CN111500773B

CN111500773B - 一种流行性出血病病毒血清型鉴定荧光定量rt-pcr引物、探针和试剂盒

Info

Publication number: CN111500773B
Application number: CN202010351199.8A
Authority: CN
Inventors: 杨振兴; 廖德芳; 杨恒; 李占鸿; 李卓然; 李华春
Original assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Current assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2040-04-28
Also published as: CN111500773A

Abstract

本发明涉及一种流行性出血病病毒血清型鉴定荧光定量RT‑PCR引物、探针和试剂盒，属于兽医传染病检测技术领域。该试剂盒包括：（1）8种不同血清型流行性出血病病毒的引物对和与引物对配合使用的探针；（2）荧光定量RT‑PCR反应试剂、8种不同血清型流行性出血病病毒的阳性质控品与阴性质控品。本发明试剂盒具有灵敏度高和特异性强的优点，通过本发明试剂盒可以对病毒和临床血液样品中的流行性出血病病毒核酸进行血清型分型，从而实现流行性出血病病毒的早期快速诊断和流行趋势监控。

Description

一种流行性出血病病毒血清型鉴定荧光定量RT-PCR引物、探针和试剂盒

技术领域

本发明属于兽医传染病检测技术领域，涉及一种采用实时荧光定量技术(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术，对临床样本中含有的或者分离培养的流行性出血病病毒进行血清型鉴定的引物、探针和试剂盒。

背景技术

流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)主要通过雌性库蠓(Culicoides.spp)吸血叮咬野生或驯养反刍动物进行传播，引起动物的流行性出血病(Epizootic haemorrhagic disease,EHD)。本病对鹿和牛的危害最为严重，可引起感染动物体温升高、休克、口腔与皱胃黏膜发生出血与糜烂、蹄冠出血和跛行，妊娠期动物出现流产或死胎，奶牛或哺乳期动物的产奶量急剧减少。近年来，随着全球气温的升高，国际贸易的日趋频繁，EHDV在全球呈分布逐步扩大趋势、在牛上引起的发病率和死亡率不断增加，如分别在摩洛哥(2006年)、土耳其(2007年)、日本(2015年)和突尼斯(2015年)的牛群中引起疫病爆发；特别是2008年在以色列引起牛的发病率最高达80％，重创了以色列养牛业。因此2008年EHD被世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)列为法定报告的跨境传播动物疫病。

EHDV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)无囊膜双链RNA病毒，基因组由10个节段RNA组成(Seg-1至Seg-10)，编码7种结构蛋白(VP1至VP7)和4种非结构蛋白(NS1至NS3)，由Seg-2节段编码的VP2蛋白构成病毒的外层衣壳，介导病毒对细胞表面受体的特异性吸附，是诱导寄主产生特异性中和抗体的主要蛋白，决定着病毒的血清型，其核酸与氨基酸序列在不同血清型毒株之间具有高度变异的特性，是通过分子方法确定EHDV血清型的唯一靶基因。

目前世界范围发现了9种血清型EHDV(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8、EHDV-9和EHDV-10型)，早期发现EHDV-3型通过血清中和试验与测序分析，最终确定为EHDV-1型。EHDV-9型毒株分离于南美洲羊驼，但其序列信息尚未在GeneBank中公布。不同血清型EHDV毒株之间缺乏有效交叉免疫保护，并且在世界范围分布不同，在动物上的致病性也存在较大差异，给EHD的防控带来了严峻挑战。国内EHDV的血清学调查与病毒分离结果显示我国已经存在多种血清型EHDV的流行，其中广东有EHDV-1与-5型，广西存在EHDV-5、-6、-7、-8型，云南主要流行EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-10型。我国存在多种EHDV血清型的广泛流行，给我国EHD的防控带来了严峻挑战。建立快速鉴定EHDV血清型方法，是开展我国EHDV流行病学研究，制定该病科学防控策略的关键。目前EHDV血清型鉴定的方法主要包括血清中和实验与核酸检测两种方法。

血清中和试验是鉴定EHDV血清型的传统方法，但存在以下不足：(1)中和试验仅适用于检测分离的病毒样品或EHDV转阳动物血清。从感染动物采集的临床样本进行病毒分离，工作耗时长、成功率低；从EHDV感染动物，到动物产生EHDV的特异性中和抗体一般需要2-3周时间，在该时间段中和实验无法检测中和抗体，造成EHDV感染动物的漏检；(2)进行EHDV的中和实验，需获得血清型完整的EHDV标准阳性血清以及标准参考病毒，一方面标准阳性血清的制备耗时、费力，另一方面活病毒的使用也存在病毒扩散的风险；(4)试验准备工作繁琐、成本高、周期长，十分不利于病毒血清型的快速鉴定；(5)自然界中，多种EHDV共感染宿主的情况十分普遍，通过中和实验进行感染病毒的血清型鉴定，存在对其它血清型EHDV漏检的可能。

