CN110551853B - 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒 - Google Patents

一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110551853B
CN110551853B CN201910888108.1A CN201910888108A CN110551853B CN 110551853 B CN110551853 B CN 110551853B CN 201910888108 A CN201910888108 A CN 201910888108A CN 110551853 B CN110551853 B CN 110551853B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
asfv
cd2v
swine fever
african swine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910888108.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110551853A (zh
Inventor
沈永义
陈瑞爱
张旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
South China Agricultural University
Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University, Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN201910888108.1A priority Critical patent/CN110551853B/zh
Publication of CN110551853A publication Critical patent/CN110551853A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110551853B publication Critical patent/CN110551853B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360‑505R基因缺失株的三重PCR检测引物组，三对检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示。本发明利用三对引物一次性扩增非洲猪瘟病毒CD2V、P72、360‑505R三个基因，减少了鉴定不同基因的检测成本和检测时间；且只需一次PCR反应即可扩增三个不同长度的基因，辨别毒株是否存在基因的缺失。仅需一次PCR扩增即可鉴别出三个基因，对于传统方法分别扩增检测三个基因的样本来说，成本降低了约2/3，具有广阔的市场前景。

Description

一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重PCR 检测引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒株鉴别方法技术领域，更具体地，涉及一种一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重PCR检测引物及试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)，可引起急性出血热，导致猪的大量发病率和死亡率事件(死亡率接近100％)。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。从2018年第一例非洲猪瘟在我国爆发来，非洲猪瘟对我国养猪业造成重大的损失，严重影响我国的养猪业的健康发展。国内外研究表明非洲猪瘟病毒CD2V和360-505R基因敲除后，可以显著降低病毒毒性，敲除这两个基因的非洲猪瘟活病毒有望成为疫苗。
非洲猪瘟病毒属于DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科,非洲猪瘟病毒属成员，是一种具有20面体结构，直径为175～215nm，基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。
近年来，国内外学者对其建立了荧光抗体试验、普通PCR诊断，SYBRGreen实时荧光定量PCR等技术进行ASF的检测。普通PCR方法成本较低，操作方便，得到了广泛应用。在PCR方法检测非洲猪瘟病毒CD2V和360-505R基因缺失毒株的时候，通过扩增特征性P72基因来确定是否有非洲猪瘟病毒感染，然后再分别通过扩增CD2V和360-505R基因来进一步确定是否基因缺失。存在步骤繁琐，不利于快速鉴定。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。是一种快速准确的检测方法。
发明内容
本发明第一方面的目的在于提供一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重PCR检测引物组。
本发明第二方面的目的在于提供包含上述检测引物组的试剂盒。
本发明第三方面的目的在于提供一种非疾病诊断目的的非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的快速区分方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重PCR检测引物组，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：
ASFV-P72-F：5’AACCAGTGGCCCTCTCCTAT 3’(SEQ ID NO：1)；
ASFV-P72-R：5’AATCGCATTGCCTCCGTAGT 3’(SEQ ID NO：2)；
ASFV-CD2V-F：5’TCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGT 3’(SEQ ID NO：3)；
ASFV-CD2V-R：5’AGATAATGGCGGGATATTGGGTAGT 3’(SEQ ID NO：4)；
ASFV-360-505R-F：5’TCTTGTCCTTTTCATACGCCTCAT 3’(SEQ ID NO：5)；
ASFV-360-505R-R：5’GAGCACACCTGGGACCTCT 3’(SEQ ID NO：6)。
本发明的第二个方面，提供一种用于快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的检测试剂盒，所述试剂盒包含上述的检测引物组。
