CN110643739A

CN110643739A - 一种区别chuv、bcv与dav的一步法三重rt-pcr检测引物及试剂盒

Info

Publication number: CN110643739A
Application number: CN201910979851.8A
Authority: CN
Inventors: 廖德芳; 杨恒; 杨振兴; 李占鸿; 李卓然; 肖雷; 李华春
Original assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Current assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2039-10-15
Also published as: CN110643739B

Abstract

本发明涉及一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT‑PCR检测引物及试剂盒，属于兽医传染病检测技术领域。该试剂盒包括3对引物，分别为CHUV‑P1和CHUV‑P2、BCV‑P1和BCV‑P2、DAV‑P1和DAV‑P2；还包括空白对照模板、阳性对照模板和PCR扩增试剂；空白对照模板为RNase Free Water；所述的阳性对照模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV灭活病毒。采用本发明试剂盒，通过一次RT‑PCR反应就能同时检测CHUV、BCV和DAV等3种PALV血清型病毒，避免了常规PCR的重复检测，具有低成本、高效率等优点，易于推广应用。

Description

一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物及试剂盒

技术领域

本发明属于兽医传染病检测技术领域，具体涉及一种区别3种PALV血清型病毒CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物及试剂盒。

背景技术

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，主要通过吸血昆虫库蠓(Culicoides spp.)对牛羊等反刍动物的叮咬传播。其中，牛对该病最为易感，感染妊娠母牛出现流产、早产和死产，引起新生犊牛的积水性无脑小脑发育不全综合症(Hydranencephaly cerebellarhypoplasia syndrome,HCH)，给牛羊养殖业带来严重的经济损失。

PALV基因组由10个节段的双链RNA组成(Seg-1～Seg-10)，编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3与NS3a)。其中，Seg-2编码的VP2蛋白构成病毒粒子的最外层衣壳，VP2蛋白介导病毒对细胞表面受体的特异性吸附，参与病毒粒子从感染细胞中的释放，诱导PALV特异性中和抗体的产生，决定病毒的血清型；Seg-2/VP2序列在不同血清型PALV毒株之间高度变异，是鉴别PALV血清型的重要靶基因。

PALV有多种不同的血清型，根据血清中和实验，目前分离出的PALV可分为6种血清群：Chuzan Virus(CHUV)、D’Aguilar Virus(DAV)、Bunyip Creek virus(BCV)、CSIROVillage virus、Marrakai Virus与Petevo virus。我国存在CHUV、BCV与DAV三种PALV血清毒株的流行，分布范围遍及由南(海南)至北(内蒙)，由东(江苏)至西(新疆)的广泛区域，给我国牛羊养殖业的健康发展构成了严重的潜在威胁。不同血清型毒株之间缺乏有效的交叉保护作用，因此，建立PALV不同血清型的鉴定方法对预防和控制PALV具有重要的现实意义。

目前有关PALV血清型鉴定技术，仅有传统的血清中和实验(Serumneutralization test，SNT)，虽然SNT为病毒血清型鉴定的金标准，但是在实际使用中存在一定的不足：(1)SNT耗时长，通常需要1周左右的时间，不利于疫病的快速诊断；(2)SNT需要使用活病毒，存在病毒扩散的生物安全隐患；(3)制备SNT使用的标准阳性血清，需要使用标准毒多次免疫易感动物制备，费时费力；(4)对于多种血清型毒株混合感染的样品，通过SNT进行血清型鉴定时，不同血清型毒株之间可能存在交叉反应，同时还可能漏检某些血清型；(5)SNT需要准备96孔细胞培养板、细胞培养基、胎牛血清等基础材料，增加了实验成本。

