CN101638685B - 交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明是涉及对核酸序列新的扩增技术，更具体地说，涉及利用交叉引物恒温扩增靶核酸序列的方法。本发明还涉及了在扩增反应中标记扩增靶核酸序列的方法及靶核酸序列的快速检测方法。本发明还涉及了在快速核酸诊断方面的试剂盒及其在细菌和病毒等病原微生物的核酸检测方面的应用，以及在人类遗传性疾病相关的基因诊断应用。

Description

交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及对核酸序列新的扩增技术，更具体地说，涉及利用交叉引物恒温扩增靶核酸序列的方法。本发明还涉及了在扩增反应中标记扩增靶核酸序列的方法及靶核酸序列的快速检测方法。

本发明还涉及了在快速核酸诊断方面的试剂盒及其在细菌和病毒等病原微生物的核酸检测方面的应用，以及在人类遗传性疾病相关的基因诊断应用。

背景技术

近30年来，全球流行病趋势表明，难培养和不能培养的病原微生物已经成为传染性和感染性疾病的主要根源。一些常规的病原菌检测方法(例如，大量增殖菌数、菌落纯化分离、外部形态结构和生理生化鉴定以及血清学鉴定等)由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之处，已经越来越跟不上人类对致病微生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。因此，在分子生物学水平上来研究这些病原菌的核酸结构和分子特征，将对那些难以人工培养和不能人工培养的病原微生物进行正确地鉴定起到重要作用，可以大大提高对病原菌的检测和研究能力。目前，高度敏感、高度特异的核酸扩增技术可以直接检测临床标本，在较短时间内得出结果，在感染性疾病的诊断中应用越来越广泛，并有逐步替代传统的细菌或病毒培养的趋势。

聚合酶链反应(PCR)技术是目前最成熟的核酸扩增技术，自它问世以来，该技术就得到了极为广泛的应用和发展。目前，体外核酸扩增技术可分为两大类，一类如聚合酶链反应技术(PCR)、连接酶链式反应(ligase chainreaction，LCR)和转录依赖的扩增系统(transcription based amplificationsystem，TAS)等，这类技术的共同特点是均要进行几个保温点的循环。第二类是恒温扩增系统，如链置换扩增技术(strand displacementamplification，SDA)，核酸序列扩增技术(Nucleic Acid Sequence BasedAmplification，NASBA)，转录酶扩增技术(Transcription MediatedAmplification，TMA)，滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)，连环恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，解链酶扩增技术(Helicase Dependent Amplification，HDA)等。这类技术的共同特点是扩增反应均在一个特定温度下进行，从而大大降低了对仪器的要求。

由于目前各种体外核酸扩增技术大多需要与电泳、荧光、质谱法或直接测序等方法结合来进行检测。这些方法大多操作复杂、价格昂贵，而且都是以大型的仪器设备和熟练的专业技能为前提的检测技术，因此并不适合于在基层医院进行广泛的应用和推广。本发明是结合了先进的恒温核酸扩增技术和核酸试纸条快速检测技术而发明的一种操作简单、时间短、价格低廉的检测技术。可以广泛地应用于所有与病原体检测等相关领域。下面就现有的主要的几种扩增检测技术进行概述。

1、聚合酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)

聚合酶链式反应是应用一对寡核苷酸引物结合到正负链上的靶序列两侧，从而酶促合成多个拷贝的靶序列DNA片段。PCR的每一循环都包括DNA变性，引物复性和由DNA聚合酶催化的延伸反应。每次循环新合成的DNA片段又可成为下次循环的模板，这就导致靶序列DNA的指数扩增。目前，PCR技术被广泛的应用到生物技术的各个方面。例如，对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估；对细菌、病毒及霉菌感染的诊断；用于亲子关系的鉴定等。

2、连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR)