进一步地，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂和PCR扩增试剂。
进一步地，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。
优选地，所述阳性对照品为包含非洲猪瘟病毒P72基因的质粒DNA。
本发明的第三个方面，提供一种非疾病诊断目的的非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的快速区分方法，包活以下步骤：
S1.从样品中提取病毒核酸；
S2.以核酸为模板，用权利要求1所述的检测引物组对样品进行PCR扩增反应获得扩增产物；
S3.将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。
更具体地，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：当无扩增产物时，则样品中没有病毒；当扩增产物为三条片段，分别为1005，414和225bp，则样本中的病毒为野毒株；当扩增产物为一条片段1005bp，则样本中的病毒缺失CD2V和360-505R基因；当扩增产物为两条片段1005和414bp，则样本中的病毒缺失CD2V基因；当扩增产物为两条片段1005和225bp，则样本中的病毒缺失360-505R基因。
更具体地，步骤S2所述PCR扩增反应的反应体系包括：2×Premix rTaq 10μL，三对引物ASFV-P72-F/R(20μM)、ASFV-CD2V-F/R(10μM)、ASFV-360-505R-F/R(10μM)各1μL，模板DNA1μL，补加去离子水至20μL。
优选地，所述2×Premix rTaq包含TaKaRa Taq酶1.25U/25μL，dNTP Mixture各0.4mM，Taq Buffer 3mM Mg2+，色素Marker。
更具体地，步骤S2所述PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸70s，共30～35个循环；最后72℃延伸10min。
本发明的有益效果是：
(1)本发明利用三对引物一次性扩增非洲猪瘟病毒CD2V、P72、360-505R三个基因，减少了鉴定不同基因的检测成本和检测时间；且只需一次PCR反应即可扩增三个不同长度的基因，辨别毒株是否存在基因的缺失。当前非洲猪瘟病毒ASF检测的靶标多为P72基因，本项目通过设计3重PCR引物同时扩增P72，CD2V和360-505R基因，产生不同长度的PCR反应产物。通过凝胶电泳可以非常简便鉴别检测的样品是否有非洲猪瘟病毒感染，以及感染的毒株是否有基因缺失。
(2)本发明具有特异性强、可重复性好等优势，仅对非洲猪瘟病毒(ASFV)的DNA产生特异性的扩增反应，对猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、轮状病毒(RV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的核酸等均无扩增反应。
(3)本发明的专用试剂盒经济实惠，仅需一次PCR扩增即可鉴别出三个基因，大大缩短了反应时间，对于传统方法分别扩增检测三个基因的样本来说，成本降低了约2/3。
(4)本发明为我国非洲猪瘟病毒的临床检测提供了新手段，该试剂盒临床应用操作便捷，实用性强，可用于生产实践中非洲猪瘟病毒的疫情监控、鉴别诊断以及疫病的净化，也可用于专业实验室对非洲猪瘟病毒株的快速鉴定，可为提升我国非洲猪瘟的综合防控水平提供技术支撑。
附图说明
图1非洲猪瘟病毒(ASFV)多重PCR优化试验结果。注：1：P72基因；2：CD2V基因；3：360-505R基因；4：无基因缺失的野毒株；5：缺失CD2V株；6：缺失CD2V和360-505R株；7：阳性质粒(P72)；8：阴性对照(去离子水)。
图2非洲猪瘟病毒(ASFV)多重PCR特异性试验结果。注：M：DL2000 Marker；1：无基因缺失的野毒株；2：缺失CD2V株；3：缺失CD2V和360-505R株；4：阳性质粒(P72)；5：阴性对照(DEPC水)；6：猪瘟病毒(CSFV)；7：猪伪狂犬病毒(PRV)；8：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；9：猪细小病毒(PPV)；10：猪乙型脑炎病毒(JEV)；11：轮状病毒(RV)；12：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；13：猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)。
图3非洲猪瘟病毒(ASFV)多重PCR敏感性试验结果。注：M：DL2000 Marker；1-8：模板浓度分别为1×10-5ng/μL、1×10-4ng/μL、1×10-3ng/μL、1×10-2ng/μL、1×10-1ng/μL、1×100ng/μL、1×101ng/μL、1×102ng/μL。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
实施例1引物设计
发明人大量对比NCBI(美国国立生物信息中心)的GenBanK数据库中已公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)的CD2V、P72、360-505R基因高度保守且具有特异性区域，设计为ASFVCD2V、P72、360-505R基因为特异性引物对，分别命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6由此来提供了一种鉴别ASFV野生型毒株和基因缺失的毒株的PCR引物，具体为：
P1：ASFV-P72-F：5’AACCAGTGGCCCTCTCCTAT 3’(SEQ ID NO：1)；
P2：ASFV-P72-R：5’AATCGCATTGCCTCCGTAGT 3’(SEQ ID NO：2)；
P3：ASFV-CD2V-F：5’TCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGT 3’(SEQ ID NO：3)；
P4：ASFV-CD2V-R：5’AGATAATGGCGGGATATTGGGTAGT 3’(SEQ ID NO：4)；
P5：ASFV-360-505R-F：5’TCTTGTCCTTTTCATACGCCTCAT 3’(SEQ ID NO：5)；
P6：ASFV-360-505R-R：5’GAGCACACCTGGGACCTCT 3’(SEQ ID NO：6)。
P1和P2用于扩增ASFV的P72片段，片段长度为1005bp。
