CN113151412B - 用于检测mdck细胞残留dna含量的特异性引物和探针及实时荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

用于检测mdck细胞残留dna含量的特异性引物和探针及实时荧光定量pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物和探针，所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物MDCK ND‑F：5’‑CATAACCAAAAGGGACGAAC‑3’；下游引物MDCK ND‑R：5’‑TTCCGAGGTTTATAGAGAGTTGT‑3’；所述探针序列为：5’‑ACCTCACTCATTTACGCCCAC‑3’。本发明还提供相应的试剂盒。本发明的试剂盒能够很好的检测MDCK细胞残留DNA含量，灵敏度高，用时短。

Description

用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物和探针及实时 荧光定量PCR试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，涉及用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR试剂盒。
背景技术
生物制品的质量控制不仅是对终产品的质量控制，更是对整个生产过程的质量控制，用于生产生物技术药物的细胞基质一直因其安全性而备受关注，生产用基质细胞经历了从原代细胞，二倍体细胞到传代细胞的发展历程，人们对其潜在风险的认识也在不断变化。
细胞基质作为主要原材料，其存在的潜在危险因素包括：促生长蛋白及细胞残留蛋白、潜在病毒、细胞DNA。质量的优劣直接影响生物制品的质量和产量，尤其是生物制品的安全性。虽然至今没有因为生物制品中DNA残留量而引发不良反应或安全事故，但其用量随着临床治疗的需求越来越大，需要长期反复用药的生物制品也越来越多，同时，疫苗的使用者为健康人群，这些都使得药品监管部门更加重视生物技术产品的安全性，其中DNA残留量的质量控制一直是人们关注的热点。几十年来对于残余DNA问题的争论一直在继续，有的观点认为应将残余DNA作为一种重要危险因素，也有人倾向于将残余DNA作为一般杂质控制。各国研究机构围绕着残余DNA问题都做了大量的工作，国内外也有很多有关细胞基质及残余DNA的文献和技术指南发表。但根据现有研究结果，现在认为应将其视为一般杂质，并控制其在生物制品中的含量达到纯化工艺可控制的最低量，中国药典第3部对宿主DNA残留的要求为单次注射剂量小于10ng/剂。残余DNA的分析检测也经历了一系列的变革，很多方法被研发和革新。现有的检测手段包括DNA探针杂交法、荧光比色法、荧光定量PCR方法，因为荧光定量PCR方法灵敏度高和可定量分析等特点，应用日益广泛。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR检测MDCK残留DNA的试剂盒及检测方法。
本发明提供用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物和探针，所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：
上游引物MDCK ND-F：5’-CATAACCAAAAGGGACGAAC-3’；
下游引物MDCK ND-R：5’-TTCCGAGGTTTATAGAGAGTTGT-3’；
所述探针序列为：5’-ACCTCACTCATTTACGCCCAC-3’。
作为优选，探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。
作为优选，所述上游引物和所述下游引物为向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
本发明提供一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，所述实时荧光定量PCR试剂盒包括上述的特异性引物和探针。
作为优选，在20μl PCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.4μl，所述下游引物的用量为0.4μl，所述探针的用量为0.2μl。
作为优选，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括阳性质粒标准品，所述阳性质粒标准品是以MDCK细胞DNA为模板，使用上述的引物和探针进行PCR扩增并回收，与pMD18-T质粒进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达得到的。
作为优选，所述试剂盒还包括Taq DNA酶、UDG酶、dNTP、Tris-HCl、KCl、MgCl及其缓冲液，空白标准品；所述空白标准品为灭菌去离子水。
本发明提供上述的特异性引物和探针、实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的：
(1)定性或定量检测或辅助检测MDCK细胞残留DNA含量；
(2)制备定性或定量检测或辅助MDCK细胞残留DNA含量的产品。