EHDV血清型的核酸检测方法包括常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR方法两种。常规RT-PCR方法具有简便快捷的优点，但是该方法灵敏度较差，难以用于临床样本的检测，主要用于分离EHDV毒株的血清型鉴定。实时荧光定量RT-PCR方法，以其特异性强、灵敏度高、速度快和检测样本通量大等优点，可在病毒感染早期从血液样品或组织中检测到微量的病毒核酸，是目前病毒快速检测的主要方法之一。我国食品与药品管理局(SFDA)已经批准了诸如HIV-1、HCV等病原体的一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒的生产与临床应用。因此，通过实时荧光RT-PCR方法开发一种EHDV血清型分型试剂盒在具有技术可行性。

目前国内外尚未见EHDV毒株血清型实时荧光RT-PCR诊断试剂盒的报道，根据我国流行EHDV毒株Seg-2基因的特点设计、筛选引物和探针，建立能快速、准确鉴定EHDV血清型的一步法实时荧光RT-PCR试剂盒，不仅可为EHDV血清的诊断提供了保障，也能为我国开展EHDV流行病学调查研究，制定科学的EHDV防控方案提供技术保障。

发明内容

针对现有血清中和试验与常规RT-PCR检测技术在EHDV血清型检测中存在耗时长、成本高，检测通量低与灵敏度不高等缺陷，本发明提供一种灵敏度高、特异性强、检测通量高、操作简便快捷的EHDV血清型鉴定一步法实时荧光RT-PCR试剂盒，用于EHDV血清型鉴定，以实现对感染动物EHDV血清型的准确鉴定。本试剂盒适用于EHDV早期感染的实验室诊断与EHDV的流行病学调查研究，填补了国内尚无EHDV血清型荧光定量RT-PCR检测方法及检测试剂盒的空白，具有良好的实际应用价值。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种流行性出血病病毒血清型鉴定荧光定量RT-PCR引物，包括8种不同血清型流行性出血病病毒的引物对；所述的8种血清型为EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10；

本发明根据国内外流行的8种EHDV血清型(EHDV-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8和-10)毒株的Seg-2序列特征(SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:32)，设计出8套EHDV血清型特异性扩增引物，引物序列如表1所示；

表1

本发明同时提供与所述引物配合使用的探针，具体地，与8种血清型流行性出血病病毒的引物对配合使用的TaqMan探针核苷酸序列如表2所示，探针5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-羧基荧光素报告荧光基团FAM，3’端标记作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ1。

表2

本发明还提供含有所述引物和/或所述探针的试剂盒。

进一步，优选的是，所述的试剂盒，所检测的样品为细胞培养物和动物血液中的病毒核酸。

进一步，优选的是，所述的试剂盒，其特征在于还包括：荧光定量RT-PCR反应试剂、阴性质控品、8种血清型EHDV的阳性质控品。

进一步，优选的是，阴性质控品为提取的未被EHDV感染的小牛血液RNA。

进一优，选的是，8种血清型流EHDV的阳性质控品的核酸浓度见表3所示；

表3

进一步，优选的是，工作反应体系中，8种血清型流行性出血病病毒的上、下游引物浓度均为5～15μmol/反应、TaqMan探针浓度为6～12μmol/反应、逆转录酶用量为2～4U/反应、热启动Taq酶用量为4～8U/反应、RNase抑制剂用量为20～30U/反应、dNTPs用量为5nmol/反应。

进一步，优选的是，工作反应体系为：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ，10.0μL；TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)，0.4μL；PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ，0.4μL；ROXReference Dye Ⅱ(50×)，0.4μL；上游引物10μmol/L)，0.4μL；下游引物(10μmol/L)，0.4μL；探针(10μmol/L)，0.8μL；模板，4.0μL；补充RNase-free水至20.0μL。

进一步，优选的是，工作程序为：42℃逆转录5min～15min，1个循环；95℃预变性5s～15s，1个循环；最后95℃变性5s～15s，55～60℃退火和收集荧光信号30s～40s，40个循环。

本发明使用核酸序列分析软件分别对国外及2012年～2018年在我国云南省、广东省与广西壮族自治区等地的牛羊监控动物上分离获得的EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10型病毒Seg-2基因(SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:32)进行分析比较，在找出各个血清型EHDV Seg-2高度保守区段的基础上，进一步使用引物设计软件(例如Primer Express 2)选择并设计8种血清型EHDV的寡核苷酸引物和TaqMan探针。

从待测样本中提取RNA，可以使用PureLink^TM Viral RNA/DNA Mini Kit、TIANampVirus DNA/RNA Kit或MagMAX^TM Viral RNA Isolation Kit市售的病毒基因组提取试剂盒提取待测样品RNA。将提取的RNA于94℃加热5min，并立即冰浴进行变性处理，解开EHDV基因组的双链RNA。

分别使用8种血清型EHDV的引物和TaqMan探针，直接经一步法荧光RT-PCR扩增，从荧光扩增曲线判断EHDV的血清型。

本发明采用一步法荧光定量RT-PCR反应试剂为一般市售的荧光定量RT-PCR试剂，如TaKaRa公司的One Step PrimeScript RT-PCR Kit、Thermo公司的AgPath-ID One-stepRT-PCR Kit或NEB公司的Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit等一般荧光定量RT-PCR试剂。

同时本试剂盒提供阴性质控品和测定核酸拷贝数的阳性质控品，通过Thermofisher/StepOnePlus、ABI 7500市售的荧光PCR扩增仪，对RT-PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析，达到快速、实时、定量检测待测样品中不同血清型EHDV的核酸拷贝数。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1.试剂盒的特点：

