CN109666749A

CN109666749A - 一种检测鲍曼不动杆菌的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN109666749A
Application number: CN201811152404.7A
Authority: CN
Inventors: 谢轶; 赖红锦; 严淳议; 巫丽娟; 戴仲秋
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2018-09-29
Filing date: 2018-09-29
Publication date: 2019-04-23

Abstract

本发明公开了一种用于鲍曼不动杆菌检测的试剂盒，它利用交叉引物恒温扩增技术(Cross‑Priming Amplification,CPA)，在固定温度下实现鲍曼不动杆菌的检测，免去了对温度程序化控制的依赖，不需要昂贵的PCR仪，因此大大降低了检测成本。本发明提供的检测方法可以准确而低成本地检测出鲍曼不动杆菌的存在，适合在医院推广。

Description

一种检测鲍曼不动杆菌的试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及医学检测领域，尤其涉及一种鲍曼不动杆菌的检测方法。

背景知识

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是医院感染的重要病原体。由于它携带多个耐药基因的移动元件，可快速获得多重耐药，它的感染率、耐药率及临床致死率正在日益上升。在各医院普及鲍曼不动杆菌的检测已迫在眉睫。

目前检测鲍曼不动杆菌的检测思路多为基因检测，具体的方法为常规聚合酶链式反应(PCR)或荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)。PCR需要用到昂贵的PCR仪，对一些条件有限的医疗机构来说很难实现。qPCR用到的PCR仪比普通的PCR仪更昂贵，成本更高，更难普及。

交叉引物恒温扩增技术(Cross-Priming Amplification,CPA)是一种恒温条件下的DNA扩增技术。它基于一种特殊的具有链置换活性的酶，Bst DNA聚合酶，通过5-6条特殊的引物，可在恒温条件快速完成扩增，免去了PCR仪的成本。其检测可以不依赖有毒核酸染料，操作更加方便安全。但是目前还没有将CPA技术应用于鲍曼不动杆菌的检测。

基于CPA技术的分子检测手段，需要针对一段短至150-200bp的DNA序列设计一组CPA引物(一组引物5-6条，缺一不可)，对于目标DNA序列的碱基组成和理化特性(G/C碱基比例，各条引物退火温度等)要求极高，CPA引物设计难度极大，这是目前尚没有CPA技术用于鲍曼不动杆菌的检测的主要原因。

发明内容

为了解决上述问题，本发明以鲍曼不动杆菌OXA-23基因中一段长193bp的序列为靶点，提供了一种利用CPA技术检测鲍曼不动杆菌的方法。

本发明提供了一组引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示；

其中，SEQ ID NO.1名为F3，SEQ ID NO.2名为B3，SEQ ID NO.3名为CPR，SEQ IDNO.4名为DF5F，SEQ ID NO.1名为DF5B。

本发明还提供了一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：它包括SEQID NO.1-5所示的5条引物、Bst DNA聚合酶和对应的缓冲液。

本发明还提供了一种检测鲍曼不动杆菌的方法，其特征在于：它是采用前述试剂盒检测。

前述方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取样本DNA：取待检样品，提取其中的DNA；

(2)恒温扩增：用前述的试剂盒对待检样本和鲍曼不动杆菌DNA进行扩增；

(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测；

(4)结果判读：出现与鲍曼不动杆菌DNA扩增条带一致的条带，则判断样本为阳性。

前述方法，其特征在于：步骤(2)中的恒温扩增的温度为48-54℃。

进一步地，前述方法，其特征在于：步骤(2)中的恒温扩增的温度为50-52℃。

进一步地，前述方法，其特征在于：步骤(2)各引物浓度为：F3 0.25μM，B3 0.25μM，DF5F 0.4μM，DF5B 0.35μM，CPR 0.25μM。

进一步地，前述方法，其特征在于：步骤(2)中反应时间为40-80min。

前述方法，其特征在于：步骤(3)中的结果检测方法为：胶体金或常规琼脂糖凝胶电泳中的至少一种。

鲍曼不动杆菌基因组较为复杂，在目标DNA序列的选取、选定目标DNA后的引物设计等，多个环节均有着较大的技术难度。本研究最初设计了8组引物，通过生物信息学分析后，确定仅其中两组符合要求，两组引物合成后进行初筛，选择了一组作为最终确定使用的引物(5条)。

