CN112359138A

CN112359138A - 基于颜色判定的逆转录环介导恒温扩增快速检测sars-cov-2的试剂盒

Info

Publication number: CN112359138A
Application number: CN202011212290.8A
Authority: CN
Inventors: 叶凯; 唐光波; 李秀娟; 窦建华; 李子航
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2020-11-03
Filing date: 2020-11-03
Publication date: 2021-02-12

Abstract

本发明公开了一种基于颜色判定的逆转录环介导恒温扩增快速检测SARS‑COV‑2的试剂盒，其基于逆转录环介导恒温扩增(RT‑LAMP)反应扩增SARS‑COV‑2的N基因和/或orf1ab基因，配合pH指示剂，标识扩增反应体系中的pH变化，可通过颜色变化判断对应基因的扩增与否，从而实现对SARS‑COV‑2的快速、低成本检测。

Description

基于颜色判定的逆转录环介导恒温扩增快速检测SARS-COV-2 的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种利用逆转录环介导恒温扩增技术并结合pH指示剂进行颜色判定，从而快速检测SARS-COV-2核酸的方法和试剂盒。

背景技术

COVID-19的检测主要依靠医学影像学及分子学，在分子学检测方面又大致分为病毒分离培养、血清抗体与核酸检测三大类。SARS-CoV-2的基因组为单链RNA，长度约为29891bp。核酸检测作为SARS-CoV-2目前主要的检测手段，广泛应用于疑似病人的筛查、治愈情况的核实以及环境检测中。目前广泛应用的核酸检测方法为荧光定量探针法，它使用荧光定量PCR仪实时采集核酸探针在DNA合成过程中被切割产生的荧光信号，具有高灵敏度、高特异性的特点，但对设备要求高、操作相对复杂。

LAMP(loop-mediated isothermal amplification)扩增技术是一种灵敏的恒温核酸扩增方法，它利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，使用针对待扩增区域6个位点设计的4-6条引物进行DNA扩增。在扩增过程中形成不同长度的茎环状结构，以其为模板引物杂交或模板3’端反折都可以作为核酸置换扩增的起始点，在Bst DNA聚合酶的作用下合成新的茎环状产物，由此循环往复，可在30min-60min内合成大量的核酸产物。RT- LAMP是在LAMP的基础上加入了反转录酶，可以将RNA反转录成cDNA后直接扩增，从而将模板范围从DNA扩展到了RNA。LAMP、RT-LAMP技术具有对设备要求低、特异性较高、操作简单(提供60℃-65℃恒温即可)的优点。

已有论文报道建立了基于RT-LAMP检测SARS-CoV-2的方法。其中Laura ED et,al报道的方法主要使用荧光激发及电泳检测，但荧光与电泳都需要额外的设备，并且电泳方式造成了极大的交叉污染风险。其他基于RT-LAMP的检测中，使用了商业化的试剂盒，价格昂贵(约24元/反应孔)，不适于进行大规模的SARS-CoV-2检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测引物。

该检测引物包括用于特异扩增SARS-COV-2 N基因部分片段的RT-LAMP引物和/或用于特意扩增SARS-COV-2 orf1ab基因部分片段的RT-LAMP引物；

所述特异扩增SARS-COV-2 N基因部分片段的RT-LAMP引物为LAMP-N-F3、 LAMP-N-B3、LAMP-N-FIP、LAMP-N-BIP、LAMP-N-LF及LAMP-N-LB，对应引物的序列如SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7及 SEQ.ID.NO.8所示；

所述特异扩增SARS-COV-2 orf1ab基因部分片段的RT-LAMP引物为 LAMP-orf1ab-F3、LAMP-orf1ab-B3、LAMP-orf1ab-FIP、LAMP-orf1ab-BIP及 LAMP-orf1ab-LF，对应引物的序列如SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、 SEQ.ID.NO.12及SEQ.ID.NO.13所示。

本发明的目的之二是提供一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测试剂盒。

该试剂盒包括用于通过改变扩增反应体系颜色从而显示SARS-COV-2核酸阳性扩增结果的pH指示剂，以及上述特异扩增SARS-COV-2 N基因部分片段的RT-LAMP引物和 /或上述特异扩增SARS-COV-2 orf1ab基因部分片段的RT-LAMP引物。