(1)具有高度的特异性：本试剂盒根据8种血清型EHDV(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10)的Seg-2基因特征(SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:32)，设计出针对8种不同血清型EHDV的血清型特异性引物与TaqMan探针。试剂盒中任意一种EHDV血清型的检测试剂只与对应血清型EHDV的核酸之间存在反应，而与其它血清型EHDV、蓝舌病病毒、中山病病毒与阿卡斑病毒核酸之间均无扩增反应及荧光信号产生，可准确的鉴定EHDV的血清型(实施例5，表6)。

(2)具有高度的灵敏度：本发明试剂盒提供的荧光定量RT-PCR检测不同血清型EHDV的最低检出核酸浓度为2.14×10¹～4.44×10¹拷贝/μL(实施例4，图10～图17)，而常规RT-PCR方法的检出下限一般为10³拷贝/μL，表明本试剂盒有更高的灵敏，因此该试剂盒提供的检测方法较常规RT-PCR方法更适宜检测病毒载量较低的临床血液样本。

(3)具有EHDV血清型涵盖广的特性：本发明试剂盒涵盖了目前世界全部已报道序列的8种血清型EHDV(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10)，特别是涵盖了新发现的EHDV-10型。

(4)本发明试剂盒中提供8种血清型EHDV的阳性核酸阳性样品作为实验对照。试剂盒中不同血清型EHDV核酸阳性样品的拷贝数均进行了定量计算，实际使用中可以利用试剂盒中提供的阳性核酸样品构建标准曲线，对临床样本内不同血清型EHDV的核酸拷贝数进行测定，了解待检样品的中EHDV的病毒核酸含量。

2.与传统血清中和实验及常规RT-PCR相比较：

本发明提供的EHDV血清型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒与血清中和试验、RT-PCR技术相比具有明显优势，体现在表4所示的以下几方面

表4

3.与现有的荧光定量RT-PCR技术相比较：

对比国外的EHDV血清型鉴定方法，本发明开发的试剂盒和英国Pbright实验室N.S.Maan等开发报道的EHDV血清型鉴定qRT-PCR方法(Development of Real-Time RT-PCRAssays for Detection and Typing of Epizootic Haemorrhagic Disease Virus)，在对我国的临床血液样品进行EHDV血清型鉴定时，本发明试剂盒表现出了更高的灵敏度和检出率。如实施例7中，对我国的150份临床血液样品的检测，本发明试剂盒准确鉴定出138份样品中EHDV的血清型，准确率92％；而国外方法仅能准确鉴定出77份样品中EHDV的血清型，准确率仅为51.33％，同时由于未提供EHDV-10的检测方法，导致EHDV-10血清型无法鉴定。

附图说明

图1为EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10型阳性质控品和阴性质控品的检测结果。数字1为EHDV-1型阳性质控品、数字2为EHDV-2型阳性质控品、数字4为EHDV-4型阳性质控品、数字5为EHDV-5型阳性质控品、数字6为EHDV-6型阳性质控品、数字7为EHDV-7型阳性质控品、数字8为EHDV-8型阳性质控品和数字10为EHDV-10型阳性质控品的扩增曲线，曲线均有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性。阴性质控品扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。

图2为EHDV-1型病毒阳性质控品扩增结果的标准曲线图。针对模板数为2.41×10⁸拷贝/μl的EHDV-1型病毒质控品进行实时荧光RT-PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为-3.246，在Y轴截距(Intercept)为40.795，相关系数的平方(R²)＝0.998，扩增效率E值为103.27，横坐标表示核酸拷贝数的Log值，纵坐标表示Ct值。

图3为EHDV-2型病毒阳性质控品扩增结果的标准曲线图。针对模板数为3.36×10⁸拷贝/μl的EHDV-2型病毒质控品进行实时荧光RT-PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为-3.259，在Y轴截距(Intercept)为40.396，相关系数的平方(R²)＝0.996，扩增效率E值为102.69，横坐标表示核酸拷贝数的Log值，纵坐标表示Ct值。

图4为EHDV-4型病毒阳性质控品扩增结果的标准曲线图。针对模板数为2.98×10⁸拷贝/μl的EHDV-4型病毒质控品进行实时荧光RT-PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为-3.357，在Y轴截距(Intercept)为41.768，相关系数的平方(R²)＝0.999，扩增效率E值为98.56，横坐标表示核酸拷贝数的Log值，纵坐标表示Ct值。

图5为EHDV-5型病毒阳性质控品扩增结果的标准曲线图。针对模板数为4.11×10⁸拷贝/μl的EHDV-5型病毒质控品进行实时荧光RT-PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为-3.309，在Y轴截距(Intercept)为40.90，相关系数的平方(R²)＝0.997，扩增效率E值为100.54，横坐标表示核酸拷贝数的Log值，纵坐标表示Ct值。

图6为EHDV-6型病毒阳性质控品扩增结果的标准曲线图。针对模板数为2.67×10⁸拷贝/μl的EHDV-6型病毒质控品进行实时荧光RT-PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为-3.312，在Y轴截距(Intercept)为41.531，相关系数的平方(R²)＝0.999，扩增效率E值为100.42，横坐标表示核酸拷贝数的Log值，纵坐标表示Ct值。