P3和P4用于扩增ASFV的CD2V片段，片段长度为225bp。
P5和P6用于扩增ASFV的360-505R中的一个片段，片段长度为414bp。
实施例2三重PCR检测方法
材料与方法
1.1实施例1中引物
1.2样品DNA提取
对DNA提取没有特殊要求，可按常规方法或者DNA提取试剂盒提取。提取的DNA置-20℃保存备用或立即用于PCR扩增。
1.3阳性质粒
以GenBanK数据库中已公布的ASFV CD2V、P72、360-505R的部分基因序列人工合成基因，与pJET1.2克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12-16h，挑菌筛选测序鉴定后，扩大培养阳性菌液后提取质粒，将阳性的质粒分别命名为pJET-P72、pJET-CD2V和pJET-360-505R。
1.4三重PCR反应建立敏感性试验
将1.3中所得阳性质粒稀释到1ng/μL作为检测模板。引物分别稀释为终浓度2μM,1.5μM,1μM,0.75μM,0.5μM,0.25μM等。应用PCR仪，采用矩阵法筛选不同引物浓度组合，得到针对三重PCR引物浓度和反应条件。
按照以下步骤进行三重PCR
S1.按照核酸提取试剂盒说明书从样品中提取病毒核酸；
S2.以核酸为模板，用权利要求1所述的检测引物对样品进行PCR扩增反应获得扩增产物；采用20μL反应体系2×Premix rTaq 10μL，三对引物ASFV-P72-F/R(20μM)、ASFV-CD2V-F/R(10μM)、ASFV-360-505R-F/R(10μM)各1μL，模板DNA 1μL，补加去离子水至20μL。
其中，2×Premix rTaq包含TaKaRa Taq酶1.25U/25μL，dNTP Mixture各0.4mM，TaqBuffer3mM Mg2+，色素Marker。
扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸70s，共30～35个循环；最后72℃延伸10min。
S3.将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。
PCR扩增产物进行电泳鉴定：称取1g琼脂糖放入500mL锥形瓶中，加入1×TAE电泳缓冲液100mL，于微波炉中熔解，再加入10μL染色液混匀。在电泳槽模内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待完全凝固后取出置于电泳槽中，将10μL PCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以120V电压于1×TAE电泳缓冲液中电泳，凝胶成像系统观察结果。
按照上述方法对阳性质粒样品和确诊感染非洲猪瘟病毒的猪脾脏组织样品进行检测，1：P72基因、2：CD2V基因、3：360-505R基因、4：无基因缺失的野毒株、5：缺失CD2V株、6：缺失CD2V和360-505R株、7：阳性质粒(P72)、8：阴性对照(去离子水)进行三重PCR检测，实验结果见附图1。从结果中可以看出，泳道1、4、5、6、7中可以检测到P72片段，泳道3、4、5可以检测到360-505R，泳道2、4可以检测到CD2V。说明：3对引物具有良好的特异性，3个PCR产物在凝胶电泳图上明显分开，分别扩增出3条大小分别为1005bp、414bp、225bp的特异性条带，与预期大小相符，均未出现任何非特异扩增条带，实验结果清晰明了。
1.5重复性试验
每份样品做3个重复，分别提取DNA，在同一次扩增中进行测定。试验重复3次检测结果一致。
实施例3特异性试验
按照实施例2中1.4建立的三重PCR检测方法对1：无基因缺失的野毒株；2：缺失CD2V株；3：缺失CD2V和360-505R株；4：阳性质粒(P72)；5：阴性对照(DEPC水)；6：猪瘟病毒(CSFV)；7：猪伪狂犬病毒(PRV)；8：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；9：猪细小病毒(PPV)；10：猪乙型脑炎病毒(JEV)；11：轮状病毒(RV)；12：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；13：猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)，进行检测。结果如附图2所示。
从附图2中可以看出，对应1：无基因缺失的野毒株；2：缺失CD2V株；3：缺失CD2V和360-505R株；4：阳性质粒(P72)的泳道在对应的片段大小的位置都能看到清晰的条带，而阴性对照(DEPC水)；6：猪瘟病毒(CSFV)；7：猪伪狂犬病毒(PRV)；8：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；9：猪细小病毒(PPV)；10：猪乙型脑炎病毒(JEV)；11：轮状病毒(RV)；12：猪流行性腹泻病毒(PEDV)；13：猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)对应的泳道都没有显示出条带，说明该检测方法具有较好的特异性。
实施例4敏感性试验
将混合后的3种阳性模板浓度分别稀释为1×10-5ng/μL、1×10-4ng/μL、1×10-3ng/μL、1×10-2ng/μL、1×10-1ng/μL、1×100ng/μL、1×101ng/μL、1×102ng/μL。按照实施例2中1.4建立的三重PCR检测方法对1-8：模板浓度分别为1×10-5ng/μL、1×10-4ng/μL、1×10- 3ng/μL、1×10-2ng/μL、1×10-1ng/μL、1×100ng/μL、1×101ng/μL、1×102ng/μL进行检测。结果如附图3所示。
从附图3中可以看出，泳道5至8可以看到清晰的3条条带，说明该方法的敏感性为1×10-1ng/μL。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
肇庆大华农生物药品有限公司
<120> 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重PCR检测引物及试剂
盒
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaccagtggc cctctcctat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aatcgcattg cctccgtagt 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcctaagcct tacagtcgtt atcagt 26