优选的，所述pH指示剂包括2mM-5mM的甲酚红和0.5mM-1.25mM的苯酚红。

优选的，所述试剂盒还包括扩增反应体系缓冲液，所述缓冲液(10×浓度)包括Tris (200mM)、KCl(500mM)、(NH₄)₂SO₄(100mM)、MgSO₄(40mM-100mM)及 Tween-20(1％)。

优选的，所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、高温逆转录酶及dNTP。

本发明的目的之三是提供一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测方法。

该检测方法包括以下步骤：

1)提取样本的RNA；

2)以提取的RNA为模板，并利用上述检测引物中用于特异扩增SARS-COV-2 N基因、orf1ab基因中某一个基因的部分片段的RT-LAMP引物，建立SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增反应体系，该扩增反应体系还含有上述pH指示剂；

3)使所述扩增反应体系进行逆转录环介导恒温扩增反应，然后根据该扩增反应体系的颜色变化对SARS-COV-2的N基因或orf1ab基因对应片段的扩增结果进行判定。

优选的，所述检测方法还包括以下步骤：

4)以提取的RNA为模板，并利用上述检测引物中用于特异扩增SARS-COV-2 N基因、orf1ab基因中另一个基因的部分片段的RT-LAMP引物，建立SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增反应体系，该扩增反应体系还含有上述pH指示剂；使所述扩增反应体系进行逆转录环介导恒温扩增反应，然后根据该扩增反应体系的颜色变化对SARS-COV-2的 N基因或orf1ab基因对应片段的扩增结果进行判定。

优选的，所述样本选自唾液、痰液、尿液、血清、血浆或细胞培养物等生物检材，或者，选自环境空气等非生物检材。

优选的，所述扩增反应体系的反应温度为63-65℃，时间为15-30分钟。

优选的，若所述样本为SARS-COV-2阳性，则随着所述扩增反应体系中SARS-COV-2N基因或orf1ab基因的部分片段的扩增，所述pH指示剂使所述扩增反应体系的颜色由粉红色变为橙黄色。

本发明的有益效果体现在：

本发明分别设计并筛选出针对病毒SARS-CoV-2 N基因的6条RT-LAMP引物及针对病毒SARS-CoV-2 orf1ab基因的5条RT-LAMP引物，可利用Bst DNA聚合酶与高温逆转录酶进行RT-LAMP反应，基于反应体系中pH指示剂产生的颜色变化判定基因靶标序列的扩增情况，从而实现对SARS-COV-2方便、快捷的检测。实验证明本发明具有检测灵敏度高、特异性强、假阳性低，以及检测成本低的特点。

进一步的，本发明提供的缓冲液、pH指示剂为组分经过优化的试剂，使阳性扩增结果可以明显的通过颜色变化予以显示，通过RT-LAMP恒温扩增技术，借助肉眼即可判断SARS-CoV-2核酸检测结果。

附图说明

图1为60℃、63℃、65℃条件下SARS-CoV-2 N基因的扩增显色情况，其中：“+”表示反应体系含RNA模板，“-”表示反应体系不含RNA模板。

图2为60℃、63℃、65℃条件下SARS-CoV-2 orf1ab基因的扩增显色情况，其中：“+”表示反应体系含RNA模板，“-”表示反应体系不含RNA模板。

图3为SARS-CoV-2 N基因的灵敏度测试结果；其中：(A)10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、 10³、10²、10拷贝N基因RNA模板扩增反应显色情况；(B)部分产物1.5％琼脂糖凝胶电泳图；M表示DL 5000 DNA marker，Positive表示阳性对照，NTC表示未加入模板。

图4为SARS-CoV-2 orf1ab基因的灵敏度测试结果；其中：(A)10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10拷贝orf1ab基因RNA模板扩增反应显色情况；(B)部分产物1.5％琼脂糖凝胶电泳图；M表示DL 5000 DNA marker，Positive表示阳性对照，NTC表示未加入模板。

图5为SARS-CoV-2 N基因的特异性测试结果；其中：(A)不同模板RT-LAMP反应的颜色变化情况；(B)产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图；pseudovirus：假病毒，serum：血清；plasma：血浆，urine：尿液，saliva：唾液，sputum：痰液。