本发明提供的试剂盒和方法可以有效检测鲍曼不动杆菌，杜绝了普通PCR或定量PCR检测方法中对程序温控装置的需求，降低了成本。

使用本发明提供的方法，可用胶体金检测装置代替核酸电泳，杜绝了来自染料的污染，且结果呈现简单直观(装置如图1所示，其判读方式如图2所示)。

本发明成本低，使用方便，为检测鲍曼不动杆菌的全国普及提供了十分有利的条件。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1是核酸扩增胶体金物快速检测装置

图2是图1装置的示意图

图3是不同引物浓度及比例优化的电泳图。从左至右分别为1-24泳道。其中第2-23泳道依次为表2中1-11组的阴、阳性对照(相邻为一组)，如第2、3泳道分别为第一组引物浓度组合的阴、阳性对照，以此类推。第1、第24泳道为DL 2000DNA marker。

图4为最佳反应时间的电泳图。30min(1-2泳道),40min(3-4泳道),50min(5-6泳道),60min(7-8泳道)，70min(9-10泳道)，80min(11-12泳道)。每个时间梯度一组阴性对照，一组阳性模板，泳道13为DL 2000DNA Marker。

图5为最佳温度探索的电泳图。48℃(1-2泳道),50℃(3-4泳道),52℃(5-6泳道),54℃(7-8泳道)。奇数号泳道为阴性对照，偶数号泳道为阳性模板，泳道9为DL 2000DNAMarker。

图6为灵敏度测试的电泳图。从左至右依次为阴性对照，2.1×10^-2copy/μL，2.1×10^-1copy/μL，2.1×10⁰copy/μL，2.1×10¹copy/μL，2.1×10²copy/μL，2.1×10³copy/μL，2.1×10⁴copy/μL，2.1×10⁵copy/μL，DL 2000DNA Marker。

图7为特异性测试的电泳图。从左到右，1号泳道为金黄色葡萄球菌临床分离株；2号泳道为铜绿假单胞菌临床分离株；3号泳道为大肠杆菌临床分离株；4号泳道为肺炎克雷伯菌临床分离株；5号泳道为鲍曼不动杆菌临床分离株；6号泳道为鲍曼不动杆菌标准DNA模板；7号泳道为阴性对照；8号泳道为DL2000DNA marker

具体实施方式

实施例1鲍曼不动杆菌CPA引物设计与筛选

CPA是一种全新的核酸恒温扩增技术，在本发明之前，CPA技术从未在鲍曼不动杆菌中进行过应用。CPA引物设计与PCR或其他DNA扩增技术的引物设计并不相同，且鲍曼不动杆菌的并无相关文献或实验数据可以借鉴。

本发明最初手动设计了8组引物，通过分析确定仅其中两组符合要求(表1)，两组引物合成后进行实验初筛后，仅其中一组符合要求，选择了第一组作为最终确定使用的引物，目标序列位于OXA-23基因碱基序列的第507bp-699bp，该区域全长193bp。5条引物中的两条分别在5’端进行了荧光素Fitc和生物素Biotin标记，用于检测结果的判读。

表1引物列表

注：第二组引物组合为淘汰组，第一组引物组合为本发明涉及的引物。

实施例2鲍曼不动杆菌CPA检测法的不同引物浓度及比例的优化

1、材料及试剂

鲍曼不动杆菌临床分离株(华西医院实验医学科微生物室)。引物(合成自上海生工公司，序列见表1第一组)，Bst 2.0DNA聚合酶(购自NEB公司)，CPA反应产物核酸检测装置(购自成都纳比生物科技)，DNA凝胶回收试剂盒(购自北京擎科公司)，甜菜碱(购自上海生工公司)，PCR mix(购自北京擎科公司)。

2、方法

2.1标准DNA模板制备

煮沸裂解法，挑取1个菌落+0.5ml水，95℃10min，离心取上清液。PCR反应体系：1μL上清液，12.5μL PCR Mix，共2μL引物，9.5μL水。PCR条件：98℃2min；35次循环(98℃10s，60℃10s，72℃10s)；72℃2minPCR产物进行凝胶电泳后，按照DNA凝胶回收试剂盒说明书，提取DNA。将回收的DNA片段交由上海生工，将目标DNA片段装载到pUC57质粒上，转化至大肠杆菌甘油冷冻保存菌。带有OXA-23基因片段的pUC57质粒将作为本研究的标准阳性模板使用。

2.2恒温扩增

(1)CPA扩增反应体系

采用20μL反应体系，在PCR管中加入Bst DNA聚合酶8U； Reaction Buffer 2.0μL；dNTPs 0.4mM；MgSO4 3.0mM；甜菜碱0.25M；引物F3；引物B3；引物DF5F；引物DF5B；引物CPR；模板DNA40ng；ddH₂O补足体系至20μL。其中引物F3，引物B3，引物DF5F，引物DF5B，引物CPR采用不同的浓度比例(表2)。

表2引物浓度优化

(2)CPA扩增反应条件

反应物于温度52℃，恒温反应60min后，90℃灭活10min。

2.3 CPA扩增反应结果检测

取10μL CPA反应产物，加入2μL 6×loading buffer，混匀后取10μL加入混有溴化乙锭的2％的琼脂糖凝胶中，电泳30min后在凝胶成像系统上成像，电泳图片(图3)显示第四组呈现最亮的两条带，表明引物浓度配比扩增效果最好，即在20μL反应体系中F3 0.25μM，B3 0.25μM，DF5F 0.4μM，DF5B 0.35μM，CPR 0.25μM。

实施例3鲍曼不动杆菌CPA反应最佳时间探索

1、材料及试剂

同实施例2。

2、方法

2.1标准DNA模板制备

制备方法同实施例2。

2.2恒温扩增

(1)CPA扩增反应体系

采用20μL反应体系，在PCR管中加入Bst DNA聚合酶8U； Reaction Buffer 2.0μL；dNTPs 0.4mM；MgSO4 3.0mM；甜菜碱0.25M；引物F3 0.25μM；引物B3 0.25μM；引物DF5F 0.4μM；引物DF5B 0.35μM；引物CPR 0.25μM；模板DNA 40ng；ddH₂O补足体系至20μL。

(2)CPA扩增反应条件

反应物于温度52℃，分为六组，各组分别进行恒温反应30min,40min,50min,60min,70min,80min；恒温反应后各组均进行90℃灭活10min。

2.3 CPA扩增反应结果检测

取10μLCPA反应产物，加入2μL 6×loading buffer，混匀后取10μL加入混有溴化乙锭的2％的琼脂糖凝胶中，电泳30min后在凝胶成像系统上成像，电泳图片(图4)显示恒温反应70min组扩增效果最好。

实施例4鲍曼不动杆菌CPA检测法的最佳温度探索

1、材料及试剂

同实施例2。

2、方法

2.1标准DNA模板制备

制备方法同实施例2。

2.2恒温扩增

(1)CPA扩增反应体系

同实施例3。

(2)CPA扩增反应条件

反应物分为四组，分别于于温度48℃,50℃,52℃,54℃恒温反应70min后，90℃灭活10min。

2.3 CPA扩增反应结果检测

取10μLCPA反应产物，加入2μL 6×loading buffer，混匀后取10μL加入混有溴化乙锭的2％的琼脂糖凝胶中，电泳30min后在凝胶成像系统上成像，电泳图片(图5)显示52℃条件下恒温扩增效果最好。

实施例5鲍曼不动杆菌CPA检测法灵敏度探索

1、材料及试剂

同实施例2。

2、方法

2.1标准DNA模板制备

制备方法同实施例2。

2.2恒温扩增

(1)CPA扩增反应体系

采用20μL反应体系，在PCR管中加入Bst DNA聚合酶8U； Reaction Buffer 2.0μL；dNTPs 0.4mM；MgSO4 3.0mM；甜菜碱0.25M；引物F3 0.25μM；引物B3 0.25μM；引物DF5F 0.4μM；引物DF5B 0.35μM；引物CPR 0.25μM；模板DNA；ddH₂O补足体系至20μL。按模板DNA在反应体系中的不同浓度分为8组：2.1×10⁵copy/μL，2.1×10⁴copy/μL，2.1×10³copy/μL，2.1×10²copy/μL，2.1×10¹copy/μL，2.1×10⁰copy/μL，2.1×10^-1copy/μL，2.1×10^-2copy/μL。

(2)CPA扩增反应条件

反应物于温度52℃，恒温反应70min后，90℃灭活10min。

2.3CPA扩增反应结果检测

取10μLCPA反应产物，加入2μL 6×loading buffer，混匀后取10μL加入混有溴化乙锭的2％的琼脂糖凝胶中，电泳30min后在凝胶成像系统上成像，电泳图片(图6)显示CPA法可检测到低至2.1×10^-2copy/μL的标准模板。

