CN117106985B - 一种bvdv快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学病原核酸快速检测技术领域。具体为一种BVDV快速检测试剂盒及其检测方法。该发明采用多重TaqMan荧光RT‑PCR技术，通过使用不同荧光染料标记BVDV‑1型、BVDV‑2型、BVDV‑3型特异性的探针基因序列，再经荧光PCR仪读取反应体系中荧光染料基团水解产生的荧光信号强度的变化，判定牛血清和组织样本中是否含有BVDV‑1型、BVDV‑2型、BVDV‑3型的病毒核酸。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学病原核酸快速检测技术领域，具体为一种BVDV快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovineviral diarrhea virus，BVDV）引起的一种以腹泻为临床特征的传染病，可导致怀孕母牛的流产、死胎、畸胎或新生犊牛的持续感染，它具有高度传染性，但症状和病变较轻，发病率高而死亡率低。除了牛之外，其它的偶蹄目动物，如绵羊、山羊、野生反刍动物和猪，都可被感染。除牛以外的反刍动物不会感染粘膜病，但是会引起它们的繁殖力下降。所有年龄的动物都易感染。本病潜伏期7天～14天。在临床上分为急性、慢性结果。急性病牛主要表现为突然发病，体温升高，重度腹泻，白细胞减少，大量流涎，口腔粘膜糜烂和溃疡，可在发病后几天死亡。病母牛所产的犊牛发生下痢，在口腔、皮肤、肺和脑有坏死灶，在体温升高的同时白细胞减少。慢性病例临床症状不明显或逐渐发病，生长发育受阻，消瘦，体重逐渐下降。比较特殊的症状是鼻镜上的糜烂，糜烂可在鼻镜上连成一片，表现为间歇性腹泻、跛行，病程较长，可在发病几周或数月死亡。
直接或间接接触均可传播本病。主要由于摄食被病毒污染的饲料、饮水而感染，也可由于病畜咳嗽、剧烈呼吸喷出的传染性飞沫而使易感动物感染。另外通过运输工具，饲养用具或者通过自然界的某些宿生如鹿、羊、猪也可以传播本病。应用被病毒污染的其他疫苗或未经消毒的注射器，也可引起本病，带毒公牛能长期从精液中排出病毒，通过配种可传染给母牛。持续性感染的母牛可以通过胎盘传染给胎儿，可引起流产及犊牛的先天损失，也可能产下貌似正常的持续性感染的犊牛，持续性感染母牛其后裔也常是持续感染牛，形成母系持续感染家族。
BVDV属于黄病毒科瘟病毒属，与古典猪瘟病毒和绵羊边界病病毒关系密切，其有三种不同的基因型BVDV-1型、BVDV-2型、BVDV-3型。BVDV的三种基因型都可以引起致细胞病变和非致细胞病变（生物型）感染。通常，在牛群中传播的是非致细胞病变的生物型。BVDV-2型和BVDV-3型病毒通常是非致细胞病变病毒，引起过严重的急性感染的爆发和出血型综合症。三种基因型都可以引起常见的温和的和不明显的感染。目前，行业中急需一种在同一检测体系中实现对不同亚型BVDV核酸的快速检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种BVDV快速检测试剂盒及其检测方法，能够快速检测BVDV-1型、BVDV-2型、BVDV-3型并进行定性。以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种用于BVDV检测的引物和Taqman探针，由正向引物1、反向引物1、Taqman探针1、正向引物2、反向引物2、Taqman探针2、正向引物3、反向引物3和Taqman探针3组成；
所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述Taqman探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述反向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述Taqman探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述正向引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述反向引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述Taqman探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述Taqman探针1、Taqman探针2和Taqman探针3的荧光基团各不相同。
优选的，所述Taqman探针的荧光基团选自FAM、HEX、ROX、VIC或Cy5中的任意一种，所述Taqman探针的猝灭基团选自MGB、BHQ1、BHQ2或TMARA中的任意一种。
优选的，所述Taqman探针1的荧光基团为VIC、猝灭基团为BHQ1，所述Taqman探针2的荧光基团为FAM、猝灭基团为BHQ1，所述Taqman探针3的荧光基团为Cy5、猝灭基团为BHQ2。
一种BVDV快速检测试剂盒，包括如前述任一的用于BVDV检测的引物和Taqman探针。
