CN111518950A - 检测引起牛腹泻的四种病毒的成套试剂与试剂盒 - Google Patents

检测引起牛腹泻的四种病毒的成套试剂与试剂盒 Download PDF

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CN111518950A CN202010362456.8A CN202010362456A CN111518950A CN 111518950 A CN111518950 A CN 111518950A CN 202010362456 A CN202010362456 A CN 202010362456A CN 111518950 A CN111518950 A CN 111518950A
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Abstract

本发明公开了检测引起牛腹泻的四种病毒的成套试剂与试剂盒。本发明公开的检测引起牛腹泻的四种病毒的成套试剂，由序列表中序列1、2、4、5、7、8、10、11所示的8条单链DNA和序列为3、6、9和12的4条探针组成。实验证明，本发明的成套试剂能够同时检测引起牛腹泻的四种主要病毒—牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒，且灵敏度高，特异性好，能够很好地辅助临床兽医准确诊断犊牛腹泻的病因以及开展流行病学监测，具有广泛的应用前景。

Description

检测引起牛腹泻的四种病毒的成套试剂与试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，检测引起牛腹泻的四种病毒的成套试剂与试剂盒。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)非细胞病变型和细胞病变型感染犊牛后均会导致一些温和的急性呼吸道疾病和腹泻的症状：感染后3-5天开始出现精神沉郁，拒食，体温高达41.9℃，从鼻腔和眼睛排出浆液性分泌液，短期血便，白细胞减少症(可低至2700个/立方毫米)并且呼吸器官及肠道有肉眼可见的变化。这些感染的动物大多在感染后12-15天后恢复，并且90％的病例在感染25天后形成体液免疫。星状病毒是人类胃肠炎的主要致病因素，与其他哺乳动物和鸟类的腹泻也有关，其中，牛星状病毒(Bovine astrovirus，BAstV)也被证明能够感染并导致肠道M细胞病变。牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCV)和牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)是最常见的病毒性肠道病原体。牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛轮状病毒均是导致犊牛腹泻的常见消化道病毒，开发一种能同时检测这四种病毒的方法是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种成套试剂，所述成套试剂包括：名称为BAstV-A的检测牛星状病毒的引物对、名称为BVDV-A的检测牛病毒性腹泻病毒1型的引物对、名称为BCV-A的检测牛冠状病毒的引物对和/或名称为BRV-A检测牛轮状病毒的引物对；
所述BAstV-A由名称分别为BAstV-F和BAstV-R的单链DNA组成，所述BAstV-F和所述BAstV-R的序列分别为序列表中序列1和2；
所述BVDV-A由名称分别为BVDV-F和BVDV-R的单链DNA组成，所述BVDV-F和所述BVDV-R的序列分别为序列表中序列4和5；
所述BCV-A由名称分别为BCV-F和BCV-R的单链DNA组成，所述BCV-F和所述BCV-R的序列分别为序列表中序列7和8；
所述BRV-A由名称分别为BRV-F和BRV-R的单链DNA组成，所述BRV-F和所述BRV-R的序列分别为序列表中序列10和11。
各引物对中的两条单链DNA的模板均可相等。
上述成套试剂还可包括名称为BAstV-P的检测牛星状病毒的探针、名称为BVDV-P的检测牛病毒性腹泻病毒1型的探针、名称为BCV-P的检测牛冠状病毒的探针和/或名称为BRV-P的检测牛轮状病毒的探针；
所述BAstV-P为两端标有荧光物质的单链DNA，其序列为序列表中序列3；
所述BVDV-P为两端标有荧光物质的单链DNA，其序列为序列表中序列6；
所述BCV-P为两端标有荧光物质的单链DNA，其序列为序列表中序列9；
所述BRV-P为两端标有荧光物质的单链DNA，其序列为序列表中序列12。
所述BAstV-P的5′末端和3′末端可分别标记有6-FAM和MGB。
所述BVDV-P的5′末端和3′末端可分别标记有HEX和MGB。
所述BCV-P的5′末端和3′末端可分别标记有Texas Red和MGB。
所述BRV-P的5′末端和3′末端可分别标记有CY5和MGB。
上述成套试剂可由所述BAstV-A、所述BVDV-A、所述BCV-A和/或所述BRV-A组成，还可由所述BAstV-A、所述BVDV-A、所述BCV-A和所述BRV-A这四种引物对中的四种、任三种、任两种、任一种与所述BAstV-P、所述BVDV-P、所述BCV-P和所述BRV-P这四种探针中的四种、任三种、任两种、任一种组成。
具体的，在所述成套试剂由所述BAstV-A、所述BVDV-A、所述BCV-A、所述BRV-A、所述BAstV-P、所述BVDV-P、所述BCV-P和所述BRV-P组成时，所述BAstV-A的两条单链DNA、所述BVDV-A的两条单链DNA、所述BCV-A的两条单链DNA、所述BRV-A的两条单链DNA、所述BAstV-P、所述BVDV-P、所述BCV-P和所述BRV-P的摩尔比为300:300:300:300:400:400:500:500:250:150:100:300。
所述成套试剂可为具有如下任一用途的试剂：