本发明提供一种定量检测MDCK细胞残留DNA含量的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，分别以系列浓度的上述的标准品和待测样本DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用上述的特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，获得Ct值；以标准品的质粒浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标得到标准曲线，将待测样本的Ct值代入标准曲线，获得待测样本中残留DNA含量。
作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：
Figure BDA0003009596790000031
本发明的试剂盒能够很好的检测MDCK细胞残留DNA含量，灵敏度高，成本低，检测迅速。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为ND序列克隆的PCR扩增电泳图和重组阳性转化子的筛选图。
图2为克隆得到的目的基因序列的测序结果图。
图3为五种浓度梯度的标准品的扩增曲线。
图4为仪器自带软件绘制标准品的标准曲线。
图5为本发明检测方法的灵敏度结果图。
图6为本发明检测方法的稳定性评价结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所用引物和探针序列合成由安徽通用生物技术有限公司完成；一代测序工作由华大基因技术有限公司完成。
实施例1扩增引物和探针的设计与合成
本发明选择的检测序列为MDCK细胞的保守基因ND序列。
本发明通过对NCBI数据库中ND基因序列进行检索，查找犬的ND基因序列(Ganbank登录号：NC_002008.4)，用Olige7软件对ND基因序列进行引物和探针的设计，选取评分好数条引物对和探针，然后对其进行引物BLAST特异性比对，选择特异性高的引物送至公司合成，再进行引物筛选，而后进行探针的合成，选择最适合扩增条件的引物和探针进行后续的实验。
ND序列片段为：
5’-CATAACCAAAAGGGACGAACCTGAGCTCTCATACTTATATCACTAATTCTATTTATTGGCTCAACTAATCTACTTGGACTATTACCTCACTCATTTACGCCCACAACACAACTCTCTATAAACCTCGGAA-3’。
最适合扩增条件的引物与探针序列如下：
上游引物MDCK ND-F：5’-CATAACCAAAAGGGACGAAC-3’；
下游引物MDCK ND-R：5’-TTCCGAGGTTTATAGAGAGTTGT-3’；
探针P：5’-FAM-ACCTCACTCATTTACGCCCAC-TAMRA-3’。
对合成回来的引物根据要求加入去离子水，将其稀释为10um的工作液浓度备用。
实施例2标准品的制备
本发明建立用于检测MDCK细胞DNA残留量的试剂盒，所用方法为实时荧光定量PCR的绝对定量方法；所以必须制备试剂盒检测所需的标准品。
本发明利用基因重组技术，将ND基因序列经PCR扩增，将PCR扩增产物连接克隆至pMD18-T载体中，构建阳性重组质粒，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量后作为待建立方法的标准品；空白标准品为灭菌去离子水。具体步骤如下：
1、重组阳性质粒pMD18-T-ND的构建和转化
(1)ND序列的PCR扩增
利用细胞DNA提取试剂盒(迪宁)对收集的MDCK细胞(购自兰州百灵生物技术有限公司)进行基因组DNA的提取，具体的操作步骤详见说明书。将提取后的基因组DNA用实施例1中的上游引物和下游引物进行扩增，PCR反应体系的总体积20ul，各反应组分如下：
Figure BDA0003009596790000041
Figure BDA0003009596790000051
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，40个循环；72℃10min。(2)ND序列的PCR产物的回收纯化与连接
基因的PCR产物采用2％琼脂糖凝胶电泳进行回收，采用胶回收试剂盒，操作过程按照胶回收试剂盒上的使用说明书进行；将回收基因产物与pMD18-T克隆载体连接，连接体系如下：
总体系10ul，包括目的基因：4ul，载体pMD18-T：1ul，SolutionⅠ：5ul。
混合均匀后置于4℃，过夜连接，获得pMD18-T-ND连接产物。
(3)pMD18-T-ND质粒的转化以及PCR鉴定
将pMD18-T-ND连接产物转化至DH5α感受态细胞中，具体方法为：
①将10μl的pMD18-T-ND连接产物加入到50μl冰浴上融化的DH5α感受态细胞，轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟。
②然后置于42℃水浴中热激90s，紧接着将其转移到冰浴中5分钟。
③冰浴完成之后，加入950μl无菌的LB液体培养基后置于37℃200rpm培养1h。
④将离心管在12000rpm离心30秒，倒去上清，剩余100μl用1ml的移液器吹打混匀使菌体悬浮起来，将悬浮起来的细胞均匀涂在LB固体培养基上，LB固体培养基含有100μg/mL Amp、7mg/mL IPTG和40mg/mL X-gal；
