CN109913583A

CN109913583A - 一种快速检测锦鲤疱疹病毒的引物及其方法

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Publication number: CN109913583A
Application number: CN201811649596.2A
Authority: CN
Inventors: 王华南; 胡明明; 董建国; 丛潇; 杨忠艳; 孙杰
Original assignee: Shanxi Animal Disease Prevention And Control Center; Guangzhou Mobile Biotech Co Ltd; Zhejiang University ZJU; Xinyang Agriculture and Forestry University
Current assignee: Shanxi Animal Disease Prevention And Control Center; Guangzhou Mobile Biotech Co Ltd; Zhejiang University ZJU; Xinyang Agriculture and Forestry University
Priority date: 2018-12-30
Filing date: 2018-12-30
Publication date: 2019-06-21

Abstract

本发明公开了一种快速检测锦鲤疱疹病毒的引物及其方法；旨在提供特异性强、灵敏性高、重复性好的快速检测锦鲤疱疹病毒检测引物和方法；其技术方案包括引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：3所示的引物；检测方法为：1)从临床样本中提取病毒基因组DNA；2)以抽提的样本DNA为模板，使用权利要1所述的引物组，权利要求2探针配制RPA反应体系，采用TwistAmp exo试剂盒进RPA扩增反应；3)将RPA扩增后的反应管置于荧光检测仪中，实时监测荧光信号，如果有明显的荧光信号曲线，则说明样本中含有KHV，如无荧光信号曲线，则说明样本中不含有KHV；本发明属于动物的病原检测领域。

Description

一种快速检测锦鲤疱疹病毒的引物及其方法

技术领域

本发明属于动物的病原检测领域，具体涉及快速检测锦鲤疱疹病毒的引物及其方法。

背景技术

锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus disease，KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Koiherpes virus disease，KHV)引起的一种高度传染性的病毒性疾病，威胁着鲤鱼和锦鲤的繁殖。锦鲤疱疹病毒又叫鲤科疱疹病毒3型(cyprinidherpesvirus 3，CyHV-3)，属于属疱疹病毒科，病毒有囊膜，核衣壳为二十面体，直径170～230nm，该病毒由31种病毒多肽组成，病毒核酸为双链DNA，基因组大小约为227kb。所有鲤鱼和锦鲤的年龄组都易受KHV感染，并且表现出高发病率和死亡率。

锦鲤疱疹病毒多发于春秋季节，潜伏期2周左右，出现症状后24-48h内会出现死亡现象，死亡率高达80％-100％。由于其对鲤鱼和锦鲤行业的传染性和重大经济损失，KHVD被世界动物卫生组织列为可通报的疾病，我国将其列为二类动物疫病。KHVD的临床症状通常是非特异性的，包括皮肤苍白或变色，眼球内陷，皮肤和鳍底部出血，鳃变色和坏死，严重威胁水产养殖业的经济情况。锦鲤疱疹病毒于1997年在以色列首次被发现，先后在世界十几个国家和地区传播与流行，目前为止，已经在亚洲、欧洲和北美洲等多个国家发现。像其它疱疹病毒一样，潜在的KHV感染可以被压力因子激活。

KHV已知可以用细胞中分离出来，但因其操作复杂，细胞病变难以判断，加上难以处理，因此，病毒分离不被认为是KHVD的最佳诊断方法。KHVD的诊断依赖于基于病毒DNA的检测方法，其比病毒分离或免疫诊断测定法更敏感，其中已经开发并验证了各种终点PCR，巢式PCR和实时荧光PCR测定以检测KHV。此外，还开发了不同的等温扩增测定法。核酸扩增试验被认为是许多传染病诊断的标准。这些技术比基于抗体的测试具有更高的灵敏度和特异性，并且比基于培养的测试更快地产生结果。PCR是最古老的和用于核酸扩增的黄金标准技术。然而，尽管有其优点，但PCR技术需要昂贵的仪器，在靶序列扩增过程中需要循环变性、退火的步骤，往往需要几个小时才能产生结果。