图6为SARS-CoV-2 orf1ab基因的特异性测试结果；其中：(A)不同模板RT-LAMP 反应的颜色变化情况；(B)产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图；pseudovirus：假病毒，serum：血清；plasma：血浆，urine：尿液，saliva：唾液，sputum：痰液。

图7为携带SARS-CoV-2 N基因的假病毒检测结果；其中：(A)假病毒与细胞RNA 作为模板的颜色变化；(B)产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图；pseudovirus：假病毒。

图8为携带SARS-CoV-2 orf1ab基因的假病毒检测结果；其中：(A)假病毒与细胞RNA作为模板的颜色变化；(B)产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图；pseudovirus：假病毒。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例是对本发明的解释，而非对本发明保护范围的限制。

本发明建立了一套试剂成份清楚的SARS-COV-2核酸RT-LAMP检测方案，检测成本为目前报道方案的成本的1/6，约为4元/反应(见表4)，并且仅凭肉眼而无需其它辅助设备即可辨认结果；此外为了解决单基因检测不够明确、不稳定的特点，本发明采用检测 N基因与orf1ab基因的双基因检测方案。

本发明利用Primerexplorer V5软件分别设计针对SARS-COV-2的N基因与orf1ab基因的RT-LAMP引物；通过合成与体外转录获得了SARS-COV-2的N基因与orf1ab基因；使用Bst DNA聚合酶和高温逆转录酶，并配合pH指示剂，对SARS-COV-2检测(RT-LAMP 反应)的引物可用性、反应温度，及反应时间进行了优化(最优反应条件为：65℃、30min)；并鉴定了检测灵敏度(可达到10-100copies)及特异性(与正常人唾液、痰液、血清、血浆、尿液来源的RNA无交叉阳性反应)；且在假病毒模型中验证了对SARS-COV-2核酸检测的有效性。

1、LAMP引物设计与筛选

从NCBI下载SARS-CoV-2的基因序列(GenBank accession number MN908947)，借鉴中国CDC已公布的的靶向检测位点，选取N基因全部序列及orf1ab基因12971-13469位序列，提交至https://primerexplorer.jp/e/网站进行LAMP引物设计，针对N基因设计扩增引物两对，针对orf1ab基因设计扩增引物三对。

N基因序列(下划线标出的为扩增靶序列)：

5`-ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTG GTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGA TCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCT CTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATT AACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTG GTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCC CTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGC ACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAA AAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCA TCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTC TCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGA CAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGC CAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACG TACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAAC AAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAA CATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCG CGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCAT CAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCA TATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGA AGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGAC TCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGC AGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAA-3`

Orf1ab基因12971-13469位处序列：

5`-GCTGGTAATGCAACAGAAGTGCCTGCCAATTCAACTGTATTATCTTTCTGTGCTTTTGCTGTAGA TGCTGCTAAAGCTTACAAAGATTATCTAGCTAGTGGGGGACAACCAATCACTAATTGTGTTAAGATGTTGTGTACA CACACTGGTACTGGTCAGGCAATAACAGTTACACCGGAAGCCAATATGGATCAAGAATCCTTTGGTGGTGCATCGTGTTGTCT GTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGT AAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAA ACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAAC TCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACCGGGTTTGCG GTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTAC-3`

RT-LAMP引物筛选步骤为：1)仅使用BIP、FIP、B3、F3引物序列，使用带扩增基因的质粒DNA为模板，选取能扩增的引物对进行下一步筛选；2)以人源细胞的基因组 RNA为模板，剔除产生假阳性的引物对；3)在BIP、FIP、B3、F3引物序列中加入LF、 LP两条或一条环状引物，挑取扩增效率最高-变色最快的引物对。对于N基因，被剔除的引物中其一为假阳性；对于orf1ab，被剔除的引物对中其一表现为无法扩增；其二变现为扩增效率过低，加入环状引物后最低扩增时间也需要45min，时间远多于于本方案最优引物的15min-20min。引物经过筛选后最优引物序列见表1。

