CN111139317A - 一种sars-cov-2病毒多重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种sars-cov-2病毒多重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种SARS‑COV‑2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，使试剂盒包括SARS‑CoV‑2病毒PCR反应液、Taq酶、过程对照、阳性对照及阴性对照，采用本发明的试剂盒检测环境和食品中的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2具有很好的特异性、敏感性及稳定性，检测时间2小时，PCR反应过程加液一步完成，避免反复开盖实验污染，通过更换特征引物和探针可扩展测试环境中已知的其他7种冠状病毒。

Description

一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
2019年12月报道了首例COVID-19的病人病例，为乙类传染病，由SARS-CoV-2病毒引起。冠状病毒有外层脂质包膜，病毒含有为连续线型单链RNA基因。SARS-CoV-2可通过呼吸道飞沫和接触传播。根据研究报道(Persistence of coronaviruses on inanimatesurfaces and its inactivation with biocidal agents doi:10.1016/j.jhin.2020.01.022)格赖夫斯瓦尔德大学医院内科医生Gunter Kampf等科学研究发现，如果温度30度以下，且湿度合适，病毒可以在铁、铝等金属，木材、纸张、塑料和玻璃等多种材料上存活4至5天，一些动物冠状病毒甚至可以存活超过28天。因此为了确认环境清洁消毒有效，在新冠病毒疾病流行期间，对环境建立一种灵敏度高，且避免假阴性结果的SARS-CoV-2病毒检测方法显得尤其重要。
目前已知可感染人类的冠状病毒仅7种：HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和这次的SARS-CoV-2。本方法选取了SARS-CoV-2的ORF1ab多聚蛋白编码ORF1ab基因及核衣壳蛋白(Nucleo capsid protein,N)基因作为特异性RNA检测目标基因，和冠状病毒(HKU1，OC43,NL63,229E)，SARS-CoV，MERS,以及人类基因DAN无交叉反应，与诺如病毒军团菌等无交叉反应。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种适用环境和食品通过涂抹，提取，RT-PCR的方法监控SARS-CoV-2清洁和灭杀效果的方法，且有效避免假阴性和假阳性的误差。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有良好特异性、较高的亲和性和稳定性的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒。
一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：从样本中提取SARS-COV-2病毒，通过一步多重荧光探针体外扩增法同时扩增SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因和N基因片段，对扩增产物进行多重荧光定量PCR检测，所述ORF1lab基因的特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物具有SEQ ID NO.1的碱基对序列；
下游引物具有SEQ ID NO.2的碱基对序列；
荧光探针具有SEQ ID NO.3的碱基对序列；
所述N基因的特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物具有SEQ ID NO.4的碱基对序列；
下游引物具有SEQ ID NO.5的碱基对序列；
荧光探针具有SEQ ID NO.6的碱基对序列。
本发明提供的一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法还通过一步多重荧光探针体外扩增法同时扩增了一个用于质控的MS2片段，所述MS2片段的特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物具有SEQ ID NO.7的碱基对序列；
下游引物具有SEQ ID NO.8的碱基对序列；
荧光探针具有SEQ ID NO.9的碱基对序列。
本发明提供的一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法中的阳性对照为合成的病毒质粒核酸序列，包括所述ORF1lab基因、N基因和MS2片段，所述SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法中的阴性对照是无菌水。
本发明提供的一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法包括如下步骤：
步骤一：环境涂抹取样品；
步骤二：使用病毒RNA提取试剂，净化柱，提取和纯化样品中的RNA；