X1、检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X2、制备检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒的产品；
X3、检测待测样品是否含有牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X4、检测待测样品是否为牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述成套试剂。
所述试剂盒还可包括进行PCR或RT-PCR所需的非模板、引物和探针外的其他试剂。
在本发明的一个实施例中，所述其他试剂为2×One Step RT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ，2×One Step RT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ均为One StepPrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)(宝生物工程(大连)有限公司)中试剂。
所述试剂盒可为具有如下任一用途的试剂盒：
X1、检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X2、制备检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒的产品；
X3、检测待测样品是否含有牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X4、检测待测样品是否为牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒。
所述成套试剂的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
X1、检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X2、制备检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒的产品；
X3、检测待测样品是否含有牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X4、检测待测样品是否为牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒。
所述试剂盒的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
X1、检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X2、制备检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒的产品；
X3、检测待测样品是否含有牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X4、检测待测样品是否为牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒。
本发明中，所述产品可为试剂盒。所述PCR可为定量PCR(qPCR)。
本发明的成套试剂与试剂盒能够同时检测引起牛腹泻的四种主要病毒—牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒，灵敏度高，特异性好，能够很好地辅助临床兽医准确诊断犊牛腹泻的病因以及开展流行病学监测，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为牛星状病毒单重qPCR退火温度优化结果。
图2为牛病毒性腹泻病毒1型单重qPCR退火温度优化结果。
图3为牛冠状病毒单重qPCR退火温度优化结果。
图4为牛轮状病毒单重qPCR退火温度优化结果。
图5为牛星状病毒引物浓度优化结果。
图6为牛病毒性腹泻病毒1型引物浓度优化结果。
图7为牛冠状病毒引物浓度优化结果。
图8为牛轮状病毒引物浓度优化结果。
图9为牛星状病毒探针浓度优化结果。
图10为牛病毒性腹泻病毒1型探针浓度优化结果。
图11为牛冠状病毒探针浓度优化结果。
图12为牛轮状病毒探针浓度优化结果。
图13为退火时间为30s的牛星状病毒扩增曲线。
图14为退火时间为45s的牛星状病毒扩增曲线。
图15为退火时间为60s的牛星状病毒扩增曲线。
图16为BVDV-P探针浓度优化荧光曲线图。横坐标为反应时间。
图17为BAstV-P探针浓度优化的荧光曲线图。横坐标为反应时间。
图18为BAstV及BVDV引物浓度优化的荧光BVDV曲线图。横坐标为反应时间。
图19为检测牛星状病毒的标准曲线。
图20为检测牛病毒性腹泻病毒1型的标准曲线。
图21为检测牛冠状病毒的标准曲线。
图22为检测牛轮状病毒的标准曲线。
图23为特异性实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
2×One Step RT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、PrimeScript RTEnzyme MixⅡ均为One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)中试剂，该试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司产品。
实施例1、检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒的成套试剂的制备