表1.用于RT-LAMP检测SARS-CoV-2核酸的引物序列

2、关键试剂的配制

2.1 pH指示剂

将称取的甲酚红(0.0764g)、苯酚红(0.0177g)溶于100ml双蒸水中，0.45μm过滤器过滤，得甲酚红-苯酚红pH指示剂(粉红色)。

2.2 RT-LAMP反应缓冲液

10×buffer：200mM Tris、500mM KCl、100mM(NH₄)₂SO₄、60mM MgSO₄，及体积分数1％的Tween-20。

3、标准模板的制备

3.1带有N基因全长的PUC57质粒(购于上海生工)或带有orf1ab基因序列的质粒(序列参见SEQ.ID.NO.2，由上海生工合成后进行XbaⅠ、BamHⅠ酶切并克隆至PUC-SP 质粒)，分别经42℃热激60s转化至DH5α大肠杆菌感受态(大连宝生物)，涂布氨苄抗生素抗性平板，挑选单克隆扩大培养后，提取质粒，质粒测量浓度后，调整浓度为10 ng/μl。

3.2用引物T7-N和T7-orf1ab及对应模板进行PCR

表2.SARS-CoV-2 N基因与orf1ab基因扩增引物

模板：3.1部分的质粒。

PCR反应体系：、Ex Taq酶(大连宝生物)0.5μl，10×Ex Taq Buffer 2μl，dNTP 2μl，上、下游引物(表2)各0.5μl(10μM)，补水至20μl。

PCR反应条件：(1)95℃2min；(2)95℃30s，60℃15s，72℃30s，共30个循环；(3)72℃延伸3min，4℃保持。

3.3体外转录获得RNA模板

以上PCR产物经1％琼脂糖电泳分离，切取400bp-500bp左右的条带，琼脂糖凝胶试剂盒回收DNA。然后以回收DNA为模板，使用MEGA shortscript^TMT7 Transcription Kit 试剂盒进行体外转录，经DNA消化、酚氯仿抽提、乙醇沉淀及洗涤，所得RNA可作为 RT-LAMP扩增的模板。

4、假病毒的载体构建与病毒包装

以携带N基因或orf1ab基因的载体(见3.1部分)为模板，分别用引物pseudovirus-N、 pseudoviru-orf1ab进行PCR。

反应体系：Ex Taq酶0.5μl、10×Ex Taq Buffer 2μl、dNTP 2μl、上、下游引物(表3) 各0.5μl(10μM)，补水至20μl。

PCR反应条件为：(1)95℃2min；(2)95℃30s，58℃15s，72℃30s，共30个循环；(3)72℃延伸3min，4℃保持。

表3.用于构建带有SARS-CoV-2 N基因、orf1ab基因的慢病毒所用的引物

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，经内切酶XbaI与BamHI酶切，与经过同样酶切的PLVX-IRES-puro载体(Clonetech公司)连接、转化大肠杆菌，筛选测序正确的阳性克隆子，分别命名为PLVX-IRES-puro-covid19-N、PLVX-IRES-puro-covid19-orf1ab，经10 ml液体LB培养基培养后，用无内毒素小提中量试剂盒(omega)提取质粒。慢病毒系统质粒按PLVX-IRES-puro-covid19-n/PLVX-IRES-puro-covid19-orf1ab/空载体:psPAX2(Addgene：12259):pMD2.G(Addgene：12259)＝4:3:1的比例(质量比)，用Lipo6000^TM转染试剂转染293T细胞(invitrogen公司)，转染后6h换液，48h后收集含有假病毒的培养液上清。

5、SARS-CoV-2的N基因与orf1ab基因的RT-LAMP检测方法建立

使用Bst 4.0酶(含Bst DNA置换酶及反转录酶的混合酶，购自新海基因公司)进行RT-LAMP反应，同时加入pH指示剂，在靶序列扩增完成后，反应体系的颜色发生变化 (由粉红到橙黄的颜色变化)，从而借助肉眼即可判断SARS-CoV-2核酸检测结果。

反应体系组成：dNTP 10μl(2.5mM each)、10×buffer 2μl(终浓度为：20mM Tris、50mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、6mM MgSO₄、0.1％Tween-20)、LAMP-N或LAMP-orf1ab 引物(终浓度为：FIP 1.6μM、BIP 1.6μM、LF 0.8μM、LB 0.8μM、F3 0.2μM、B3 0.2μM)、 Bst 4.0酶0.8μl、RNA模板10ng、甲酚红-苯酚红pH指示剂2μl，水补充到20μl。