步骤三：以所述步骤二中的RNA为模板，在50度的温度下，通过反转录酶转录得到对应DNA，DNA模板在PCR反应液中，利用热启动Taq聚合酶，在设定的链式反应条件下，进行PCR循环反应；
步骤四：选择FAM，HEX，Cy5为多重反应同时测试，设定阈值，由电脑分析并得到Ct值。
本发明提供的一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法中所述步骤二中的PCR反应体系终浓度组成如下：
PCR缓冲液Mg2+浓度为3.3mM，0.1-0.5mM dNTP，SARS-CoV-2特异性基因的上游引物、下游引物和探针上下游引物浓度为0.1-1.0M；探针浓度为0.1-0.5M；Taq酶浓度为0.5-5U/反应，每个测试20-1000个拷贝病毒基因组模板；所述步骤二中的反应条件为：50℃RNA逆转录15min，95℃水解、热启动DNA15min，94℃15S退火，55℃延伸，退火和延伸步骤45个循环。
一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测SARS-COV-2病毒的所述权利要求1中ORF1ab基因和N基因序列的特异性引物和荧光探针序列，所述ORF1ab基因和N基因序列的特异性引物和荧光探针序列作为阳性对照使用。
本发明提供的一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，还包括MS2片段的特异性引物和荧光探针序列，MS2片段的特异性引物和荧光探针序列在检测SARS-COV-2病毒的过程中作为过程控制参考物使用。
本发明提供的一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒包括PCR反应液、反转录酶、热启动酶、所述过程控制参考物、阴性对照和所述阳性对照。
本发明提供的一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒按照如下方式配置反应体系：50μl的反应体系中包括2μl含有反转录酶、Taq酶和dNTP的PCR反应液、10μl的缓冲溶液、5μl的RT-Prime mix预混液、4μl含有上游引物、下游引物和探针的混合液、10μl模板RNA或样品中提取的RNA和19μl超纯水。
本发明提供的一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒中所述缓溶液中Mg2+的浓度为3.3mM，所述dNTP浓度为0.1-0.5mM，上下游引物浓度为0.1-1.0M，探针浓度为0.1-0.5M，Taq酶浓度为0.5-5U/反应。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：逆转录荧光定量RT-PCR检测技术，融合传统PCR方法，通过荧光标记物和淬灭基团的切断释放荧光信号，电子倍增技术，检测的灵敏度可以达到15个拷贝数，同时扩增的目标基因序列由特异性引物和探针，以及选用了两个特异性RNA核酸片段，一个质控RAN，三重荧光信号同时控制，具有更好的特异性，避免假阳性的同时也避免假阴性的结果，提高结果准确性。可对特殊时期的疾病预防监控起到非常重要作用。
以下对本发明做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是实施例中阳性结果荧光定量RT-PCR特异性循环扩增图；
图2是实施例中阴性结果荧光定量RT-PCR循环扩增图；
图3是荧光定量PCR扩增曲线；
图4是图3的荧光定量PCR扩增图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例
在本实施例中，提供一种特异性，高效、准确的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其步骤如下：
1、环境、食品表面涂抹，取样，将涂抹棒置于含缓冲溶液和灭活溶液的取样管中。取样时应带手套，口罩，避免人的RNA降解酶污染样品；
2、使用病毒RNA提取试剂，净化柱，提取和纯化样品中的RNA；
3、以上述RNA为模板，在50度的温度下，通过反转录酶转录得到对应DNA，DNA模板在PCR反应液中，利用热启动Taq聚合酶，在设定的链式反应条件下，进行PCR循环反应；
4、选择FAM，HEX，Cy5为多重反应同时测试，设定阈值，由电脑分析并得到Ct值。
步骤2中的PCR反应体系终浓度组成如下：
1×CR缓冲液Mg2+浓度为3.3mM，0.1-0.5mMdNTP，SARS-CoV-2特异性基因的上游引物、下游引物和探针上下游引物浓度为0.1-1.0M；探针浓度为0.1-0.5M；Taq酶浓度为0.5-5U/反应，每个测试20-1000个拷贝病毒基因组模板。
步骤2中的反应条件为：50℃RNA逆转录15min，95℃水解、热启动DNA15min，94℃15S退火，55℃延伸，退火和延伸循环重复45次。
逆转录荧光定量RT-PCR检测技术，融合传统PCR方法，通过荧光标记物和淬灭基团的切断释放荧光信号，电子倍增技术，检测的灵敏度可以达到15个拷贝数。同时扩增的目标基因序列由特异性引物和探针，以及选用了两个特异性RNA核酸片段，一个质控RAN，三重荧光信号同时控制，具有更好的特异性，避免假阳性的同时也避免假阴性的结果，提高结果准确性。可对特殊时期的疾病预防监控起到非常重要作用。
一种基于本申请提供的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括：PCR反应液、反转录酶、热启动酶、过程控制参考物，阴性对照，阳性对照。