实施例6鲍曼不动杆菌检测方法的特异性试验

1、材料及试剂

鲍曼不动杆菌临床分离株，金黄色葡萄球菌临床分离株，铜绿假单胞菌临床分离株，大肠杆菌临床分离株，肺炎克雷伯菌临床分离株(均来自华西医院实验医学科微生物室)。

其余同实施例2。

2、方法

2.1标准DNA模板制备

制备方法同实施例2。

2.2临床菌株待检样品制备

煮沸裂解法，挑取1个菌落+0.5ml水，95℃10min，离心取上清液。实施例6的五种临床菌株均使用该方法制备待检样品。

2.3恒温扩增

(1)CPA扩增反应体系

采用20μL反应体系，在PCR管中加入Bst DNA聚合酶8U； Reaction Buffer 2.0μL；dNTPs 0.4mM；MgSO4 3.0mM；Betaine 0.25M；引物F3 0.25μM；引物B3 0.25μM；引物DF5F 0.4μM；引物DF5B0.35μM；引物CPR 0.25μM；待检DNA；ddH2O补足体系至20μL。待检DNA依次为标准鲍曼不动杆菌DNA模板40ng，鲍曼不动杆菌煮沸裂解的待检上清液4μL，金黄色葡萄球菌煮沸裂解的待检上清液4μL，铜绿假单胞菌煮沸裂解的待检上清液4μL，大肠杆菌煮沸裂解的待检上清液4μL，肺炎克雷伯菌煮沸裂解的待检上清液4μL。

(2)CPA扩增反应条件

反应物于温度52℃，恒温反应70min后，90℃灭活10min。

2.3CPA扩增反应结果检测

取10μLCPA反应产物，加入2μL 6×loading buffer，混匀后取10μL加入混有溴化乙锭的2％的琼脂糖凝胶中，电泳30min后在凝胶成像系统上成像，电泳图片(图7)显示金黄色葡萄球菌临床分离株、铜绿假单胞菌临床分离株、大肠杆菌临床分离株、肺炎克雷伯菌临床分离株的CPA扩增产物均为阴性条带；鲍曼不动杆菌临床分离株CPA扩增产物为阳性条带，与鲍曼不动杆菌标准DNA模板扩增产物条带类似。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种检测鲍曼不动杆菌的试剂盒和方法

<130> GY026-18P1505

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial（F3）

<400> 1

gacgtatcgg tcttgatctc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial（B3）

<400> 2

tttacattag cctgcacttt 20

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial（CPR）

<400> 3

gaaattggac agcaggttga ttgtatgtgc taattgggaa aca 43

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial（DF5F）

<400> 4

gaaattggac agcaggttga t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial（DF5B）

<400> 5

attaaaggtt acgcctattc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial（F3（2））

<400> 6

aaaatgttga atgccctgat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial（B3（2））

<400> 7

tcctgataga ctgggactgc 20

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial（CPR（2））

<400> 8

gaagggcgag aaaaggtcat tagcttcatg gcttctccta gtg 43

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial（DF5F（2））

<400> 9

gaagggcgag aaaaggtcat t 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial（DF5B）

<400> 10

accgcttggg aaaaagacat 20

Claims

1.一组引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示。

2.一种用于检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1-5所示的5条引物。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶和对应的缓冲液。

4.一种检测鲍曼不动杆菌的方法，其特征在于：它是采用前述试剂盒检测。

5.权利要求4所述方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取样本DNA：取待检样品，提取其中的DNA；

(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测；

6.权利要求5所述方法，其特征在于：步骤(2)中的恒温扩增的温度为48-54℃。

7.权利要求5所述方法，其特征在于：步骤(2)各引物浓度为：F3 0.25μM，B3 0.25μM，DF5F 0.4μM，DF5B 0.35μM，CPR 0.25μM；

其中，F3、B3、CPR、DF5F和DF5B的序列依次如SEQ ID NO. 1-5所示。

8.权利要求5所述方法，其特征在于：步骤(2)中反应时间为40-80min。

9.权利要求5所述方法，其特征在于：步骤(3)中的结果检测方法为：胶体金或常规琼脂糖凝胶电泳中的至少一种。