连接酶反应是基于Taq连接酶的连接能力的特异性，为了检出靶基因序列中的点突变而设计的。连接酶反应识别点突变的特异性高于PCR，若靶序列有点突变，则引物不能与靶序列精确结合，缺口附近的核苷酸空间结构发生变化，则连接反应不能进行，也就不能产生扩增产物。目前该方法主要用于点突变的研究与检测，如单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定和癌基因的点突变研究等。

3、滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)

滚环复制技术分为线性和指数扩增两种。线性滚环复制只适用于环状核酸的扩增，其产物是具有大量与环状DNA互补的重复序列的DNA单链。线性滚环复制非常适合于固相形式的微阵列的特异信号的检测。指数滚环复制时，扩增产物也作为模板参与反应，因此能使得产物呈指数递增。同时指数滚环复制也可用于非环状DNA的扩增。滚环复制技术特异性很高，可用于突变与SNP的检测，若与荧光实时检测系统结合起来，其应用前景将是很广的。

4、转录酶扩增技术(Transcription Mediated Amplification，TMA)

转录酶扩增技术是一种在逆转录酶和T7 RNA多聚酶的共同作用下，在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统。其扩增原理为目标序列在逆转录酶作用下，以引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成双链的DNA，并在T7 RNA多聚酶作用下，转录出成千上万个目标RNA序列，这些RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。该方法特异性强，灵敏度高，反应条件简单，扩增效率高，无需专门的扩增仪器，且因整个反应在1个试管中进行，也减少了污染。

5、依赖核酸序列扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)

依赖核酸序列的扩增，又称自主序列复制系统(self-sustained sequencereplication，3SR)，主要用于RNA的检测。该反应有赖于逆转录酶，T7 RNA多聚酶和核酸酶H，以及两条特殊的引物共同协作完成。引物I的3’末端与靶序列互补，5’端含T7 RNA多聚酶启动子，用于合成cDNA。引物II的序列则与cDNA的5’未端互补。反应时，引物I先与RNA模板结合，在逆转录酶的作用下催化合成cDNA，再由核酸酶H水解cDNA上的RNA，形成一条单链的DNA；引物II与此cDNA的5’未端结合，并在逆转录酶的作用下合成第二条DNA链。这样形成的DNA双链含有T7 RNA多聚酶的启动子。逆转录酶再以此DNA为模板，转录出与样品RNA序列相同的新的RNA链。每条新的RNA又可作为模板合成cDNA，如此反复进行，将获得更多的RNA和cDNA。

NASBA操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环，同时由于外来双链DNA无启动子序列，不能被扩增，这大大提高了反应的特异性。NASBA技术适于检测和定量分析特异性RNA，也可应用于扩增双链DNA，因此在临床上有比较广泛的应用。

6、链置换扩增技术(strand displacement amplification，SDA)

链置换扩增技术主要是依赖于限制性内切酶和DNA聚合酶两种酶的共同协作来完成。其过程主要包括单链DNA模板的准备、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段。链置换扩增的原理是先用含有限制性内切酶识别位点的引物与单链靶分子结合，在无外切酶活力的DNA聚合酶的作用下，形成具有半磷酸硫酸化位点的DNA双链。接着用限制性内切酶切割未保护的引物链，而被修饰的靶片段则保持不动。这时再由DNA聚合酶在切口处启动延伸并取代下游部分，又重新产生了一条新的可以被限制性内切酶打开切口的DNA单链，而靶DNA分子仍保持不动。这种打切口、聚合、取代的步骤不断循环反复，产生大量靶分子的互补链。链置换扩增灵敏性高，可快速扩增获得单链DNA分子，但由于其靶序列准备的复杂性和其结果检测手段的局限，限制了它的应用范围。

7、环介导恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)