因此，有研究人员已经开发了不同的等温核酸扩增方法，并且这些方法在灵敏度，特异性和通量方面可以满足或超过基于PCR的方法。

重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种很有前景的等温核酸扩增技术，它依赖于重组酶，单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶的结合，在37到42℃的恒定温度下进行20-30min的DNA扩增。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，ssDNA结合蛋白稳定非模板链的置换，并用链置换聚合酶进行启动互补DNA链合成。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内，目前基于RPA扩增产物进行检测的方法主要有三种形式:RPA与琼脂糖凝胶检测技术相结合 (基础型RPA)、RPA与荧光检测技术相结合(real time RPA)、RPA与侧向流动免疫技术相结合(RPA-LFD)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏性高、重复性好的快速检测锦鲤疱疹病毒检测用引物和探针。

本发明的另一目的在于提供快速检测锦鲤疱疹病毒检测方法。

为此，本发明提供的第一个技术方案为：

一种快速检测锦鲤疱疹病毒的引物，其核苷酸序列如下所示：

KHV-RPA-F：5`-TTTATGCAGCAGCCCTTCAAGCAGGTGACG-3`(SEQ ID NO：1)

KHV-RPA-R：5`-ATCCTGAACCCCGTGAGACAGGGACGACAC-3`(SEQ ID NO：2)。

一种快速检测锦鲤疱疹病毒的探针，其核苷酸序列如下所示：

KHV-RPA-P：GATGCGCGACGCACCCTTCACCGTCAGAA(dT-FAM)(THF)(dT-BHQ1)CTCAGGGCAGGACCT-(C3spacer)(SEQ ID NO：3)。

本发明提供的第二个技术方案为：

一种快速检测锦鲤疱疹病毒的方法，依次包括下述步骤：

1)从临床样本中提取病毒基因组DNA；

2)以抽提的样本DNA为模板，使用权利要1所述的引物组，权利要求2探针配制RPA反应体系，采用TwistAmp exo试剂盒进RPA扩增反应；

3)将RPA扩增后的反应管置于荧光检测仪中，实时监测荧光信号，如果有明显的荧光信号曲线，则说明样本中含有KHV，如无荧光信号曲线，则说明样本中不含有KHV。

优选的，上述的一种快速检测锦鲤疱疹病毒的方法，所述的RPA扩增反应的体系为：

优选的，上述的一种快速检测锦鲤疱疹病毒的方法，所述的扩增反应温度39℃，时间 20min。

优选的，上述的一种快速检测锦鲤疱疹病毒的方法，所述的恒温荧光检测仪为Deaou-308c 恒温荧光检测仪。

本发明的有益效果是：

1、本申请提供的技术方案采用Real time RPA技术通过荧光信号检测仪测量exo探针产生的荧光信号，无需琼脂糖凝胶，也无需侧流层析检测试纸，闭管操作进一步避免了气溶胶污染的问题。同时灵敏度也要高于琼脂糖凝胶法。

2、本申请提供的技术方案筛选不同的引物探针组合特异性扩增KHV(TK)基因，优化反应条件，并验证方法的特异性、灵敏性、重复性，建立了一种早期、快速现场诊断锦鲤疱疹病的方法。

附图说明

图1是PRC扩增产物的电泳图；

图2是RPA试验灵敏度曲线图；

图3是特异性实验曲线图。

具体实施方式

下面结合附图说明和具体实施方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明。

实施例1

1.病毒的提取

将感染了锦鲤疱疹病毒的鱼组织按TIANGEN公司TIANamp Genomic DNAKit试剂盒说明书进行提取DNA。

2.引物的设计

根据GenBank中KHV公布的TK基因序列，设计PCR引物，其中：KHV-TK-F： 5`GGGTTACCTGTACGAG`3，KHV-TK-R：5`CACCCAGTAGAT TATGC`3，利用该对引物扩增基因，反应体系为：rTaq酶20μL，上游引物(SEQ ID NO：1)2μL，下游引物(SEQ ID NO： 2)2μL，模板DNA(步骤1提取的DNA提取)2μL，dH₂O 14μL补足40μL。扩增程序为： 95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min；12℃保存，见图1。扩增完成的PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后按照OMEGA公司GelExtraction Kit试剂盒说明书进行回收PCR产物。