参见图1、图2，60℃、63℃、65℃条件下，SARS-CoV-2 N基因靶序列的扩增在三个温度下都为明显的橙色、而orf1ab基因靶序列的扩增在65℃变色程度大于其它温度。最终确定的反应条件为：65℃、30min。

6、灵敏度测试、特异性测试

体外转录获得的N基因、orf1ab基因RNA产物，经仪器测定浓度。N基因RNA模板长度为465bp，orf1ab基因模板长度为500bp，其分子量分别近似为465bp×320g/mol/bp 及500bp×320g/mol/bp，则：

每微升RNA拷贝数(拷贝/μl)＝RNA单位浓度(g/μl)/RNA模板分子量(g/mol) ×阿伏伽德罗常数(6.02×10²³)

使用EASY Dilution buffer(大连宝生物)10倍梯度稀释至拷贝数分别为：10⁸copies/μl、10⁷copies/μl、10⁶copies/μl、10⁵copies/μl、10⁴copies/μl、10³copies/μl、10²copies/μl、10 copies/μl，分别取1μl作为模板用于RT-LAMP的灵敏度测试。

收集一例正常人的血清、血浆、唾液、痰液、尿液，使用MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit法提取RNA，所得RNA用于RT-LAMP的特异性测试。

灵敏度、特异性测试的RT-LAMP反应体系：dNTP 10μl(2.5mM each)、10×buffer 2μl(终浓度为：20mM Tris、50mM KCl、10mM(NH4)2SO₄、6mM MgSO₄、0.1％ Tween-20)、LAMP-N或LAMP-orf1ab引物(终浓度为：FIP 1.6μM、BIP 1.6μM、LF 0.8μM、 LB 0.8μM、F3 0.2μM、B30.2μM)、Bst 4.0酶0.8μl、RNA模板1μl、甲酚红-苯酚红pH 指示剂2μl，用水补充到20μl。

灵敏度、特异性测试的反应条件为：65℃、30min。

参见图3A、图4A，N基因模板在梯度稀释至100个拷贝时变色明显，但在10个拷贝的时已不可见明显的颜色变化；orf1ab基因模板在梯度稀释至100个拷贝时仍有明显的颜色变化，而在10个拷贝时无明显颜色变化。测试结果提示对N基因、orf1ab基因的检测灵敏度在100copies-10copies之间。参见图3B、图4B，取部分产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，变色的产物对应电泳呈阳性，而未变色扩增产物电泳呈阴性。

参见图5、图6，在特异性测试中，除分别带有N基因、orf1ab基因的假病毒外，293T及来源于正常人的血清、血浆、尿液、痰液、唾液的RNA均无阳性交叉反应。

7、假病毒的检测测试

用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取RNA，取1μl用于测试。假病毒测试结果参见图7、图8。结果显示带有N基因或orf1ab基因的假病毒作为模板，检测结果阳性(RT-LAMP反应体系变为橙黄色)，1.5％琼脂糖凝胶电泳显示假病毒为阳性；293T RNA检测结果为阴性(RT-LAMP反应体系仍为粉红色)，1.5％琼脂糖凝胶电泳显示无此形状的电泳条带，结果提示本发明建立的RT-LAMP反应体系在假病毒模型中可有效检测 SARS-Cov-2 N基因、orf1ab基因序列。

8、相同条件下，对使用本发明反应体系和条件与商业化检测试剂盒检测一个样本的价格进行了对比。

来源于NEB公司的WarmStart LAMP试剂被应用于多个实验研究中，其价格为2399元/100次反应，而本发明采用的LAMP核心酶试剂为750元/200次反应，价格仅为NEB 试剂的1/6.3，合计成本成本仅为广泛应用的NEB方案的1/6。

表4.论文报道方案与本发明方案核心试剂成本统计

备注：①每次反应仅用8U

9、检测方法在非诊断领域的应用

应用情景1：在应用细胞感染模型研究新冠的侵入及治病机理的体外研究中，用于评估SARS-Cov-2的成功感染后的扩增。使用试剂为TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit。

