGGAAGGAACACG-3’(SEQ ID NO:2)。

3)目的基因的克隆

将纯化后的RT-PCR扩增产物连入pGEM-T载体中，转化入DH5a大肠杆菌中获得含有鲤春病毒血症病毒(SVCV)靶序列的质粒，利用T7RiboMAXTM Express RNAi System转录成dsRNA，也就是SVCV的阳性标准品。

实施例2

本发明根据鲤春病毒血症病毒公布的鲤春病毒血症病毒SVCV M基因序列，设计了RT-RPA反应引物以及探针。核苷酸序列如下所示：

RT-RPA反应引物：

SVCV-RPA-F:5’-TACTCTAAGAAAGCTCTTTGGAATCAAGAA-3’(SEQ ID NO:3)，

SVCV-RPA-R:5’-Biotin-TGTAATCTACATCCCAATTTTTCAAGAGTC-3’(SEQ ID NO:4)。

RT-RPA反应探针：

SVCV-RPA-P:

5’-FITC-TGAGGTACCATGTTGAATTGGACATACAATTC(THF)ACTCGCCCTTGAAGAC GA-(C3spacer)-3’(SEQ ID NO:5)。

作为优选实施例，检测时，本发明选用了FITC荧光基团标记的探针，但是本发明要求的权利不仅限于FAM、VIC、FITC固定荧光标记，可以换成其他荧光标记的探针，但试纸条要换成相应的抗对应荧光标记的检测试纸条。

实施例3

在最优扩增条件下对鲤春病毒血症病毒(SVCV)阳性核酸RNA进行扩增，每个样品3个复孔：

RT-RPA反应体系为：

将以上混合所得物轻微震荡后离心数秒；再往RT-RPA反应体系中加入2.5μL的醋酸镁溶液，放置于39℃金属浴中进行RT-RPA反应20min，得到RT-RPA反应产物；从上述RT-RPA 反应产物取5μL，加入45μL的LFD反应缓冲液混合得到混合液。

将混合液滴在抗FITC的检测试纸条上，确定样品中含有鲤春病毒血症病毒。

实施例4临床样品检测

在最优扩增条件下对实验室保存的25份临床样品的病毒RNA进行扩增，每份样品3个复孔；

RT-RPA反应体系为：

将以上混合所得物轻微震荡后离心数秒；再在反应体系中加入2.5μL的醋酸镁溶液，放置于39℃金属浴中进行RT-RPA反应20min，得到RT-RPA反应产物；从上述RT-RPA反应产物取5μL，加入45μL的LFD反应缓冲液混合得到混合液，将混合液滴在抗FITC的检测试纸条上，确定样品中是否含有鲤春病毒血症病毒(见图5)。

结果分析：

通过检测限与质控线的结果，从而确定样品中是否存在鲤春病毒血症病毒。将混合液取 50μL滴在抗FITC的检测试纸条上，五分钟后，如果同时出现两条红色色条：一条位于质控区(质控线)，一条位于检测区(检测线)，图4的两条深色色条中上端为质控线，下端为检测线，则RT-RPA-LFD反应的检测结果为阳性；如果只出现质控线，则RT-RPA-LFD反应的检测结果为阴性；若质控线和检测线均无红色条带出现，表明试纸条失效。图5中可知，该批25份临床样品中，阳性样品(出现检测线与质控线)为16份，阴性样品(只出现质控线)为9份。

实施例5灵敏度试验

在最优扩增条件下对鲤春病毒血症病毒(SVCV)阳性标准品进行扩增，将SVCV的阳性标准品按照10倍比例稀释用做模板进行RT-RPA检测，模板浓度从10⁷ copies/μL～1copies/μL，共8个梯度，每个梯度3个复孔，使用ddH₂O做空白对照。

RT-RPA反应体系为：

将上述混合所得物轻微震荡后离心数秒；再往RT-RPA反应体系中加入2.5μL的醋酸镁溶液，放置于39℃金属浴中进行RT-RPA反应20min，得到RT-RPA反应产物；从上述RT-RPA 反应产物取5μL，加入45μL的LFD反应缓冲液混合得到混合液。将混合液滴在抗FITC的检测试纸条上，确定样品中是否含有鲤春病毒血症病毒。

结果：本发明的RT-RPA-LFD检测方法灵敏度为10²copies/μL(检测结果如图2所示)。

实施例6特异性试验

通过检测SVCV阳性核酸、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)、鲤鱼浮肿病病毒(carp edema virus，CEV)、鲤鱼疱疹病毒Ι型(Carp pox cyprinid herpesvirus 1，CyHV-1)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(Carp pox cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)以及鱼传染性造血器官坏死病 (infectious haematopoietic necrosis of fish，IHNV)的病毒模板，使用本发明实施例中的 RT-RPA-LFD方法检测RPA的特异性(见图3)，ddH₂O做空白对照。

从图3中可知，本发明实施例中的RT-RPA-LFD方法特异性良好，SVCV阳性核酸有特异扩增，均出现检测线与质控线；而其他病原与引物探针没有交叉反应，检测结果符合预期，准确率达100％。

实施例7重复性试验

在三个不同的时间段进行重复性试验，分别用10⁶copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL 的SVCV的阳性标准品作为模板进行扩增，三次检测结果一致，见图4。说明本发明实施例中的RT-RPA-LFD方法重复性好，稳定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所广东省实验动物监测所

<120> 一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA-LFD引物、方法和试剂盒

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

ccacttacga ggagacac 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

gaacagggaa ggaacacg 18

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

tactctaaga aagctctttg gaatcaagaa 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

tgtaatctac atcccaattt ttcaagagtc 30

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

tgaggtacca tgttgaattg gacatacaat tcactcgccc ttgaagacga 50

Claims

1.一种快速检测鲤春病毒血症病毒的组合物，所述组合物包括RPA-LFD引物和RPA-LFD探针，所述RPA-LFD引物的核苷酸如下所示：

SVCV-RPA-F：5’-TACTCTAAGAAAGCTCTTTGGAATCAAGAA-3’；

SVCV-RPA-R：5’-Biotin-TGTAATCTACATCCCAATTTTTCAAGAGTC-3’；

所述RPA-LFD探针的核苷酸序列如下所示：

SVCV-RPA-P：

5’-TGAGGTACCATGTTGAATTGGACATACAATTC(THF)ACTCGCCCTTGAAGACGA-(C3spacer) -3’。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述RPA-LFD探针的5'标记有荧光基团，所述荧光基团为FITC、FAM和VIC中的一种。

3.一种快速检测鲤春病毒血症病毒的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求1所述的组合物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有MLV酶、醋酸镁和反应缓冲液Rehydration Buffer组成。