图7为EHDV-7型病毒阳性质控品扩增结果的标准曲线图。针对模板数为3.83×10⁸拷贝/μl的EHDV-7型病毒质控品进行实时荧光RT-PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为-3.363，在Y轴截距(Intercept)为41.153，相关系数的平方(R²)＝0.996，扩增效率E值为98.31，横坐标表示核酸拷贝数的Log值，纵坐标表示Ct值。

图8为EHDV-8型病毒阳性质控品扩增结果的标准曲线图。针对模板数为3.01×10⁸拷贝/μl的EHDV-8型病毒质控品进行实时荧光RT-PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为-3.305，在Y轴截距(Intercept)为41.051，相关系数的平方(R²)＝0.997，扩增效率E值为100.71，横坐标表示核酸拷贝数的Log值，纵坐标表示Ct值。

图9为EHDV-10型病毒阳性质控品扩增结果的标准曲线图。针对模板数为4.44×10⁸拷贝/μl的EHDV-10型病毒质控品进行实时荧光RT-PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为-3.414，在Y轴截距(Intercept)为40.756，相关系数的平方(R²)＝0.999，扩增效率E值为96.30，横坐标表示核酸拷贝数的Log值，纵坐标表示Ct值。

图10为EHDV-1型病毒荧光定量RT-PCR方法检测EHDV-1型病毒质控品的敏感性扩增曲线；数字1～9分别对应的病毒核酸浓度为2.41×10⁰,2.41×10¹,2.41×10²,2.41×10³,2.41×10⁴,2.41×10⁵,2.41×10⁶,2.41×10⁷,2.41×10⁸拷贝/μL；10为阴性对照。除了浓度为2.41×10⁰拷贝/μL的EHDV-1型病毒质控品样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，其余样本均可明确判定为阳性。

图11为EHDV-2型病毒荧光定量RT-PCR方法检测EHDV-2型病毒质控品的敏感性扩增曲线；数字1～9分别对应的病毒核酸浓度为3.36×10⁰,3.36×10¹,2.41×10²,3.36×10³,3.36×10⁴,3.36×10⁵,3.36×10⁶,3.36×10⁷,3.36×10⁸拷贝/μL；10为阴性对照。除了浓度为3.36×10⁰拷贝/μL的EHDV-2型病毒质控品样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，其余样本均可明确判定为阳性。

图12为EHDV-4型病毒荧光定量RT-PCR方法检测EHDV-4型病毒质控品的敏感性扩增曲线；数字1～9分别对应的病毒核酸浓度为2.98×10⁰,2.98×10¹,2.98×10²,2.98×10³,2.98×10⁴,2.98×10⁵,2.98×10⁶,2.98×10⁷,2.98×10⁸拷贝/μL；10为阴性对照。除了浓度为2.98×10⁰拷贝/μL的EHDV-4型病毒质控品样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，其余样本均可明确判定为阳性。

图13为EHDV-5型病毒荧光定量RT-PCR方法检测EHDV-5型病毒质控品的敏感性扩增曲线；数字1～9分别对应的病毒核酸浓度为4.11×10⁰,4.11×10¹,4.11×10²,4.11×10³,4.11×10⁴,4.11×10⁵,4.11×10⁶,4.11×10⁷,4.11×10⁸拷贝/μL；10为阴性对照。除了浓度为4.11×10⁰拷贝/μL的EHDV-5型病毒质控品样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，其余样本均可明确判定为阳性。

图14为EHDV-6型病毒荧光定量RT-PCR方法检测EHDV-6型病毒质控品的敏感性扩增曲线；数字1～9分别对应的病毒核酸浓度为2.67×10⁰,2.67×10¹,2.67×10²,2.67×10³,2.67×10⁴,2.67×10⁵,2.67×10⁶,2.67×10⁷,2.67×10⁸拷贝/μL；10为阴性对照。除了浓度为2.67×10⁰拷贝/μL的EHDV-6型病毒质控品样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，其余样本均可明确判定为阳性。

图15为EHDV-7型病毒荧光定量RT-PCR方法检测EHDV-7型病毒质控品的敏感性扩增曲线；数字1～9分别对应的病毒核酸浓度为3.83×10⁰,3.83×10¹,3.83×10²,3.83×10³,3.83×10⁴,3.83×10⁵,3.83×10⁶,3.83×10⁷,3.83×10⁸拷贝/μL；10为阴性对照。除了浓度为3.83×10⁰拷贝/μL的EHDV-7型病毒质控品样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，其余样本均可明确判定为阳性。

图16为EHDV-8型病毒荧光定量RT-PCR方法检测EHDV-8型病毒质控品的敏感性扩增曲线；数字1～9分别对应的病毒核酸浓度为3.01×10⁰,3.01×10¹,3.01×10²,3.01×10³,3.01×10⁴,3.01×10⁵,3.01×10⁶,3.01×10⁷,3.01×10⁸拷贝/μL；10为阴性对照。除了浓度为3.01×10⁰拷贝/μL的EHDV-8型病毒质控品样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，其余样本均可明确判定为阳性。