病毒核酸检测是鉴定病毒血清型的常用方法。尤其是多重PCR技术，通过在同一反应管内同时加入针对不同血清型毒株的特异性引物，即可实现对多种血清型毒株混合感染样品的准确检测，具有省时省力、简单快速、敏感、特异的优点。然而目前国内尚未建立CHUV、BCV与DAV的多重PCR检测方法，严重阻碍了我国PALV流行病学与病原学的研究；因此，根据我国流行的CHUV、BCV与DAV毒株的序列信息，亟需建立相应的血清型多重PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了完善现有PALV血清型鉴定技术，提供一种区别CHUV、BCV与DAV血清型的一步法三重RT-PCR检测引物及试剂盒，采用该试剂盒进行检测，简单、快速，特异性好，灵敏度高，可以用于混合感染样品中PALV病毒的快速血清型鉴定。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物，其特征在于，包括3对引物，分别为CHUV-P1和CHUV-P2、BCV-P1和BCV-P2、DAV-P1和DAV-P2；

CHUV-P1：gaggctgtatgtggagtggagat(SEQ ID NO.1)，

CHUV-P2：tctatcaatggtcccacgcatct(SEQ ID NO.2)，

扩增产物大小为576bp；

BCV-P1：gtgacgcaatctcaatggctctg(SEQ ID NO.3)，

BCV-P2：caacacatccgtccgccaattc(SEQ ID NO.4)，

扩增产物大小为705bp；

DAV-P1：gcgagattgggatggatgtca(SEQ ID NO.5)，

DAV-P2：cagaytctccctttctcagat(SEQ ID NO.6)，

扩增产物大小为881bp。

本发明同时提供含有上述区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物的试剂盒。

进一步，优选的是，所述的试剂盒还包括空白对照模板、阳性对照模板和PCR扩增试剂；

所述的空白对照模板为RNase Free Water；

所述的阳性对照模板为3种单一的灭活病毒CHUV、BCV与DAV。

进一步，优选的是，CHUV、BCV与DAV病毒灭活前的滴度分别为4.5×10³PFU/mL、3.5×10³PFU/mL、6.2×10³PFU/mL，病毒使用β-丙内酯灭活。

进一步，优选的是，所述的PCR扩增试剂包括PrimeScript 1 Step Enzyme Mix和2×1Step Buffer。

进一步，优选的是，引物CHUV-P1：CHUV-P2：BCV-P1：BCV-P2：DAV-P1：DAV-P2的摩尔比为1：1：1.5：1.5：1.5：1.5。

进一步，优选的是，所述的试剂盒，其扩增体系如表1；

表1 CHUV、BCV与DAV一步法三重RT-PCR反应体系

共计：25μL。

进一步，优选的是所述的试剂盒的扩增程序：50℃反转录30min；94℃灭活逆转录酶2min；94℃预变性30s、57℃退火30s、72℃延伸75s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

进一步，若所述RT-PCR扩增产物的大小为576bp，则样品中含有CHUV；

若所述RT-PCR扩增产物的大小为705bp，则样品中含有BCV；

若所述RT-PCR扩增产物的大小为881bp，则样品中含有DAV；

若所述RT-PCR扩增产物的大小为576bp和705bp，则样品中含有CHUV和BCV；

若所述RT-PCR扩增产物的大小为576bp和881bp，则样品中含有CHUV和DAV；

若所述RT-PCR扩增产物的大小为705bp和881bp，则样品中含有BCV和DAV；

若所述RT-PCR扩增产物的大小为576bp、705bp和881bp，则样品中含有CHUV、BCV和DAV；

所述576b的RT-PCR扩增产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列7：SEQ IDNO.7；

所述705b的RT-PCR扩增产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列8：SEQ IDNO.8；

所述881b的RT-PCR扩增产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列9：SEQ IDNO.9。

本发明的构思：PALV Seg-2基因节段编码的外层衣壳蛋白VP2介导病毒对细胞表面受体的特异吸附，诱导PALV特异性中和抗体的产生，决定病毒的血清型，其核酸与氨基酸序列在不同血清型毒株之间具有高度变异的特性，因此可以根据Seg-2基因的差异鉴定PALV毒株的血清型。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