本发明提供了一种检测四种牛病毒的成套试剂，能够同时检测牛星状病毒(BAstV)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)、牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)，该成套试剂由检测牛星状病毒的成套试剂、检测牛病毒性腹泻病毒1型的成套试剂、检测牛冠状病毒的成套试剂和检测牛轮状病毒的成套试剂组成。
其中，检测牛星状病毒的成套试剂由检测牛星状病毒的引物对BAstV-A和探针BAstV-P组成，BAstV-A由名称分别为BAstV-F和BAstV-R的单链DNA组成，BAstV-P为两端标有荧光物质的单链DNA。
检测牛病毒性腹泻病毒1型的成套试剂由检测牛病毒性腹泻病毒1型的引物对BVDV-A和探针BVDV-P组成，BVDV-A由名称分别为BVDV-F和BVDV-R的单链DNA组成，BVDV-P为两端标有荧光物质的单链DNA。
检测牛冠状病毒的成套试剂由检测牛冠状病毒的引物对BCV-A和探针BCV-P组成，BCV-A由名称分别为BCV-F和BCV-R的单链DNA组成，BCV-P为两端标有荧光物质的单链DNA。
检测牛轮状病毒的成套试剂由检测牛轮状病毒的引物对BRV-A和探针BRV-P组成，BRV-A由名称分别为BRV-F和BRV-R的单链DNA组成，BRV-P为两端标有荧光物质的单链DNA。
各引物和探针的序列和标记的荧光物质见表1。
表1、引物及探针信息
Figure BDA0002475463550000041
注：引物对中“F”表示上游引物，“R”表示下游引物。
实施例2、实施例1的成套试剂检测条件的优化
一、制备标准质粒
使用病毒基因组RNA提取试剂盒分别提取牛星状病毒B76-2/HK株、牛病毒性腹泻病毒1型JL株(BVDV-JL)、牛冠状病毒Aks-01新疆南疆株(BCV-Aks-01)、牛轮状病毒NX23株的全基因组RNA，并将牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型和牛冠状病毒反转录为cDNA。
其中，牛星状病毒B76-2/HK株(艾佛德，广西牛星状病毒分子流行病学调查与全基因克隆及序列分析，广西大学硕士论文，2014年6月)；
牛病毒性腹泻病毒1型JL株(BVDV-JL)(张淑琴等，牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL分离株全基因序列测定与分析，中国畜牧兽医，2014年第41卷第10期)；
牛冠状病毒Aks-01新疆南疆株(BCV-Aks-01)(张婉琪等，牛冠状病毒BCV-Aks-01新疆南疆株全基因组序列测定及其分子特征分析，病毒学报，2017年6月，第33卷第4期)；
牛轮状病毒NX23株(葛雨等，G8P[1]型牛轮状病毒的分离鉴定及序列分析，现代畜牧兽医，2019年第4期)。
使用引物BAstV-F、BAstV-R对牛星状病毒的全基因组cDNA进行PCR，电泳并胶回收获得146bp的牛星状病毒的目的片段，使用引物BVDV-F、BVDV-R对牛病毒性腹泻病毒1型的全基因组cDNA进行PCR，电泳并胶回收获得142bp的牛星状病毒的目的片段，使用引物BCV-F、BCV-R对牛冠状病毒的全基因组cDNA进行PCR，电泳并胶回收获得179bp的牛冠状病毒的目的片段。
将牛轮状病毒NX23株的全基因组RNA在95℃5min后置于冰上，使用引物BRV-F、BRV-R对牛轮状病毒的全基因组RNA采用One-Step RT-PCR进行PCR,电泳并胶回收获得121bp的牛轮状病毒的目的片段。
将回收的各病毒的目的片段分别连接到pEASY-T1克隆质粒(北京全式金生物技术有限公司)上，通过大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(北京全式金生物技术有限公司)转化，涂板，挑取白色菌落，提质粒，PCR鉴定并送生工测序，确认序列正确后，阳性菌增殖，大量提取质粒DNA,分别得到含有牛星状病毒目的片段的重组质粒pEASY-T1-BAstV、含有牛病毒性腹泻病毒1型目的片段的重组质粒pEASY-T1-BVDV、含有牛冠状病毒目的片段的重组质粒pEASY-T1-BCV和含有牛轮状病毒目的片段的重组质粒pEASY-T1-BRV，以ThermoFisherNanoDrop 2000c全自动核酸微量测定仪测其浓度及纯度后，冻存于-20℃，作为实时荧光定量PCR检测四种病毒的标准质粒。
二、优化退火温度：
分别以牛星状病毒B76-2/HK株、牛病毒性腹泻病毒1型JL株(BVDV-JL)、牛冠状病毒Aks-01新疆南疆株(BCV-Aks-01)、牛轮状病毒NX23株的全基因组RNA为模板优化利用各病毒的成套试剂进行单重qPCR的退火温度。
反应体系均为：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，上、下游引物(20μM)各0.4μL，探针(10μM)0.8μL，总RNA 2μL，RNase Free dH2O 5.6μl。
反应条件为：反转录42℃5min，预变性95℃10s，三步法45个循环(变性95℃5s，退火温度下退火10s，延伸72℃10s)。
BAstV、BVDV-1和BCV的退火温度设置为50.0，50.4，51.2，52.1，53.2，54.3，55.4，56.3，57.1，57.7，58.0，58.0℃；BRV的退火温度设置为48.0，48.3，48.7，49.3，50.0，50.7，51.3，52.0，52.5，52.8，53.0，53.0℃。
表2、BAstV、BVDV-1和BCV单重qPCR不同退火温度下的Ct值
Figure BDA0002475463550000051
Figure BDA0002475463550000061
表2中，“-”表示未检测到CT值。
表3、牛轮状病毒单重qPCR不同退火温度下的Ct值
退火温度 48.0℃ 48.3℃ 48.7℃ 49.3℃ 50.0℃ 50.7℃ 51.3℃ 52.0℃ 52.5℃ 52.8℃ 53.0℃ 53.0℃
Ct值 16.08 15.33 17.16 15.80 16.01 15.70 15.59 15.37 16.70 15.36 15.41 16.11