SARS-CoV-2 PCR反应液包括：PCR缓冲液(含Mg2+)，dNTP以及SARS-CoV-2特异性RNA的上游引物、下游引物和探针，其中Mg2+浓度为3.3mM，dNTP浓度为0.1-0.5mM；上下游引物浓度为0.1-1.0M；探针浓度为0.1-0.5M；Taq酶浓度为0.5-5U/反应。
根据SARS-CoV-2基因序列(GenBank：MN908947)以及中国疾病预防控制中心发布信息，设计并合成特异性引物和荧光探针，其序列如下：
ORF1lab基因
上游引物具有SEQ ID NO.1的碱基对序列；
下游引物具有SEQ ID NO.2的碱基对序列；
荧光探针具有SEQ ID NO.3的碱基对序列；
N基因
上游引物具有SEQ ID NO.4的碱基对序列；
下游引物具有SEQ ID NO.5的碱基对序列；
荧光探针具有SEQ ID NO.6的碱基对序列。
过程控制参考物MS2参考基因号JF 719743.1扩增基因位置3135-3336
上游引物具有SEQ ID NO.7的碱基对序列；
下游引物具有SEQ ID NO.8的碱基对序列；
荧光探针具有SEQ ID NO.9的碱基对序列。
其中，阳性对照为合成的病毒质粒核酸序列，含ORF1lab片段，N片段和MS2，阴性对照为不含RNA的无菌水。
为了达到定量的要求，使用已知拷贝数浓度的阳性克隆质粒，用缓冲液按10倍梯度，逐级稀释，依次稀释4-7个梯度得到不同浓度的溶液，取该溶液在检测相同条件下经行RT-PCR测试。以阳性标准品的浓度对数值为纵坐标，实验的Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)为横坐标绘制标准曲线。根据样品测试得到的Ct值，计算可得到样本中SARS-CoV-2的浓度。
在本实施例中，提供一种特异性，高效、准确的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，MS2标准菌株为ATCC 15597-B1，仪器使用MX3005P实时荧光定量PCR仪和YX-LS75G立式压力灭菌器。
具体的，使用过程包括以下步骤：
①采集涂抹环境食品样品是采用无菌不含RNA的采样棒，对环境或物品表面进行涂抹，面积10×10cm2。将该涂抹棒置于事先准备好的采样管中，采样管内含有缓冲盐，RNA降解酶抑制剂，病毒灭活溶剂。采集的样品应尽快提取RNA，或者于-20℃以下保存且于48小时内提取RNA；作为对照的过程质控，采用MS2喷洒表面后进行涂抹收集，作为涂抹，提取、复制全过程；
②对RNA进行提取、纯化，是采用商品化的病毒RNA提取试剂盒DP315-R，按操作说明书步骤对样品中的病毒RNA进行裂解、提取、纯化和富集；
③准备PCR反应体系溶液，是按照表1所示的配置反应体系(PCR反应体系的配置最好在冰浴或在冰上进行)；
表1：PCR反应体系
Figure BDA0002410455520000071
④室温离心数秒，使液体聚于管底；
⑤PCR反应参数的设定如表2所示。
表2：参数的设定
Figure BDA0002410455520000072
⑥选择荧光检测模式检测FAM，Cy5，HEX荧光，在log图谱窗口设置Threshold的阈值，由电脑自动分析并计算结果；
⑦标准曲线的建立：采用上述步骤③到⑤的反应体系和反应条件，对标准品质粒的各个梯度进行PCR扩增，计算Ct值对稀释浓度的log值，获得浓度与Ct值对应的标准曲线，荧光定量PCR扩增曲线如图3所示，其中y＝-4.3x+44.5，R2＝0.9968。
本发明针对SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因和N基因序列设计特异引物和探针研制出SARS-CoV-2病毒的检测试剂盒，基因序列信息来自世界卫生组织WHO和中国CDC已经公开公布的数据。以其为靶点设计的特异性引物和探针通过荧光定量RT-PCR方法检测SARS-CoV-2，在检测公共环境，生产区域，办公场所，食品产品表面的SARS-CoV-2病毒是，具有更好的特异性、敏感性、准确性和稳定性，是一种快速、准确的SARS-CoV-2病毒检测方法。
序列表
<110> 欧陆分析技术服务（苏州）有限公司
<120> 一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
<130> 2020.3.12
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> designed
<400> 1
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> designed
<400> 2
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> designed
<400> 3
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> designed
<400> 4
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> designed
<400> 5
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> designed
<400> 6
ttgctgctgc ttgacagatt 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> designed
<400> 7
ggctgctcgc ggataccc 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> designed
<400> 8
tgagggaatg tgggaaccg 19
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> designed
<400> 9
acctcgggtt tccgtcttgc tcgt 24

Claims (10)

1.一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：从样本中提取SARS-COV-2病毒，通过一步多重荧光探针体外扩增法同时扩增SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因和N基因片段，对扩增产物进行多重荧光定量PCR检测，所述ORF1lab基因的特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物具有SEQ ID NO.1的碱基对序列；
下游引物具有SEQ ID NO.2的碱基对序列；
荧光探针具有SEQ ID NO.3的碱基对序列；
所述N基因的特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物具有SEQ ID NO.4的碱基对序列；
下游引物具有SEQ ID NO.5的碱基对序列；
荧光探针具有SEQ ID NO.6的碱基对序列。
2.根据权利要求1所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：还通过一步多重荧光探针体外扩增法同时扩增了一个用于质控的MS2片段，所述MS2片段的特异性引物和荧光探针序列如下：
上游引物具有SEQ ID NO.7的碱基对序列；
下游引物具有SEQ ID NO.8的碱基对序列；
荧光探针具有SEQ ID NO.9的碱基对序列。
3.根据权利要求2所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法中的阳性对照为合成的病毒质粒核酸序列，包括所述ORF1lab基因、N基因和MS2片段，所述SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法中的阴性对照是无菌水。
4.根据权利要求1所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：取样品；
步骤二：使用病毒RNA提取试剂，净化柱，提取和纯化样品中的RNA；
步骤三：以所述步骤二中的RNA为模板，在50度的温度下，通过反转录酶转录得到对应DNA，DNA模板在PCR反应液中，利用热启动Taq聚合酶，在设定的链式反应条件下，进行PCR循环反应；
步骤四：选择FAM，HEX，Cy5为多重反应同时测试，设定阈值，由电脑分析并得到Ct值。
5.根据权利要求4所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述步骤二中的PCR反应体系终浓度组成如下：
PCR缓冲液中Mg2+浓度为3.3mM，dNTP的浓度为0.1-0.5mM，SARS-CoV-2特异性基因的上游引物、下游引物和探针上下游引物浓度为0.1-1.0M，探针浓度为0.1-0.5M，Taq酶浓度为0.5-5U/反应，每个测试20-1000个拷贝病毒基因组模板；
所述步骤二中的反应条件为：50℃RNA逆转录15min，95℃水解、热启动DNA 15min，94℃15S退火，55℃延伸。
6.一种SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于检测SARS-COV-2病毒的所述权利要求1中ORF1ab基因和N基因序列的特异性引物和荧光探针序列，所述ORF1ab基因和N基因序列的特异性引物和荧光探针序列作为阳性对照使用。
7.根据权利要求6所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括所述权利要求2中MS2片段的特异性引物和荧光探针序列，所述MS2片段的特异性引物和荧光探针序列在检测SARS-COV-2病毒的过程中作为过程控制参考物使用。
8.根据权利要求7所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液、反转录酶、热启动酶、所述过程控制参考物、阴性对照和所述阳性对照。
9.根据权利要求8所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒按照如下方式配置反应体系：50μl的反应体系中包括2μl含有反转录酶、Taq酶和dNTP的PCR反应液、10μl的缓冲溶液、5μl的RT-Prime mix预混液、4μl含有上游引物、下游引物和探针的混合液、10μl模板RNA或样品中提取的RNA和19μl超纯水。
10.根据权利要求9所述的SARS-COV-2病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述缓溶液中Mg2+的浓度为3.3mM，所述dNTP浓度为0.1-0.5mM，上下游引物浓度为0.1-1.0M，探针浓度为0.1-0.5M，Taq酶浓度为0.5-5U/反应。
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