1.病毒的裂解

1)收集被SARS-Cov-2感染的细胞培养液200μl。

2)加入200μl的Buffer VGB、20μl的Proteinase K和1.0μl的Carrier RNA，充分混匀于56℃水浴温浴10分钟。

3)向裂解液中加入200μl无水乙醇，充分吸打混匀。

2.将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。

3.将500μl的Buffer RWA 加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。

4.将700μl的Buffer RWB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。沿Spin Column管壁四周加入Buffer RWB。

5.重复操作步骤4。

6.将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。

7.将Spin Column安置于新的1.5ml RNase free collection tube上，在SpinColumn 膜的中央处加入30～50μl的RNase free dH2O，室温静置5分钟。

8.12,000rpm离心2分钟洗脱DNA/RNA。RNA用于RT-LAMP检测。

应用情景2：测定房间内空气中SARS-Cov-2的存在情况。SARS-COV-2随着空气进行传播，会引发病毒的交叉感染。高效检测空气中的病毒，对于疾病研究和公共安全防控至关重要。

1.把25mm凝胶膜过滤器与0.3微米的截留滤膜安装到赛多利斯AirPort MD8微生物采样仪的适配器上。

2.仪器设置参数为空气流速5L/min，采样2h。

3.停止采样，用无菌镊子取下凝胶膜，用ddH₂O溶解凝胶膜，用上述的TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取RNA，RNA用于RT-LAMP检测。

10、本发明的特点

本发明提供一种用于快速检测SARS-COV-2核酸的方法，该方法基于逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)反应扩增SARS-COV-2的N基因和/或orf1ab基因，配合pH指示剂，标识扩增反应体系中的pH变化，可通过颜色变化判断对应基因的扩增与否，从而实现对SARS-COV-2的快速、低成本检测。该方法一方面要求低，只需使用低廉的设备和简单的操作(例如，水浴锅65℃下恒温孵育30min)即可快速扩增出两个基因的序列；另一方面结果读取方便，无需任何仪器，基于pH指示剂的颜色反应，使靶标序列的扩增与反应体系由粉红到橙黄的颜色变化进行关联，仅凭颜色变化即可快速、准确判断 SARS-CoV-2的存在情况。

<110> 西安交通大学

<120> 基于颜色判定的逆转录环介导恒温扩增快速检测SARS-COV-2的试剂盒

<160> 21

<210> 1

<211> 1260

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 1

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 2

gctggtaatg caacagaagt gcctgccaat tcaactgtat tatctttctg tgcttttgct 60

gtagatgctg ctaaagctta caaagattat ctagctagtg ggggacaacc aatcactaat 120

tgtgttaaga tgttgtgtac acacactggt actggtcagg caataacagt tacaccggaa 180

gccaatatgg atcaagaatc ctttggtggt gcatcgtgtt gtctgtactg ccgttgccac 240

atagatcatc caaatcctaa aggattttgt gacttaaaag gtaagtatgt acaaatacct 300

acaacttgtg ctaatgaccc tgtgggtttt acacttaaaa acacagtctg taccgtctgc 360

ggtatgtgga aaggttatgg ctgtagttgt gatcaactcc gcgaacccat gcttcagtca 420

gctgatgcac aatcgttttt aaaccgggtt tgcggtgtaa gtgcagcccg tcttacaccg 480

tgcggcacag gcactagtac 500

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> LAMP-N-F3

<400> 3

tggctactac cgaagagct 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> LAMP-N-B3

<400> 4

tgcagcattg ttagcaggat 20

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> LAMP-N-FIP

<400> 5

tctggcccag ttcctaggta gtgacgaatt cgtggtggtg a 41

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> LAMP-N-BIP

<400> 6

agacggcatc atatgggttg cagcgggtgc caatgtgatc 40

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> LAMP-N-LF

<400> 7

tggactgaga tctttcattt taccg 25

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> LAMP-N-LB

<400> 8

actgagggag ccttgaatac a 21

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> LAMP-orf1ab-F3

<400> 9

atgcaacaga agtgcctg 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> LAMP-orf1ab-B3

<400> 10

caccaccaaa ggattcttg 19

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> LAMP-orf1ab-FIP

<400> 11

tcccccacta gctagataat ctttgcaact gtattatctt tctgtgctt 49

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> LAMP-orf1ab-BIP

<400> 12

gtgttaagat gttgtgtaca cacacatcca tattggcttc cgg 43

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> LAMP-orf1ab-LF

<400> 13

agctttagca gcatctacag c 21

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> T7-N-sense

<400> 14

taatacgact cactataggg cgttccaatt aac 33

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> T7-N-antisense

<400> 15

aagagcagca tcaccgccat tg 22

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> T7-orf1ab-sense

<400> 16

taatacgact cactataggt ctagagctgg taatgca 37

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> T7-orf1ab-antisense

<400> 17

gatccgtact agtgcctgtg ccgca 25

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> pseudovirus-N-sense

<400> 18

attactcgag agggcgttcc aattaac 27

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> pseudovirus-N-antisense

<400> 19

tgaggatcca agagcagcat cacc 24

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> pseudovirus-orf1ab-sense

<400> 20

aattctcgag gctggtaatg caaca 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> pseudovirus-orf1ab-antisense

<400> 21

gcaaggatcc gtactagtgc ctgtg 25

Claims

1.一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测引物，其特征在于：该检测引物包括用于特异扩增SARS-COV-2N基因部分片段的RT-LAMP引物和/或用于特意扩增SARS-COV-2orf1ab基因部分片段的RT-LAMP引物；

所述特异扩增SARS-COV-2N基因部分片段的RT-LAMP引物为LAMP-N-F3、LAMP-N-B3、LAMP-N-FIP、LAMP-N-BIP、LAMP-N-LF及LAMP-N-LB，对应引物的序列如SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7及SEQ.ID.NO.8所示；

所述特异扩增SARS-COV-2orf1ab基因部分片段的RT-LAMP引物为LAMP-orf1ab-F3、LAMP-orf1ab-B3、LAMP-orf1ab-FIP、LAMP-orf1ab-BIP及LAMP-orf1ab-LF，对应引物的序列如SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12及SEQ.ID.NO.13所示。

2.一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于通过改变扩增反应体系颜色从而显示SARS-COV-2核酸阳性扩增结果的pH指示剂，以及用于特异扩增SARS-COV-2N基因部分片段的RT-LAMP引物和/或用于特异扩增SARS-COV-2orf1ab基因部分片段的RT-LAMP引物。

3.根据权利要求2所述一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述特异扩增SARS-COV-2N基因部分片段的RT-LAMP引物为LAMP-N-F3、LAMP-N-B3、LAMP-N-FIP、LAMP-N-BIP、LAMP-N-LF及LAMP-N-LB，对应引物的序列如SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7及SEQ.ID.NO.8所示；

4.根据权利要求2所述一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述pH指示剂包括2mM-5mM的甲酚红和0.5mM-1.25mM的苯酚红。

5.根据权利要求2所述一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括扩增反应体系缓冲液，所述缓冲液包括200mM Tris、500mM KCl、100mM(NH₄)₂SO₄、40mM-100mM MgSO₄及1％Tween-20。

6.根据权利要求2所述一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、高温逆转录酶及dNTP。

7.一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测方法，其特征在于：该检测方法包括以下步骤：

1)提取样本的RNA；

2)以提取的RNA为模板，并利用用于特异扩增SARS-COV-2N基因、orf1ab基因中某一个基因的部分片段的RT-LAMP引物，建立SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增反应体系，该扩增反应体系还含有pH指示剂，pH指示剂包括2mM-5mM的甲酚红和0.5mM-1.25mM的苯酚红；

8.根据权利要求7所述一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括以下步骤：

4)以提取的RNA为模板，并利用用于特异扩增SARS-COV-2N基因、orf1ab基因中另一个基因的部分片段的RT-LAMP引物，建立SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增反应体系，该扩增反应体系还含有所述pH指示剂；使所述扩增反应体系进行逆转录环介导恒温扩增反应，然后根据该扩增反应体系的颜色变化对SARS-COV-2的N基因或orf1ab基因对应片段的扩增结果进行判定。

9.根据权利要求7所述一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测方法，其特征在于：所述样本选自唾液、痰液、尿液、血清、血浆、细胞培养物或者环境空气。

10.根据权利要求7所述一种SARS-COV-2逆转录环介导恒温扩增检测方法，其特征在于：若所述样本为SARS-COV-2阳性，则随着所述扩增反应体系中SARS-COV-2N基因或orf1ab基因的部分片段的扩增，所述pH指示剂使所述扩增反应体系的颜色由粉红色变为橙黄色。