图17为EHDV-10型病毒荧光定量RT-PCR方法检测EHDV-10型病毒质控品的敏感性扩增曲线；数字1～9分别对应的病毒核酸浓度为4.44×10⁰,4.44×10¹,4.44×10²,4.44×10³,4.44×10⁴,4.44×10⁵,4.44×10⁶,4.44×10⁷,4.44×10⁸拷贝/μL；10为阴性对照。除了浓度为4.44×10⁰拷贝/μL的EHDV-10型病毒质控品样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，其余样本均可明确判定为阳性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，如Sambrook的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明实验过程中除非另有说明，否则百分号为质量百分数，比例为质量比。

实施例1

本发明中不同血型EHDV阳性质控品的制备

1、EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8、-10型阳性质控品的制备

(1)实验材料

以下实施例中涉及的EHDV-1、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7和EHDV-10型毒株由云南省畜牧兽医科学院的云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室提供，EHDV-2(AUS1979/01)和EHDV-8(AUS1982/06)型毒株由澳大利亚麦克阿瑟.伊丽莎白农业研究所(ElizabethMacarthur Agricultural Institute,EMAI)提供。

(2)试剂与仪器

NaOH、二乙烯亚胺(BEI)购自重庆亚翔龙生物医药有限公司，病毒RNA提取试剂盒MagMAX^TM Viral RNA Isolation Kit购自TaKaRa公司，核酸自动提取仪KingFisher Flex购自Thermo公司，实时荧光定量PCR仪7500Fast购自ABI公司，干式恒温金属浴OSE-96购自天根生化科技有限公司。

(3)阳性质控品的制备

取EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10型病毒，用0.2mol/LNaOH配制的浓度为1.5mmol/L二乙烯亚胺(BEI)，在病毒液中加入1.5mmol/L BEI使其终浓度为0.5％，充分混匀，37℃下作用24h灭活病毒下。用核酸提取试剂盒提取病毒核酸，参照已经发表的文章(2019年，中国兽医科学，第9期，蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用)，对提取的病毒核酸进行绝对定量，测得病毒核酸的拷贝数在2.41×10⁸拷贝/uL至4.44×10⁸拷贝/uL，表3给出了各血清型EHDV阳性质控品的核酸拷贝数。

2、EHDV-4型阳性质控品的制备

由于未获得EHDV-4型毒株，本发明中的EHDV-4阳性标准品，参照尼日利亚EHDV-4型毒株(NIG1968/01)的Seg-2基因(SEQ ID NO:27)体外合成DNA后进行体外转录获得其ssRNA，合成大小为496bp，位于Seg-2全长的2506-2776，以上DNA序列均由金斯瑞生物科技股份有限公司代理合成。

(1)试剂与仪器

pLB零背景快速连接试剂盒、质粒小提试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、Universal DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；Xba I限制性内切酶、HiScribe^TM T7 High Yield RNA Synthesis Kit和Monarch RNA Cleanup Kit购自NEB公司；EasyPureVrial DNA/RNA Kit购自Transgen Biotech公司。

梯度PCR仪Veriti 96 Well Thermal Cycler(ABI)；电泳仪Power Pac Basic(BIO-RAD)；水平电泳系统DYCP-32B(北京六一)；紫外凝胶成像系统Gel Doc XR+(BIO-RAD)；紫外分光光度计Nano Vue Plus(GE)；干式恒温金属浴OSE-96(天根生化科技有限公司)；台式离心机1-14(Sigma)。

(2)阳性质控品的制备

将体外合成的EHDV-4型Seg-2的DNA片段按照“pLB零背景快速连接试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书与pLB平末端克隆载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司)，筛选阳性克隆菌进行测序鉴定，将鉴定正确的质粒命名为pLB_EHDV-4_S2。

按照“质粒小提试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书提取pLB_EHDV-4_S2质粒，使用Xba I限制性内切酶(NEB)按说明书要求对质粒进行酶切线性化，按照“UniversalDNA纯化回收试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书对酶切产物进行胶回收纯化。以纯化后的线性化质粒DNA作为模板，按照“HiScribe^TM T7 High Yield RNA Synthesis Kit”(NEB)说明书进行EHDV-4 Seg-2 ssRNA的体外转录。使用RNA纯化试剂盒“Monarch RNACleanup Kit”(NEB)按说明书操作进行转录产物的纯化，测定纯化后的核酸浓度，并根据EHDV-4 Seg-2 ssRNA的分子量计算拷贝数；RNA拷贝数计算公式：拷贝数(拷贝/μL)＝RNA浓度(ng/μL)×6.02×10²³(拷贝/mol)×10^-9/(340×RNA碱基数)。测的EHDV-4 Seg-2 ssRNA的拷贝数分别为2.98×10⁸拷贝/μL。

实施例2

EHDV血清型鉴定荧光定量RT-PCR试剂盒的研制

1、引物和探针的设计

通过对我国分离的EHDV的Seg-2基因进行序列比对分析，以8种血清型EHDV(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10)的Seg-2基因(SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:32)为扩增靶位点，选择高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计8对EHDV Seg-2特异性扩增引物和TaqMan探针。

2、核酸样本

实施例1中合成的EHDV-4型Seg-2 ssRNA以及提取的7种血清型EHDV(EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8和-10)核酸。

3、反应体系的建立与优化样品的准备

样品的准备：以实施例1中制备的不同血清型EHDV阳性质控品和蓝舌病病毒、中山病病毒和阿卡斑病病毒核酸作为待测实验样品；以未感染过EHDV的动物血液核酸作为阴性质控品。使用以上核酸样品前，未经变性的核酸样品都需经过95℃加热5min后，迅速冰水浴中冷却的进行变性处理。

引物探针的筛选：以上述(1)中设计的多组引物和探针分别检测上述(3)中的待测实验样品及阴性性质控品，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合。(如序列表中SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：24)。

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从2μmol/反应至15μmol/反应浓度梯度的引物和从2μmol/反应至15μmol/反应浓度梯度的TaqMan探针进行荧光定量RT-PCR反应，经多次重复试验发现引物和TaqMan探针浓度在5～15μmol/反应之间均可，其中最佳引物浓度为10μmol/反应、最佳TaqMan探针浓度为10μmol/反应。

一步法荧光定量RT-PCR反应试剂为一般市售的法荧光定量RT-PCR试剂，可以选择TaKaRa公司的One Step PrimeScript RT-PCR Kit、Thermo公司的AgPath-ID One-stepRT-PCR Kit或NEB公司的Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit等一般市售荧光定量RT-PCR试剂。

逆转录酶用量的优化：在20μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从2U(酶单位)至4U/反应浓度梯度的酶用量进行荧光定量RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的逆转录酶用量为3U/反应。

热启动Taq酶用量的优化：在20μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从4U(酶单位)至8U/反应浓度梯度的酶用量进行荧光定量RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的热启动Taq酶用量为6U/反应。

RNase抑制剂用量的优化：在20μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从20U(酶单位)至30U/反应浓度梯度的酶用量进行荧光定量RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNase抑制剂用量为25U/反应。

dNTPs浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从3nmol/反应至7nmol/反应浓度梯度的dNTPs进行荧光定量RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为5nmol/反应。

反应温度的优化：根据酶的活性和靶基因的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：42℃逆转录10min，1个循环；95℃预变性10s，1个循环；最后95℃变性10s，60℃退火和收集荧光信号35s，40个循环。

当反应程序为42℃逆转录5min，1个循环；95℃预变性5s，1个循环；最后95℃变性5s，55℃退火和收集荧光信号30s，40个循环时，也能完成该反应。

当反应程序为42℃逆转录15min，1个循环；95℃预变性15s，1个循环；最后95℃变性15s，60℃退火和收集荧光信号40s，40个循环时，也能完成该反应。

实施例3

EHDV血清型鉴定荧光定量RT-PCR试剂盒的使用

1、样品的采集、运送和保存

根据实际情况进行标本采集，可检测的标本包括：血液和细胞培养的病毒分离物。采集方法如下：①血液样本：无菌采集动物的静脉血约3～5mL于EDTA采血管中，上下摇晃5～10次；②细胞培养的病毒液：无菌采集进行分离病毒的细胞培养液100μL，4℃保存待用。

上述样品可立即用于核酸提取和测试，也可以保存于-80℃待测，保存期为6～9个月。标本运送采用0℃冰壶。

2、检测步骤

(1)RNA提取：可以使用PureLink^TM Viral RNA/DNA Mini Kit、TIANamp VirusDNA/RNA Kit或MagMAX^TM Viral RNA Isolation Kit市售的病毒基因组提取试剂盒提取待测样品RNA，按选用的病毒核酸提取试剂盒说明书操作提取待测样品核酸。提取的核酸可立即用于测试，也可以保存于-80℃待测，保存期为1年。

(2)RNA变性处理：将提取的核酸分装于1.5mL离心管中，95℃水浴加热5min，后立即放入冰水浴中降温进行核酸的变性处理。变性后的核酸可立即用于检测，也可以保存于-80℃待测，保存期为1年。

(3)荧光RT-PCR反应试剂选择TaKaRa公司的One Step PrimeScript RT-PCR Kit，反应体系为：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ10.0μL；TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL；PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ0.4μL；ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4μL；上游引物10μmol/L)0.4μL；下游引物(10μmol/L)0.4μL；探针(10μmol/L)0.8μL；模板4.0μL；补充RNase-free水至20.0μL。

(4)上游引物和下游引物组成的引物对为8种血清型EHDV引物对中的任意一对(表1)；所述的探针为8种血清型EHDV的上下游引物对所配合使用的TaqMan探针(表2)。

(5)同时设立阴性和阳性对照，取阴性4μL，分别加入8种血清型EHDV(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10)的反应液中，同时取8种血清型EHDV的阳性质控品4μL分别加入到对应血清型的反应预混液(如：EHDV-1型阳性质控品4μL加入EHDV-1型反应预混液，剩余血清型同样方法操作)。

(6)使用市售的荧光定量PCR仪(如ABI 7500)进行一步法荧光定量RT-PCR扩增。循环条件是：42℃逆转录10min，1个循环；95℃预变性10s，1个循环；最后95℃变性10s，60℃退火和收集荧光信号35s，40个循环。

(7)反应结束后保存检测数据文件。根据荧光定量RT-PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果。如扩增曲线有明显指数增长期，Ct值小于38，则判定为相应血清型型阳性；Ct值介于38和40间判定为可疑，同时再次对可疑样品进行检测，Ct值同样在38和40间的样品判定为阳性；Ct值大于40判定为阴性。实验成立条件：对应血清型的阳性质控品出现扩增曲线，阴性未出现扩增曲线。