一种BVDV快速检测方法，其为利用前述任一项的用于BVDV检测的引物和Taqman探针对待测样本进行BVDV检测。
优选的，具体步骤为：
S1、提取待检测样本的RNA；
S2、对步骤S1中提取的RNA进行逆转录扩增反应，得到cDNA模板；
S3、以步骤S2中得到的cDNA模板、利用权利要求1～3任一项所述的用于BVDV检测的引物和Taqman探针进行荧光PCR反应，反应条件为：95℃ 3分钟，然后95℃ 10秒，60℃ 30秒，40个循环，每个循环第二步收集荧光信号；
S4、通过荧光检测确定检测结果。
如前述的一种BVDV快速检测试剂盒在BVDV非诊断目的核酸快速检测中的应用。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
本专利依靠多重荧光RT-PCR技术，通过使用不同荧光染料标记BVDV-1型、BVDV-2型、BVDV-3型特异性的探针基因序列，在同一检测体系中实现对不同亚型BVDV核酸的快速检测。
通过对三重荧光RT-PCR检测不同亚型BVDV病毒的特异性测试，证实本专利的方法仅能高效检出BVDV-1型、BVDV-2型、BVDV-3型病毒核酸，而包括BTV、LSDV、AKV、PPRV、FMDV、BLV、IBRV、BRSV、BPIV-3、BAV-3在内的十种常见牛病毒均不能检出。通过对三重荧光RT-PCR检测不同亚型BVDV病毒的敏感性测试，证实该方法的检测下限为10拷贝数/μL左右，与常规的RT-PCR技术相比，其敏感性提高了2~3个数量级。通过对三重荧光RT-PCR检测不同亚型BVDV病毒的稳定性测试，证明该方法具有良好的重复性和稳定性，未见阴性样品的非特异性扩增，方法的稳定性有助于减少大量临床疑似样本重复检测的时间，极大地提高工作效率。
BVDV是一种感染普遍的常见牛病毒病，其体外培养，易引起细胞病变，从而极大的影响牛血清制品产业的发展。随着生物药业产业的发展，各大生产企业、科研单位和高校对胎牛血清、新生牛血清的需求旺盛，这促使BVDV阴性血清更易获得用户的认可。牛养殖企业从种群净化入手，做好BVDV的清查；牛血清生产企业从生产环节入手，做好病毒的消杀，是控制BVDV感染，提高牛血清质量的必要手段。这其中，都离不开高效的开展BVDV的病原检测。
由于BVDV变异性强，BVDV-1型、BVDV-2型、BVDV-3型基因序列之间存在显著性差异。为了满足快速检测的需要，本专利使用多重荧光RT-PCR技术，建立了BVDV-1型、BVDV-2型和BVDV-3型同时检测的方法。由于BVDV病毒基因存在高度变异，仅利用一组引物和探针，无法完成这三种不同亚型BVDV的检测，本专利方法有助于全面的监测BVDV的感染情况，避免易忽视的BVDV稀有亚型对牛血清造成的污染。同时，该检测方法还能对BVDV的亚型进行判别。该特点是本专利有别于其他类似专利方法的独特之处。
总之，与病原分离、血清ELISA和普通RT-PCR等传统检测方法相比，本专利建立的三重荧光RT-PCR检测不同亚型BVDV病毒的方法，具有特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好的特点，同时其操作简便，检测周期仅需2个小时，这可大幅度提升养殖企业和牛血清生产企业筛查BVDV工作的效率，对控制BVDV的传播，提高牛血清质量具有重要意义。该专利技术的推广应用可产生良好的经济效益和社会效益。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1 三重荧光RT-PCR检测BVDV-1型的特异性试验；
图2 三重荧光RT-PCR检测BVDV-2型的特异性试验；
图3 三重荧光RT-PCR检测BVDV-3型的特异性试验；
图4 三重荧光RT-PCR检测BVDV-1型病毒的敏感性试验（FAM通道）；
图5 三重荧光RT-PCR检测BVDV-2型病毒的敏感性试验（VIC通道）；
图6 三重荧光RT-PCR检测BVDV-3型病毒的敏感性试验（Cy5通道）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明首先通过大量的基因序列比对和试验验证，开发了用于同时检测BVDV-1型、BVDV-2型、BVDV-3型核酸的分型的三重荧光RT-PCR检测引物组，包括如下引物对和探针序列：
按下表1的序列分别合成BVDV-1型、BVDV-2型、BVDV-3型的引物和探针，其中BVDV-1型探针5’端标记FAM荧光、3’端标记BHQ1淬灭基团，BVDV-2型探针5’端标记VIC荧光、3’端标记BHQ1淬灭基团，BVDV-3型探针5’端标记Cy5荧光、3’端标记BHQ2淬灭基团。
表1 BVDV分型检测荧光RT-PCR的引物和探针序列
引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物和探针的工作浓度均为20μM。
主要试剂
TRIzol试剂购自赛默飞Invitrogen（英杰）（货号：15596-018），Taq酶（货号：RR390A）、AMV逆转录酶（货号：6210A）、RNA酶抑制剂（货号：6210A）、dNTP、随机引物（货号：6210A）购自宝生物工程（大连）有限公司；其它试剂购自国药集团上海化学试剂有限公司。
实施例2的BVDV-1型病毒质粒、BVDV-2型病毒质粒、BVDV-3型病毒质粒（质粒均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，所用载体质粒为PUC57）
BVDV-1型病毒插入质粒的序列如SEQ ID NO：10所示：具体为
5’-CATGCCCAAAGCACATCTTAACCTGAGCGGGGGTCGCCCAGGTGAAAACAGTTTAACTAACTGTTACGAATACAGCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTGATTTGCTACTAAAAATCTCTGCTGTACATGGCACATGG-3’
BVDV-2型病毒插入质粒的序列如SEQ ID NO：11所示：具体为
5’-CAAACCATCCTTCCCTGGAGATACAGAGACCCAACAAGAGGGGAGGAGGTTTGTAGCTAGTCTTTTTATATCTGCACTAGCGACATACACATACAAAACCTG-3’
BVDV-3型病毒插入质粒的序列如SEQ ID NO：12所示：具体为
5’-GGTCTACATAAGAAAGGGGCAGAGAGGCAGTGGCCAACCAGATACAAGCGCAGGGAACAGCATGCTAAATGTGCTAACCATGGT-3’
1、样品前处理
组织样本、粪便样本加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心10分钟，收集上清液待检；粪便样本加等体积生理盐水混匀，再3000g离心10分钟，收集上清液待检；血液样本直接1000 g离心5分钟，收集血清待检。
2、RNA提取及cDNA模板制备
取200μL待检上清液或血清，加1mL TRIzol试剂，用枪头吹打20~30次；加入200μL氯仿，涡旋震荡30秒混匀；12000转/分钟离心15分钟；取上层水相，加500μL异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20分钟；12000转/分钟离心10分钟；弃上清，沉淀用1mL DEPC水配制的75%乙醇清洗；7500转/分钟离心10分钟；弃上清，沉淀室温干燥10分钟；加30μL DEPC水溶解RNA沉淀。
RNA提取也可采用全自动核酸提取仪进行操作。取11μL RNA溶液，加5倍逆转录酶浓缩缓冲液4μL、dNTP 1μL、随机引物1μL、RNA酶抑制剂1μL、AMV逆转录酶2μL，置PCR仪上42℃反应30分钟，即得cDNA模板。
3、荧光PCR检测
采用ABI公司ViiA7荧光PCR仪。反应体系为：10倍Taq酶浓缩缓冲液2μL、dNTP 0.5μL、Taq酶0.2μL、cDNA模板3μL、正反向引物和探针各0.2μL、加水补足总体积至20μL。反应条件为：首先95℃ 3分钟；然后95℃ 10秒，60℃ 30秒，40个循环，每个循环第二步收集荧光信号，样品同时做两个重复。
针对BVDV-1型、BVDV-2型、BVDV-3型的特异性基因序列，分别设计合成FAM、VIC和Cy5不同荧光染料标记的探针，建立同时检测这3种不同亚型BVDV的三重荧光RT-PCR方法，并将其应用于不同亚型BVDV病毒和其它10种常见牛病毒的检测，其中包括：牛蓝舌病病毒（Blue-tongue virus，BTV）、牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）、赤羽病病毒（Akabane virus，AKV）、小反刍兽疫病毒（Peste-des-petits-ruminants virus，PPRV）、口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）、牛白血病病毒（Bovineleukemia virus，BLV）、牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitisvirus，IBRV）、牛呼吸道合胞病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3）、牛腺病毒3型（Bovineadenovirus type 3，BAV-3）。结果显示，针对上述不同阳性病原培养物的检测，BVDV的三重荧光RT-PCR的 FAM通道仅BVDV-1型病毒样本出现阳性扩增曲线、VIC通道仅BVDV-2型病毒样本出现阳性扩增曲线、Cy5通道仅BVDV-3型病毒样本出现阳性扩增曲线，其他对照牛病毒阳性样本均未出现BVDV的非特异性扩增（图1~图3）。
样品前处理、RNA提取及cDNA模板制备和荧光PCR检测条件和过程参照实施例1。
将浓度为1×105拷贝数/μL BVDV-1型病毒质粒、BVDV-2型病毒质粒、BVDV-3型病毒质粒分别进行10倍比稀释，然后用建立的三重荧光RT-PCR分别进行检测，每个样品做两个重复。结果显示，三重荧光RT-PCR检测体系的FAM通道、VIC通道和Cy5通道，其检测下限均为1×101拷贝数/μL（图4~图6）。
由于敏感性实验涉及检测限的计算，因此采用质粒作为模版。实际生物样本的检测，才需要RNA提取和cDNA模版制备。
图4从左到右阳性曲线分别为BVDV-1型质粒浓度1×105拷贝数/μL、1×104拷贝数/μL、1×103拷贝数/μL、1×102拷贝数/μL、1×101拷贝数/μL、1拷贝数/μL、阴性对照。
图5从左到右阳性曲线分别为BVDV-2型质粒浓度1×105拷贝数/μL、1×104拷贝数/μL、1×103拷贝数/μL、1×102拷贝数/μL、1×101拷贝数/μL、1拷贝数/μL、阴性对照。
图6从左到右阳性曲线分别为BVDV-3型质粒浓度1×105拷贝数/μL、1×104拷贝数/μL、1×103拷贝数/μL、1×102拷贝数/μL、1×101拷贝数/μL、1拷贝数/μL、阴性对照。
图4~图6中的1拷贝数/μL和对照阴性曲线平直，基本与△Rn=0横线重合。
样品前处理、RNA提取及cDNA模板制备和荧光PCR检测条件和过程参照实施例1。
为了验证建立的三重荧光RT-PCR检测三种不同亚型BVDV的稳定性，使用100份牛血清样本和100份猪血清样本分别测试该检测方法。结果证实，85.6%的牛血清样本呈BVDV-1型病毒核酸阳性，而BVDV-2型和BVDV-3型病毒在这100份牛血清未有检出；经检测，所有猪血清均呈BVDV-1型、BVDV-2型和BVDV-3型阴性，阴性曲线平直，未发现非特异性扩增曲线或翘尾。
此外，将配制的三重荧光RT-PCR检测溶液进行4等份，分装后冻存，每间隔2个月取出其中1份，测试相同浓度的BVDV-1型、BVDV-2型和BVDV-3型阳性核酸各1份，以及15份牛血清提取的BVDV阴性核酸样本，以测试建立的三重荧光RT-PCR方法的稳定性。结果证实，4次独立反应的阳性样品扩增曲线的CT值几乎一致，而所有阴性样品曲线平直，均未发现非特异性扩增曲线或翘尾。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用于BVDV检测的引物和Taqman探针，其特征在于，由正向引物1、反向引物1、Taqman探针1、正向引物2、反向引物2、Taqman探针2、正向引物3、反向引物3和Taqman探针3组成；
所述正向引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物1的核苷酸序列如SEQID NO：2所示，所述Taqman探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述正向引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述反向引物2的核苷酸序列如SEQID NO：5所示，所述Taqman探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述正向引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述反向引物3的核苷酸序列如SEQID NO：8所示，所述Taqman探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述Taqman探针1、Taqman探针2和Taqman探针3的荧光基团各不相同。
2.根据权利要求1所述的一种用于BVDV检测的引物和Taqman探针，其特征在于，所述Taqman探针的荧光基团选自FAM、HEX、ROX、VIC或Cy5中的任意一种，所述Taqman探针的猝灭基团选自MGB、BHQ1、BHQ2或TMARA中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的一种用于BVDV检测的引物和Taqman探针，其特征在于，所述Taqman探针1的荧光基团为VIC、猝灭基团为BHQ1，所述Taqman探针2的荧光基团为FAM、猝灭基团为BHQ1，所述Taqman探针3的荧光基团为Cy5、猝灭基团为BHQ2。
4.一种BVDV快速检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1~3任一所述的用于BVDV检测的引物和Taqman探针。
5.一种非诊断目的的BVDV快速检测方法，其特征在于，其为利用权利要求1～3任一项所述的用于BVDV检测的引物和Taqman探针对待测样本进行BVDV检测。
6.根据权利要求5所述的一种非诊断目的的BVDV快速检测方法，其特征在于，具体步骤为：
S1、提取待检测样本的RNA；
S2、对步骤S1中提取的RNA进行逆转录扩增反应，得到cDNA模板；
S3、以步骤S2中得到的cDNA模板、利用权利要求1～3任一项所述的用于BVDV检测的引物和Taqman探针进行荧光PCR反应，反应条件为：95℃ 3分钟，然后95℃ 10秒，60℃ 30秒，40个循环，每个循环第二步收集荧光信号；
S4、通过荧光检测确定检测结果。
7.如权利要求4所述的一种BVDV快速检测试剂盒在BVDV非诊断目的核酸快速检测中的应用。
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