以
Figure BDA0002475463550000062
96Real-timePCR仪进行实时荧光定量PCR，各病毒的结果如表2-3、图1-4所示，综合考虑Ct值较小，荧光值较高，且曲线形状较好的退火温度是50.0℃，取其为最佳退火温度。
三、优化单重qPCR的引物浓度：
分别以牛星状病毒B76-2/HK株、牛病毒性腹泻病毒1型JL株(BVDV-JL)、牛冠状病毒Aks-01新疆南疆株(BCV-Aks-01)、牛轮状病毒NX23株的全基因组RNA为模板优化利用各病毒的成套试剂进行单重qPCR的引物浓度。
反应体系为：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，上、下游引物(20μM)，探针(10μM)0.8μL，总RNA 2μL，RNase Free dH2O 5.6μL。
反应条件为：反转录42℃5min，预变性95℃10s，三步法45个循环(变性95℃5s，退火50.0℃10s，延伸72℃10s)。
牛星状病毒引物的上下游引物均设置11个浓度，上下游引物在体系中的浓度分别如表4-1～4-3所示，每种浓度三个重复孔。
结果如表4-1～4-3和图5所示。取平均Ct值较小，误差较小，荧光值较高，曲线平滑且三个重复间重叠度好的，因此牛星状病毒最佳引物浓度为300nmol/L。
表4-1、牛星状病毒引物浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000063
表4-2、牛星状病毒引物浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000064
表4-3、牛星状病毒引物浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000065
注：表4-1～4-3中，“-”表示未检测到CT值，Ct Mean表示CT值平均值，Ct Error表示CT值误差。
牛病毒性腹泻病毒1型引物的上下游引物均设置6个浓度，上下游引物在体系中的浓度分别如表5-1～5-2所示，每种浓度三个重复孔。
结果如表5-1～5-2和图6所示。取平均Ct值较小，误差较小，荧光值较高，曲线平滑且三个重复间重叠度好的，因此牛病毒性腹泻病毒1型最佳引物浓度为300nmol/L。
表5-1、牛病毒性腹泻病毒1型引物浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000071
表5-2、牛病毒性腹泻病毒1型引物浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000072
注：表5-1～5-2中，Ct Mean表示CT值平均值，Ct Error表示CT值误差。
牛冠状病毒引物的上下游引物均设置11个浓度，上下游引物在体系中的浓度分别如表6-1～6-3所示，每种浓度三个重复孔。
结果如表6-1～6-3和图7所示。取平均Ct值较小，误差较小，荧光值较高，曲线平滑且三个重复间重叠度好的，因此牛冠状病毒最佳引物浓度为400nmol/L。
表6-1、牛冠状病毒引物浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000073
表6-2、牛冠状病毒引物浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000074
表6-3、牛冠状病毒引物浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000075
注：表6-1～6-3中，“-”表示未检测到CT值，Ct Mean表示CT值平均值，Ct Error表示CT值误差。
牛轮状病毒引物的上下游引物均设置9个浓度，上下游引物在体系中的浓度分别如表7-1～7-2所示，每种浓度三个重复孔。
结果如表7-1～7-2和图8所示。取平均Ct值较小，误差较小，荧光值较高，曲线平滑且三个重复间重叠度好的，因此牛轮状病毒最佳引物浓度为500nmol/L。
表7-1、牛轮状病毒引物浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000081
表7-2、牛轮状病毒引物浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000082
注：表7-1～7-2中，Ct Mean表示CT值平均值，Ct Error表示CT值误差。
四、优化单重qPCR的探针浓度：
分别以牛星状病毒B76-2/HK株、牛病毒性腹泻病毒1型JL株(BVDV-JL)、牛冠状病毒Aks-01新疆南疆株(BCV-Aks-01)、牛轮状病毒NX23株的全基因组RNA为模板优化利用各病毒的成套试剂进行单重qPCR的探针浓度。
反应体系为：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，上、下游引物(20μM)，探针(10μM)0.8μL，总RNA 2μL，RNase Free dH2O 5.6μL。
反应条件为：反转录42℃5min，预变性95℃10s，三步法45个循环(变性95℃5s，退火50.0℃10s，延伸72℃10s)。
牛星状病毒上下游引物浓度均为300nmol/L，探针设置6个浓度，各浓度如表8-1～8-2所示，每种浓度三个重复孔。
结果如表8-1～8-2和图9所示。取平均Ct值较小，误差较小，荧光值较高，曲线平滑且三个重复间重叠度好的，因此牛星状病毒最佳探针浓度为400nmol/L。
表8-1、牛星状病毒探针浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000083
表8-2、牛星状病毒探针浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000084
注：表8-1～8-2中，Ct Mean表示CT值平均值，Ct Error表示CT值误差。