如一个样品经8种血清型EHDV检测，只有EHDV-1型出现扩增曲线(Ct值小于38)，其余血清型未出现扩增曲线(Ct值大于40)，则可以判定待测样品为EHDV-1病毒。其余血清型EHDV试验判定标准类同。

如一个样品经8种血清型EHDV检测出现多条扩增曲线，若是临床样品则可以判断为不同血清型EHDV共同感染(混合感染)，若是细胞培养分离的病毒样品则可以判断为不同血清型EHDV混在一起(混毒)。(参见附图1)

实施例4

EHDV血清型检测试剂盒标准曲线绘制及灵敏度实验

分别取实施例1中制备的8种血清型的EHDV(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10)阳性质控品，分别作10倍梯度连续稀释至拷贝数为10⁰～10⁸拷贝/μL，用对应血清型引物和TaqMan探针，按照实施例3中的方法分别检测。

检测结果表明，本试剂盒的8种血清型EHDV特异性引物和探针的扩增效率(E值)均在90％以上，相关系数R²均高于0.99，扩增曲线具有良好的线性关系(参见附图2～图9)；由图10～图17可知本试剂盒检出不同血清型EHDV阳性质控品的最低拷贝数均为10拷贝/μL级别(见表5)，具有较高的灵敏度。

表5

实施例5

EHDV血清型检测试剂盒特异性实验

分别取实施例1中制备的8种血清型的EHDV(EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10)阳性质控品以及蓝舌病病毒、中山病病毒和阿卡斑病病毒核酸各4μL为模板，按照实施例3中的方法，分别进行8种血清型EHDV检测，和同时使用文献报道的EHDV血清群特异性检测方法(2019年，中国兽医科学，第9期，蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用)进行EHDV群特异性检测。检测结果表明如表6所示，不同血清型EHDV特异性引物和探针仅能和对应血清型的阳性质控品之间进行扩增反应并产生Ct值，对蓝舌病病毒、中山病病毒和阿卡斑病病毒均无扩增曲线产生，表明该试剂盒具有良好特异性。同时文献报道的EHDV血清群特异性方法能检测到EHDV，本发明试剂盒就能鉴定其血清型，并且Ct值相近，说明本EHDV血清型鉴定试剂盒的灵敏度和已经报道的EHDV血清群鉴定方法灵敏度处于同一水平。EHDV血清型鉴定荧光定量RT-PCR检测试剂盒特异性试验如表6所示：

表6

注：荧光定量检测Ct值≤38判定为EHDV核酸阳性；No Ct表示未检测到荧光信号判定为EHDV核酸阴性。

实施例6

EHDV血清型检测试剂盒检测临床血液样品

1.临床样品来源

选择2012年～2017年云南师宗、普洱和德宏3个监控点分离出EHDV-1、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-10型的病毒的对应监控动物，取每头动物EHDV血清抗体转阳前后4周的抗凝血各50μL(清抗体转阳：C-ELISA结果抑制率PI％大于50％，按照文献报道方法检测计算得出，2018年，畜牧兽医学报，第7期，流行性出血病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立)，使用PureLink^TM Viral RNA/DNA Mini Kit、TIANamp Virus DNA/RNA Kit或MagMAX^TMViral RNA Isolation Kit市售的病毒基因组提取试剂盒提取待测样品RNA2.临床样品检测

按照实施例3的方法和文献报道的EHDV血清群特异性检测方法(2019年，中国兽医科学，第9期，蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用)分别对上述核酸样品进行检测。检测结果表明(表7)，文献报道的EHDV血清群特异性检测方法在血液样品中检测出EHDV核酸，本发明的试剂盒既能进行EDHV血清型的鉴定，检测结果与病毒的分离鉴定结果符合率为100％；同时本发明试剂盒可以连续检测临床血液中的病毒核酸，动态检测被感染动物从“未感染病毒”到“感染病毒”再到“病毒血症出现”这一病毒自然感染过程，而EHDV抗体的C-ELISA检测方法对动物感染EHDV的确认比本发明试剂盒检测要延后2至3周(表7)。表明本发明试剂盒具有高度的灵敏性，能用于临床血液样品的检测，可做到动物感染EHDV血清型的早期诊断。监控动物EHDV血清抗体转阳前后4周血液样品的EHDV血清群和血清型特异性荧光定量RT-PCR检测如表7所示：

表7

注：荧光定量检测Ct值≤38判定为EHDV核酸阳性；No Ct表示未检测到荧光信号判定为EHDV核酸阴性；C-ELISA抑制率PI≥50％判定为EHDV抗体阳性；*表示分离到病毒的时间点。

实施例7

本发明试剂盒和国外相关方法的对比测试

1、样品的准备

取2012年～2017年采集自我国云南省、广西壮族自治区与广东省等地区，被5种不同血清型EHDV(EHDV-1、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-10)毒株感染的牛血液样本150份，使用PureLink^TM Viral RNA/DNA Mini Kit、TIANamp Virus DNA/RNA Kit或MagMAX^TM ViralRNA Isolation Kit市售的病毒基因组提取试剂盒提取待测样品RNA，变性处理后使用文献报道的EHDV群特异性检测方法(2019年，中国兽医科学，第9期，蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用)进行EHDV血清群特异性检测，结果均为阳性，取4μL作为模板进行血清型鉴定。