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agataatggc gggatattgg gtagt 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcttgtcctt ttcatacgcc tcat 24
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagcacacct gggacctct 19

Claims (10)

1.一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重PCR检测引物组，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：
ASFV-P72-F：5’AACCAGTGGCCCTCTCCTAT 3’（SEQ ID NO：1）；
ASFV-P72-R：5’AATCGCATTGCCTCCGTAGT 3’（SEQ ID NO：2）；
ASFV-CD2V-F：5’TCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGT 3’（SEQ ID NO：3）；
ASFV-CD2V -R：5’AGATAATGGCGGGATATTGGGTAGT 3’（SEQ ID NO：4）；
ASFV-360-505R-F：5’TCTTGTCCTTTTCATACGCCTCAT 3’（SEQ ID NO：5）；
ASFV-360-505R-R：5’GAGCACACCTGGGACCTCT 3’（SEQ ID NO：6）。
2.一种用于快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的检测引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂和PCR扩增试剂。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为包含非洲猪瘟病毒P72基因的质粒DNA。
6.一种非疾病诊断目的的非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的快速区分方法，其特征在于，包活以下步骤：
S1.从样品中提取病毒核酸；
S2.以核酸为模板，用权利要求1所述的检测引物组对样品进行PCR扩增反应获得扩增产物；
S3.将PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：
当无扩增产物时，则样品中没有病毒；
当扩增产物为三条片段，分别为1005，414和225bp，则样本中的病毒为野毒株；
当扩增产物为一条片段1005bp，则样本中的病毒缺失CD2V和360-505R基因；
当扩增产物为两条片段1005和414bp，则样本中的病毒缺失CD2V基因；
当扩增产物为两条片段1005和225bp，则样本中的病毒缺失360-505R基因。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的反应体系包括：2×Premix rTaq 10μL，三对引物20μM 的ASFV-P72-F/R、10μM 的ASFV-CD2V-F/R、10μM 的ASFV- 360-505R-F/R各1μL，模板DNA 1μL，补加去离子水至20μL。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述2×Premix rTaq包含TaKaRa Taq酶1.25U/25μL，dNTP Mixture各0.4 mM，Taq Buffer 3 mM Mg2+，色素Marker。
10.根据权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸70s，共30～35个循环；最后72℃延伸10min。
CN201910888108.1A 2019-09-19 2019-09-19 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒 Active CN110551853B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910888108.1A CN110551853B (zh) 2019-09-19 2019-09-19 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910888108.1A CN110551853B (zh) 2019-09-19 2019-09-19 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110551853A CN110551853A (zh) 2019-12-10
CN110551853B true CN110551853B (zh) 2021-05-04

Family

ID=68740840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910888108.1A Active CN110551853B (zh) 2019-09-19 2019-09-19 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110551853B (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110927390A (zh) * 2019-12-16 2020-03-27 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA方法、试剂盒及应用
CN113122655A (zh) * 2019-12-30 2021-07-16 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法
CN111172321B (zh) * 2020-01-02 2021-04-23 中国检验检疫科学研究院 鉴别非洲猪瘟感染与免疫的荧光pcr检测试剂盒
CN111020062A (zh) * 2020-01-10 2020-04-17 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量pcr试剂盒
CN111363852A (zh) * 2020-04-20 2020-07-03 叶繁全 一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒
CN111676327B (zh) * 2020-07-21 2021-05-14 河南省农业科学院 非洲猪瘟病毒野毒感染与基因缺失毒株双重荧光定量pcr检测组合物、方法及试剂盒