⑤将涂抹均匀后的培养基倒置于37℃培养箱中，16-24h后取出置于室内；
⑥待到X-gal显色完全时，挑取白色的单克隆在100μg/mLAmp的LB液体培养基的离心管中，37℃摇床220rpm培养12小时。
⑦根据步骤(1)中的PCR扩增方法进行菌液PCR扩增，筛选出阳性转化子。
图1为ND序列克隆的PCR扩增电泳图和重组阳性转化子的筛选图。其中，左图中扩增的目的基因片段长度为130bp；在左图中，M.DL2000；泳道1.以水作为模板的扩增产物；泳道2-5.DNA为模板的PCR扩增产物；右图为含有Amp抗性的平板进行阳性转化子的筛选。
2、重组阳性质粒的提取和标准品的获取和定量
(1)采用质粒抽提试剂盒提取重组阳性质粒，同时取10ul纯化质粒送至华大基因技术有限公司进行测序，将测序结果和原序列用DNAMAN软件进行同源性比对及重合率分析，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
图2为克隆得到的目的基因序列的测序结果图。
(2)使用ND5000超微量紫外可见分光光度计对提取的质粒测定浓度，质粒的浓度为20ng/ul，根据A260/A280判断质粒的纯度，DNA应满足OD260/OD280＝1.8-2.0，实际测得A260/A280＝1.83。
(3)在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/μL。
质粒拷贝数计算：
质粒的分子量＝2692bp×660(每对碱基的平均分子量)
质粒copies/μL＝阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数
其中阿伏伽德罗常数＝6.02×1023copies/mol。
拷贝数计算公式：6.02×1023拷贝数/摩尔×(浓度)/(MWg/mol)＝copies/ml
即(6.02×1023)×(g/ml)/(DNA length×660)＝copies/ml
或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)＝copies/ul
质粒浓度为20ng/μL时，换算为单位copies/μL，即为：20×10-9g/uL×6.02×1023copies/mol÷(2692bp×660g/bp·mol)＝0.7×1010copies/μL。
实施例3实时荧光定量PCR检测MDCK残留DNA方法的建立
1、待测样本DNA的提取
提取待测生物制品(需要用MDCK细胞培养获得的制品，比如疫苗或者抗体)的中间品、半成品和成品中样本基因组DNA，用作实时荧光定量PCR扩增的模板，待测样本中DNA的提取用的是微量DNA提取试剂盒，操作过程按照试剂盒上的使用说明书进行。
2、标准品的稀释
在进行实时荧光定量PCR之前，先将上述得到的标准品定量到20ng/μl，再进行10倍、100倍、1000倍、10000倍工作浓度稀释，用于标准曲线定量。
3、实时荧光定量PCR反应体系和反应条件
分别以5个浓度的标准品、空白标准品、待测样本DNA为模板，以实施例1中的上游引物-F和下游引物-R为扩增引物，以荧光标记的探针-P进行实时荧光定量PCR扩增。反应体系为20uL，各反应组分如下：
Figure BDA0003009596790000061
Figure BDA0003009596790000071
其中PCR缓冲液购自南京诺唯赞生物科技有限公司，
Figure BDA0003009596790000072
U+Probe MasterMix。
反应条件如下：
Figure BDA0003009596790000073
4、标准曲线的绘制
以稀释的5个浓度梯度的标准品为模板，将空白标准品作为空白对照，根据步骤3的反应体系及反应条件，进行实时荧光定量PCR扩增，得到Ct值。分别以质粒浓度的对数为横坐标，以Ct为纵坐标，绘制标准曲线，用实时荧光定量PCR仪自带的分析软件，根据标准品的浓度和Ct值算出标准方程为Y＝-3.4X+24.29；标准曲线的相关系数R2应大于0.98，实测为：R2＝0.998。
图3为五种浓度梯度的标准品的扩增曲线。其中，A：0.7×1010copies/ul；B：0.7×109copies/ul；C：0.7×108copies/ul；D：0.7×107copies/ul；E：0.7×106copies/ul；F:空白对照。
图4为ASA-9600实时荧光定量PCR仪器自带软件绘制标准品的标准曲线。
5、待测样本浓度的检测
根据上述的反应体系和反应条件，对提取的待测样本DNA进行实时荧光定量PCR检测，将得到的待测样本DNA的Ct值代入步骤4的标准曲线方程中，计算出待测样本DNA的浓度。
实施例4实时荧光定量PCR检测MDCK残留DNA方法的灵敏度的方法试验
将实施例3稀释得到的0.2pg的标准品继续按照10的倍数进行稀释，按照实施例3中的反应体系和反应条件，对后续稀释的标准品进行实时荧光定量PCR扩增，以确定本发明检测方法的最低检出限。
用上述体系检出的最低阳性质粒的浓度为0.2fg/μL(图5)，根据实施例2中的公式计算拷贝数为：
质粒copies/μL＝0.2×10-6×10-9g/uL×6.02×1023copies/mol÷(2692bp×660g/bp·mol)＝0.7×102copies/μL。