DNA环介导的恒温扩增法主要由Bst大片段DNA聚合酶和两对特殊的内引物(FIP由F1C和F2组成；BIP由BIC和B2组成)、一对外引物(F3和B3)组成。FIP引物的F2序列与靶DNA上互补序列配对，启动循环链置换反应。F3引物与模板上的F3C区域互补，引起合成与模板DNA互补的双链，从而挤掉FIP引起的DNA单链。与此同时，BIP引物与被挤掉的这条单链杂交结合，形成的环状结构被打开，接着B3引物在BIP外侧进行碱基配对，在聚合酶的作用下形成新的互补链。被置换的单链DNA两端均存在互补序列，从而发生自我碱基配对，形成类似哑铃状的DNA结构。LAMP反应以此DNA结构为起始结构，进行再循环和延伸，靶DNA序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎一环结构的DNA。

LAMP反应特异性强、灵敏度高，利用LAMP方法检测病原微生物，不仅可以对反应结果进行定性，而且还可以通过利用焦磷酸镁沉淀的产生量与DNA的生成量之间的线性关系，对反应的DNA进行定量。同时LAMP反应实验装置简单可在恒温进行，因此仅需要普通水浴锅或者其他可以得到稳定热源的设备就可以。但是此方法需要使用肉眼或比浊仪来观测结果，而使用肉眼观察通常是不精确的，比浊仪则需要额外的投资。

8、转录依赖的扩增系统(transcription based amplification system，TAS)

转录依赖的扩增系统主要用于扩增RNA，它由逆转录酶，T7 RNA多聚酶和核酸酶H，以及两条特殊的引物共同协作完成。引物I的3’末端与待扩增RNA互补，其5’端有T7 RNA多聚酶的启动子信息。逆转录酶以引物I为起点合成cDNA；引物II与此cDNA的3’端互补合成cDNA第二链。T7 RNA多聚酶又以此双链DNA为模板，转录出与待扩增RNA一样的RNA，可作为下轮反应的模板。转录依赖的扩增系统的扩增效率高，特异性高但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和T7 RNA多聚酶，因此有待进一步研究。

9、解链酶扩增技术(Helicase Dependent Amplification，HDA)

HAD是模拟自然的DNA复制的方法，即利用一种解链酶使得DNA变性。因此，整个HAD反映能够在同一个温度下进行，从而起到优化合成并且不需要昂贵的耗电的热循环器。

本发明人发明的交叉引物扩增法是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计6种(三对)特异引物，引物尾端交叉互换序列，利用链置换DNA聚合酶(如，但不限于，Bst DNA polymerase)在恒温条件即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、多次温度循环等过程。

本发明的目的在于为人们提供一种操作简单，价格低廉的恒温核酸检测方法，从而使得有关的研究工作能在基层科研机构及医院的检验顺利开展。

发明内容

因此，本发明提供一种交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：

1)设计一对交叉扩增引物和一对剥离引物；

2)在扩增靶核酸序列的两端引入交叉引物杂交位点和产生固定末端，为快速扩增准备模板；

3)以线性结构和/或二级结构的方式进行扩增，通过引物的反复杂交、延伸和扩增产物的自我杂交折叠及延伸，产生多个引物杂交位点，使同一条模板上可有多个扩增反应同时进行。

另一方面，本发明提供一种检测引物扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：

1)设计一对交叉扩增引物和一对剥离引物；

2)在扩增靶核酸序列的两端引入交叉引物杂交位点和产生固定末端，为快速扩增准备模板；

3)以线性结构和/或二级结构的方式进行扩增，通过引物的反复杂交、延伸和扩增产物的自我杂交折叠及延伸，产生多个引物杂交位点，使同一条模板上可有多个扩增反应同时进行；和

4)设计一对检测引物，以扩增阶段产生的大量含有检测序列的扩增产物为模板，用检测引物合成可被检测的双重标记的DNA双链分子。

另一方面，本发明提供一种靶核酸序列的快速检测方法，其包括以下步骤：

1)设计一对交叉扩增引物和一对剥离引物；

2)在扩增靶核酸序列的两端引入交叉引物杂交位点和产生固定末端，为快速扩增准备模板；

3)以线性结构和/或二级结构的方式进行扩增，通过引物的反复杂交、延伸和扩增产物的自我杂交折叠及延伸，产生多个引物杂交位点，使同一条模板上可有多个扩增反应同时进行；

