CN111733293A - 一种检测sars-cov-2的双链引物探针、试剂盒及多重pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于PCR技术领域，具体公开了一种检测SARS‑COV‑2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法。所述双链引物探针包括用于检测SARS‑COV‑2病毒的ORF1ab、N和E基因序列的特异性引物探针，所述试剂盒包括所述双链引物探针。本发明采用双链引物探针来减少引物自身形成茎环结构或引物之间形成二聚体的机率，使得PCR扩增效率达到一致，从而解决了多重PCR之间的竞争性抑制，实现了SARS‑COV‑2病毒ORF1ab、N和E多个靶基因的单管同时检测。本发明的双链引物探针实现了引物和探针的一体化设计，减少了体系的复杂程度，提升了引物和模板结合的特异性；且所述双链引物探针温度兼容性好，且便于新用户操作。

Description

一种检测SARS-COV-2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法

技术领域

本发明涉及PCR技术领域，特别是涉及一种检测SARS-COV-2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法。

背景技术

实验室检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)的方式包括病毒分离培养、血清学检测和分子生物学检测等。目前市场上新型冠状病毒检测以分子生物学检测为主，由于荧光定量PCR法检测具有操作简便快速、准确度高、可用于早期确诊等特点，因此是目前已经应用的新型冠状病毒检测试剂盒的主要实验原理。荧光定量PCR和普通PCR反应相同，都需要根据目标序列设计扩增引物，然后在扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时监控；其检测方法包括双链DNA交联荧光染料、Taqman探针法、分子信标法和双杂交探针等。

对于一种新型病毒来说，其鉴定依赖于该病毒RNA序列上的高度保守的序列，即使病毒再次发生变异，这些高度保守的序列在进化中基本保持不变。在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所1月21日发布的新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列一文中，说明了试剂盒的目标序列分别为新冠病毒的开放读码框1ab(open reading frame，ORF1ab)、核壳蛋白(nucleoprotein，N)基因区域。除了这两个目标基因外，上海之江生物生产的试剂盒还包含新冠病毒的囊膜糖蛋白基因(envelope gene，E基因)，可以通过三重荧光PCR的方法更准确地对新冠病毒感染者进行判断。

多重荧光定量PCR是在单个PCR反应管中同时进行多个反应，从而一次性扩增多个靶基因，可节省大量的时间和经费，具有巨大的时效性和经济性，是广泛应用的分子生物学技术。引物设计是多重PCR成功与否的关键，但引物设计并不是单重反应引物设计的简单叠加：一方面，引物之间以及引物与模板序列之间的相互干扰，导致多重PCR引物设计考虑因素增加，极大地增加了计算的空间和时间复杂度；另一方面，多重PCR引物设计需要被当作一个整体考虑，不能被分割为多个PCR引物设计问题的简单组合。多重PCR的引物设计需要满足单重PCR引物的约束条件，亦要考虑引物之间的相互干扰，让退火温度同时适合多个引物与模板的结合，那就需要解决以下挑战：引物二聚体、引物发夹结构、引物脱靶效应和兼容多对引物的退火温度。

综上，本发明拟针对SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因设计一种特异性更好、温度兼容性更好的适用于多重荧光定量PCR的引物探针。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测SARS-COV-2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法，本发明通过设计双链引物探针，实现引物和探针的一体化设计，减少体系的复杂程度，并提升引物和模板结合的特异性，本发明通过设计多对引物探针并标记不同的荧光基团可应用于SARS-COV-2病毒的多个靶基因的多重PCR检测。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种检测SARS-COV-2的多重荧光定量PCR双链引物探针，所述双链引物探针包括用于检测SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因序列的特异性引物探针，其中，针对ORF1ab基因序列的特异性引物探针序列如下：

上游双链引物探针的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，

下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；

针对N基因序列的特异性引物探针序列如下：

上游双链引物探针的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，

下游引物的序列如SEQ ID NO.6所示；

针对E基因序列的特异性引物探针序列如下：

上游双链引物探针的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，

下游引物的序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步，所述荧光探针的5’端均连接有荧光基团，所述荧光探针的3’端均连接有淬灭基团。