3.目的基因的克隆

将4.5μL上述回收产物与0.5μLpMD-18T vector载体、5μL solution I总体积共10μL轻微混匀，用离心机短暂离心，放4℃连接过夜。

将10μL连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞中，具体转化步骤为：从-80℃冰箱里取出100μL DH5a大肠杆菌感受态细胞放在冰上10min溶解；将10μL连接产物加入 100μLDH5a感受态细胞中轻轻混匀，放置冰上冰浴30min；金属浴42℃热激90Sec后冰浴 5min；加入1mL LB培养基后在200rpm，37℃的摇床上摇40min；将离心管放置在离心机中 3000rpm离心1min，倒掉上清培养基，用200μL LB培养基重悬DH5a菌；抽取100μL重悬液用弯头玻璃棒均匀涂布37℃预热好含有氨苄青霉素抗性的平板上37℃过夜。

鉴定阳性菌落：使用10μL的移液枪头挑取白色菌落，接在1mL含有氨苄青霉素抗性的液体培养基中在200rpm 37℃的摇床上培养4小时，用引物KHV-F/RPCR菌液进行鉴定。

提质粒：按照OMEGA公司的PlasmidMini Kit I试剂盒说明书进行提取。将提取后的质粒送至上海生工生物股份有限公司广州分公司测序。

4.RPA引物与探针的设计

本申请基于KHV TK基因序列设计了多组RPA引物和探针，以扩增特定的片段并将探针和引物进一步通过NCBI的BLAST进行序列比对分析。

为了在荧光信号检测仪上检测RPA产物，在探针的5'末端用FAM荧光基团标记并设置一个BHQ1淬灭基团，在其3'末端用C3spacer进行封闭；还通过用四氢呋喃(THF；也称为dSpacer)替换一个核苷酸在内部修饰探针。

现有技术中：

KHV-RPA-F：5`-CGAGGTGATGCAGCGTCTGGAGGAATACGACGCC-3`(SEQ ID NO： 4)

KHV-RPA-R：5`-GTCCCCGTCCAGCGCCGCCACGATCACGTACTTG-3`(SEQ ID NO：5)

KHV-RPA-P：CCGTCGACGAGGGACAGTTCTTCCCCGACC(dT-FAM)-(THF)-(dT- BHQ1)ACGAGGGAGTCGTGC(C3spacer)(SEQ ID NO：6)

本申请中：

KHV-RPA-F：5`-TTTATGCAGCAGCCCTTCAAGCAGGTGACG-3`(SEQ ID NO：1)

KHV-RPA-R：5`-ATCCTGAACCCCGTGAGACAGGGACGACAC-3`(SEQ ID NO：2)

KHV-RPA-P：GATGCGCGACGCACCCTTCACCGTCAGAA(dT-FAM)(THF)(dT-BHQ1)CTCAGGGCAGGACCT-(C3spacer)(SEQ ID NO：3)

5.RPA的建立

1)从临床样本中提取病毒基因组DNA；

2)以抽提的样本DNA为模板，使用SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2所述的引物组，SEQID NO：3所述的探针配制RPA反应体系，采用TwistAmp nfo试剂盒进RPA扩增反应；

其中：

RPA反应用TwistAmp exo试剂盒(TwistDX,Cambridge,United Kingdom)，在50ul的体积内进行，体系为：试剂盒含有的Rehydration Buffer 29.5μL；420nM上游引物；420nM下游引物；120nm探针，2μL模板，再加入2.5μL的醋酸镁溶液，dH₂O补齐。放在Deaou-308c 恒温荧光检测仪中39℃反应，时间为20min。