牛病毒性腹泻病毒1型上下游引物浓度均为300nmol/L，探针设置6个浓度，各浓度如表9-1～9-2所示，每种浓度三个重复孔。
结果如表9-1～9-2和图10所示。取平均Ct值较小，误差较小，荧光值较高，曲线平滑且三个重复间重叠度好的，因此牛病毒性腹泻病毒1型最佳探针浓度为100nmol/L。
表9-1、牛病毒性腹泻病毒1型探针浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000091
表9-2、牛病毒性腹泻病毒1型探针浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000092
注：表9-1～9-2中，Ct Mean表示CT值平均值，Ct Error表示CT值误差。
牛冠状病毒上下游引物浓度均为400nmol/L，探针设置6个浓度，各浓度如表10-1～10-2所示，每种浓度三个重复孔。
结果如表10-1～10-2和图11所示。取平均Ct值较小，误差较小，荧光值较高，曲线平滑且三个重复间重叠度好的，因此牛冠状病毒最佳探针浓度为100nmol/L。
表10-1、牛冠状病毒探针浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000093
表10-2、牛冠状病毒探针浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000094
注：表10-1～10-2中，“-”表示未检测到CT值，Ct Mean表示CT值平均值，Ct Error表示CT值误差。
牛轮状病毒上下游引物浓度均为500nmol/L，探针设置6个浓度，各浓度如表11-1～11-2所示，每种浓度三个重复孔。
结果如表11-1～11-2和图12所示。取平均Ct值较小，误差较小，荧光值较高，曲线平滑且三个重复间重叠度好的，因此牛轮状病毒最佳探针浓度为300nmol/L。
表11-1、牛轮状病毒探针浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000095
表11-2、牛轮状病毒探针浓度优化结果
Figure BDA0002475463550000096
Figure BDA0002475463550000101
注：表11-1～11-2中，Ct Mean表示未检测到CT值，Ct Error表示CT值误差。
五、优化多重qPCR退火时间：
以牛星状病毒B76-2/HK株、牛病毒性腹泻病毒1型JL株(BVDV-JL)、牛冠状病毒Aks-01新疆南疆株(BCV-Aks-01)、牛轮状病毒NX23株的全基因组RNA各0.5μL组成的混合RNA为模板优化利用实施例1的成套试剂进行多重qPCR的退火时间。
反应体系为：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，BAstV-F(20μM)和BAstV-R(20μM)各0.3μL，BVDV-F(20μM)和BVDV-R(20μM)各0.3μL，BCV-F(20μM)和BCV-R(20μM)各0.4μL，BRV-F(20μM)和BRV-R(20μM)各0.5μL，BAstV-P(10μM)0.8μL，BVDV-P(10μM)0.2μL，BCV-P(10μM)0.2μL，BRV-P(10μM)0.6μL，混合RNA 2μL，RNase Free dH2O补足至20μL。反应体系中，BAstV-F和BAstV-R的浓度均为300nmol/L，BVDV-F和BVDV-R的浓度均为300nmol/L，BCV-F和BCV-R的浓度均为400nmol/L，BRV-F和BRV-R的浓度均为500nmol/L，BAstV-P的浓度为400nmol/L，BVDV-P的浓度为100nmol/L，BCV-P的浓度为100nmol/L，BRV-P的浓度为300nmol/L。
反应条件为：反转录42℃5min，预变性95℃10s，三步法45个循环(变性95℃5s，退火50℃不同时间，延伸72℃10s)。退火时间设置为30s，45s，60s。
结果如图13-15所示，退火时间为45s时曲线更适宜且耗时短，取退火时间为45s。
六、优化四种病毒各多重qPCR的条件：
优化多重qPCR的条件：
反应体系为：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，BAstV-F(20μM)和BAstV-R(20μM)，BVDV-F(20μM)和BVDV-R(20μM)，BCV-F(20μM)和BCV-R(20μM)，BRV-F(20μM)和BRV-R(20μM)，BAstV-P(10μM)，BVDV-P(10μM)，BCV-P(10μM)，BRV-P(10μM)，模板2μL，RNase Free dH2O补足至20μL。
反应条件：反转录42℃5min，预变性95℃10s，三步法45个循环(变性95℃5s，退火50℃45s，延伸72℃10s)。
按照上述体系和反应条件进行BVDV探针浓度优化：向反应体系中分别加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5μL的探针BVDV-P(10μM)，每种浓度四个重复，其中两个重复的模板为步骤一的四种标准质粒的混合物，另两个重复的模板为104拷贝/μL的步骤一的pEASY-T1-BVDV。BVDV-F和BVDV-R以及其余病毒的引物和探针的浓度均同步骤五。结果见图16，可知体系中BVDV-P的浓度为150nmol/L时为最佳浓度。
按照上述体系和反应条件进行BAstV探针浓度优化：向反应体系中分别加入0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8μL的探针BAstV-P(10μM)，每种浓度四个重复，其中两个重复的模板为步骤一的四种标准质粒的混合物，一个重复的模板为103拷贝/μL的步骤一的pEASY-T1-BastV，一个重复的模板为104拷贝/μL的步骤一的pEASY-T1-BAstV。BAstV-F和BAstV-R以及其余病毒的引物和探针的浓度均同步骤五。结果见图17，可知体系中BAstV-P的浓度为250nmol/L时为最佳浓度。