4)设计一对检测引物，以扩增阶段产生的大量含有检测序列的扩增产物为模板，用检测引物合成可被检测的双重标记的DNA双链分子；和

5)用核酸检测试纸条检测扩增产物。

另一方面，本发明提供快速核酸检测靶核酸序列的试剂盒。

另一方面，本发明提供上述试剂盒在细菌和病毒等病原微生物的核酸检测和在人类遗传性疾病相关的基因诊断中的用途。

附图说明

图1A说明了引物设计过程，交叉扩增引物、剥离引物和检测引物的位置；

图1B说明了引物设计过程，交叉扩增引物、剥离引物和检测引物的序列安排；

图1C说明了引物设计过程，交叉扩增引物、剥离引物和检测引物的序列设计；

图2，图2A及图2B图2C说明了，交叉引物扩增靶核酸序列的方法原理，包括起动阶段，扩增阶段，其中：

图2为交叉引物恒温扩增法原理图解一，属起动阶段，表述了交叉引物杂交位点及固定末端的产生；

图2a为图2的图例；

图2A为交叉引物恒温扩增法原理图解二A，属扩增阶段，表述了线性结构，多个引物杂交位点的产生；

图2B为交叉引物恒温扩增法原理图解二B，属扩增阶段，表述了二级结构，自我杂交折叠及延伸；

图3为交叉引物恒温扩增法原理图解三。说明了可检测产物的产生原理。属检测引物阶段，表述了双重标记产物用于检测；

图4为交叉引物恒温扩增法检测原理图解，说明了用核酸检测试纸条检测扩增产物的原理，双重标记的扩增终产物的试纸条检测；

图5显示了不同反应时间的电泳结果；

图6显示了不同反应温度下的电泳结果；

图7显示了不同交叉扩增引物浓度的电泳结果；

图8显示了不同Mg²⁺浓度下的电泳结果；

图9显示了试纸条检测扩增产物的结果；

具体实施方式

因此，本发明提供一种交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：

1)设计一对交叉扩增引物和一对剥离引物；

2)在扩增靶核酸序列的两端引入交叉引物杂交位点和产生固定末端，为快速扩增准备模板；

3)以线性结构和/或二级结构的方式进行扩增，通过引物的反复杂交、延伸和扩增产物的自我杂交折叠及延伸，产生多个引物杂交位点，使同一条模板上可有多个扩增反应同时进行。

更具体地，本发明提供一种利用交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：

1)设计一对交叉扩增引物和一对剥离引物，其包括：

a)设计一对交叉扩增引物，交叉扩增引物F和交叉扩增引物R，交叉扩增引物F和交叉扩增引物R主要由杂交序列、连接区域和互换序列三部分组成；

b)设计一对剥离引物，剥离引物F和剥离引物R，剥离引物F为正向外引物，与靶基因的反义链完全互补，剥离引物R为反向外引物，与靶基因的正义链完全互补；

2)在扩增靶核酸序列的两端引入交叉引物杂交位点和产生固定末端，为快速扩增准备模板，其包括：

a)使正向扩增引物F与核酸靶分子杂交，其中所述正向引物F的5’末端带有反向引物R的杂交识别序列；

b)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸正向扩增引物F，合成双链核酸；

c)使正向剥离引物F与核酸靶分子杂交；

d)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸剥离引物F，剥离正向扩增引物F的延伸链，由此产生固定的正向链5’末端；

e)用被剥离的扩增引物延伸链作为模板，与反向扩增引物R杂交，其中所述反向引物R的5’末端带有正向引物F的杂交识别序列；

f)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸反向扩增引物R，合成双链核酸；

g)使反向剥离引物R与核酸靶分子杂交；

h)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸剥离引物R，剥离反向扩增引物R的延伸链，由此产生固定的反向链5’末端，此时产生的反向扩增引物R延伸链两端已经固定，并在3’和5’末端分别引入扩增引物F和R的杂交序列，用作快速扩增的模板(如图2，图2a所示)；

3)以线性结构和/或二级结构的方式进行扩增，通过引物的反复杂交、延伸和扩增产物的自我杂交折叠及延伸，产生多个引物杂交位点，使同一条模板上可有多个扩增反应同时进行，位于后方的引物延伸依次剥离前方引物的延伸链，而被剥离的延伸链又可作为模板参与下一轮的扩增，从而大大地提高了扩增速度。

在本发明的说明书中，所使用的技术术语具有如下含义：

“交叉扩增引物”是指用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5’末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5’末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引入对方的杂交序列，增加引物的杂交位点，促进扩增反应。

用于本发明的交叉扩增引物为人工合成的单链寡核苷酸。

“剥离引物”是指位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸链从模板上剥离。

用于本发明的剥离引物为人工合成的单链寡核苷酸。

“检测引物”是指用生物素或半抗原标记短链引物，其作用是使扩增产物带有标记，以用于检测。

用于本发明的检测引物为人工合成的单链寡核苷酸。

“半抗原”是指用于标记检测引物的化学物质，它们与相应的抗体特异性地结合，用于检测扩增产物。常见的半抗原如荧光染料等。此外，生物素和亲和素由于其高度特异的结合能力，也常用于此目的。

用于本发明的半抗原为荧光染料和/或生物素。

在优选实施方案中，本发明提供利用交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其中，交叉扩增引物F和交叉扩增引物R主要由三部分组成：

a)杂交序列是与模板特异性杂交用于扩增延伸的碱基序列；

b)连接区域用于引物上两个不同序列的连接，通常为一至三个单核苷酸；

c)互换序列，即交叉扩增引物F的杂交序列用来作为交叉扩增引物R的5’末端序列，反之，交叉扩增引物R的杂交序列用来作为交叉扩增引物F的5’末端序列；

剥离引物F和R主要是用于恒温扩增反应起动阶段剥离交叉扩增引物的延长链；

检测引物F与检测引物R分别用不同的半抗原标记，用该对引物扩增的产物将带有双重抗原标记，用于检测。

引物的设计及各引物的位置如图1A，图1B和图1C所示。

在另一项优选实施方案中，本发明提供利用交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其中扩增阶段以线性结构方式进行扩增引物每次延伸都会引入一个新的引物杂交序列，扩增产物会随着每轮扩增而延长；另一方面，由于短链产物的合成速度较快，引物杂交的机会较多，最终产物大部分为短链产物。

因此，交叉引物扩增法的产物是不同长度扩增物的混合物，其中长链扩增物为进一步扩增提供多重引物杂交位点，提高扩增速度；短链扩增物是最终被检测的主要对象(参见附图2A)。

在另一项优选实施方案中，本发明提供利用交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其中扩增阶段以二级结构方式进行，由于长链扩增物带有多个重复互补的序列，扩增物将自我折叠形成各种复杂的二级结构，其中一些能够自我延伸，使产物更长，结构更复杂；另一些二级结构的单链部分可供引物杂交，合成新的产物。

在更优选的实施方案中，本发明提供利用交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其中扩增阶段以线性结构和二级结构混合的方式进行，线性结构与二级结构可互变，单链的线性结构和二级结构分子还可通过杂交而相互交联，形成巨大的DNA杂交复合物。

因此交叉引物扩增法的产物非常复杂，表现在凝胶电泳图上，可见许多长短不一的条带，特大的DNA杂交复合物可停留在点样孔中而不泳动(参见附图2B，以及图5-8)。

另一方面，本发明提供利用检测引物标记靶核酸序列的方法，其包括：

本发明的上述利用交叉引物扩增靶核酸序列的方法的步骤1)-3)，和

4)设计一对检测引物，检测引物F与检测引物R，检测引物R为反向内侧引物，与靶基因的正义链完全互补；检测引物F为正向内侧引物，与靶基因的反义链完全互补；以扩增阶段产生的大量含有检测序列的扩增产物为模板，检测引物合成可被检测的双重标记的DNA双链分子。

此类双重标记的DNA双链分子大多为较短的扩增终产物，但较大的扩增产物以及特大的DNA杂交复合物均含有检测引物的杂交位点，可通过与检测引物杂交而获得双重标记，因而可被检测(参见附图3)。

另一方面，本发明提供利用核酸试纸条检测靶核酸序列的方法，其包括：本发明的上述利用检测引物标记靶核酸序列的方法的步骤1)-4)，和

5)用核酸检测试纸条检测扩增产物。

用本发明的利用检测引物标记的靶核酸序列的方法获得的双重标记的靶核酸序列的扩增产物可通过常见的琼脂糖凝胶电泳或核酸检测试纸条进行检测。核酸检测试纸条的检测原理参见附图4。

用于本发明的核酸扩增物检测试纸条的具体信息参见本发明人的另一项发明专利申请CN1811447A(申请号200610003429.1)。

另一方面，根据本发明的优选实施方案，在交叉引物恒温扩增靶核酸序列的方法中，所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶，VentDNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。

根据本发明的更优选实施方案，在交叉引物恒温扩增靶核酸序列的方法中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶。

根据本发明的更优选实施方案，在交叉引物恒温扩增靶核酸序列的方法中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

另一方面，根据本发明的优选实施方案，在用于扩增靶核酸序列的试剂盒中，  所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。

根据本发明的更优选实施方案，在用于扩增靶核酸序列的试剂盒中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶。

根据本发明的更优选实施方案，在用于扩增靶核酸序列的试剂盒中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

在另一项实施方案中，本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒在检测病原微生物、环境微生物或微生物分型中的用途。

在另一项实施方案中，本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒在检测人类、动物或植物传染病病原体中的用途。

在另一项实施方案中，本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒在检测食品或生物武器中传染病病原体的用途。

在另一项实施方案中，本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒在检测人类遗传病或健康风险基因及其评估的用途。

本发明的突出的有益效果是能利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在恒温条件(62℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。能够快速有效的进行核酸的快速扩增。只需要一个简单的恒温装置即可完成所有的扩增过程，极大的降低了对仪器的要求。同时本发明还可以结合我们原有的核酸检测试纸条发明专利，进而开发出一种新的快速核酸检测的方法。进而使得整个扩增过程以及检测过程快速简便，不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳等过程。本发明以其特异、简单、快捷的特性可以获得很广泛的应用，如：

1.与直接相关的人类遗传性疾病的分子诊断；

2.病原体微生物的检测；

3.对肿瘤癌症的诊断及预后的评估；

4.某些微生物的分型。

以下实施例举例说明本发明的检测方法及其检测效果。实施例仅用来举例，并不构成对本发明保护范围的任何限制，本发明的保护范围在权利要求书中说明。

实施例

实施例1沙眼衣原体的检测

自20世纪90年代以来，沙眼衣原体成为超过淋球菌成为泌尿生殖道感染性疾病最常见的致病菌。随着沙眼衣原体感染及其并发症的发病率逐渐升高，它已经成为人类生殖健康越来越大的威胁。1995年世界卫生组织估计全球有9千万沙眼衣原体患者，仅次于HIV的感染。因此实现对沙眼衣原体的快速诊断，有着重要的意义。应用本专利就可对沙眼衣原体的病毒的DNA实现快速检测。其相关引物的具体设计如下：我们在沙眼衣原体的DNA序列上选择所要扩增的基因片段，并且根据序列设计特异性的引物。反应体系如下：

剥离引物F和R              各0.05微摩尔每升

交叉扩增引物F和R          各0.4微摩尔每升

检测引物F和R              各0.2微摩尔每升

dNTP：                    0.4毫摩尔每升

Thermopol buffer(10×)    2微升

MgSO₄                     8毫摩尔每升

甜菜碱                    1摩尔每升

Bst DNA聚合酶             8单位

反应总体积共20微升。

在上述反应体系中，在其它条件设定不变的情况下，分别改变反应时间、反应温度、交叉扩增引物F和R的浓度和镁离子浓度，进行一系列试验，试验结果显示于以下附图中。

附图5显示了在其他条件完全一致的情况下，不同反应时间的电泳图。泳道2-9的反应时间分别为66分钟，68分钟，70分钟，72分钟，74分钟，76分钟，78分钟和80分钟。信号呈梯度增强。泳道1为DNA分子量标准物。显然最佳的反应时间为80分钟。附图6显示了在其他反应条件完全一致的情况下，不同反应温度结果的电泳图。泳道1为DNA分子量标准物，泳道2-7的反应温度分别是56℃，58℃，60℃，62℃，64℃和66℃。当温度小于60℃时，随着温度的升高，信号也随着增强；当温度高于60℃时，随着温度的升高，信号随着减弱。从上述结果可知，最佳的反应温度为60℃。附图7显示了在其他反应条件完全一致的情况下，不同交叉扩增引物F和R浓度的反应结果的电泳图。泳道1为DNA分子量标准物，泳道10为阴性对照，泳道2-9的交叉扩增引物F和R浓度分别0.8微摩尔每升，0.7微摩尔每升，0.6微摩尔每升，0.5微摩尔每升，0.4微摩尔每升，0.3微摩尔每升，0.2微摩尔每升，0.1微摩尔每升。交叉引物浓度在0.4微摩尔每升的时候信号最强，而当引物浓度高于0.4微摩尔每升时，随着引物浓度的下降，信号也随着增强；而引物浓度低于0.4微摩尔每升时，随着引物浓度的下降，信号也随着下降，因而最佳的扩增引物浓度为0.4微摩尔每升。附图8显示了在其他反应条件完全一致的情况下，不同Mg²⁺浓度的反应结果电泳图。泳道1为DNA分子量标准物。泳道2-7的Mg²⁺浓度分别为：10毫摩尔每升，9毫摩尔每升，8毫摩尔每升，7毫摩尔每升，6毫摩尔每升，5毫摩尔每升。Mg²⁺浓度在8毫摩尔每升时，反应信号最强。而当Mg²⁺浓度高于8毫摩尔每升时，随着Mg²⁺浓度的下降，信号也随着增强；而引物浓度低于8毫摩尔每升时，随着Mg²⁺浓度的下降，信号也随着下降。显然，最佳的Mg²⁺浓度为8毫摩尔每升。图9显示了试纸条检测扩增产物的结果。

Claims (10)

1.一种用于非诊断目的交叉引物扩增靶核酸序列的方法，其特征为包括以下步骤：

1)设计一对交叉扩增引物和一对剥离引物，其包括：

a)设计一对交叉扩增引物，交叉扩增引物F和交叉扩增引物R，交叉扩增引物F和交叉扩增引物R由杂交序列、连接区域和互换序列三部分组成；其中，杂交序列是与模板特异性杂交用于扩增延伸的碱基序列；连接区域用于引物上两个不同序列的连接，为一至三个单核苷酸；互换序列，即交叉扩增引物F的杂交序列用来作为交叉扩增引物R的5’末端序列，反之，交叉扩增引物R的杂交序列用来作为交叉扩增引物F的5’末端序列；和

b)设计一对剥离引物，剥离引物F和剥离引物R，剥离引物F为正向外引物，与靶基因的反义链完全互补，剥离引物R为反向外引物，与靶基因的正义链完全互补；

2)在扩增靶核酸序列的两端引入交叉引物杂交位点和产生固定末端，为快速扩增准备模板，其包括：

a)使交叉扩增引物F与核酸靶分子杂交，其中所述交叉扩增引物F的5’末端带有交叉扩增引物R的杂交序列；

b)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸交叉扩增引物F，合成双链核酸；

c)使正向剥离引物F与核酸靶分子杂交；

d)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸剥离引物F，剥离交叉扩增引物F的延伸链，由此产生固定的正向链5’末端；

e)使用被剥离的扩增引物延伸链作为模板，与交叉扩增引物R杂交，其中所述交叉扩增引物R的5’末端带有交叉扩增引物F的杂交识别序列；

f)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸交叉扩增引物R，合成双链核酸；

g)使反向剥离引物R与核酸靶分子杂交；

h)用具备剥离功能的DNA聚合酶延伸剥离引物R，剥离交叉扩增引物R的延伸链，由此产生固定的反向链5’末端，此时产生的交叉扩增引物R延伸链两端已经固定，并在3’和5’末端分别引入交叉扩增引物F和R的杂交序列，用作快速扩增的模板；和

3)以线性结构和/或二级结构的方式进行扩增，通过引物的反复杂交、延伸和扩增产物的自我杂交折叠及延伸，产生多个引物杂交位点，使同一条模板上可有多个扩增反应同时进行，位于后方的引物延伸依次剥离前方引物的延伸链，而被剥离的延伸链又可作为模板参与下一轮的扩增，从而大大地提高了扩增速度。

2.一种用于非诊断目的检测引物扩增靶核酸序列的方法，其特征为包括以下步骤：

权利要求1所述的步骤1)-3)；

4)设计一对检测引物，检测引物F与检测引物R，检测引物R为反向内侧引物，与靶基因的正义链完全互补；检测引物F为正向内侧引物，与靶基因的反义链完全互补；以扩增阶段产生的大量含有检测序列的扩增产物为模板，用检测引物合成可被检测的双重标记的DNA双链分子。

3.一种用于非诊断目的核酸试纸条检测靶核酸序列的方法，其特征为包括：

权利要求2所述的步骤1)-4)；

5)用核酸检测试纸条检测扩增产物。

4.权利要求1-3的任何一项的方法，其特征为其中扩增阶段以线性结构方式进行，扩增引物每次延伸都会引入一个新的引物杂交序列，扩增产物会随着每轮扩增而延长；另一方面，由于短链产物的合成速度较快，引物杂交的机会较多，最终产物大部分为短链产物。

5.权利要求1-3的任何一项的方法，其特征为其中扩增阶段以二级结构方式进行，由于长链扩增物带有多个重复互补的序列，扩增物将自我折叠形成各种复杂的二级结构，其中一些能够自我延伸，使产物更长，结构更复杂；另一些二级结构的单链部分可供引物杂交，合成新的产物。

6.权利要求1-3的任何一项的方法，其特征为其中扩增阶段以线性结构和二级结构混合的方式进行，线性结构与二级结构可互变，单链的线性结构和二级结构分子还可通过杂交而相互交联，形成巨大的DNA杂交复合物。

7.权利要求2或3的任何一项的方法，其特征为其中检测引物F和R分别用不同的半抗原标记，该对引物扩增的产物将带有双重抗原标记，用于检测。

8.权利要求1-3的任何一项的方法，其特征为其中所述的DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或Phi29DNA聚合酶。

9.用于权利要求1-3中任一项的方法的扩增靶核酸序列的试剂盒，其特征为其中所述核酸为DNA。

10.权利要求9所述的试剂盒，其特征为其中所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶或Phi29DNA聚合酶。

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