(1)首次建立了针对PALV中国毒株的血清型特异性多重RT-PCR检测试剂盒。目前，世界范围内仅有Imadeldin报道的针对PALV Seg-3基因设计的群特异性巢式PCR检测方法，诊断PALV血清型的核酸检测方法尚无报道。采用本发明试剂盒进行检测，为快速进行PALV血清型鉴定提供了准确、高效的方法。

(2)在进行PALV血清型鉴定时，本发明提供的血清型特异性RT-PCR检测试剂盒与传统的血清中和试验相比，具有明显优势，体现在以下几方面，如表2：

表2 CHUV、BCV与DAV三重RT-PCR检测试剂盒与血清中和试验对比结果

(3)采用本发明试剂盒，可以通过一次RT-PCR反应就能同时检测CHUV、BCV和DAV等3种PALV血清型病毒进行检测，避免了常规PCR的重复检测，具有低成本、高效率等优点，而且在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。

(4)本发明根据RT-PCR技术原理，并根据PALV病毒基因型与血清型相对应以及我国南方地区具有三种血清型PALV病毒的特点，通过本发明试剂盒建立了多重RT-PCR检测方法，其简单、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于临床样品中PALV病毒的快速血清型鉴定。

附图说明

图1CHUV、BCV与DAV血清型一步法三重RT-PCR反应后检测的电泳图，M:DL2000DNAMarker，1:CHUV+BCV+DAV混合RNA模板的扩增条带，2:CHUV RNA模板的扩增条带，3:BCV RNA模板的扩增条带，4:DAV RNA模板的扩增条带，5:空白对照；

图2CHUV、BCV与DAV血清型一步法三重RT-PCR特异性试验的电泳图，M:DL2000DNAMarker，1:CHUV+BCV+DAV混合RNA模板的扩增条带，2:CHUV+BCV混合RNA模板的扩增条带，3:CHUV+DAV混合RNA模板的扩增条带，4:BCV+DAV混合RNA模板的扩增条带，5:CHUV RNA模板的扩增条带，6:BCV RNA模板扩增的条带，7:DAV RNA模板的扩增条带，8-11:BTV、EHDV、AKAV、AHSV RNA模板的扩增结果，12:空白对照。

图3CHUV、BCV与DAV血清型一步法三重RT-PCR灵敏度试验的电泳图，M:DL2000DNAMarker，1-8：ssRNA稀释度分别为10³～10¹⁰倍稀释，相对应的核酸拷贝数分别为9.5×10⁸拷贝/μL～95拷贝/μL(CHUV/Seg-2ssRNA)、5.0×10⁸拷贝/μL～50拷贝/μL(BCV/Seg-2ssRNA)、6.9×10⁸拷贝/μL～69拷贝/μL(DAV/Seg-2ssRNA)，9:空白对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实验材料

病毒、细胞株、质粒及血清：

Chuzan Virus(CHUV)、Bunyip Creek virus(BCV)、D’Aguilar Virus(DAV)三种血清型PALV毒株共计19株记载在2012—2016年中国南方地区帕利亚姆血清群病毒的分离与序列特征分析，杨恒，肖雷，李占鸿，孟锦昕，杨振兴，吕敏娜，林栩慧，廖德芳，牛保生，李华春，《畜牧兽医学报》2018年，第49期，公众可从云南省畜牧兽医科学院获得；蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)国际标准参考毒株源自世界动物卫生组织(OIE)参考实验室Onderstepoort Veterinary Institute(South Africa)；非洲马瘟病毒(African horsesickness virus,AHSV)灭活疫苗源自世界动物卫生组织(OIE)参考实验室OnderstepoortVeterinary Institute(South Africa)；流行出血病病毒(Epizootic HemorrhagicDisease Virus,EHDV)标准参考毒株源自澳大利亚麦克阿瑟-伊丽莎白农业研究所(Elizabeth Macarthur Agricultural Institute,EMAI)；阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)为标准参考毒源自澳大利亚麦克阿瑟-伊丽莎白农业研究所(Elizabeth MacarthurAgricultural Institute,EMAI)。BHK-21细胞来源于云南省畜牧兽医科学院；兔抗CHUV、BCV与DAV阳性血清，由云南省畜牧兽医科学院以分离的CHUV、BCV与DAV毒株灭活后经三次免疫新西兰大白兔制备得到，抗体效价分别为1:453、1:320、1:226。