按照上述体系和反应条件进行BAstV及BVDV引物浓度优化：首先向反应体系中加入BastV两条引物(BastV-F和BastV-R，20μM)各0.6-1.4μL与BVDV两条引物(BVDV-F和BVDV-R，20μM)各0.2-1.0μL做棋盘式优化，然后取较优的三个组合(即BastV两条引物各0.6μL和BVDV两条引物各0.2μL，BAstV两条引物各0.6μL和BVDV两条引物各0.6μL，BAstV两条引物各1.4μL和BVDV两条引物各0.6μL)再次实验，每种组合六个重复，其中两个重复的模板为步骤一的四种标准质粒的混合物，两个重复的模板为104拷贝/μL的步骤一的pEASY-T1-BVDV，两个重复的模板为104拷贝/μL的步骤一的pEASY-T1-BastV。其余探针和引物的浓度均同步骤五。结果见图18，可知体系中BastV两条引物浓度均为300nmol/L、BVDV两条引物浓度均为300nmol/L时为最佳引物组合浓度。
七、检验同时检测四种病毒与单种病毒的差异：
以优化好的多重体系与反应条件进行qPCR，模板为步骤一的四种标准质粒的混合物、pEASY-T1-BastV、pEASY-T1-BVDV、pEASY-T1-BCV或pEASY-T1-BRV，以无菌去离子水为阴性对照，对比单种模板存在的四重qPCR与四种模板同时存在的四重qPCR的Ct值差异。
反应体系为：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，BAstV-F(20μM)和BAstV-R(20μM)0.3μL，BVDV-F(20μM)和BVDV-R(20μM)0.3μL，BCV-F(20μM)和BCV-R(20μM)0.4μL，BRV-F(20μM)和BRV-R(20μM)0.5μL，BAstV-P(10μM)0.5μL，BVDV-P(10μM)0.3μL，BCV-P(10μM)0.2μL，BRV-P(10μM)0.6μL，模板2μL，RNase Free dH2O补足至20μL。其中BAstV-F和BAstV-R的浓度均为300nmol/L，BVDV-F和BVDV-R的浓度均为300nmol/L，BCV-F和BCV-R的浓度均为400nmol/L，BRV-F和BRV-R的浓度均为500nmol/L，BAstV-P的浓度为250nmol/L，BVDV-P的浓度为150nmol/L，BCV-P的浓度为100nmol/L，BRV-P的浓度为300nmol/L。
反应条件：反转录42℃5min，预变性95℃10s，三步法45个循环(变性95℃5s，退火50℃45s，延伸72℃10s)。
结果见表12，每种单种模板存在的四重qPCR与四种模板同时存在的四重qPCR的Ct值差异小于3，即拷贝数差异小于一个数量级，可进行数量级程度拷贝数的定量。
表12、单种模板与多种模板的差异性
Figure BDA0002475463550000111
八、检验多重系统检测病原效果：
以BVDV-JL的95℃5min水浴后置于冰上的基因组RNA为模板，利用步骤七中优化后的反应体系和条件进行qPCR，以无菌去离子水为阴性对照。
结果显示，BVDV-JL株的RNA可检出，其Ct值为18.05，RNA浓度为111.80ng/μL，TCID50为10-4.5/0.1ml，所对应的拷贝数为1.41×106拷贝/μL，检测的2μL病毒含2.5×103个TCID50，高志强等对北京爱德士元亨生物科技有限公司的BVDV抗原检测试剂盒(货号为99-43810)的敏感度为1.2×103个TCID50。95℃5min水浴后置于冰上的BVDV BJ株的RNA的Ct值为17.37，差异不大，则前期BRV病毒RNA高温解链操作不影响BVDV病毒RNA的检测。
高志强等对IDXX的BVDV抗原检测试剂盒的敏感度的检测步骤如下：
以BVDV标准毒株(Oregon)C24V增殖的二代毒(TCID50为10-5.39/0.1mL)，从10-1～10-5作倍比稀释后，取原液及各个稀释度的病毒液50μL按试剂盒的说明要求进行ELISA试验，每个稀释度作两孔重复，对试剂盒的敏感性进行检测。
实施例3、实施例1的成套试剂的敏感性
将实施例2得到的4种标准质粒的浓度，利用公式(6.02×1023拷贝数/摩尔)×(浓度μg/ml)/(MWg/mol)＝copies/μL分别计算出相应的拷贝数，再分别作10倍稀释，分别得到四种标准质粒的浓度分别为1010-100拷贝/μL的稀释液，每种标准质粒共有11种浓度的稀释液。
分别以各标准质粒的稀释液为模板，利用实施例1步骤七中优化后的反应体系和条件进行qPCR。
以
Figure BDA0002475463550000121
96Real-timePCR仪进行实时荧光定量PCR，采集荧光信号，经计算机软件
Figure BDA0002475463550000122
96SW 1.1生成以起始模板数对数为X轴，CT值为Y轴的标准曲线。
检测牛星状病毒的标准曲线如图19所示，线性关系良好，R2为0.99，扩增效率为103％，最低检测限为102拷贝/μL；检测牛病毒性腹泻病毒1型的标准曲线如图20所示，线性关系良好，R2为0.99，扩增效率为101％，最低检测限为102拷贝/μL；检测牛冠状病毒的标准曲线如图21所示，线性关系良好，R2为0.99，扩增效率为100％，最低检测限为102拷贝/μL；检测牛轮状病毒的标准曲线如图22所示，线性关系良好，R2为0.99，扩增效率为97％，最低检测限为101拷贝/μL。
实施例4、实施例1的成套试剂的特异性
待测样品为：牛传染性鼻气管炎病毒BK 1295株、牛腺病毒3型HLJ0955株、牛支原体PG45株、牛支原体NM2012株、肠道沙门氏菌CVCC3949株、多杀性巴氏杆菌CVCC391株、牛副流感病毒3型SD0835株、牛病毒型腹泻病毒2型HLJ-10株，牛星状病毒B76-2/HK株、牛病毒性腹泻病毒1型JL株(BVDV-JL)、牛冠状病毒Aks-01新疆南疆株(BCV-Aks-01)、牛轮状病毒NX23株。