进一步，所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX中的任意一种，所述淬灭基团选自BHQ1、Dabcy1中的任意一种。

本发明第二方面提供一种检测SARS-COV-2的多重荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒含有如第一方面所述的引物探针。

进一步，所述上游双链引物探针和下游引物的浓度为10μM。

进一步，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品。

进一步，所述阳性对照品为包含SARS-COV-2病毒ORF、E和N基因的质粒，阴性对照品为去离子水。

进一步，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体系为：去离子水5.5μL，PCR反应缓冲液12.5μL，DNA模板5μL，上游双链引物探针10μM、1μL，下游引物10μM、1μL。

进一步，所述试剂盒进行荧光定量PCR的扩增程序为：

逆转录，55℃，持续时间10min；

预变性，95℃，持续时间3min；

变性，95℃，持续时间15s，循环数50个；

退火，57℃，持续时间15s，循环数50个；

延伸，72℃，持续时间15s，循环数50个；

荧光收集，45℃，持续时间5s，循环数50个。

本发明第三方面提供一种检测SARS-COV-2的双链引物探针多重荧光定量PCR方法，从样本中提取SARS-COV-2病毒，采用如第二方面所述的试剂盒，同时扩增SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因，然后对扩增产物进行多重荧光定量PCR检测。

进一步，所述多重荧光定量PCR方法包括如下步骤：

(1)将如第二方面所述的试剂盒中的试剂混匀后瞬时离心，得到PCR反应液，将PCR反应液分装至PCR反应管中；

(2)将DNA模板加入PCR反应管中，将PCR反应液与DNA模板振荡混匀后瞬时离心，并记录DNA模板加样顺序；

(3)同时扩增SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因，然后对扩增产物进行多重荧光定量PCR检测，收集荧光信号。

如上所述，本发明的检测SARS-COV-2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法，具有以下有益效果：

本发明采用了一种新的、简便的双链引物探针介导的多重聚合酶链反应用来检测SARS-COV-2病毒。本发明采用双链引物探针来减少引物自身形成茎环结构或引物之间形成二聚体的机率，使得PCR扩增效率达到一致，从而解决了多重PCR之间的竞争性抑制，通过设计多对引物探针并标记不同的荧光基团，实现了SARS-COV-2病毒ORF1ab、N和E多个靶基因的单管同时检测。本发明设计的双链引物探针温度兼容性好，且便于新用户操作。与现有基于Taqman探针的RT-PCR方法相比，本发明的双链引物探针实现了引物和探针的一体化设计，从而减少了体系的复杂程度，并提升了引物和模板结合的特异性。

附图说明

图1显示为本发明实施例中的双链引物探针介导实时逆转录聚合酶链反应检测SARS-COV-2的流程示意图。

图2显示为本发明实施例中delta G与杂交效率之间的Matlab代码(A)和模拟结果(B)图，以及(C)三对双链引物和模板之间的delta G，温度范围为57至63℃。

图3显示为本发明实施例中NUPACK模拟三对双链引物和相应的互补模板之间的二级结构图。

图4显示为本发明实施例中针对ORF1ab(A和B)、N(C和D)和E(E和F)基因的三对双链引物的熔解曲线图和相应的导数曲线图。

图5显示为本发明实施例中ORF1ab、N、E基因PCR产物在57～63℃四种退火温度下(从左至右依次为57、59、61、63℃)、25bp DNA标记(自下而上：25、50、75、100、150、200、300、400、500bp)的非变性PAGE电泳结果图(12％)(A、B和C)，针对ORF1ab(D和E)、N(F和G)和E(H和I)基因的PCR扩增产物的熔解曲线图和相应的导数曲线图。