主要试剂及仪器：

β-丙内酯(Sigma)，病毒RNA/DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)，pLB零背景快速连接试剂盒(天根生物科技有限公司)、质粒小提试剂盒(天根生物科技有限公司)、大肠杆菌DH5α感受态细胞(天根生物科技有限公司)、胶回收试剂盒(天根生物科技有限公司)，Xba I内切酶(NEB)，T7启动子RNA体外转录试剂盒(NEB)，RNA纯化试剂盒(NEB)，PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit与DL5000DNA Marker(TaKaRa公司)，核酸蛋白检测仪(Bio-Rad)、梯度PCR仪(ABI)、紫外凝胶成像分析系统(Bio-Rad)、核酸电泳仪(Bio-Rad)。

一组区别CHUV、BCV与DAV血清型的一步法三重RT-PCR检测引物，包括3对引物，分别为CHUV-P1和CHUV-P2、BCV-P1和BCV-P2、DAV-P1和DAV-P2；序列信息如表3所示。

表3 CHUV、BCV与DAV血清型特异性一步法三重RT-PCR检测引物序列信息

一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测试剂盒除了包括表3中的引物外，还包括空白对照模板、阳性对照模板和PCR扩增试剂；

所述的空白对照模板为RNase Free Water；

所述的阳性对照模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV灭活病毒灭活前病毒滴度分别为4.5×10³PFU/mL、3.5×10³PFU/mL、6.2×10³PFU/mL，使用β-丙内酯灭活。

所述的RT-PCR扩增试剂包括PrimeScript 1 Step Enzyme Mix和2×1 StepBuffer，两者源自TaKaRa公司PrimeScriptTM One Step RT-PCR试剂盒。

优选，引物CHUV-P1：CHUV-P2：BCV-P1：BCV-P2：DAV-P1：DAV-P2的摩尔比为1：1：1.5：1.5：1.5：1.5。

所述的区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测试剂盒包括彼此独立分装的以下各组分，如表4所示。

表4试剂盒组分(50次量)

实施例1、一步法三重RT-PCR检测方法的建立

1.1引物的设计与合成

根据中国CHUV、BCV与DAV毒株Seg-2基因序列以及GenBank公布的PALV毒株的序列，分别设计一对针对CHUV的特异性引物CHUV-P1和CHUV-P2，一对针对BCV的特异性引物BCV-P1和BCV-P2，一对针对DAV的特异性引物DAV-P1和DAV-P2；设计的三对特异性引物(表5)由上海Invitrogen公司合成。

表5 CHUV、BCV与DAV血清型特异性一步法三重RT-PCR检测引物序列信息

所有引物以无菌ddH₂O(RNase free)配成20μM的浓度备用。

1.2病毒RNA的提取

使用β-丙内酯对CHUV、BCV、DAV、BTV、EHDV、AKAV进行灭活，具体灭活过程如下：β-丙内酯的终浓度为0.025％(体积百分数)，4℃灭活24h，然后于37℃作用2h水解β-丙内酯。取200μL灭活的病毒液，利用病毒RNA/DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)，按说明书方法，提取病毒RNA，将提取的核酸于94℃变性5min后，立即置于冰盒冷却，并于-80℃保存备用。

1.3三重RT-PCR反应条件优化

分别以4.5μL CHUV RNA、4.5μL BCV RNA、4.5μL DAV RNA、1.5μL CHUV RNA+1.5μLBCV RNA+1.5μL DAV RNA混合核酸作为模板，以引物对CHUV-P1/P2+BCV-P1/P2+DAV-P1/P2为混合引物，上下游引物分别使用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μL，退火温度分别设置为53、55、57、59℃共4个梯度，进行三重RT-PCR检测，反应结束后，取5μL扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶上进行电泳。