图5为本发明检测方法的灵敏度结果图。其中，对应模板的拷贝数A：0.7×105copies/ul；B：0.7×104copies/ul；C：0.7×103copies/ul；D：0.7×102copies/ul；F:空白对照。
实施例5实时荧光定量PCR检测MDCK残留DNA方法的稳定性评价
用本发明建立的q-PCR方法，对20ng、2ng、200pg、20pg、2pg标准品进行本发明方法的稳定性评价，同一批次内进行3个重复，以及进行3次批件重复；结果显示，同一个批次内的3个重复和3次批间重复Ct值误差均小于0.5，变异系数均小于5％(表1-表4)，表明该方法具有较高的稳定性和重复性。
图6为本发明检测方法的稳定性评价结果图。其中，a-c分别为第一批、第二批和第三批试剂盒对5个浓度测试的扩增曲线；对应模板的拷贝数A：0.7×1010copies/ul；B：0.7×109copies/ul；C：0.7×108copies/ul；D：0.7×107copies/ul；E：0.7×106copies/ul；F:空白对照。
表1第一批试剂盒对5个浓度测试的CT值
标记 Ct 标准差(Ct) 定量 子集编号 样品名称
A1 FAM 8.90 0.06 - S I -1
A2 FAM 8.94 0.06 - S I -1
A3 FAM 8.90 0.06 - S I -1
A6 FAM 12.48 0.20 - S I -2
A7 FAM 12.65 0.20 - S I -2
A8 FAM 12.63 0.20 - S I -2
B1 FAM 15.86 0.05 - S I -3
B2 FAM 15.89 0.05 - S I -3
B3 FAM 15.93 0.05 - S I -3
B6 FAM 19.72 0.10 - S I -4
B7 FAM 19.70 0.10 - S I -4
B8 FAM 19.66 0.10 - S I -4
C2 FAM 23.14 0.14 - S I -5
C3 FAM 23.23 0.14 - S I -5
C4 FAM 23.35 0.14 - S I -5
C9 FAM - 18.06 - S I 水
C10 FAM - 18.06 - S I 水
C11 FAM - 18.06 - S I 水
表2第二批试剂盒对5个浓度测试的CT值
标记 Ct 标准差(Ct) 定量 子集编号 样品名称
D2 FAM 8.95 0.10 - S I -1
D3 FAM 8.87 0.10 - S I -1
D4 FAM 8.86 0.10 - S I -1
D5 FAM 12.44 0.06 - S I -2
D7 FAM 12.52 0.06 - S I -2
D8 FAM 12.57 0.06 - S I -2
E2 FAM 15.87 0.03 - S I -3
E3 FAM 15.89 0.03 - S I -3
E4 FAM 15.82 0.03 - S I -3
E5 FAM 19.63 0.07 - S I -4
E7 FAM 19.75 0.07 - S I -4
E8 FAM 19.69 0.07 - S I -4
F1 FAM 23.11 0.16 - S I -5
F3 FAM 23.36 0.16 - S I -5
F4 FAM 23.17 0.16 - S I -5
F9 FAM - 0.00 - S I 水
F10 FAM - 0.00 - S I 水
F11 FAM - 0.00 - S I 水
表3第三批试剂盒对5个浓度测试的CT值
标记 Ct 标准差(Ct) 定量 子集编号 样品名称
F12 FAM 23.33 0.11 - S I -5
G1 FAM 8.88 0.02 - S I -1
G3 FAM 8.87 0.02 - S I -1
G4 FAM 8.87 0.02 - S I -1
G5 FAM 12.50 0.07 - S I -2
G7 FAM 12.57 0.07 - S I -2
G8 FAM 12.54 0.07 - S I -2
G12 FAM 23.27 0.11 - S I -5
H1 FAM 15.85 0.09 - S I -3
H3 FAM 15.78 0.09 - S I -3
H4 FAM 15.79 0.09 - S I -3
H6 FAM 19.68 0.06 - S I -4
H7 FAM 19.69 0.06 - S I -4
H8 FAM 19.79 0.06 - S I -4
H9 FAM - 0.00 - S I 水
H10 FAM - 0.00 - S I 水
H11 FAM - 0.00 - S I 水
H12 FAM 23.48 0.11 - S I -5
表4 ND批间重复试验
Figure BDA0003009596790000101
实施例6基于实时荧光定量PCR检测MDCK残留DNA试剂盒
本发明基于实时荧光定量PCR检测MDCK残留DNA试剂盒包括以下组分：
1、标准品
标准品(20ng/μl)：本发明实施例2制备的重组阳性质粒；
空白标准品：灭菌去离子水。
2、PCR扩增试剂
引物：
上游引物MDCK ND-F：5’-CATAACCAAAAGGGACGAAC-3’；
下游引物MDCK ND-R：5’-TTCCGAGGTTTATAGAGAGTTGT-3’；
定量PCR扩增试剂：Taq DNA酶、UDG酶、dNTP、Tris-HCl、KCl、MgCl2及其缓冲液。