其中，牛传染性鼻气管炎病毒BK 1295株、肠道沙门氏菌CVCC3949株、多杀性巴氏杆菌CVCC391株均为中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)产品，毒株号分别为CVCCAV252、CVCC3949、CVCC391；
牛支原体PG45株为美国模式菌种收集中心产品，ATCC 25523。
牛腺病毒3型HLJ0955株(史鸿飞，牛腺病毒3型和牛副流感病毒3型对实验动物致病性的研究，中国农业科学院学位论文，2014年5月)；
牛支原体NM2012株(高航飞等，牛支原体NM2012株致病性研究，畜牧鱼饲料科学，2016，37(4)：18-23)；
牛副流感病毒3型SD0835株(史鸿飞，牛腺病毒3型和牛副流感病毒3型对实验动物致病性的研究，中国农业科学院学位论文，2014年5月)；
牛病毒型腹泻病毒2型HLJ-10株(刘华等，牛病毒性腹泻病毒基因II型HLJ-10分离株全基因组克隆及其序列特征分析，中国预防兽医学报，2012年1月，第34卷第1期)。
提取牛传染性鼻气管炎病毒BK1295株、牛腺病毒3型HLJ0955株、牛支原体PG45株、牛支原体NM2012株、肠道沙门氏菌CVCC3949株、多杀性巴氏杆菌CVCC391株全基因组DNA；提取牛副流感病毒3型SD0835株、牛病毒型腹泻病毒2型HLJ-10株、牛星状病毒B76-2/HK株、牛病毒性腹泻病毒1型JL株(BVDV-JL)、牛冠状病毒Aks-01新疆南疆株(BCV-Aks-01)、牛轮状病毒NX23株的全基因组RNA。
分别以各病毒的全基因组DNA或RNA为模板，利用实施例1步骤七中优化后的反应体系和条件进行qPCR，并以无菌去离子水作为阴性对照。
以
Figure BDA0002475463550000132
96Real-timePCR仪进行实时荧光定量PCR，采集荧光信号。结果显示，牛星状病毒B76-2/HK株、牛病毒性腹泻病毒1型JL株(BVDV-JL)、牛冠状病毒Aks-01新疆南疆株(BCV-Aks-01)、牛轮状病毒NX23株的扩增体系中均有相应的特异性扩增曲线，产生Ct值，其余病毒的检测结果中均无特异曲线，特异性试验结果见图23，每种病毒三个复孔。结果表明实施例1的成套试剂特异性好。
具体的，判断待测样品中是否含有四种病毒的步骤如下：
以待测样品的基因组为模板，利用上述体系与条件进行实时荧光定量PCR，采集荧光信号，FAM通道对应的CT值平均值＜35且FAM通道有特异扩增曲线时，待测样品含有牛星状病毒；FAM通道对应的CT值平均值≥35和/或FAM通道无特异扩增曲线时，待测样品不含有牛星状病毒；
HEX通道对应的CT值平均值<35且HEX通道有特异扩增曲线时，待测样品含有牛病毒性腹泻病毒1型；HEX通道对应的CT值平均值≥35和/或HEX通道无特异扩增曲线时，待测样品不含有牛病毒性腹泻病毒1型；
Texas Red通道对应的CT值平均值<35且Texas Red通道有特异扩增曲线时，待测样品含有牛冠状病毒；Texas Red通道对应的CT值平均值≥35和/或Texas Red通道无特异扩增曲线时，待测样品不含有牛冠状病毒；
CY5通道对应的CT值平均值<35且CY5通道有特异扩增曲线时，待测样品含有牛轮状病毒；CY5通道对应的CT值平均值≥35和/或CY5通道无特异扩增曲线时，待测样品不含有牛轮状病毒。
实施例5、利用实施例1的成套试剂检测4种病毒重复性试验
分别以实施例2得到的四种标准质粒的稀释液为模板利用实施例1步骤七中优化后的反应体系和条件进行重复性试验，以加入无菌去离子水组为阴性对照，重复进行三次实验，各质粒稀释液中质粒的浓度均为107拷贝/μL。
以
Figure BDA0002475463550000133
96Real-timePCR仪进行实时荧光定量PCR，采集荧光信号，确定Ct值，如表13所示，四种病毒三次检测的变异系数均小于10％，重复性好。
表13、三次重复性检测数据
Figure BDA0002475463550000131
实施例6、利用实施例1的成套试剂检测临床样品试验
待检样品：北京市大兴区奶牛粪样88份，北京市昌平区奶牛粪样20份，天津市武清区牛粪样17份，牛抗凝血17份，牛胃内容物10份，牛肺研磨液10份，牛脾研磨液10份，牛口腔黏液7份。
提取各待检样品的全基因组RNA，并以其为模板，分别利用实施例1步骤七中优化后的反应体系和条件进行qPCR。
阳性检测结果如表14所示，北京和天津粪样牛星状病毒阳性率为3.20％(4/125)，粪样牛病毒性腹泻病毒1型阳性率为0.00％(0/125)，粪样牛冠状病毒阳性率为3.20％(4/125)，粪样牛轮状病毒阳性率为0.80％(1/125)，其他样品阳性率均为0.00％。
表14、临床样品检测结果
Figure BDA0002475463550000141
<110> 中国农业大学
<120> 检测引起牛腹泻的四种病毒的成套试剂与试剂盒
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
tagactgaca tcgtccccga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
cagtgaaccc gcagaaggaa 20
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
cgcgtggttg ccatg 15
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
cagggtagtc gtcagtggtt cg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
ggctgtattc gtagcggttg gt 22