结果表明，使用CHUV RNA+BCV RNA+DAV RNA为混合模板，扩增得到大小为576bp、705bp与881bp的条带，使用CHUV RNA、BCV RNA、DAV RNA单一核酸为模板，分别扩增得到大小为576bp、705bp、881bp的条带，符合实验预期大小(附图1)。

最终确定三重RT-PCR的最佳退火温度为57℃，最佳反应程序为：50℃反转录30min；94℃灭活逆转录酶2min；94℃预变性30s、57℃退火30s、72℃延伸75s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。引物最佳使用量：CHUV-P1/P2分别为0.4μL，终浓度为0.32μM，BCV-P1/P2分别为0.6μL，终浓度为0.48μM，DAV-P1/P2分别为0.6μL，终浓度为0.48μM，最佳反应体系如表6所示。

表6多重RT-PCR反应体系

总计：25μL。

1.4 CHUV/Seg-2ssRNA、BCV/Seg-2ssRNA与DAV/Seg-2ssRNA标准品的制备

按照“胶回收试剂盒”说明书(天根生化科技有限公司)将步骤1.3所得的CHUV/Seg-2、BCV/Seg-2、DAV/Seg-2扩增产物(即分别为以CHUV、BCV与DAV的变性RNA为模板的扩增产物)进行电泳胶回收纯化，将纯化产物按照“pLB零背景快速连接试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书与pLB平末端克隆载体进行连接，转化“大肠杆菌DH5α感受态细胞”(天根生化科技有限公司)，筛选阳性克隆菌进行测序鉴定。

按照“质粒小提试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书分别提取插入目的基因的质粒，并命名为pLB_CHUV_Seg-2、pLB_BCV_Seg-2、pLB_DAV_Seg-2，按照“Xba I”限制性内切酶(NEB)说明书线性化质粒；使用胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)按照说明书切胶回收酶切产物作为体外转录的DNA模板，使用T7启动子RNA体外转录试剂盒(NEB)按说明书进行体外转录，使用体外转录试剂盒(NEB)提供的DNase I酶按照说明书进行DNA模板的消化处理，使用RNA纯化试剂盒(NEB)进行转录ssRNA的纯化。将纯化的ssRNA进行电泳检测，采用Nanodrop ND-2000测定核酸浓度，并根据RNA拷贝数计算公式“ssRNA拷贝数(拷贝/μL)＝(6.02×10²³)×RNA浓度(ng/μL)×10^-9/(RNA length×340)”，计算RNA拷贝数：CHUV/Seg-2ssRNA浓度为618ng/μL，拷贝数为9.5×10¹¹拷贝/μL；BCV/Seg-2ssRNA浓度为325ng/μL，拷贝数为5.0×10¹¹拷贝/μL；DAV/Seg-2ssRNA浓度为450ng/μL，拷贝数为6.9×10¹¹拷贝/μL，分装后于-80℃保存备用。

实施例2、三重RT-PCR的特异性试验

按照实施例1-步骤1.3中确定的最佳反应条件进行反应，对CHUV+BCV+DAV混合RNA模板(1.5μL+1.5μL+1.5μL)，CHUV+BCV混合RNA模板(2.25μL+2.25μL)，CHUV+DAV混合RNA模板(2.25μL+2.25μL)，BCV+DAV混合RNA模板(2.25μL+2.25μL)，CHUV、BCV、DAV、BTV、EHDV、AKAV、AHSV单一RNA模板(4.5μL)进行多重RT-PCR扩增。反应结束后，取5μL扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，结果表明，本发明建立的CHUV、BCV、DAV三重RT-PCR检测方法仅能对CHUV、BCV、DAV RNA进行特异性扩增，对BTV、EHDV、AKAV、AHSV RNA的扩增结果均为阴性，说明本发明可作为特异性鉴定CHUV、BCV和DAV血清型的方法(附图2)。

实施例3、引物的敏感性验证

分别取实施例1-步骤1.4中制备的CHUV Seg-2ssRNA(9.5×10¹¹拷贝/μL)、BCVSeg-2ssRNA(5.0×10¹¹拷贝/μL)和DAV Seg-2ssRNA(6.9×10¹¹拷贝/μL)等体积混合后进行10倍系列稀释，选择10³～10¹⁰稀释的ssRNA为模板，相应的核酸拷贝数分别为9.5×10⁸拷贝/μL～95拷贝/μL(CHUV/Seg-2ss RNA)、5.0×10⁸拷贝/μL～50拷贝/μL(BCV/Seg-2ssRNA)、6.9×10⁸拷贝/μL～69拷贝/μL(DAV/Seg-2ssRNA)；按照实施例1-步骤1.3中确定的优化后的RT-PCR反应体系与条件进行多重RT-PCR扩增。反应结束后，取5μL扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，结果表明本研究建立的CHUV、BCV、DAV三重RT-PCR检测方法对CHUV的最低检测量为950拷贝，BCV最低检测量为500拷贝，DAV最低检测量为690拷贝(附图3)。以上结果表明利用试剂盒检测CHUV、BCV和DAV具有较高的灵敏度。

实施例4、分离培养病毒的检测

用本发明建立的三重RT-PCR检测试剂盒对分离至云南、广西、广东等3个省市的19株PALV毒株进行检测。同时，使用CHUV、BCV与DAV标准阳性血清(兔抗CHUV、BCV与DAV阳性血清)，按照常规血清中和试验的方法，对分离病毒的血清型进行鉴定。

结果如表7所示，本发明建立的三重RT-PCR方法的检测结果与血清中和试验结果完全一致，说明本发明建立的多重RT-PCR方法在进行PALV血清型鉴定时，具有准确、可靠等优点；同时，检测时间仅为2小时，与血清中和试验相比，检测时间大大缩短，满足对疫病进行快速诊断的需求。

表7 CHUV、BCV、DAV血清型一步法三重RT-PCR检测与病毒中和试验结果对比

注：“﹨”表示缺少相应血清型毒株，未进行检测。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物及试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gaggctgtat gtggagtgga gat 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tctatcaatg gtcccacgca tct 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gtgacgcaat ctcaatggct ctg 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

caacacatcc gtccgccaat tc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gcgagattgg gatggatgtc a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

cagaytctcc ctttctcaga t 21

<210> 7

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gaggctgtat gtggagtgga gataagtgat cccacaagcg atcttggcaa ttatagcaat 60

aggtcttcac gaaccgtttc gtatgtggag atgaaatggg aatgtgatga aattagaact 120

gatgctccga tcagagcaat taattgggac atccttgaaa agaataacgt gctctttata 180

cagcaagggt ttggtgttgt atcaaaaaat actgatggat attttgatga tattagcgtg 240

catgcttttt tatcatacag cactttcgag agggaggggc gaaatctcaa gattcattgg 300

atttacgatg aagaatggaa gaagccgaag cgtttttatt cttatcacta taagatcacc 360

agagaagaat ccattatgaa taatttcttt gggaagaatg tgtatgaagt taaaggacga 420

aagtatccat atccatatac tgaaatcgca ccgcatacac gtgaatattt gcaagagacg 480

ctaatgattg ggaacgtaag agaaccatat gatggagtaa acgaaagatg gaaatgggtt 540

gaaaacgaac tgcagatgcg tgggaccatt gataga 576

<210> 8

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gtgacgcaat ctcaatggct ctggtaaaag tttgtaattt tccgttggca acgcgtgagc 60