图6显示为本发明实施例中ORF1ab(A)、N(B)和E(C)基因PCR扩增曲线图，质粒浓度分别为4.0×E6、4.0×E5、4.0×E4和4.0×E3拷贝/mL。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明提供一种检测SARS-COV-2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法。本发明针对SARS-COV-2病毒的ORT1ab、N和E基因序列设计特异性双链引物探针，从而研制出检测SARS-COV-2病毒的试剂盒及多重荧光定量PCR方法。SARS-COV-2病毒(新冠病毒)的全序列来源于NCBI已经公布的数据，基因组序列链接为：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947。

本发明的双链引物探针设计原理如下：

多重PCR的引物设计需要满足单重PCR引物的约束条件，亦要考虑引物之间的相互干扰，让退火温度同时适合多个引物与模板的结合，因此，设计多重PCR引物探针时需要解决以下挑战：引物二聚体、引物发夹结构、引物脱靶效应和兼容多对引物的退火温度。

链置换反应利用双链探针与靶基因结合的热力学特性来实现靶基因的特异性检测，其核心步骤包括靶基因与探针的结合，发生碱基-碱基位移变化和生成新的链置换产物。而突变靶基因中的突变位点会影响靶基因与探针的结合和发生碱基-碱基位移变化，影响链置换反应的发生。链置换反应中应用到的双链探针可以减少引物二聚体或茎环结构的形成，从而解决多重PCR反应体系非特异性杂交的难题。

本发明采用双链引物探针来减少引物自身形成茎环结构或引物之间形成二聚体的机率，使得PCR扩增效率达到一致，从而解决多重PCR之间的竞争性抑制，实现SARS-COV-2病毒ORF1ab、N和E多个靶基因的单管检测。本发明的双链引物探针实现了引物和探针的一体化设计，从而减少了体系的复杂程度，并提升了引物和模板结合的特异性。通过设计多对引物探针并标记不同的荧光基团可应用于SARS-COV-2病毒的多个靶基因的多重PCR检测。

具体实施过程如下：

实施例

一、实验步骤和实验条件：

1、阳性对照品质粒的选择：包含SARS-COV-2病毒ORF，E和N基因的质粒(从上海生物工程股份有限公司获得)。

2、针对SARS-COV-2病毒ORF1ab、N和E基因的特异性引物探针：

表1

名称	序列(5’-3’)	编号
			ORF1ab-F(FAM)	6-FAM-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA	SEQ ID NO.1
ORF1ab-F(BHQ1)	TGTAAAACCCACAGGG-BHQ1	SEQ ID NO.2
			ORF1ab-R	ACGATTGTGCATCAGCTGA	SEQ ID NO.3
N-F(HEX)	HEX-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT	SEQ ID NO.4
			N-F(BHQ1)	AGCAGGAGAAGTTCCCC-BHQ1	SEQ ID NO.5
N-R	CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG	SEQ ID NO.6
			E_Sarbeco_F(ROX)	ROX-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT	SEQ ID NO.7
E_Sarbeco_F(Dabcyl)	TTAACTATTAACGTACCTGT-Dabcyl	SEQ ID NO.8
			E_Sarbeco_R	ATATTGCAGCAGTACGCACACA	SEQ ID NO.9

3、PCR反应体系如下：

表2

反应物	浓度
		去离子水	5.5微升
PCR反应缓冲液	12.5微升
		DNA模板	5微升
上游双链引物探针(10微摩尔/L)	1微升
		下游引物(10微摩尔/L)	1微升

4、试剂准备

4.1、提前10～15分钟从-20℃冰箱中取出试剂盒，并取出试剂。

4.2、取出适当容积的无菌EP管，并做好相应标记。加入表2所示的试剂(去离子水、PCR反应缓冲液、上游双链引物探针、下游引物)，混匀后瞬时离心。

4.3、取出无菌的0.2mL PCR反应管，并做好相应标记，按照20μL/管分装量进行分装。

4.4、盖紧PCR反应管盖后将PCR反应管转移至样本准备区。剩余试剂放回-20℃冰箱冷冻保存。

4.5、打开PCR反应管盖，每管加入DNA模板5μL，盖好PCR反应管，将PCR反应液与样本模板振荡混匀后瞬时离心，并记录DNA模板加样顺序。

5、扩增程序、荧光采集和结果分析

采用CFX96荧光定量PCR仪在FAM通道下对荧光信号进行采集，PCR扩增程序如下：

表3

二、实验及结果分析

2.1、图2A和2B显示了链置换反应产率和ΔG₀之间关系的Matlab代码。然后用NUPACK估算了这三对双链引物探针介导的链置换反应在不同温度下的ΔG₀(见图2C)。PCR的盐浓度设置条件为50mM Na⁺，1.5mM Mg²⁺。

上述结果表明，在57～63℃的温度下，双链引物可以结合模板并引起聚合酶延伸。

2.2、图3显示了NUPACK模拟的三对双链引物探针和相应的互补模板之间的二级结构。

如图3所示，正义引物显示淬灭基团和荧光基团标记的寡核苷酸之间形成稳定的双链结构，而反义引物之间不存在非特异性杂交。

2.3、进一步研究针对ORF1ab、N和E基因的三对双链引物探针在一个反应管中的熔解曲线，结果如图4所示，对ORF1ab(A和B)、N(C和D)和E(E和F)基因的双链引物探针的熔化温度分别为53.5、64.0和55℃。

从图4可以看出，在较低温度下，双链引物探针形成稳定的双链结构；随着温度的升高，双链逐渐分离导致荧光信号增强；当温度进一步升高时，荧光信号减弱，这是由于高温提高了淬灭基团与荧光基团之间的碰撞几率。

2.4、为了显示上述三对双链引物探针对退火温度的兼容性，在57-63℃的退火温度范围内(温度区间设置为2℃)进行梯度PCR，25bp DNA标记(自下而上：25、50、75、100、150、200、300、400、500bp)。然后用12％的非变性PAGE电泳分析PCR产物。如图5(A-C)所示，在57-63℃退火温度下，均出现了扩增条带为119、99、113bp的ORF1ab、E、N基因扩增产物。上述结果表明，本发明的三对双链引物探针在较宽的温度范围内具有很好的相容性。

PCR扩增产物的熔解曲线如图5(D至I)所示。ORF1ab、N和E基因扩增产物的熔解曲线有明显的差异。PCR结束时，PCR产物由不同长度的未扩增双链引物、过量淬灭链和荧光标记的双链PCR产物组成。对于ORF1ab基因产物的熔解曲线(FAM通道)，随着温度从50℃升高到60℃，双链引物首先解链并产生其特有的峰。此时，双链引物完全解链形成单链核酸链。当温度为60～80℃时，FAM标记的PCR产物开始解链，过量的淬火标记引物与FAM标记的链杂交，导致荧光强度下降。当温度超过80℃时，FAM基团标记的双链结构发生解链，导致荧光增强。当温度超过80℃时，由于高温增强了淬灭剂与荧光基团的碰撞，荧光强度降低。

与ORF1ab基因的PCR产物熔解曲线完全不同，N(HEX)和E(ROX)基因PCR产物熔解曲线则相对简单。荧光信号首先由于双链引物的熔解而增强，然后荧光信号减弱，可能是由于以下两个原因：过量淬灭基团标记的引物阻断荧光信号，分子碰撞导致荧光淬灭。上述结果提示熔解过程是一个伴随着解链和再杂交的复杂过程，每个步骤可能有不同反应不同程度的参与。

2.5、为评估本发明的双链引物探针多重荧光定量PCR检测方法对SARS-COV-2病毒的检测性能，使用本发明方法对系列不同浓度的质粒进行检测，结果如图6所示。

从图6可知，三对双链引物探针的Ct值与阳性质粒浓度的对数在4.0*E6、4.0*E5、4.0*E4和4.0*E3拷贝/mL范围内均表现出良好的相关性。上述结果表明，本发明方法对实际样品中SARS-COV-2的检测具有潜在的应用价值。

综上所述，本发明采用了一种新的、简便的双链引物探针介导的多重聚合酶链反应用来检测SARS-COV-2。本发明设计的双链引物探针温度兼容性好，且便于新用户操作。与现有基于Taqman探针的RT-PCR方法相比，本发明基于双链引物的独特设计避免了复杂的探针设计，将引物和探针整合成一个整体，简化了反应体系的复杂程度和多靶标分析的巨大潜力。利用双链引物提高模板和引物结合的阈值，严格保证了PCR的特异性。这种基于链置换反应的多重PCR方法将特别适用于SARS-COV-2病毒RNA的多靶标多通道的同时检测。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南医科大学附属中医医院

<120> 一种检测SARS-COV-2的双链引物探针、试剂盒及多重PCR方法

<130> PCQXN204784

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ORF1ab-F(FAM)

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ccctgtgggt tttacactta a 21

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ORF1ab-F(BHQ1)

<400> 2

tgtaaaaccc acaggg 16

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ORF1ab-R

<400> 3

acgattgtgc atcagctga 19

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> N-F(HEX)

<400> 4

ggggaacttc tcctgctaga at 22

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<212> DNA

<213> Artificial

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agcaggagaa gttcccc 17

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<212> DNA

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cagacatttt gctctcaagc tg 22

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ttaactatta acgtacctgt 20

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> E_Sarbeco_R

<400> 9

atattgcagc agtacgcaca ca 22

Claims (10)

1.一种检测SARS-COV-2的多重荧光定量PCR双链引物探针，其特征在于，所述双链引物探针包括用于检测SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因序列的特异性引物探针，其中，针对ORF1ab基因序列的特异性引物探针序列如下：

上游双链引物探针的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，

下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；

针对N基因序列的特异性引物探针序列如下：

上游双链引物探针的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，

下游引物的序列如SEQ ID NO.6所示；

针对E基因序列的特异性引物探针序列如下：

上游双链引物探针的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，

下游引物的序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的双链引物探针，其特征在于：所述荧光探针的5’端均连接有荧光基团，所述荧光探针的3’端均连接有淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的双链引物探针，其特征在于：所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX中的任意一种，所述淬灭基团选自BHQ1、Dabcyl中的任意一种。

4.一种检测SARS-COV-2的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有如权利要求1-3任一项所述的双链引物探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述上游双链引物探针和下游引物的浓度均为10μM。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品为包含SARS-COV-2病毒ORF、E和N基因的质粒，阴性对照品为去离子水。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体系为：去离子水5.5μL，PCR反应缓冲液12.5μL，DNA模板5μL，上游双链引物探针10uM、1μL，下游引物10μM、1μL；

和/或，所述试剂盒进行荧光定量PCR的扩增程序为：

逆转录，55℃，持续时间10min；

预变性，95℃，持续时间3min；

变性，95℃，持续时间15s，循环数50个；

退火，57℃，持续时间15s，循环数50个；

延伸，72℃，持续时间15s，循环数50个；

荧光收集，45℃，持续时间5s，循环数50个。

9.一种检测SARS-COV-2的双链引物探针多重荧光定量PCR方法，其特征在于：从样本中提取SARS-COV-2病毒，采用如权利要求4-8任一项所述的试剂盒，同时扩增SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因，然后对扩增产物进行多重荧光定量PCR检测。

10.根据权利要求9所述的多重荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将如第二方面所述的试剂盒中的试剂混匀后瞬时离心，得到PCR反应液，将PCR反应液分装至PCR反应管中；

(2)将DNA模板加入PCR反应管中，将PCR反应液与DNA模板振荡混匀后瞬时离心，并记录DNA模板加样顺序；

(3)同时扩增SARS-COV-2病毒的ORF1ab、N和E基因，然后对扩增产物进行多重荧光定量PCR检测，收集荧光信号。

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