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
ccacgtggac gaggg 15
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
accagtatgg caccgacatt ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
agcagacctt cctgagcctt ca 22
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
cccaagtagc gatgagg 17
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
gtgacatctg ttagacaaga atacg 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
atacacgctg caagttatcc tc 22
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
cgataccagt tggaccagt 19

Claims (8)

1.成套试剂，包括：名称为BAstV-A的检测牛星状病毒的引物对、名称为BVDV-A的检测牛病毒性腹泻病毒1型的引物对、名称为BCV-A的检测牛冠状病毒的引物对和/或名称为BRV-A检测牛轮状病毒的引物对；
所述BAstV-A由名称分别为BAstV-F和BAstV-R的单链DNA组成，所述BAstV-F和所述BAstV-R的序列分别为序列表中序列1和2；
所述BVDV-A由名称分别为BVDV-F和BVDV-R的单链DNA组成，所述BVDV-F和所述BVDV-R的序列分别为序列表中序列4和5；
所述BCV-A由名称分别为BCV-F和BCV-R的单链DNA组成，所述BCV-F和所述BCV-R的序列分别为序列表中序列7和8；
所述BRV-A由名称分别为BRV-F和BRV-R的单链DNA组成，所述BRV-F和所述BRV-R的序列分别为序列表中序列10和11。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还包括名称为BAstV-P的检测牛星状病毒的探针、名称为BVDV-P的检测牛病毒性腹泻病毒1型的探针、名称为BCV-P的检测牛冠状病毒的探针和/或名称为BRV-P的检测牛轮状病毒的探针；
所述BAstV-P为两端标有荧光物质的单链DNA，其序列为序列表中序列3；
所述BVDV-P为两端标有荧光物质的单链DNA，其序列为序列表中序列6；
所述BCV-P为两端标有荧光物质的单链DNA，其序列为序列表中序列9；
所述BRV-P为两端标有荧光物质的单链DNA，其序列为序列表中序列12。
3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂为具有如下任一用途的试剂：
X1、检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X2、制备检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒的产品；
X3、检测待测样品是否含有牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X4、检测待测样品是否为牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒。
4.一种试剂盒，包括权利要求1或2所述成套试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括进行PCR或RT-PCR所需的其他试剂。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为具有如下任一用途的试剂盒：
X1、检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X2、制备检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒的产品；
X3、检测待测样品是否含有牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X4、检测待测样品是否为牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒。
7.权利要求1-3中任一所述的成套试剂的下述任一应用：
X1、检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X2、制备检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒的产品；
X3、检测待测样品是否含有牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X4、检测待测样品是否为牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒。
8.权利要求4-6中任一所述的试剂盒的下述任一应用：
X1、检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X2、制备检测牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒的产品；
X3、检测待测样品是否含有牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒；
X4、检测待测样品是否为牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和/或牛轮状病毒。
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