CN117660701B - 一种检测丽水穿山甲病毒的lamp引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测丽水穿山甲病毒的LAMP引物组、试剂盒及方法。本发明的LAMP引物组，包括一对外引物F3和B3以及一对内引物FIP和BIP，利用该引物组及其荧光可视化快速检测试剂盒可实现对丽水穿山甲病毒的高灵敏度和高特异性检测，特异性强不与穿山甲其他相关病毒反应，最低检测限可达到1.59×100 copies/μL，全程只需要40分钟内就能完成检测，具有高特异性、高灵敏性、快速高效、操作简便的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测丽水穿山甲病毒的LAMP引物组、试剂盒及方法。
背景技术
丽水穿山甲病毒(Lishui pangolin virus，LSPV)属于Colti病毒，但是，迄今为止还没有直接的证据表明Colti病毒是否与野生哺乳动物疾病有关。建立快速而准确的检测LSPV的技术，将有助于提早了解蜱虫或动物是否携带和感染，利于疫病的防控。
环介导等温扩增（LAMP）是一种的DNA扩增方法，该方法在恒温条件下扩增DNA，特异性强、速度快、专业性强、效率高。检测时间比PCR短，扩增时不依赖热循环仪器，只需要一些简单的小型加热器便能实现扩增。但目前还未能有检测LSPV的环介导等温扩增（LAMP）方法。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种快速、高效、灵敏、准确的检测丽水穿山甲病毒的LAMP引物组、试剂盒及方法，以适用于基层实验室和现场检测的推广和应用。
本发明的第一个目的是提供一种检测丽水穿山甲病毒的LAMP引物组，包括一对外引物F3和B3以及一对内引物FIP和BIP；所述的外引物F3，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的外引物B3，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的内引物FIP，其核酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述的内引物BIP，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个目的是提供一种检测丽水穿山甲病毒的LAMP试剂盒，其包括环介导等温扩增试剂和所述的检测丽水穿山甲病毒的LAMP引物组。
优选，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为含有丽水穿山甲病毒的VP11基因的重组质粒，所述的阴性对照品为DEPC处理的ddH2O。
本发明的第三个目的是提供所述的检测丽水穿山甲病毒的LAMP引物组在制备用于检测丽水穿山甲病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本。
本发明的第四个目的是提供一种非疾病诊断目的的检测丽水穿山甲病毒的方法，其包括利用所述的检测丽水穿山甲病毒的LAMP引物组检测丽水穿山甲病毒的步骤。
优选，所述的方法，包括以下步骤：
S1. 提取待检样品RNA并反转录为cDNA；
S2. 利用所述的检测丽水穿山甲病毒的LAMP引物组，以步骤S1获得的cDNA为模板进行环介导等温扩增反应；
S3. 扩增反应程序完成后，通过判断扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物来判断待检样品中是否含有丽水穿山甲病毒。
优选，所述的步骤S2中，所述的环介导等温扩增反应的体系为25 μL：含有2.5 μL10× Isothermal Amplification Buffer II、1.0 μL 8U/μL Bst 3.0 DNA Polymerase、2.5 μL 10 mM dNTP Mix、1.5 μL 100 mM MgSO4、2.5 μL 10 mM Betaine、10 μM的外引物F3、B3分别加入1.0 μL，40 μM的内引物FIP、BIP分别加入1.0 μL，待检样品cDNA模板加入1.5 μL，加ddH2O补足至25 μL；所述的环介导等温扩增反应的程序为：65℃恒温反应40-60min，80℃恒温处理5 min。
优选，所述的环介导等温扩增反应的程序为：65℃恒温反应60 min，80℃恒温处理5 min。
优选，所述的步骤S3中判断的方法为：向扩增反应体系溶液中加入SYBR Green I，然后直接用肉眼观察产物；如果溶液变成绿色，则为阳性；如果溶液保持橙色，则为阴性。
优选，所述的步骤S3中判断的方法为：将扩增反应体系溶液经琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯状电泳条带则为阳性，如果无梯状电泳条带则为阴性。
与现有PCR技术相比，本发明具有高特异性、高灵敏性、快速高效、操作简便等有益效果，具体如下：
高特异性：为了验证该体系对LSPV检测的特异性，避免与其他病毒交叉的情况，对该检测体系的特异性进行评估。在检测体系中，除了LSPV外还包括其他不同的病毒基因组分别为东阳病毒（Dong yang pangolin virus，DYPV）基因组、穿山甲呼吸道合胞病毒A(Respiratory syncytial virus A，RSV-A)基因组、穿山甲呼吸道合胞病毒B（Respiratorysyncytial virus B，RSV-B）基因组、副流感病毒5型（Parainfluenza virus 5，PIV5）基因组、盖塔病毒（Getah virus，GETV）基因组、巴泰病毒（Batai virus，BATV）基因组以及ddH2O作为阴性对照，本发明的LAMP引物组只特异的扩增LSPV，其他病毒均表现为阴性样本，无扩增产物。说明该LAMP引物组特异性良好。高灵敏性：为了评估该体系对丽水穿山甲病毒检测的灵敏度，模板RNA按照1.59×104copies/μL到1.59×10-1copies/μL6个梯度进行稀释，每个梯度分别为一个模板，通过本发明的LAMP体系，检测灵敏度可达到1.59×100copies/μL。快速高效：整个扩增在60 min内即可完成。
操作简便：不需要复杂的仪器，只需要恒温水浴锅即可反应。结果分析时通过凝脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带对检测结果进行判读或通过加入荧光核酸染料在紫外光下观察。
附图说明
图1为LAMP引物组对LSPV用LAMP法扩增后经琼脂糖凝胶电泳检测图；其中，M为DNAMarker DL5000，1为阳性对照，2为阴性对照。
图2为用LAMP引物组检测不同病毒基因组的特异性检测图；其中，M，DNA marker；泳道1：LSPV；泳道2-7分别为：DYPV、RSV-A、RSV-B、PIV5、GETV以及BATV；泳道8，阴性对照。
图3为用LAMP引物组检测LSPV的灵敏性检测图；其中反应产物在琼脂糖凝胶中电泳分离（泳道1-7，分别是1.59×104copies/μL、1.59×103copies/μL、1.59×102copies/μL、1.59×101copies/μL、1.59×100copies/μL、1.59×10-1copies/μL和阴性对照）。
图4为LSPV的LAMP引物组最佳反应时间的优化；其中，A为反应溶液经琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道1-6分别为在65℃下进行60、50、40、30、20、10 min的反应结果；泳道7，阴性对照；M，DNA marker；B为反应溶液在紫外光照下的可视图，反应管1-6分别为在65℃下进行60、50、40、30、20、10 min的反应结果；反应管7，阴性对照。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：LAMP检测方法的建立，包括LAMP引物组、LAMP反应液
1.1 LAMP引物设计：
LAMP引物组设计采用PrimerExplorerV5软件进行设计，其网站为http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html，将从NCBI数据库上下载好的LSPV的VP11基因序列导入上述软件，经过筛选得到合适的LAMP引物组，进行引物合成，合成后的外引物F3、B3的浓度为10 μM，内引物FIP、BIP的浓度为40 μM。初步试验时其使用浓度分别为：外引物F3、B3分别为1.0 μM；内引物FIP、BIP分别为1.0 μM。取不同体积的引物进行混匀后进行DYPV的检测。上述的LAMP引物组序列具体如下：
外引物F3：GGCTTGGATCAATGAAGGGA(SEQ ID NO.1)；
外引物B3：GCAAAGCATTGCTCCAAAGC(SEQ ID NO.2)；
内引物FIP：CCGACAGCATTTTCAACGGACCTGGCATGTTGCCAGTTCTT(SEQ ID NO.3)；
内引物BIP：TCAATCATCTCGCCGAAGCTCGACGACGAATGTCATCCACAG(SEQ ID NO.4)。
1.2 RNA模板的制备
1.2.1 质粒RNA模板的制备：
LAMP反应液：LSPV的pUC57- LSPV-VP11重组质粒由库美基因有限公司合成构建，是将丽水穿山甲病毒的VP11基因目的片段连接到pUC57得到的，含有T7启动子，该质粒的RNA转录本依照T7体外转录试剂盒制备，具体各试剂组分和用量见表1。反应程序为：37℃孵育2 h，孵育完全后加入2 μL的RNase free DNase I，37℃消化30 min，以除去残留DNA。
表1 体外转录反应体系
1.2.2 待检样品RNA模板的制备：
利用FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit（诺唯赞），提取样品基因组RNA，具体方法如下：
（1）向RNase-free离心管中加入200 μL样本(如样本量不足，使用PBS或0.9% NaCl补足)，加入500 μL Buffer VL，涡旋混匀15-30 s，将混合液瞬时离心收集至管底。
（2）将FastPure RNA Columns置于2 mL收集管中，转移上述混合液至FastPureRNA Columns中，12,000 rpm (13,400×g)离心1 min，弃滤液。
（3）向FastPure RNA Columns中加入600 μL Buffer RW，12,000 rpm (13,400×g)离心30 s，弃滤液。重复步骤3。空柱12,000 rpm (13,400×g)离心2 min。
（4）小心将FastPure RNA Columns转移至新的1.5 mL RNase-free收集管(试剂盒提供)中，向膜中央悬空加入30 - 50 μL的 RNase-free ddH2O，室温放置1 min，12,000rpm (13,400×g)离心1 min。
（5）弃去FastPure RNA Columns，RNA可直接用于后续检测或置于-30 ~ -15℃短期保存或置于-85 ~ -65℃长期保存。
1.3 cDNA模板的制备
利用1.21或1.2.2制备的RNA模板，逆转录反应为cDNA模板，反应体系见表2。反应程序为：30℃反应10 min，42℃反应40 min后95℃灭活5 min，产物-20℃储存备用。