agttatttta tatagcacat tctataaata aggttgaggc catgattgag gtttttccaa 120

aaatacgcaa tcttattaat gatcacacgg tgatttcctt ctactctttg aatattatac 180

caatattgtt aactgtgata ccatatggta gaattgtgga taatcacatt ccaattataa 240

tacatacaga tgttggtatg agagtgatac cagggtcaac ctataatgtg aagagtggcc 300

aaaacatgtc tgattggttg atgtatctgg aatcagtcgt agatagacgt cagggctcga 360

gaaatttgac gaaccacgaa cgtgaagtga agagtgcttt tttaagatac tatgagcatg 420

taataataaa atcacgtttc agtcgcgcag cgttgaagta taagttagaa atgctggaaa 480

gttgggttgg cattaattgt tcaggttatt tcgattcgat ggttcaagtc gtgccaattc 540

gatcgccaaa gaaaggtttt gtgttactga ttttatcgga tgatacgaag ccattggcct 600

atattcacgc aaggttatta cgtatgtttt cacatgtttg gacctcatgt cgcggagtac 660

atataataga tgtacgcaaa ggtgaattgg cggacggatg tgttg 705

<210> 9

<211> 881

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gcgagattgg gatggatgtc atgtaagcaa ttggtccgca tgtgagatgt ttgagacaag 60

aaggcttctt atttttcttc taagacgtat ttcccagcca ggaccccatc cattattttc 120

aaaatttgat gatgaagatt ggttggagag taagggatat ggcctgggta aaggtgttcc 180

tatggacatg tgtgattgtg tcaatatcgc tgttagtagt gttttaaatt ttgaaaattt 240

taatcgagag aaacagttct ttttcataca cgcgatgaat agaatcgaag ctttaaaaga 300

gattgagcca aaattcactg ctatgttagc ctcaaccact agactttcaa tgtatgcgct 360

taatttactt ccgattctaa tgacgatgat tccttatgga cgaattacag aaggatatat 420

accaatcatc atatacacag atgtagggat gcgggtgata ccggcgtccg tttcaaatgt 480

taagaatgcg caaaatatgt ctgactgggc gatgtatttg gaagcctata tgtcgaaagg 540

tgaagcgcaa gctaatttga cagattacga aaataaaatt agggatgctt ttatcaattt 600

ttataactca ttaaaagttg aatcaagata tgaacgaatg aatagaaaat ataaattaga 660

gtcgcttgag agctggatag gggcgaattg tatgggttat tttgattgtt atacacagat 720

gattcctatc aagagtccaa aaagaggttt tatcttcttg gtacttacgg actctgttaa 780

agctatggga catgtcacag ctcgactaag gaaaatgttt cctcatgtct ggaacagttg 840

tagaggcgtg catatcatcg atctgagaaa gggagagtct g 881

Claims

1.一种区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物，其特征在于，包括3对引物，分别为CHUV-P1和CHUV-P2、BCV-P1和BCV-P2、DAV-P1和DAV-P2；

CHUV-P1：gaggctgtatgtggagtggagat（SEQ ID NO.1）；

CHUV-P2：tctatcaatggtcccacgcatct（SEQ ID NO.2）；

BCV-P1：gtgacgcaatctcaatggctctg（SEQ ID NO.3）；

BCV-P2：caacacatccgtccgccaattc（SEQ ID NO.4）；

DAV-P1：gcgagattgggatggatgtca（SEQ ID NO.5）；

DAV-P2：cagaytctccctttctcagat（SEQ ID NO.6）。

2.含有权利要求1所述区别CHUV、BCV与DAV的一步法三重RT-PCR检测引物的试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括空白对照模板、阳性对照模板和PCR扩增试剂；

所述的空白对照模板为RNase Free Water；

所述的阳性对照模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV灭活病毒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，CHUV、BCV与DAV病毒灭活前的滴度分别为4.5×10³PFU/mL、3.5×10³PFU/mL、6.2×10³PFU/mL，病毒使用β-丙内酯灭活。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂包括PrimeScript 1Step Enzyme Mix和2×1 Step Buffer。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，引物CHUV-P1：CHUV-P2：BCV-P1：BCV-P2：DAV-P1：DAV-P2的摩尔比为1：1：1.5：1.5：1.5：1.5。

7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其扩增体系为：

共计：25μL。

8.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的扩增程序：50℃ 反转录30min；94℃ 灭活逆转录酶2 min；94℃ 预变性30 s、57℃ 退火30 s、72℃延伸 75s，30个循环；72℃终延伸10 min，4℃ 保存。