CN111876527A (zh) * 2020-08-13 2020-11-03 中国动物卫生与流行病学中心 一种非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株鉴别检测试剂盒
CN112094950A (zh) * 2020-10-15 2020-12-18 杭州博日科技股份有限公司 用于检测非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的引物组、试剂盒、方法和应用
CN112646934B (zh) * 2021-01-21 2021-08-31 华南农业大学 一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量pcr检测引物及试剂盒
CN113215311A (zh) * 2021-04-23 2021-08-06 华南农业大学 一种离心式微流控芯片鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株和非洲猪瘟流行株的引物组合及试剂盒
CN113584227B (zh) * 2021-08-03 2023-04-28 长江大学 一种鉴别非洲猪瘟基因缺失株的巢式pcr检测引物组及方法
CN114085929B (zh) * 2022-01-20 2022-04-08 济凡生物科技（北京）有限公司 一种用于检测非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株的试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110093324A (zh) * 2019-04-26 2019-08-06 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110093324A (zh) * 2019-04-26 2019-08-06 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立;李维彬等;《宁夏大学学报（自然科学版）》;20070331;第28卷(第1期);第1.2、1.5、2.1部分 *
非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立;黄萍等;《中国动物检疫》;20101231;第27卷(第11期);第28-30页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110551853A (zh) 2019-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110551853B (zh) 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒
CN111270012B (zh) 一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒
CN106947838B (zh) 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN111139317A (zh) 一种sars-cov-2病毒多重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN107475459B (zh) 同时鉴别美洲型prrsv经典毒株、变异毒株及新型病毒类nadc30毒株的检测方法
CN111020062A (zh) 一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重实时荧光定量pcr试剂盒
CN113502352B (zh) 检测具有感染性ASFV的EMA-ddPCR引物、探针及应用
CN106957927A (zh) 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN112094948A (zh) 一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒
CN111394431B (zh) 一种使用双重实时荧光等温扩增技术检测核酸的方法
CN116024208B (zh) 一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒
CN112430686B (zh) 用于同时检测bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3的试剂盒及引物和探针
CN111334614A (zh) 一种采用RT-qPCR技术检测新型冠状病毒的方法
CN110804677B (zh) 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重pcr检测引物及试剂盒
CN113718045A (zh) 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用
CN106435032B (zh) 一种用于同时扩增北美型和欧洲型猪蓝耳病病毒的二重rt-pcr引物、试剂盒和方法
CN113046476A (zh) 一种快速检测新型冠状病毒n501y突变的引物组合物及试剂盒
KR20190026403A (ko) 돼지 유행성 설사 바이러스의 유전자형 분석용 프라이머 및 이의 용도
CN116042878A (zh) 一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法
CN111500774B (zh) 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒
CN115232888A (zh) 快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物、试剂盒及方法
CN114634996A (zh) 用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、试剂盒及其应用
CN114395643A (zh) 非洲猪瘟病毒的双通道数字pcr检测试剂盒及方法
CN110760601B (zh) 一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组、试剂盒及应用
CN112063757A (zh) 一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant