CN115232888A - 快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物、试剂盒及方法。属于分子生物学检测技术等技术领域，本发明所述的检测试剂盒由病毒核酸快速扩增试剂组成。病毒核酸快速扩增试剂包括反应缓冲液、猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因快速扩增引物和质控品。利用荧光定量PCR仪，本方法可在35分钟内一步法完成猪繁殖与呼吸综合征病毒快速荧光检测。本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法操作简单、安全，无需单独的反转录步骤，灵敏度高、特异性强、重复性好，有利于实际应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术等技术领域，涉及了一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物、试剂盒及方法；具体的是，涉及了一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的扩增引物、其检测试剂盒及方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的猪的生殖和呼吸系统综合征。该病以母猪发热、厌食、流产、死产、产木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。PRRSV呈世界性传播，已成为危害全球养猪业的主要疫病之一。PRRSV属于动脉炎病毒属，其基因组全长约15kb，为单股正链、不分节段的RNA。不同地域的分离毒株的序列分析表明，PRRSV有2种基因型，即以VR2332毒株为代表的美洲型和以Lelystad virus(LV)为代表的欧洲型。2006年开始流行高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，其特征是病毒Nsp2蛋白上出现30个氨基酸不连续缺失。我国主要流行美洲型毒株，但近几年欧洲型毒株也陆续在我国多个省份被检出。PRRSV具有超强的变异能力，形成了多种变异毒株循环流行的复杂局面。同时，我国主要使用高致病性毒株的弱毒疫苗来防控猪繁殖与呼吸综合征病毒感染，但该疫苗对当前主要流行毒株的保护力有限，导致疫苗毒株与流行毒株以及流行毒株之间常发生重组事件，致使田间毒株复杂多变，混合感染严重，对PRRSV的鉴定和防控带来了极大挑战。此外，近年来，猪蓝耳病疫情愈演愈烈，并有变异株毒力增强的趋势。因此，临床上迫切需要提高实验室诊断PRRSV的能力。
目前，国内外检测猪繁殖与呼吸综合征病毒方法主要有以下几种：(1)病毒分离鉴定结合红细胞吸附试验。该方法结果准确，但操作烦琐、耗费时间长，且只能检测样本中具有感染能力的病毒颗粒，因此灵敏度不足，不利于感染的早期诊断。(2)免疫学检测方法。以免疫层析试纸条法和酶联免疫吸附试验为代表的免疫学检测方法也是目前实验室检测常用的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法，但该方法具有滞后性，灵敏度和特异性也有待提高。(3)病毒核酸检测。应用最为广泛的是聚合酶链式反应(PCR)技术。常规PCR检测结果的判断主要依赖于琼脂糖凝胶电泳，耗时较长，且需使用含有一定毒性的核酸染料等试剂，操作安全性有待提高。实时荧光定量PCR可以对靶标进行快速定量检测且无需电泳，但由于仪器和试剂成本较高而未能在基层医疗单位和现场检测中广泛使用。
根据目前已公开的文献或专利中基于核酸扩增的检测技术包括常规PCR、多重PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增及其衍生技术。这些方法要么检测所需时间较长或单反应成本较高，要么对靶序列及长度有一定的要求，且引物设计有一定限制。
因此，本领域亟需开发一种能够精准检测PRRSV，且检测时间短、操作便捷、灵敏度高、特异性强、准确性好、成本可控且适于即时检测的病毒核酸检测方法。这对于有效防控PRRSV具有极其重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是针对现有技术在快速检测PRRSV应用中存在的时间长、需反转录步骤、对靶序列有限制等问题，提供了一种熔解曲线分析辅助的病毒核酸快速检测方法，且本发明的引物和扩增方法相较现有技术具有适于短序列扩增、无需单独的反转录步骤、适用范围广、灵敏度高、检测快速等显著优势。而且本发明方法可扩增大于等于30个核苷酸的靶序列，且对目前已知的PRRSV美洲经典株、欧洲株以及高致病株均可有效检测，未来可根据PRRSV的变异情况灵活调整引物设计，方便快捷、适用性强，具有环介导等温扩增技术等不具备的技术优势。
本发明还要解决的技术问题是提供了扩增引物组在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂盒中的应用。
本发明最后所要解决的技术问题是针对现有技术在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)应用中存在的问题，提供一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光定量试剂盒及检测方法，灵敏度优于荧光定量PCR方法，且可在35分钟内完成核酸检测。本发明具有操作便捷、一步法检测、简单快速、灵敏高、特异强等优势，有利于实际应用。
技术方案：本发明所述的快速扩增引物，所述快速扩增引物基于猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因特异性保守区域设计，由正向引物(F)和反向引物(R)组成；
所述正向引物M-F序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物M-R序列如SEQ ID NO：2。
进一步的，所述正向引物F、反向引物R的浓度为0.1～50μM，所述正向引物F、反向引物R的摩尔比范围为1：1～1：2。
进一步的，本发明还包括所述的快速扩增引物在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法及试剂盒中的应用。
进一步的，本发明还包括一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述快速的扩增引物。
进一步的，所述试剂盒的结果判断方式为荧光检测，一种方式为反应液中加入核酸荧光染料，包括但不限于SYBR Green I、Eva Green、SYTO 9。
进一步的，所述试剂盒还包括含有石墨烯的快速扩增缓冲液、石墨烯、BstDNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、无酶水、阳性对照和阴性对照。
进一步的，所述石墨烯，包括但不限于氧化石墨烯、还原石墨烯、石墨烯纳米片、石墨烯量子点、磁性石墨烯以及官能团修饰石墨烯。
其中，所述阳性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸质控品；阴性对照：灭菌生理盐水。
进一步的，所述快速扩增引物的反应温度为两步温度快速循环，所述第一步温度为辅助变性温度，范围为70～74℃，第二步温度为扩增反应温度，范围为58～64℃，每步温度反应时间为1～10秒；所述引物优选反应温度为第一步温度73～74℃，第二步温度60～61℃,每步温度反应时间为1～3秒，循环数为30～50。
进一步的，本发明还包括一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其反应程序为：70～74℃1～10秒，59～64℃1～10秒，共30～50个循环。当反应结束(约35分钟)后，荧光曲线起峰(即荧光值(终点荧光值减去起点荧光值)大于0.0001)，且熔解温度范围为72～76℃时出现熔解曲线峰(导数值大于30)，判定为阳性；荧光曲线未起峰(即荧光值(终点荧光值减去起点荧光值)小于等于0.0001)，且熔解温度范围为72～76℃时未出现熔解曲线峰(导数值小于30)，判定为阴性。
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明的特点是：1、RNA病毒一步法检测：针对RNA病毒，无需额外的反转录步骤，可实现病毒核酸一步法、一管式扩增及检测。2、检测用时短：病毒核酸扩增过程只需约35分钟，即可直接判定结果；3、熔解曲线验证：结合熔解曲线分析，可辅助验证荧光扩增曲线，防止假阳性结果；4、特异性强：本发明引物扩增高效特异，可特异性检出目前已知的三种流行性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株，与猪瘟等7种临床症状相似的其他猪源致病性病毒无交叉反应性；5、灵敏度高：本发明的试剂盒最低检测极限可达到0.6拷贝/μL，优于荧光定量PCR方法；6、广泛的适用性：核酸快速扩增方法及其检测试剂盒具有广泛的适用性，对靶序列无特殊要求，常规引物即可扩增，成本可控，应用前景广阔；7、适于基因组高突变率的靶标的检测：本发明方法对短序列具有良好的扩增效率，适于基因组高突变率的病原微生物的检测；8、适于即时检测：本发明可使用便携式荧光定量设备完成检测，结果判读简单快捷，适于基层检验检疫机构及养殖场现场检测。综上，本发明的荧光定量试剂盒及其检测方法具有用时短、高特异性、高灵敏度、通用性强、适于即时检测等优点，为基层机构、出入境检验检疫等单位筛查和检测猪繁殖与呼吸综合征病毒提供了新的有力技术支持。
附图说明
图1是本发明中基于猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因设计特异性扩增引物试验结果图；
图2是本发明中猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光快速检测方法扩增反应温度优化试验结果图；
图3是本发明中猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光快速检测方法预反应时间优化试验结果图；
图4是本发明中猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒荧光快速检测方法扩增阳性对照和阴性对照的结果图；
图5是本发明中猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒荧光快速检测方法扩增阳性对照和阴性对照的熔解曲线结果图；
图6是本发明中猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光快速检测方法重复性试验结果图；
图7是本发明中猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光快速检测方法敏感性试验结果图；
图8是本发明中猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR方法敏感性试验结果图；
图9是本发明中猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光快速检测方法特异性试验结果图；
图10是本发明中猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光快速检测方法特异性试验熔解曲线图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。
如图所示，猪繁殖和呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)(美洲经典株、欧洲株、高致病株)、非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)、猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)核酸质控品购自普道(北京)标准技术有限公司。
10×扩增缓冲液为200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Tween-20，pH 8.0～8.8。
实施例中所述产物的荧光值计算方式为扩增产物终点荧光值减去起点荧光值。
实施例1：基于猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的快速扩增引物的设计
根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组序列和其他临床症状相似猪病毒全基因组序列(MW788405_PRRSV，AF176348_PRRSV，MK906026_HP-PRRSV，KT119352_CSFV，M34651_PRV，NC001718_PPV，AY181948_PCV2，NC003436_PEDV，MN198861_SIV)，使用BLASTn、MAFFT、DNASTAR等分子生物学工具进行全基因组多序列比对分析，获得猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因特异性的保守区域；根据保守靶基因序列，利用Primer Premier 5.0和在线工具NUPACK(http://www.nupack.org/)进行快速扩增引物的设计；所设计引物进一步通过BLASTn和Primer-BLAST检索验证，结果显示所设计的备选引物仅与GenBank数据库中已公开的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组完全匹配；引物信息如下：
表1 基于猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的备选快速扩增引物
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品(原始浓度为6×103拷贝/μL)为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(1～10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(1～10ng/μL)、1μL Eva Green(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照；其中，引物分别使用上述表格中的引物进行同步实验；将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中。反应程序为：60～61℃反应10分钟，然后73～74℃1秒，60～61℃1秒，共40个循环。
如图1所示，当使用第二对引物(M2)和第三对引物(M3)扩增阳性对照和阴性对照时，二者均无荧光信号产生；使用第一对引物(M1)可对阳性对照进行高效扩增，且阴性对照产物无非特异性荧光信号；因此，优选M1引物对作为后续实验的扩增引物。
实施例2：猪繁殖与呼吸综合征病毒快速荧光检测方法的建立
使用实施例1中设计的猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因特异性扩增引物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品(6×103拷贝/μL)和阴性对照(灭菌生理盐水)进行扩增方法测试，以获得最佳反应温度及反应体系；
1、扩增反应温度的优化
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品(原始浓度为6×103拷贝/μL)为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(1～10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(1～10ng/μL)、1μL Eva Green(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水；将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌生理盐水)；将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中；反应程序为：73～74℃1秒，59℃～63℃1秒，共40个循环；其中，扩增反应温度具体设置为：59℃、60℃、61℃、62℃、63℃；
如图2所示，当反应温度为59℃时，阳性对照(猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品)的扩增产物荧光信号值接近1700，同时阴性对照(灭菌生理盐水)的扩增产物荧光信号值接近100；此后，随着反应温度的升高，阳性对照扩增产物的荧光信号值均呈现不同程度的降低，且阴性对照的扩增产物荧光曲线均接近x轴(0.0001)；因此，扩增反应温度优选为60℃；
2、预反应时间的优化
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品(原始浓度为6×103拷贝/μL)为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(1～10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(1～10ng/μL)、1μL Eva Green(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照；将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中；反应程序为：60～61℃反应0～10分钟，然后73～74℃1秒，60～61℃1秒，共40个循环。其中，预扩增反应时间具体设置为：0分钟、2分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟；
如图3所示，当预扩增反应时间为0分钟时，阳性对照(猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品)的扩增产物荧光信号值接近1000，同时阴性对照(灭菌生理盐水)的扩增产物也出现一定的荧光信号值(100～200)；随着预扩增反应时间的增加，阳性对照扩增产物的荧光信号值均呈现不同程度的升高，且阴性对照的扩增产物荧光曲线均接近x轴(0.0001)。因此，从缩短检测时间更有利于即时检测的角度考虑，预扩增反应时间优选为2分钟；
3、猪繁殖与呼吸综合征病毒快速荧光检测方法的建立
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品(原始浓度为6×103拷贝/μL)为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(1～10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(1～10ng/μL)、1μLEva Green(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照；将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中；反应程序为：60～61℃反应2分钟，然后73～74℃1秒，60～61℃1秒，共40个循环；
如图4所示，基于上述优化的反应条件，阳性对照(猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品)的扩增产物荧光信号值接近1300，同时阴性对照(灭菌生理盐水)的扩增产物荧光曲线均接近x轴(0.0001)；同时，根据熔解曲线分析结果，在溶解温度为74～76℃区间时，仅阳性对照出现明显的熔解曲线峰(导数值约为300)，阴性对照无熔解曲线峰(导数值小于30)(图5)。
实施例3：猪繁殖与呼吸综合征病毒快速荧光检测方法的重复性测试
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品(原始浓度为6×103拷贝/μL)为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(1～10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(1～10ng/μL)、1μLEva Green(20×)、5μL模板和1.2μL无酶水；将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照；将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中；反应程序为：60～61℃反应2分钟，然后73～74℃1秒，60～61℃1秒，共40个循环。
结果如图6和表2所示，通过对猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品进行10次扩增测试，荧光信号增加值相对稳定(变异系数约为0.17)，阴性对照(灭菌生理盐水)的10次扩增产物荧光曲线均接近x轴(荧光信号增加值为0.0001)，有利于实际应用。
表2猪繁殖与呼吸综合征快速检测方法检测阳性对照和阴性对照结果对比
注：CV表示变异系数。
实施例4：猪繁殖与呼吸综合征病毒快速荧光检测试剂盒的敏感性测试
本实施例测试本发明快速荧光检测试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的灵敏度，并将本发明灵敏度与荧光定量PCR方法(Real-time quantitative PCR，qPCR)(世界动物卫生组织OIE推荐方法)进行比较；将猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲经典株)核酸质控品从6×103拷贝/μL进行10倍梯度稀释至6×10-2拷贝/μL；反应体系和程序如下所示：
20μL扩增反应体系包括：2μL的10×扩增缓冲液、2μL dNTPs(1～10mM)、1μL液态聚乙二醇、1μL甜菜碱(1～10mM)、引物F和R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯分散液(1～10ng/μL)、1μL EvaGreen(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照；将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于荧光定量PCR仪中；反应程序为：60～61℃反应2分钟，然后73～74℃1秒，60～61℃1秒，共40个循环；
检测结果如图7所示，图中：荧光扩增曲线对应的核酸质控品模板浓度分别为6×103拷贝/μL、6×102拷贝/μL、6×101拷贝/μL、6×100拷贝/μL、6×10-1拷贝/μL，而6×10-2拷贝/μL和阴性对照则看不到明显的曲线；判定本试剂盒的检测灵敏度为6×10-1拷贝/μL(等于1.8拷贝/反应)，具有较高的灵敏度和应用价值。
荧光定量PCR方法的测试结果如图8所示，图中：荧光扩增曲线对应的核酸质控品模板浓度分别为6×103拷贝/μL、6×102拷贝/μL、6×101拷贝/μL、6×100拷贝/μL，而6×10-1拷贝/μL、6×10-2拷贝/μL和阴性对照则看不到明显的曲线；
图9为本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒快速荧光检测方法Ct值与荧光定量PCR方法Ct值所建立的线性关系；
结果表明，本试剂盒的荧光定量检测方法最低检出限为6×10-1拷贝/μL，灵敏度优于荧光定量PCR方法；结果表明，本发明试剂盒具有较高的灵敏度和检测价值，有利于临床诊断应用。
实施例5：猪繁殖与呼吸综合征病毒快速荧光检测试剂盒的特异性测试