6.灵敏度试验

将提取的质粒制备阳性标准品，KHV阳性标准品10倍比例稀释用做模板进行RPA检测，模板浓度从10⁶copies/μL-1copies/μL，共7个梯度，ddH2O做空白对照。以确定建立的方法的灵敏度，见图2。从上图2可知灵敏性为10copies/μL。

7.特异性试验

通过检测KHV阳性核酸以及其它病原病毒(包括鲤鱼浮肿病carp edema virusdisease， CEV；鲤春病毒血症病毒Spring viraemia ofcarp virus，SVCV；鲤疱疹病毒Ι型Carp pox cyprinid herpesvirus 1，CyHV-1；鲤疱疹病毒Ⅱ型Carp pox cyprinidherpesvirus 2，CyHV-2；鱼传染性造血器官坏死病nfectious haematopoietic necrosisoffish，INTV；罗非鱼湖病毒Tilapia Lake Virus，TiLV，)，检测RPA的特异性，见图3，ddH2O做空白对照，从图3可知，本申请提供的技术方案特异性良好，与其它病原没有交叉反应。

8.重复性试验

在3个不同的时间段进行重复性试验，分别用10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、 10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL的质粒为模板进行扩增，结果如下。说明所建立的方法重复性好，稳定，可操作。

9.临床样品检测

对12份疑似患有KHV的临床样品进行real time PCR与real-time RPA检测，做对比，看结果的吻合情况。

检测方法	阳性样品	阴性样品	检出率
				RPA	8(8*)	4(4*)	66.67％
qPCR	8	4	66.67％

*指实时RT-RPA法和实时RT-PCR法的平行检测结果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州动佰生物科技有限公司

浙江大学

山西省动物疫病预防控制中心

信阳农林学院

<120> 一种快速检测锦鲤疱疹病毒的引物及其方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 锦鲤(Cyprinus carpio)

<400> 1

tttatgcagc agcccttcaa gcaggtgacg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 锦鲤(Cyprinus carpio)

<400> 2

atcctgaacc ccgtgagaca gggacgacac 30

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 锦鲤(Cyprinus carpio)

<400> 3

gatgcgcgac gcacccttca ccgtcagaac tcagggcagg acct 44

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 锦鲤(Cyprinus carpio)

<400> 4

cgaggtgatg cagcgtctgg aggaatacga cgcc 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 锦鲤(Cyprinus carpio)

<400> 5

gtccccgtcc agcgccgcca cgatcacgta cttg 34

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 锦鲤(Cyprinus carpio)

<400> 6

ccgtcgacga gggacagttc ttccccgacc 30

Claims

1.一种快速检测锦鲤疱疹病毒的引物，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：

KHV-RPA-F：5`-TTTATGCAGCAGCCCTTCAAGCAGGTGACG-3`(SEQ ID NO：1)；

KHV-RPA-R：5`-ATCCTGAACCCCGTGAGACAGGGACGACAC-3`(SEQ ID NO：2)。

2.一种快速检测锦鲤疱疹病毒的探针，其特征在于，其核苷酸序列如下所示：

3.一种快速检测锦鲤疱疹病毒的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

1)从临床样本中提取病毒基因组DNA；

3)将RPA扩增反应管置于荧光检测仪中，实时监测荧光信号，如果有明显的荧光信号曲线，则说明样本中含有KHV，如无荧光信号曲线，则说明样本中不含有KHV。

4.根据权利要求1所述的一种快速检测锦鲤疱疹病毒的方法，其特征在于，所述的RPA扩增反应的体系为：

5.根据权利要求3所述的一种快速检测锦鲤疱疹病毒的方法，其特征在于，所述的扩增反应温度39℃，时间20min。

6.根据权利要求3中所述的一种快速检测锦鲤疱疹病毒的方法，其特征在于，所述的恒温荧光检测仪为Deaou-308c恒温荧光检测仪。