3、检测探针；
探针P：5’-FAM-ACCTCACTCATTTACGCCCAC-TAMRA-3’。
应用该试剂盒检测MDCK残留DNA的方法与实施例3相同。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 兰州百源基因技术有限公司
<120> 用于检测MDCK细胞残留DNA含量的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cataaccaaa agggacgaac ctgagctctc atacttatat cactaattct atttattggc 60
tcaactaatc tacttggact attacctcac tcatttacgc ccacaacaca actctctata 120
aacctcggaa 130
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cataaccaaa agggacgaac 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttccgaggtt tatagagagt tgt 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acctcactca tttacgccca c 21

Claims (10)

1.一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒包括特异性引物和探针；
所述特异性引物为下述序列：
上游引物MDCK ND-F：5’- CATAACCAAAAGGGACGAAC -3’；
下游引物MDCK ND-R：5’- TTCCGAGGTTTATAGAGAGTTGT -3’；
所述探针序列为：5’-ACCTCACTCATTTACGCCCAC -3’。
2.根据权利要求1所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：在20μl PCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.4μl，所述下游引物的用量为0.4μl，所述探针的用量为0.2μl。
4.根据权利要求1或2所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括阳性质粒标准品，所述阳性质粒标准品是以MDCK细胞DNA为模板，使用权利要求1中所述的引物进行PCR扩增并回收，与pMD18-T质粒进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达得到的。
5.根据权利要求3所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括阳性质粒标准品，所述阳性质粒标准品是以MDCK细胞DNA为模板，使用权利要求1中所述的引物进行PCR扩增并回收，与pMD18-T质粒进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达得到的。
6.根据权利要求4所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Taq DNA酶、UDG酶、 dNTP、Tris-HCl、KCl、MgCl2，空白标准品；所述空白标准品为灭菌去离子水。
7.根据权利要求5所述的一种用于定量检测MDCK细胞残留DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Taq DNA酶、UDG酶、 dNTP、Tris-HCl、KCl、MgCl2，空白标准品；所述空白标准品为灭菌去离子水。
8.权利要求1-7任一所述的实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的：
（1）定性或定量检测或辅助检测MDCK细胞残留DNA含量；
（2）制备定性或定量检测或辅助检测MDCK细胞残留DNA含量的产品。
9.一种定量检测MDCK细胞残留DNA含量的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：分别以系列浓度的权利要求5中所述的标准品和待测样本DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，利用权利要求1中所述的特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，获得Ct值；以标准品的质粒浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标得到标准曲线，将待测样本的Ct值代入标准曲线，获得待测样本中残留DNA含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件为：
Hold cycle1 污染消化 37℃ 2min
预变性 94℃ 5min
Cycle cycle45 循环反应 94℃ 30s
56℃ 30s
72℃ 30s 收集荧光信号。
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