用实施例2确定的优化反应体系及反应条件进行核酸扩增及荧光定量检测。取猪繁殖和呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)(高致病株、美洲经典株、欧洲株)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus type 2，PCV2)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)，并设置阴性对照；按照实施例2确定的优化反应体系和反应条件进行扩增；反应程序为：60～61℃反应2分钟，然后73～74℃1秒，60～61℃1秒，共40个循环；
结果如图9和图10所示，仅猪繁殖与呼吸综合征病毒(高致病株、美洲经典株、欧洲株)核酸质控品显示出较高的荧光信号值并出现明显的熔解曲线峰，而其他7种病毒和阴性对照均无荧光信号及熔解曲线峰；
结果表明，本发明快速荧光检测方法具有良好的特异性，适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性检测，具有较高的诊断应用价值；
表3 快速荧光检测方法特异性评价试验测试结果
实施例6：临床样本验证测试
为了验证本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒快速荧光检测方法的临床适用性，以5份灭活PRRSV阳性样品和15份经荧光定量PCR方法检测为阴性的样品(包括血液、鼻拭子和病变组织)为检测对象，按照实施例2确定的优化反应体系和反应条件进行扩增；样品处理及检测程序严格参照《猪繁殖与呼吸综合征诊断方法(GB/T 18090-2008)》标准进行；结果如表4所示。
表4 临床样本验证测试结果
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的扩增引物，其特征在于，
所述快速的扩增引物是基于猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因特异性保守区域设计的；
包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F为M-F序列，如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物R为M-R序列，如SEQ ID NO：2。
2.根据权利要求1所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的扩增引物，其特征在于，
所述正向引物F、反向引物R的浓度为0.1-50μM；
所述正向引物F、反向引物R的摩尔比为1：1-1：2。
3.快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒包括权利要求1-2任一项所述的扩增引物。
4.根据权利要求3所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒还包括含有石墨烯的扩增缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、无酶水、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于，
所述石墨烯包括但不限于氧化石墨烯、还原石墨烯、石墨烯纳米片、石墨烯量子点、磁性石墨烯以及官能团修饰石墨烯。
6.快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法，其特征在于，
所述检测方法是利用权利要求1-2任一项所述的扩增引物或权利要求3-5任一项所述的试剂盒，采用荧光检测方法结合溶解曲线分析进行检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。
7.根据权利要求6所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光检测方法是：将反应液中加入核酸荧光染料，其包括但不限于SYBR Green I、EvaGreen、SYTO 9。
8.根据权利要求6所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法，其特征在于，
其检测步骤具体如下所述：在待测液中加入权利要求1-2任一项所述的扩增引物或权利要求3-5任一项所述的试剂盒及核酸荧光染料，采用荧光定量PCR仪进行扩增分析，当反应结束后荧光曲线起峰，即荧光值＞0.0001时，且熔解温度范围为72～76℃时出现熔解曲线峰，即导数值＞30时，判定为阳性；当反应结束后荧光曲线未起峰，即荧光值≤0.0001时，且熔解温度范围为72～76℃时未出现熔解曲线峰，即导数值＜30时，判定为阴性；
其中，所述的荧光值是终点荧光值减去起点荧光值。
9.根据权利要求3-8任一项所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及其检测方法，其特征在于，
所述快速的扩增引物的反应温度为两步温度快速循环，其第一步温度为辅助变性温度，范围在73～75℃之间，第二步温度为扩增反应温度，范围在58～64℃之间，且每步温度反应时间为1～10秒；
所述引物的反应温度为第一步温度74～75℃，第二步温度60～61℃,每步温度反应时间为1～3秒，循环总数30～50。
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|---|---|---|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN117844988A (zh) * | 2024-03-06 | 2024-04-09 | 赛锐思生物技术(吉林)有限公司 | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-qPCR检测引物、试剂盒及其应用 |
| CN117844988B (zh) * | 2024-03-06 | 2024-05-14 | 赛锐思生物技术(吉林)有限公司 | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-qPCR检测引物、试剂盒及其应用 |
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