2、一步法荧光定量RT-PCR检测结果

使用本发明的一步法EHDV血清型鉴定荧光定量RT-PCR试剂盒，按照实施例3中的EHDV血清型鉴定方法，和按照英国Pbright实验室N.S.Maan等国外学者报道的EHDV血清型鉴定方法(Development of Real-Time RT-PCR Assays for Detection and Typing ofEpizootic Haemorrhagic Disease Virus)对上述150份临床血液样品进行EHDV血清型鉴定。结果见表8，本试剂盒准确鉴定了138份临床血液样品中EHDV的血清型，准确率为92％；国外EHDV血清型鉴定荧光定量RT-PCR方法对中国采集的临床血液样品进行检测，血清型检测灵敏度降低，仅准确鉴定出77份临床血液样品中EHDV的血清型，准确率仅为51.33％。

原因为N.S.Maan等是以分离自美国、中东和非洲等地分离的西方型EHDV毒株的VP2基因为目标靶基因，设计引物和探针开发了血清型鉴定RT-PCR方法，但中国毒株属于东方型，东西方型毒株Seg-2基因序列有较大的差异(最高可达29.4％)，导致国外设计的引物和探针与中国流行的不同血清型EHDV的Seg-2基因序列匹配度较低，存在较多的碱基错配，从而造成国外方法用于检测鉴定我国流行的EHDV时灵敏度降低，所以导致国外方法不完全适用于我国流行的不同血清型EHDV临床样品的检测。同时目前国内外暂未报道过新发现血清型EHDV-10型的荧光定量RT-PCR鉴定方法，导致EHDV-10血清型的鉴定存在漏检，本试剂盒包含EHDV-10血清型的鉴定，填补了这项空白。本发明试剂盒同国外EHDV血清型鉴定方法对检测临床血液样品的对比试验如表8所示：

表8

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注：表8中“-”表示由于目前国外暂未报道过血清型EHDV-10型的荧光定量RT-PCR鉴定方法，因此导致国外方法无法进行EHDV-10的鉴定及和本试剂盒进行比较。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

/>

序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 一种流行性出血病病毒血清型鉴定荧光定量RT-PCR引物、探针和试剂盒

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

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<213> 人工序列()

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<400> 31

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tggtttacgg aaaagattca cctggtccat acggtcaact tacgttgatg gatgccgtag 120

agtatgtgat agacgacaaa catttatgac ccgtatacca tatttcgatc tcaatcaaga 180

ggaaggcgat agcatataca a 201

<210> 32

<211> 281

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

cgatttgacg aaggtgaaaa gaaagtgctt accacgagcg ttaatcctgg agattacgaa 60

ttaaaaaaga aaatctttga tgaatccatc gcggttggag ttgaaagaag agagttgctt 120

caatatgatg gggaagtatc taaattagat gagatagcga cgagatggtt tcgacatcaa 180

agtgcagatg aatcggatga gattatagcg ctgttggaag gtttaggaga taaaaataaa 240

cgcgttgaac caacgaattc gaacgatatg cgtgaacgtt t 281

Claims

1.一种流行性出血病病毒血清型鉴定荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：包括8种不同血清型流行性出血病病毒的引物对；所述的8种血清型为EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10；

所述的8种不同血清型流行性出血病病毒的引物对的核苷酸序列如表1所示；

表1

还包括与8种血清型流行性出血病病毒的引物对配合使用的TaqMan探针，TaqMan探针核苷酸序列如表2所示；

表2

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所检测的样品为细胞培养物和动物血液中的流行性出血病病毒核酸。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：荧光定量RT-PCR反应试剂、阴性质控品、8种血清型流行性出血病病毒的阳性质控品。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，阴性质控品为提取未被流行性出血病病毒感染的小牛血液RNA。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，8种血清型流行性出血病病毒的阳性质控品的核酸浓度见表3所示；

表3

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，工作反应体系中，8种血清型流行性出血病病毒的上、下游引物浓度均为5～15μmol/反应、TaqMan探针浓度均为6～12μmol/反应、逆转录酶用量为2～4U/反应、热启动Taq酶用量为4～8U/反应、RNase抑制剂用量为20～30U/反应、dNTPs用量为5nmol/反应。

7.如权利要求3或6所述的试剂盒，其特征在于，反应体系为：2×One Step RT-PCRBufferⅢ10.0μL；TaKaRa Ex Taq HS 5U/μL 0.4μL；PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL；ROX Reference DyeⅡ50×0.4μL；上游引物10μmol/L 0.4μL；下游引物10μmol/L 0.4μL；TaqMan探针10μmol/L 0.8μL；模板4.0μL；补充RNase-free水至20.0μL；上游引物和下游引物组成的引物对为权利要求1中8种血清型流行性出血病病毒引物对中的任意一对；探针为权利要求1中与血清型流行性出血病病毒的引物对配合使用的TaqMan探针。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，反应程序为：42℃逆转录5min～15min，1个循环；95℃预变性5s～15s，1个循环；最后95℃变性5s～15s，55～60℃退火和收集荧光信号30s～40s，40个循环。