表2 逆转录反应体系
1.4 LAMP反应扩增
LAMP反应体系如表3所示。其中的cDNA模板，阳性对照为来自LSPV的pUC57- LSPV-VP11重组质粒，阴性对照为DEPC处理的ddH2O。
表3 LAMP反应体系
LAMP反应程序为：上机：恒温扩增PCR仪反应温度设置为65℃恒温反应，时间为60min；再在80℃下反应5 min。
1.5 判断结果：
方案一：通过向LAMP反应混合物中加入1.0 μL SYBR Green I (Invitgen)，然后直接用肉眼观察产物。在LAMP扩增产物存在（阳性）的情况下，溶液变成绿色，但在没有样本扩增产物（阴性）的情况下，溶液保持橙色。
方案二：LAMP反应混合物(10 μL)经2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色紫外光下观察。通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯状条带判定结果；如电泳出现梯状条带即为阳性，否则，为阴性（图1）。
实施例2：LSPV的LAMP引物组的LAMP特异性检测
特异性试验是评价LAMP引物组能否特异检出LSPV。分析该引物组是否对除LSPV之外的其他病毒有交叉反应。
该实验利用可感染穿山甲的病原体基因组包括丽水穿山甲病毒（Lishuipangolin virus，LSPV）基因组、东阳病毒（Dong yang pangolin virus，DYPV）基因组、穿山甲呼吸道合胞病毒A(Respiratory syncytial virus A，RSV-A)基因组、穿山甲呼吸道合胞病毒B（Respiratory syncytial virus B，RSV-B）基因组、副流感病毒5型（Parainfluenzavirus 5，PIV5）基因组、盖塔病毒（Getah virus，GETV）基因组、巴泰病毒（Batai virus，BATV）基因组为检测对象，应用实施例1中1.1中设计筛选的LSPV的LAMP引物组，利用构建的含有LSPV的VP11基因的重组质粒（pUC57- LSPV-VP11）采用实施例1中1.2.1和1.3反应体系制备cDNA模板，再利用1.4的反应体系在65℃条件下反应60 min，再80℃下反应5 min，利用LAMP引物组进行恒温扩增反应，扩增后的产物经凝胶电泳检测，结果如图2所示。该LAMP引物组只特异的扩增LSPV，其他病毒均表现为阴性样本，无扩增产物。说明该LAMP引物组特异性良好。
实施例3：LSPV的LAMP引物组的灵敏度检测
本试验初步对LSPV设计的引物组进行检出能力(灵敏度)分析 。将pUC57- LSPV-VP11重组质粒按照1.59×104copies/μL、1.59×103copies/μL、1.59×102copies/μL、1.59×101copies/μL、1.59×100copies/μL、1.59×10-1copies/μL，6个梯度进行稀释后制成反应模板，利用实施例1中1.1的LAMP引物组，按实施例1中1.2.1和1.3方法制备cDNA模板，再利用1.4方法进行扩增，重复三次。
本实施例所得结果如图3所示，将pUC57- LSPV-VP11重组质粒进行梯度稀释后，建立的LSPV LAMP检测体系灵敏度可达到1.59×100copies/μL。
实施例4: LSPV反应时间优化
LAMP反应配置25 μL反应体系，含有2.5 μL 10× Isothermal AmplificationBuffer II、1.0 μL 8U/μL Bst 3.0 DNA Polymerase、2.5 μL 10 mM dNTP Mix (Takara)、1.5 μL 100 mM MgSO4(Thermo Fisher Scientific)、2.5 μL 10 mM Betaine、10 μM的外引物F3、B3分别加入1.0 μL，40 μM的内引物FIP、BIP分别加入1.0 μL，10 mM待检样品cDNA模板加入1.5 μL，加ddH2O补足至25 μL；在65℃下进行60、50、40、30、20和10 min，以确定最佳反应时间。反应程序结束后，将反应溶液分别按照实施例1中的方案一和方案二判定结果，图4中的A和B结果表明，在反应60、50或40 min时都能明显的看到有LAMP扩增产物。其中LAMP反应的时间最优为60 min。
Claims (3)
1. 一种检测丽水穿山甲病毒（Lishui pangolin virus，LSPV）的LAMP引物组，其特征在于，包括一对外引物F3和B3以及一对内引物FIP和BIP；所述的外引物F3，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的外引物B3，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的内引物FIP，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的内引物BIP，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种检测丽水穿山甲病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，包括环介导等温扩增试剂和权利要求1所述的检测丽水穿山甲病毒的LAMP引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为含有丽水穿山甲病毒的VP11基因的重组质粒，所述的阴性对照品为DEPC处理的ddH2O。
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